CN116463270A

CN116463270A - 一种木质纤维素降解微生物菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116463270A
Application number: CN202310705740.4A
Authority: CN
Inventors: 张璐; 刘笑语; 邱茗; 冯雪晴; 申文杰
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2023-06-15
Filing date: 2023-06-15
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2043-06-15
Also published as: CN116463270B

Abstract

本发明公开了一种木质纤维素降解微生物菌剂及其制备方法和应用，属于固体有机废弃物处置和资源化利用领域。所述微生物菌剂包括解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、热紫链霉菌不渗透亚种（Streptomyces thermoviolaceus subsp.apingens）和罗杰斯无性穗霉（Clonostachys rogersoniana）和/或其发酵产物。所述微生物菌剂具有极强的木质纤维素降解能力和固定重金属的能力，在林业剩余物堆肥中，能够明显提高木质纤维素降解效率，缩短堆肥时间，能够显著降低重金属对生态环境的影响。

Description

一种木质纤维素降解微生物菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及固体有机废弃物处置和资源化利用领域，特别是涉及一种木质纤维素降解微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

林业剩余物是城市绿化建设中园林植物自然凋落物（枯枝、落叶等）、人工绿化修剪物以及其他行业副产品（木质废弃物）等的统称。随着生态环境建设和绿化工作开展，园林绿化废弃物总量逐年递增。堆肥是处理林业剩余物的较为经济实用的方法。经过堆肥后，有机物被转化为稳定、卫生且具有优良的物理结构和养分含量的堆肥产品（Mistry etal., 2023）。这些堆肥产品可被用作植物或作物的栽培基质或土壤改良剂，进而减少植物或作物栽培过程中对化石燃料基肥料的依赖（Mohamed et al., 2022）。但是，林业剩余物含有大量的木质纤维素（木质素，纤维素和半纤维素通过分子间作用力和化学键相互纠缠）限制了它的堆肥进程（Sajid et al., 2022）。因此，林业剩余物的堆肥周期长，且难以获得较高品质的堆肥产品。

堆肥技术是通过微生物群落的代谢作用降解复杂有机物。一般情况下，植物残体中的半纤维素通过氢键与纤维素相连，木质素通过共价键与半纤维素连接后填充于纤维素和半纤维素间的空隙，三种物质相互纠缠，形成较为稳定的结构（闫智培等，2014）。因此，林业剩余物中木质纤维素的降解需要由多种具有特异性的微生物协同完成。综上所述，在林业剩余物堆肥过程中增加具有特定功能的微生物的数量和种类可以有效加快堆肥进程（华彬彬，2017）。接种外源菌剂是增加特定功能微生物数量的主要方式，可以有效提高堆肥效率，缩短堆肥周期（崔宗均等，2002；李瑜等，2008）。研究证明，在堆肥初期接种复合微生物菌剂可以直接增加堆肥过程中功能微生物的数量和活性，提高堆肥效率（Zhu et al.,2021）。同时，较多的研究表明复合菌剂对降解复杂有机物（如多氯联苯、多环芳烃、木质纤维素等）的效果远远强于单一菌株（华彬彬，2017；Mikeskova et al.，2012；王宇等，2009）。Huang et al.（2022）研究证明，Bacillus subtilis and Trichoderma harzianum的接种增加了堆肥中养分的转化。Mistry et al.（2023）研究发现，bacterial consortium EAc的接种可以促进堆肥的矿化。因此，制备具有特异性和高效性的木质纤维素降解菌复合菌剂并接种于林业剩余物堆肥过程，可以有效提高林业剩余物堆肥效率。

然而，当前常用于堆肥的微生物菌剂多为液态，其中包含的微生物处于游离态，易受外界环境中温度、pH值、盐、重金属等影响（张小红等，2021）。故而，堆肥过程中微生物菌剂存在生物活性和数量难以长期保持的问题。凝胶包埋法是指利用传质性能好、对生物毒性小的天然高分子载体材料，将分散的、游离的生物催化剂（细胞或酶）固定在限定空间区域的一项技术，是提高微生物和酶制剂对不利的外界环境变化的抗性的常用方法（许奕敏，2020）。凝胶包埋法不仅可以提高微生物细胞浓度，使微生物保持较高活性（元妙新，2011），还可以增强微生物对环境的适应能力和对有机物的降解能力（陆佳靓，2014；元妙新，2011；韩嘉碧等，2020；王娟等，2021；吴梦莉等，2021）。因此，采用凝胶包埋法将菌剂制备成具有一定机械强度的菌体小球，可以有效降低堆肥过程中环境对微生物菌剂的影响，延长微生物菌剂在堆肥过程中的作用周期，进而提高木质纤维素降解率。

发明内容

本发明的目的是提供一种木质纤维素降解微生物菌剂及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。所述生物菌剂具有极强的木质纤维素降解能力和固定重金属的能力，在林业剩余物堆肥中，能够明显提高木质纤维素降解效率，缩短堆肥时间。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种能够降解木质纤维素的微生物组合，包括解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、热紫链霉菌不渗透亚种（Streptomyces thermoviolaceus subsp. apingens）和罗杰斯无性穗霉（Clonostachys rogersoniana），所述解淀粉芽孢杆菌、所述热紫链霉菌不渗透亚种和所述罗杰斯无性穗霉已于2023年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，；其中，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.27236，所述热紫链霉菌不渗透亚种的保藏编号为CGMCCNo.27237，所述罗杰斯无性穗霉的保藏编号为CGMCC No.40611。

本发明还提供一种微生物菌剂，包括所述的微生物组合和/或其发酵产物。

本发明还提供一种所述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：分别制备所述解淀粉芽孢杆菌、所述热紫链霉菌不渗透亚种和所述罗杰斯无性穗霉的菌悬液，将所述菌悬液混合获得混合菌液，将所述混合菌液加入5wt%的海藻酸钠溶液中，混合均匀后，将其滴入3wt%的CaCl₂溶液中，得到固定化微球，将所述固定化微球在CaCl₂溶液中交联，蒸馏水冲洗，获得所述微生物菌剂。

进一步地，所述混合菌液中所述解淀粉芽孢杆菌、所述热紫链霉菌不渗透亚种和所述罗杰斯无性穗霉菌悬液的体积比为2:2:1。

进一步地，所述海藻酸钠溶液和所述混合菌液的体积比为2:1。

进一步地，所述交联的时间为8h。

本发明还提供所述的微生物组合或所述的微生物菌剂在制备林业剩余物堆肥产品中的应用。

本发明还提供所述的微生物组合或所述的微生物菌剂在林业剩余物堆肥中的应用。

本发明还提供所述的微生物组合或所述的微生物菌剂在提高林业剩余物堆肥效率中的应用。

本发明还提供所述的微生物组合或所述的微生物菌剂在降解木质纤维素中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、热紫链霉菌不渗透亚种（Streptomyces thermoviolaceus subsp. apingens）和罗杰斯无性穗霉（Clonostachys rogersoniana）为发明人从不同堆肥阶段的改良后的林业剩余物与牛粪联合堆肥中分离获得，对高木质纤维素含量的堆肥具有极强的适应性。

本发明所制备的固体微生物菌剂能高效分泌蛋白酶，淀粉酶，纤维素酶，半纤维素酶和木质素过氧化物酶等酶类，具有极强的木质纤维素降解能力和固定重金属的能力。应用于林业剩余物堆肥中，提高木质纤维素降解效率，缩短堆肥时间。与对照相比，添加固体菌剂的处理的木质素、纤维素和半纤维素降解率均明显提高。堆肥过程中添加固体菌剂能显著提高堆肥温度，延长堆肥高温期，加快堆肥腐熟，缩短堆肥周期。同时，添加固体菌剂的处理的堆肥产品中有效态的铜，锌和镉相比对照处理均明显减少，显著降低了重金属对生态环境的影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为固体菌剂成品的效果图；

图2为不同处理组堆肥过程中的温度变化；

图3为不同处理组堆肥过程中的pH变化；

图4为不同处理组堆肥过程中的EC变化；

图5为不同处理组堆肥过程中有效态铜的变化；

图6为不同处理组堆肥过程中有效态锌的变化；

图7为不同处理组堆肥过程中有效态镉的变化；

图8为不同处理组堆肥过程中木质素含量的变化；

图9为不同处理组堆肥过程中纤维素含量的变化；

图10为不同处理组堆肥过程中半纤维素含量的变化。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1 高效优势木质纤维素降解菌的分离和鉴定

1.木质纤维素降解菌的分离

自林业剩余物与牛粪联合堆肥的升温期、高温期、降温期和腐熟期取样，称取10g样品至灭菌后的100mL塑料瓶内（121℃灭菌20min，该灭菌条件适用于所有物料灭菌），加入90mL无菌水后将塑料瓶置于往复式震荡机上震荡15min，使微生物充分分散到液相，静置15min。吸取0.1mL上清液至装有0.9mL无菌水的2mL灭菌离心管内，充分摇匀，获得10^-1稀释液，按照上述方法制得10^-2至10^-6稀释液；各吸取0.1mL稀释液涂布至牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g和琼脂20g，定容至1L）和马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA:马铃薯浸粉6g、琼脂20g和葡萄糖20g，定容至1L），分别培养细菌和真菌。将培养基置于恒温培养箱中（记录温度），培养至长出清晰菌落，分别挑取形态不同的菌落至新的培养基，并在相同条件下划线培养，直至出现单菌落或者菌体形态相对均一的菌落，完成菌株纯化。

随后鉴定微生物的木质素和纤维素降解能力，完成初筛。准备若干直径为6mm滤纸片，灭菌后用镊子整齐放置在羧甲基纤维素钠培养基（羧甲基纤维素钠10g、磷酸氢二钾1g、七水合硫酸镁0.1g、七水合硫酸亚铁0.1g、硫酸锰5×10^-4g、蛋白胨10g、酵母浸粉10g和琼脂粉20g，定容至1L）、苯胺蓝培养基（培养真菌：在每升PDA培养基中加入0.1g苯胺蓝；培养细菌：在每升牛肉膏蛋白胨培养基中加入0.1g苯胺蓝）和愈创木酚培养基（培养真菌：在每升PDA培养基中加入0.4mL愈创木酚；培养细菌：在每升牛肉膏蛋白胨培养基中加入0.4mL愈创木酚），分别鉴定菌株的纤维素酶生产能力（羧甲基纤维素钠培养基）、锰过氧化物酶或者木质素过氧化物酶生产能力（苯胺蓝培养基，锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶均能使苯胺蓝褪色）和漆酶生产能力（愈创木酚培养基）。将斜面培养基保存的菌体进行扩繁，用灭菌的竹签蘸取各培养物润湿滤纸完成接种，该方法可使培养物集中在滤纸范围内形成规则的褪色圈或者变色圈以便观察。分离能够产生上述任何一种现象的微生物，完成初筛；鉴定入选微生物的拮抗作用，完成复筛。对于细菌和细菌间的拮抗作用，采用混菌平板法鉴定。将不存在拮抗作用的微生物（共3株）送往美吉生物科技有限公司测定16S rDNA（细菌）和ITS序列（真菌），并与GenBank数据库对比鉴定菌株类别。三者分别命名为B4，J1和J2。

2.菌株鉴定

对筛选到的菌株进行了16S rDNA和ITS分子鉴定。测序所得的核酸序列结果于NCBI Nucleotide BLAST上进行比对。

2.1 B4鉴定

形态鉴别：菌落黄色不透明，表面粗糙，有隆起，边缘不规则，液体培养静止时有菌膜产生。革兰氏染色呈阳性，杆状，形成内生芽孢，呈椭圆形。

生理生化实验：淀粉和明胶水解，乙酰甲基甲醇(V-P)试验阴性，硝酸盐还原试验阴性，苯丙氨酸脱氨酶试验、吲哚试验、甲基红(MR)试验和硫化氢试验均为阴性。其16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

>B4（SEQ ID NO.1）：

ACTTCGGCGGCTGGCTCCAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAGCCTCGCGGCTTCGCTGCCCTTTGTTCTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGAAGCCCTATCTCTAGGGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTTGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGC。

该序列通过BLAST与NCBI GenBank数据库中已报道序列进行同源性比对，结果显示，B4与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的同源性达99％以上，结合形态学特征与生理生化试验，鉴定B4为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

2.2 J1鉴定

形态鉴别：孢子丝紧密螺旋形，孢子卵圆形，表面光滑。气丝白色至紫灰色。基丝黄色、橙色至赭褐色。

生理生化实验：明胶液化。牛奶迅速凝固和胨化。淀粉水解快。硝酸盐不还原。纤维素分解强。其16S rDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

>J1（SEQ ID NO.2）：

ACCTGCAGTCGAACGATGAAGCCCCTTCGGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACGACACAGGGAGGCATCTCCTCTGTGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACTCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAGCATTCCACGTTGTCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACATCCAGAGATGGGTGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGAGCTGTCGAAGGG。

该序列通过BLAST与NCBI GenBank数据库中已报道序列进行同源性比对，结果显示，J1与热紫链霉菌不渗透亚种（Streptomyces thermoviolaceus subsp. apingens）的同源性达99％以上，结合形态学特征与生理生化试验，鉴定J1为热紫链霉菌不渗透亚种（Streptomyces thermoviolaceus subsp. apingens）。

2.3 J2鉴定

形态鉴别：分生孢子梗形成孢梗束，浅黄褐色，分生孢子具粘性。

其ITS序列如SEQ ID NO.3所示。

>J2（SEQ ID NO.3）

CCCTCCGTAAGGGGTACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCATGTGAACATACCTATCGTTGCTTCGGCGGGATCGCCCCGGGCGCCTTGTGTGCCCCGGATCCAGGCACCCGCCGGGGGACCTTAACTCTTGTTTTATTTAGAATCTTCTGAGTAGTTTTTACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGAAAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCATACCCCTAGGGTGTGGTGTTGGGGATCGGCCAAGGCCCGCAAGGGACGGCCGGCCCCTAAATCTAGTGGCGGACCCGTCGTGGCCTCCTCTGCGAAGTAGTAATATTCCGCATCGGAGAAGCGACGAGCCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTTCTAAGGTTGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAGGGCCGGAAGGAAATTTTTTTTT。

该序列通过BLAST与NCBI GenBank数据库中已报道序列进行同源性比对，结果显示，J2与罗杰斯无性穗霉（Clonostachys rogersoniana）的同源性达99％以上，结合形态学特征，鉴定J2为罗杰斯无性穗霉（Clonostachys rogersoniana）。

以上3株菌株均于2023年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院生物研究所。其中，菌株B4的分类命名为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），保藏编号为CGMCCNo.27236；菌株J1的分类命名为热紫链霉菌不渗透亚种（Streptomyces thermoviolaceus subsp. apingens），保藏编号为CGMCC No.27237；菌株J2的分类命名为罗杰斯无性穗霉（Clonostachys rogersoniana），保藏编号为CGMCC No.40611。

实施例2 固体菌剂的制备

1.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）菌悬液制备

在无菌操作台上，接种5%解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）种子液到LB液体培养基（胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g和氯化钠10g，定容至1L），200r/min，37℃，恒温震荡48h，待游离菌处于对数生长期，取出，在室温条件下以4000r/min速度离心20min后，丢弃上清液，用灭菌的0.9%生理盐水多次洗涤湿菌体表面后，在波长λ为600nm条件下且吸光度值达到1.003，用生理盐水将其调成菌悬液，置于冰箱4℃保存备用。

2.热紫链霉菌不渗透亚种（Streptomyces thermoviolaceus subsp. apingens）菌悬液制备

在无菌操作台上，接种10%热紫链霉菌不渗透亚种（Streptomyces thermoviolaceus subsp. apingens）到PDB液体培养基（马铃薯浸粉5g、蛋白胨10g、葡萄糖15g和氯化钠5g，定容至1L），200r/min，50℃，恒温震荡48h，待游离菌处于对数生长期，取出，在室温条件下以4000r/min速度离心20min后，丢弃上清液，用灭菌的0.9%生理盐水多次洗涤湿菌体表面后，在波长λ为600nm条件下且吸光度值达到1.003，用生理盐水将其调成菌悬液，置于冰箱4℃保存备用。

3.罗杰斯无性穗霉（Clonostachys rogersoniana）菌悬液制备

在无菌操作台上，接种10%罗杰斯无性穗霉（Clonostachys rogersoniana）到PDB液体培养基（马铃薯浸粉5g、蛋白胨10g、葡萄糖15g和氯化钠5g，定容至1L），200r/min，37℃，恒温震荡48h，待游离菌处于对数生长期，取出，在室温条件下以4000r/min速度离心20min后，丢弃上清液，用灭菌的0.9%生理盐水多次洗涤湿菌体表面后，在波长λ为600nm条件下且吸光度值达到1.003，用生理盐水将其调成菌悬液，置于冰箱4℃保存备用。

4.固体菌剂的制备

将分离出的各菌株制备的菌悬液按2：2：1的体积比复配，获得混合菌液。制备质量浓度为5%的海藻酸钠溶液和3% CaCl₂溶液，将二者放入高压灭菌锅中进行灭菌处理（121℃，30min），待其冷却后，按照海藻酸钠溶液：混合菌液=2：1（体积比）的比例，向5%的海藻酸钠中加入混合菌液。混合均匀后，将其滴入3% CaCl₂溶液中，得到固定化微球。将获得的固定化微球在CaCl₂溶液中交联8h，用灭菌的蒸馏水冲洗干净，置于冰箱4℃备用，固体菌剂成品如图1。

使用柠檬酸钠溶解固体菌剂后，采用平板菌落计数法测定菌剂的活菌数为1.54×10¹¹CFU·g⁻¹。

实施例3 固体菌剂在林业剩余物堆肥中的应用

1.林业剩余物堆肥的制作

林业剩余物取自北京植物园春季景观维护期间收集的残余枝叶。在堆肥之前，将收集的材料机械粉碎成<2厘米长的碎片。实验在堆肥厂进行，所有的林业剩余物材料初始总量(总干重= 120 kg)是相同的。没有添加微生物菌剂的处理(对照)被指定为T1。含0.5%普通商用菌剂（EM菌剂，购自山东君德生物科技有限公司，由光合菌群、乳酸菌群、酵母菌群、放线菌群和丝状菌群组成的复合菌剂）、0.5%固体菌剂（实施例2中制备），0.5%液体菌剂（B4，J1和J2菌株种子液按2：2：1复配），0.5%固体菌剂（B4和J1菌株种子液按2：2复配，实施例2中方法制备成固化微球）和0.5%固体菌剂（B4，J1和枯草芽孢杆菌ATCC6633菌株种子液按2：2：1复配，枯草芽孢杆菌ATCC6633购自上海保藏生物技术中心）的处理分别指定为T2、T3、T4、T5和T6。每个处理设置三个重复。堆体的高度为1米，底面积为1平方米。每天测量每个堆中的水分含量，并根据需要通过加水在整个过程中保持在60 %。每堆每4天翻一次，以提供通风。每天测量堆肥温度，每天记录平均温度。每隔4天从每个堆中采集600g样品。收集的样品分为两部分：一部分保存在4℃，用于新鲜样品分析和微生物多样性测量；另一部分被风干并用于物理化学性质的分析。

2.实验结果

2.1 堆肥过程中的温度变化

在堆肥过程中，六个处理的温度变化如图2所示。所有处理的温度都在堆肥启动后迅速上升。T3（包含B4、J1和J2的固体菌剂）在第二天进入高温期，早于其他处理。T1（未添加菌剂）、T2（添加EM菌剂）、T4（液体复合菌剂）、T5（包含B4和J1的固体菌剂）和T6（包含B4、J1和枯草芽孢杆菌的固体菌剂）分别在第7天、第5天、第4天、第6天和第5天进入高温期。研究证明，当高温期≥3天，堆肥中的病原微生物和杂草种子会被破坏。T1、T2、T3、T4、T5和T6的高温期持续时间分别为2、7、15、10、7和9天。T3处理的最高温度为58.6℃（第4天），高于其他处理。T1、T2、T3、T4、T5和T6的总堆肥时间分别为51、43、37、39、43和40天。因此，添加固体菌剂可以延长高温期，提高堆体温度和缩短堆肥周期。

2.2 堆肥过程中pH的变化

六种处理的pH值均在堆肥初期急速降低(图3)。在这一过程中，T3下降的幅度较小。在进入堆肥高温期后，T1、T2、T5和T6的pH值普遍高于T3和T4。pH值在6.5至7.5之间的最终堆肥被视为成熟堆肥。本发明中，T3的最终堆肥具有最低的pH值。因此，T3中固体菌剂的添加能促进林业剩余物堆肥的pH的降低。

2.3 堆肥过程中可溶性离子浓度EC的变化

对于六种处理，堆肥过程中的可溶性离子浓度（EC）均下降（图4），其中T3的下降幅度最小。六个处理堆肥产品的pH值分别为0.76（T1）、1.04（T2）、1.41（T3）、1.22（T4）、1.01（T5）和1.15（T6）。因此，添加T3的固体菌剂有利于提高堆肥产品的EC值。

2.4 堆肥过程中重金属的变化

随着堆肥的进行，浓缩效应的发生导致总的重金属浓度增加。在堆肥过程中总的重金属浓度增加。与此同时，有效态重金属不断减少。T1、T2、T3、T4、T5和T6的有效态铜的含量分别降低了40.34%、45.72%、58.36%、52.80%、42.85%和50.90%（图5）；有效态锌的含量分别降低了18.16%、21.78%、27.65%、22.41%、20.83%和24.57%（图6）；有效态镉的含量分别降低了2.54%、7.63%、11.20%、7.05%、7.63%和4.26%（图7）。上述结果表明，菌剂的添加有利于重金属向稳定态的转化。其中，T3添加的固体菌剂对堆肥中重金属的钝化效果最佳。

2.5 堆肥过程中木质纤维素的变化

堆肥过程中每个处理的木质素、纤维素和半纤维素含量均持续降低。堆肥结束时，T1、T2、T3、T4、T5和T6的木质素降解率分别为11.23%、18.72%、24.34%、20.18%、19.00%和21.22%（图8）；纤维素降解率分别为16.62%、23.90%、43.52%、32.13%、31.14%和37.28%（图9）；半纤维素降解率分别为18.92%、24.36%、36.06%、30.27%、23.14%和28.89%（图10）。上述结果表明，菌剂的添加有利于堆肥过程中木质素、纤维素和半纤维素的降解。其中，T3的固体菌剂的添加对木质纤维素的效果优于其它菌剂。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种能够降解木质纤维素的微生物组合，其特征在于，包括解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、热紫链霉菌不渗透亚种（Streptomyces thermoviolaceus subsp. apingens）和罗杰斯无性穗霉（Clonostachys rogersoniana），所述解淀粉芽孢杆菌、所述热紫链霉菌不渗透亚种和所述罗杰斯无性穗霉已于2023年4月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其中，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.27236，所述热紫链霉菌不渗透亚种的保藏编号为CGMCCNo.27237，所述罗杰斯无性穗霉的保藏编号为CGMCC No.40611。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的微生物组合和/或其发酵产物。

3.一种如权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：分别制备所述解淀粉芽孢杆菌、所述热紫链霉菌不渗透亚种和所述罗杰斯无性穗霉的菌悬液，将所述菌悬液混合获得混合菌液，将所述混合菌液加入5wt%的海藻酸钠溶液中，混合均匀后，将其滴入3wt%的CaCl₂溶液中，得到固定化微球，将所述固定化微球在CaCl₂溶液中交联，蒸馏水冲洗，获得所述微生物菌剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述混合菌液中所述解淀粉芽孢杆菌、所述热紫链霉菌不渗透亚种和所述罗杰斯无性穗霉菌悬液的体积比为2:2:1。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠溶液和所述混合菌液的体积比为2:1。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述交联的时间为8h。

7.如权利要求1所述的微生物组合或权利要求2所述的微生物菌剂在制备林业剩余物堆肥产品中的应用。

8.如权利要求1所述的微生物组合或权利要求2所述的微生物菌剂在林业剩余物堆肥中的应用。

9.如权利要求1所述的微生物组合或权利要求2所述的微生物菌剂在提高林业剩余物堆肥效率中的应用。

10.如权利要求1所述的微生物组合或权利要求2所述的微生物菌剂在降解木质纤维素中的应用。