CN112592862A - 一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法及应用 - Google Patents

一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法及应用 Download PDF

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丁国春
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Abstract

本发明公开了一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，主要包括以下步骤：提供菌种原料和培养基；斜面培养；制备一级种子培养液；制备二级种子培养液；制备混合发酵培养液。还公开了该好氧发酵耐盐复合微生物菌剂在餐厨垃圾处理方面的应用。本发明的氧发酵耐盐复合微生物菌剂的菌种可以耐受1‑10％(NaCl计)的盐分，同时具备产生可降解餐厨垃及主要成分蛋白质、纤维素、淀粉、油脂等物质的水解胞外酶，可以加快有机大分子的降解速率，加快堆肥进程，缩短堆肥周期，提高堆肥产品品质；将其进行餐厨垃圾好氧堆肥，能够更快进入高温期，在高温期保持时间更长，堆体发酵效果更好，最快达到堆肥腐熟标准。可以缩短堆肥周期，节约生产成本。

Description

一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及菌剂生产技术领域，尤其是涉及一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法及应用。
背景技术
餐厨垃圾可以进行好氧堆肥，在微生物的作用下将调节合适碳氮比的堆料进行生物降解，最终将有机质降解形成二氧化碳、水和能成为植物养分的矿物质和腐殖质，这类矿物质和腐殖质可以改善土壤，可以成为作物生长所必须的养分物质。为了加快餐厨垃圾的腐解的进程，除了依靠其自然滋生的微生物之外，通常为堆料中接种腐解菌剂来加速。
好氧微生物的混合发酵技术是近年来兴起的一种高效环保的餐厨垃圾处理方式，混合发酵的原理是利用不同微生物的互生、共生关系以适当的比例进行组合并混合培养来配置微生物共同体。由于混合发酵的多种微生物间具有协同作用，环境适应力较强，且多种微生物所产的酶相比于单菌发酵更加广泛，可有效降解餐厨垃圾中的淀粉、蛋白质、脂肪和纤维素，所以混合发酵在餐厨垃圾的处理中有着显著的效果。
混合发酵是一种效率高、成本低的新方式，利用不同微生物的互生、共生关系以适当的比例进行组合发酵，其环境适应力较强，且多种微生物所产的酶相比于单菌发酵更加广泛，可有效降解餐厨垃圾中的淀粉、蛋白质、脂肪和纤维素，所以混合发酵在餐厨垃圾的处理中有着显著的效果，有研究表明多种微生物菌剂复配的使用发酵餐厨垃圾的效果优于使用单一菌种的效果。
餐厨垃圾堆肥受物料盐分过高这一性质影响，堆肥过程中微生物活动受到盐分胁迫、活性下降，致使堆体升温较为缓慢。
发明内容
发明目的：为了克服背景技术的不足，本发明第一目的是公开一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法；第二目的是公开该好氧发酵耐盐复合微生物菌剂在处理高盐餐厨垃圾上的应用。
技术方案：本发明公开了一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、提供菌种原料和培养基：所述菌种原料包括短短芽孢杆菌和枝芽孢杆菌，所述培养基包括LB琼脂培养基和LB液体培养基；
S2、斜面培养：无菌下，将短短芽孢杆菌和枝芽孢杆菌接种于LB琼脂培养基中；
S3、一级种子培养液：无菌下，将S2培养得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中，制得一级种子液；
S4、二级种子培养液：无菌下，将S3所制得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌一级种子液接种于LB液体培养基中，制得二级种子液；
S5、混合发酵培养液：将S4所制得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌二级种子液等数量级混合接种于LB液体培养基进行混合培养，得到混合发酵培养液。
其中，所述短短芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21234。
本发明中短短芽孢杆菌(菌株H166)已于2020年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.21234；分类命名：副短短芽孢杆菌Brevibacillusparabrevisi(AF237682)。本发明的菌株H166能耐受1％盐分，其主要生理生化特征如下：菌落圆形、白色、湿润、透明、边缘整齐、革兰氏阳性。
所述枝芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21233。
本发明中枝芽孢杆菌(菌株H83)已于2020年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.21233；分类命名：废盐田枝芽孢杆菌Virgibacilluschiguensis(EF101168)。本发明的菌株H83能耐受1-7％盐分，其主要生理生化特征如下：菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，1.0～1.2×3.0～5.0微米。产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5微米，孢囊无明显膨大。
进一步的，S1中所述LB琼脂培养基制备方法为：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15～20g，加入1000ml去离子水搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节PH至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下121℃蒸汽灭菌20min；
所述LB液体培养基制备方法为：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入1000ml去离子水搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节PH至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下121℃蒸汽灭菌20min。
进一步的，S2中在28-32℃下培养1-2天。
进一步的，S3中短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基后，在28-32℃条件下，180-200r/min摇床培养1～2天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养。
进一步的，S4中短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌一级种子液接种于LB液体培养基中，接种量为4-6％。在28-32℃条件下，180-200r/min摇床培养1～2天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养。
进一步的，S5中短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌二级种子液接种于LB液体培养基进行混合培养，接种量为2-3％在28-32℃条件下，180-200r/min摇床培养1～2天。
本发明还公开了一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的应用，将上述制备的好氧发酵耐盐复合微生物菌剂应用于高盐餐厨垃圾的处理。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点为：首先，本发明的氧发酵耐盐复合微生物菌剂的菌种可以耐受1-10％(NaCl计)的盐分，同时具备产生可降解餐厨垃及主要成分蛋白质、纤维素、淀粉、油脂等物质的水解胞外酶，可以加快有机大分子的降解速率，加快堆肥进程，缩短堆肥周期，提高堆肥产品品质；其次，通过添加本发明耐盐微生物复合菌剂进行餐厨垃圾好氧堆肥，能够更快进入高温期，在高温期保持时间更长，堆体发酵效果更好，最快达到堆肥腐熟标准。可以缩短堆肥周期，节约生产成本；同时，处理过后的餐厨垃圾堆肥电导率下降较多，发酵后堆肥电导率数值远远低于肥料施用于土壤电导率不得大于4ms/cm的标准，减轻高盐分堆肥对于土壤的损害。
附图说明
图1为本发明制备方法流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1
一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、提供菌种原料和培养基：所述菌种原料包括短短芽孢杆菌和枝芽孢杆菌，所述培养基包括LB琼脂培养基和LB液体培养基；
所述LB琼脂培养基制备方法为：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，加入1000ml去离子水搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节pH至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下121℃蒸汽灭菌20min；
所述LB液体培养基制备方法为：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入1000ml去离子水搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节pH至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下121℃蒸汽灭菌20min。
S2、斜面培养：无菌下，将短短芽孢杆菌和枝芽孢杆菌接种于LB琼脂培养基中，在28℃下培养1天；
S3、一级种子培养液：无菌下，将S2培养得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中，在28℃条件下，180r/min摇床培养1天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养，制得一级种子液；
S4、二级种子培养液：无菌下，将S3所制得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌一级种子液接种于LB液体培养基中，接种量为4％。在28℃条件下，180r/min摇床培养1天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养，制得二级种子液；
S5、混合发酵培养液：将S4所制得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌二级种子液等数量级混合接种于LB液体培养基进行混合培养，接种量为2％在28℃条件下，180r/min摇床培养1天，得到混合发酵培养液。
所述短短芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21234。
所述枝芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21233。
实施例2
一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、提供菌种原料和培养基：所述菌种原料包括短短芽孢杆菌和枝芽孢杆菌，所述培养基包括LB琼脂培养基和LB液体培养基；
所述LB琼脂培养基制备方法为：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉18g，加入1000ml去离子水搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节pH至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下121℃蒸汽灭菌20min；
所述LB液体培养基制备方法为：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入1000ml去离子水搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节pH至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下121℃蒸汽灭菌20min。
S2、斜面培养：无菌下，将短短芽孢杆菌和枝芽孢杆菌接种于LB琼脂培养基中，在30℃下培养1.5天；
S3、一级种子培养液：无菌下，将S2培养得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中，在30℃条件下，190r/min摇床培养1.5天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养，制得一级种子液；
S4、二级种子培养液：无菌下，将S3所制得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌一级种子液接种于LB液体培养基中，接种量为5％。在30℃条件下，190r/min摇床培养1.5天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养，制得二级种子液；
S5、混合发酵培养液：将S4所制得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌二级种子液等数量级混合接种于LB液体培养基进行混合培养，接种量为2.5％在30℃条件下，190r/min摇床培养1.5天，得到混合发酵培养液。
所述短短芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21234。
所述枝芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21233。
实施例3
一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、提供菌种原料和培养基：所述菌种原料包括短短芽孢杆菌和枝芽孢杆菌，所述培养基包括LB琼脂培养基和LB液体培养基；
所述LB琼脂培养基制备方法为：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉20g，加入1000ml去离子水搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节pH至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下121℃蒸汽灭菌20min；
所述LB液体培养基制备方法为：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入1000ml去离子水搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节pH至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下121℃蒸汽灭菌20min。
S2、斜面培养：无菌下，将短短芽孢杆菌和枝芽孢杆菌接种于LB琼脂培养基中，在32℃下培养2天；
S3、一级种子培养液：无菌下，将S2培养得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中，在32℃条件下，200r/min摇床培养2天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养，制得一级种子液；
S4、二级种子培养液：无菌下，将S3所制得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌一级种子液接种于LB液体培养基中，接种量为6％。在32℃条件下，200r/min摇床培养2天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养，制得二级种子液；
S5、混合发酵培养液：将S4所制得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌二级种子液等数量级混合接种于LB液体培养基进行混合培养，接种量为3％在32℃条件下，200r/min摇床培养2天，得到混合发酵培养液。
所述短短芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21234。
所述枝芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21233。
试验例1
菌株水解酶活特性鉴定
将菌种原料短短芽孢杆菌，枝芽孢杆菌2株耐盐菌株分别用接种环至脂肪水解培养基、淀粉水解培养基、蛋白水解培养基、淀粉水解培养基中，相应温度下培养48h，观察是否出现水解透明圈。若出现透明水圈说明该种底物已经被水解，菌株具有降解该种底物的能力。2种耐盐菌水解酶活性结果如下表：
菌种 蛋白酶 纤维素酶 脂肪酶 淀粉酶
短短芽孢杆菌 + + + +
枝芽孢杆菌 + + + +
通过水解酶活性试验结果，两株耐盐菌可以产降解蛋白、油脂、纤维素、淀粉四种大分子有机物的酶，并在30℃培养过程中保持较高活性，适用于降解富含这四种有机大分子的餐厨废弃物，极富开发利用潜力。
试验例2
混合菌剂活菌数量测定
根据上述菌剂制备步骤最终得到混合菌剂进行平板涂布法活菌计数，菌剂总浓度为8.9×108cfu/mL，各菌种活菌数结果如下：
菌种 活菌数
短短芽孢杆菌 2.7×10<sup>8</sup>cfu/mL
枝芽孢杆菌 2.3×10<sup>8</sup>cfu/mL
实施例4
使用本发明耐盐菌剂处理高盐餐厨垃圾
1.材料
(1)菌剂：根据实施例2中获得混合发酵培养液作为耐盐微生物复合菌。
(2)原料：餐厨垃圾由餐厨处理公司统一收集、分捡、破碎、脱水得，估算肉类：菜类：淀粉类为1:2:3，测定含水率为78.4％；锯末为市购锯末，测的含水率为11.5％。
(3)堆肥装置：泡沫箱，容积为30L。
2.方法
(1)实验方法：
T1—餐厨垃圾+锯末+LB空白液体；
T2—餐厨垃圾+锯末+0.5％耐盐微生物复合菌剂；
T3—餐厨垃圾+锯末+餐厨垃圾发酵处理机专用菌(SKYZYE-RBFW300)；
将餐厨垃圾与锯末按照含水率65％进行配比，每个处理加入8kg餐厨垃圾和2.3kg锯末混合均匀加入到堆肥装置中。接种0.5％耐盐复合微生物菌剂于物料表面混匀后开始堆制。该堆肥中当温度高于50℃翻堆进行曝气，每1～2天翻堆一次，每天取一次样品进行后续指标测定。堆肥发酵10～15天完成。
(2)测定方法
温度、pH、EC、GI指标参考国标《NY525-2012-有机肥料》方法测定。
3.实验结果：
(1)堆肥过程中温度随时间变化，如下表：
Figure BDA0002860121570000061
Figure BDA0002860121570000071
根据堆肥过程中温度的变化可以看出T1、T2、T3三个堆肥处理整体都呈先增加后下降的趋势，可以看出T2处理在第3天升至最高温60.0℃，并在55℃上保持4天高温，相较T1、T3处理升温更快、高温期时间更长。这是因为餐厨垃圾具有高盐的特性，而耐盐菌剂中的耐盐微生物可以更快适应生存环境，开始堆肥进程。温度是反映堆肥进程的关键指标，堆肥升温快可以缩短堆肥进程，保持较长高温期有利于堆肥快速腐熟。
(2)堆肥过程中pH随时间变化，如下表：
Figure BDA0002860121570000072
Figure BDA0002860121570000081
根据堆肥过程中pH的变化可以看出T1、T2、T3三个处理pH值整体呈上升趋势，腐熟的堆肥一般呈弱碱性，pH值在8～9左右，但pH值受堆肥原料的影响较大。在第8天时，T2处理达到7.98比同一时间的T1、T2处理都大，说明添加耐盐微生物复合菌剂前期发酵效果更好，更快接近腐熟程度。
(3)堆肥第1、3、7、10、13天电导率测定结果：
EC(ms/cm) T1 T2 T3
第1天 4.68 4.56 2.93
第4天 3.35 2.05 1.62
第7天 1.37 2.18 1.86
第10天 3.97 2.00 3.59
第13天 3.82 1.28 2.56
根据堆肥过程中导电率的测定结果，T1、T2、T3三个处理整体呈下降的趋势。堆肥腐熟标准要求EC≤4.0ms/cm，T1、T2、T3三个处理均能达到腐熟要求，最终处理中添夹耐盐微生物复合菌及处理餐厨垃圾电导率的值为最小。
(4)堆肥前后种子发芽指数测定，结果如下：
GI(种子发芽指数) T1 T2 T3
初始发芽指数 0.34 0.31 0.32
发酵后发芽指数 0.62 0.82 0.70
经过14天发酵后的堆肥，只有添加耐盐菌剂处理的餐厨垃圾堆肥种子发芽指数达到商品有机肥指标(≥0.8)，说明耐盐微生物复合菌剂在处理高盐餐厨垃圾好氧堆肥方面效果显著。

Claims (9)

1.一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提供菌种原料和培养基：所述菌种原料包括短短芽孢杆菌和枝芽孢杆菌，所述培养基包括LB琼脂培养基和LB液体培养基；
S2、斜面培养：无菌下，将短短芽孢杆菌和枝芽孢杆菌接种于LB琼脂培养基中培养；
S3、一级种子培养液：无菌下，将S2培养得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中培养，制得一级种子液；
S4、二级种子培养液：无菌下，将S3所制得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌一级种子液接种于LB液体培养基中培养，制得二级种子液；
S5、混合发酵培养液：将S4所制得的短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌二级种子液等数量级混合接种于LB液体培养基进行混合培养，得到混合发酵培养液。
2.根据权利要求1所述的好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述短短芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21234。
3.根据权利要求1所述的好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述枝芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.21233。
4.根据权利要求1所述的好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：
S1中所述LB琼脂培养基制备方法为：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15～20g，加入1000ml去离子水搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节PH至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下121℃蒸汽灭菌20min；
所述LB液体培养基制备方法为：称取试剂胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加入1000ml去离子水搅拌至溶质溶解，用5mol/L NaOH调节PH至7.0，用去离子水定容至1L，在高压下121℃蒸汽灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：S2中在28-32℃下培养1-2天。
6.根据权利要求1所述的好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：S3中短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基后，在28-32℃条件下，180-200r/min摇床培养1～2天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养。
7.根据权利要求1所述的好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：S4中短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌一级种子液接种于LB液体培养基中，接种量为4-6％。在28-32℃条件下，180-200r/min摇床培养1～2天，当菌种液体培养OD值达到3.0以上时停止培养。
8.根据权利要求1所述的好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于：S5中短短芽孢杆菌、枝芽孢杆菌二级种子液接种于LB液体培养基进行混合培养，接种量为2-3％在28-32℃条件下，180-200r/min摇床培养1～2天。
9.一种好氧发酵耐盐复合微生物菌剂的应用，其特征在于：将权利要求1制备的好氧发酵耐盐复合微生物菌剂应用于高盐餐厨垃圾的处理。
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