CN110819555A - 一种木质纤维高效降解耐高温罗伊氏短芽孢杆菌njau-n20及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种木质纤维高效降解耐高温罗伊氏短芽孢杆菌NJAU‑N20及其应用。所述菌种保藏编号为CGMCC No.18020，所述菌株的应用为其加速堆肥发酵。步骤如下：将秸秆接种液体菌种，堆成高堆后，采用工厂化发酵工艺，翻堆发酵。相比于对照不添加菌种，菌种的添加有效促进了堆肥初期堆体温度的升高，促使堆体提前进入降温期，促进堆肥产品发芽指数等的提高。所制成的有机肥，能够有效促进土壤肥力的提高。

Description

一种木质纤维高效降解耐高温罗伊氏短芽孢杆菌NJAU-N20及 其应用

技术领域

本发明属于农业微生物高新技术领域，公开了一种木质纤维高效降解耐高温罗伊氏短芽孢杆菌NJAU-N20及其应用。

背景技术

中国是世界上的农业大国，也是秸秆资源大国，每年农作物收割后将会产生超过9亿吨的秸秆。近年来，国家相继出台了禁止燃烧秸秆的法律法规；秸秆沼气化技术目前不够成熟，在农村地区推广不易；露天堆放由于缺乏功能微生物不能高效降解秸秆。另外，30多年来，我国大农业(作物生产、水产、畜牧业) 发展中一个显著特点就是我国畜牧业产值的比重越来越大，例如，1980年畜牧业占大农业的比重约10％，而目前已经接近50％，作物生产和水产加起来也只占了50％。我国农民在1980年的时候，只能在过年几天吃上几顿肉，而目前我国人民几乎天天吃肉，这一巨大的饮食变化，使我国对畜牧业发展的需求越来越大。另一方面，我国目前大多数农户家已经不再养猪和其他家禽，我国的畜牧业已经完全进入规模化养殖阶段，我国高度集约化的养殖业是世界上任何一个国家不能比拟的，万头、甚至几十万头的猪场、或几百万羽的禽场到处可见，确保了我国人民对肉类产品的需求。然而，高度集约化的养殖业同样产生大量的养殖粪污，如何高效处理这些废弃物同样至关重要，目前处理利用好氧发酵将养殖粪污转化为有机肥为常用方法，但畜禽粪污普遍氮含量较高，其和秸秆采用最优配比混合能够有效驱动堆肥进行。但是，限制农业废弃物高效转化的重要因子为废弃物转化微生物。将秸秆与畜禽粪污混合后，由于含有秸秆，限制肥料化主要因素为木质纤维降解能力，因此，筛选新的高效木质纤维降解菌，并评估其工厂化堆肥的实际效果，变得意义重大。

发明内容

本发明目的在于针对秸秆与畜禽粪污混合物，筛选新的高效高温木质纤维降解菌，利用原位堆肥开发出堆肥转化菌剂，基于此，筛选出一株芽孢杆菌 NJAU-N20，为秸秆与畜禽粪污混合物肥料化产业提供技术支持及应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现:

一种具有快速降解木质纤维能力的罗伊氏短芽孢杆菌(Brevibacillusreuszeri)NJAU-N20，所述菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年6月24日，保藏编号为CGMCC No.18020。

菌株NJAU-N20耐高温，能够在50℃高温下生长；耐盐，能够在含盐15％的培养基中生长；16S rRNA序列构建的发育树比对分析结果表明，菌株NJAU-N20 与罗伊氏短芽孢杆菌Brevibacillus reuszeri同源性最高，结合16S rRNA序列构建的发育树比对分析结果和生理生化性状，将菌株NJAU-N20鉴定为罗伊氏短芽孢杆菌。菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18020。

菌株NJAU-N20于LB液体培养基50℃，170r/min水平震荡培养1d测定产酶值，外切-β-1、4-葡聚糖酶活力达到10.0613U，内切-β-1、4-葡聚糖酶活力达到12.4996U，β-葡聚糖苷酶的酶活力达到14.145U，中性木聚糖酶活力达到 417.44U，滤纸酶活力达到0.4292U。

所述的罗伊氏短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)NJAU-N20在秸秆和/ 或畜禽粪便堆肥发酵中的应用。

所述的罗伊氏短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)NJAU-N20在生产有机肥中的应用。

采用所述的罗伊氏短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)NJAU-N20生产有机肥的方法，包括以下步骤：

(1)原料混合：将秸秆或秸秆和猪粪混合物按照堆体C/N值25：1配比混合，初始含水率调节至65％～75％，采用液态接种体接种，接种量为10ml/kg，接种后均匀混合堆体材料，再砌成条垛状，堆体基料长宽1～1.2米，高1.5～1.8米，长度不限；

(2)堆肥发酵：有机肥发酵基料堆放于发酵仓内后，采用人工翻堆发酵，5 天翻堆1次，堆温50度以上维持10天以上，共堆肥发酵30-40天，停止翻堆，使堆肥进入下一阶段；

(3)后熟发酵：后熟堆放10天后，第9次采集样品后，发酵结束。

其中,所述的液态接种体制备方法如下：

将-80℃甘油管保存的NJAU-N20菌种于LB固体培养基平板划线活化，37℃培养箱培养24小时，挑取NJAU-N20单菌落于3ml液体试管37℃，170r/min震荡培养10小时，菌液作为种子液；以1％(v/v)的接种量将一种子液转接至LB 液体摇瓶中，37℃，170r/min培养至对数中期OD₆₀₀＝1.0，4℃离心收集菌体，菌体用蒸馏水洗涤3次，等体积蒸馏水重悬备用。

按照本发明所述的方法制备有机肥。

有益效果

本发明提供一种木质纤维高效降解芽孢杆菌。使用芽孢杆菌NJAU-N20对水稻秸秆粉末进行降解，半个月后秸秆的降解率达到20.75％，而此时空白处理的秸秆降解率只有2.08％，可见芽孢杆菌NJAU-N20对秸秆的降解效果比自然发酵要好，能缩短降解时间，加快降解进程，节约生产成本。

将筛选出的菌株NJAU-N20应用到四川乐山工厂化秸秆高堆腐熟发酵，经40 d堆置后，秸秆堆体中的含水量为33％，相比较空白处理，下降了10.83％，肥料腐熟效果也得到大幅度提高。猪粪秸秆加菌处理在堆肥结束后腐熟程度和速度显著优于不添加菌处理。

附图说明

图1功能菌NJAU-N2016S rRNA序列构建的系统发育树；

图2为高温菌株对秸秆降解的影响；

图3为秸秆堆肥过程中其余不同理化性状的影响；

图4为猪粪秸秆堆肥过程中其余不同理化性状变化的影响；

生物材料保藏证明

NJAU-N20，分类命名为罗伊氏短芽孢杆菌Brevibacillus reuszeri，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年6月24日，保藏编号为CGMCC No.18020。

具体实施方式

实施例1功能菌NJAU-N20的鉴定

菌株NJAU-N20在5％盐浓度的LB培养基上培养24h后，呈现白色无光泽菌落，菌落较大，柔软黏稠，不规则片状，边缘散射状；耐高温，能够在50℃高温下生长；耐盐，能够在含盐15％的培养基中生长；16S rRNA序列构建的发育树比对分析结果表明，菌株NJAU-N20与罗伊氏短芽孢杆菌Brevibacillus reuszeri同源性最高，结合16S rRNA序列构建的发育树比对分析结果和生理生化性状，将菌株NJAU-N20鉴定为罗伊氏短芽孢杆菌。该菌株对作物无害，对人和动物无致病性。

实施例2功能菌NJAU-N20的产木质纤维类降解酶活性

将菌株NJAU-N20接种到LB培养基中，在50℃、170rpm下培养1天。待各菌长好后，用无菌水调OD值，使菌液的浓度在10⁹CFU/ml。

单菌酶活测定

单菌用酶活试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定其降解与木质素和纤维素相关的酶活。

(1)β-葡萄糖苷酶(β-GC)活力测定

β-葡萄糖苷酶分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯，后者在 400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-葡萄糖苷酶活力。

β-GC(nmol/min/ml)＝(△A+0.0027)÷0.00543×V反总÷V样÷T＝61.39× (△A+0.0027)

(2)外切-β-1，4-葡聚糖酶(C1)活力测定

采用3,5-二硝基水杨酸法测定外切-β-1，4-葡聚糖酶催化微晶纤维素降解产生的还原糖的含量。

C1(ug/min/ml)＝1000×(△A+0.0673)÷6.4078×V反总÷V样÷T＝14.305×(△A+0.0673)

(3)内切-β-1，4-葡聚糖酶(Cx)活力测定

采用3,5-二硝基水杨酸法测定内切-β-1，4-葡聚糖酶催化羧甲基纤维素钠降解产生的还原糖的含量。

Cx(ug/min/ml)＝1000×(△A+0.0673)÷6.4078×V反总÷V样÷T＝14.305×(△A+0.0673)

(4)滤纸酶(FPA)活力测定

滤纸酶水解滤纸产生的还原糖能与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物，在540nm处有最大光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与还原糖的量成正比，可测定计算滤纸酶的活力。

FPA(U/ml)＝(△A+0.0255)÷0.2805×V反总÷V样÷T＝0.416×(△A+0.0255)

(5)中性木聚糖酶(NEX)活力测定

NEX在中性环境中催化木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，在沸水浴条件下进一步与3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在540nm处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在540nm吸光值增加速率，可计算NEX活力。

NEX(nmol/min/ml)＝(△A－0.00058)÷1.6904÷150÷T×106＝657×(△A －0.00058)

注：V反总：反应体系总体积；V样：加入反应体系中样本体积；T：反应时间

△A：测定组与对照组的吸光值差

结果与分析

芽孢杆菌NJAU-N20在50℃下的酶活如表1所示，可以看出芽孢杆菌NJAU-N20 对木质素和纤维素均有很强的降解能力。

表1芽孢杆菌NJAU-N20在50℃下的酶活

注:β—GC表示β-葡萄糖苷酶,C1表示外切-β-1,4葡聚糖酶,Cx表示内切 -β-1,4葡聚糖酶,FPA表示滤纸酶,NEX表示中性木聚糖酶

实施例3菌株NJAU-N20对秸秆的降解

称取10g秸秆粉末置于250ml三角瓶中，吸取总量相等的菌液加入三角瓶中，并混合均匀，放入50℃培养箱中培养，15天后，烘干样品称重，以不接菌种时的秸秆作为对照，通过失重法计算秸秆降解率。实验时间为2018年3月12日至 3月27日。

结果与分析

高温菌株NJAU-N20对秸秆降解的影响如图2所示。NJAU-N20对秸秆的降解率为20.75％，空白组秸秆的降解率为2.08％。相比较于不加菌处理，加高温单菌处理对秸秆的降解提高了18.67％。根据室内秸秆降解结果，NJAU-N20对秸秆降解有提升效果。

实施例4功能菌在纯秸秆堆肥中的应用

将筛选出的菌株NJAU-N20于四川省乐山市奥甘霖有限公司肥料厂，以纯秸秆为原料进行原位堆肥试验，试验共设计2个处理：秸秆，秸秆+单菌，分别标记为J1，J2。

试验流程

1、原料准备：于室外堆场将玉米秸秆切碎。

2、配料：将NJAU-N20单菌菌液按照1％比例加入切碎的玉米秸秆堆并加入适量清水混合均匀，使秸秆组堆体初始含水量为65％～75％，设计不接种菌的对照组。

3、布料：用铲车将混合料转运至发酵仓进行条式发酵，堆体基料长宽1～1.2米，高1.5～1.8米，长度不限；布料完成后，采集样品两份，一份自然风干，一份鲜样保存于-80℃冰箱内；(采样方法：采用五点采样法，与堆肥四个方向和中间位置采集等量样品混合均匀)。

4、翻堆：每隔5天翻堆一次，每次翻堆结束后，采集两份样品。

5、记录：每天早晚记录堆体温度及室温，温度记录为早上11:00和下午17:00；

6、堆肥结束：堆肥进行35天后，最后一次采集样品，共采集样品8次后，停止翻堆，使堆肥进入后熟发酵阶段。

7、后熟处理：后熟堆放10天后，第9次采集样品后，发酵结束。

8、检测：按照NY525-2012标准检测堆肥样品各理化性质，鲜样测定含水量、 pH等指标；风干样检测有机质、N、P、K等指标。

结果与分析

不同菌群组合对秸秆堆肥养分的影响如表2和图3所示。相比于不加菌处理 J1，添加菌剂堆体J2在堆肥过程中，升温最快，高温期最高温度可达到73℃；添加单菌堆体J2在堆肥过程中含水量下降最快，在堆肥结束时含水量为33.％，相比于不加菌处理J1，在堆肥结束时下降了10.83％；两个堆体的pH变化趋势大致相同，在堆肥结束时，添加单菌堆体J2的PH为6.57，不加菌处理为6.61，均小于8.5，符合国家标准NY525-2012；J2堆体发芽指数在堆肥结束时为88.65％，大于不加菌处理的81.48％，腐熟效果更好；有机质含量在堆肥结束时为58.36％，大于45％，符合国家标准NY525-2012；相比于不加菌处理J1，添加单菌堆体J2在堆肥结束时肥料中氮磷钾指标均为最高，分别为1.14％、0.52％和1.76％，促进了秸秆腐熟。

表2不同处理对秸秆堆肥过程中养分含量变化的影响(％)

实施例5功能菌在秸秆猪粪混合原料堆肥中的应用

将筛选出的菌株NJAU-N20于四川省乐山市奥甘霖有限公司肥料厂，接种与纯秸秆与猪粪混合原料进行堆肥，试验共设计2个处理：猪粪+秸秆，猪粪+秸秆+单菌，分别标记为Z1和Z2。

试验流程

1、原料准备：于室外堆场将玉米秸秆切碎与新鲜猪粪按照堆体C/N值25：1配比混合均匀。

2、配料：将NJAU-N20单菌菌液按照1％比例加入堆肥处理中并加入适量清水混合均匀，使猪粪组堆体初始含水量为65％～75％,设计不接菌种的对照组。

3、布料：用铲车将混合料转运至发酵仓进行条式发酵，堆体基料长宽1～1.2米，高1.5～1.8米，长度不限；布料完成后，采集样品两份，一份自然风干，一份鲜样保存于-80℃冰箱内；(采样方法：采用五点采样法，与堆肥四个方向和中间位置采集等量样品混合均匀)。

4、翻堆：每隔5天翻堆一次，每次翻堆结束后，采集两份样品。

5、记录：每天早晚记录堆体温度及室温，温度记录为早上11:00和下午17:00；

6、堆肥结束：堆肥进行35天后，最后一次采集样品，共采集样品8次后，停止翻堆，使堆肥进入后熟发酵阶段。

7、后熟处理：后熟堆放10天后，第9次采集样品后，发酵结束。

8、检测：按照NY525-2012标准检测堆肥样品各理化性质，鲜样测定含水量、 pH等指标；风干样检测有机质、N、P、K等指标。

结果与分析

不同菌群组合对猪粪秸秆堆肥养分的影响如表3和图4所示。相比于不加菌处理Z1，添加单菌剂堆体Z2在堆肥过程中，升温较快，高温期最高温度可达到 73.5℃；Z2在堆肥结束时含水量为28.71％，相比于不加菌处理Z1，在堆肥结束时下降了0.34％；两个堆体的pH变化趋势大致相同，在堆肥结束时，添加单菌堆体Z2的PH为7.27，不加菌处理为7.41，均小于8.5，符合国家标准 NY525-2012；Z2堆体发芽指数在10-30天时，均高于ZI，在堆肥结束时为90.65％，均已达到腐熟要求；Z2堆体有机质含量在堆肥结束时为47.77％，不加菌处理Z1 为48.76％，均大于45％，符合国家标准NY525-2012；相比于不加菌处理Z1，添加单菌堆体Z2在堆肥结束时肥料中氮磷钾之和为4.04％，相比于不加菌处理，增加了0.29％，提高了养分含量。

根据案例1-5，说明高温菌株NJAU-N20对秸秆畜禽粪污的腐熟效果较好，能促进降解，提高企业经济效益和生态环境效益。

表3不同处理对猪粪秸秆堆肥过程中养分含量变化的影响(％)

Claims (6)

1.一种具有快速降解木质纤维能力的罗伊氏短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)NJAU-N20，所述菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年6月24日，保藏编号为CGMCC No.18020。

2.权利要求1所述的罗伊氏短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)NJAU-N20在秸秆和/或畜禽粪便堆肥发酵中的应用。

3.权利要求1所述的罗伊氏短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)NJAU-N20在生产有机肥中的应用。

4.采用权利要求1所述的罗伊氏短芽孢杆菌(Brevibacillus reuszeri)NJAU-N20生产有机肥的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)原料混合：将秸秆或秸秆和猪粪混合物按照堆体C/N值25：1配比混合，初始含水率调节至65％～75％，采用液态接种体接种，接种量为10ml/kg，接种后均匀混合堆体材料，再砌成条垛状，堆体基料长宽1～1.2米，高1.5～1.8米，长度不限；

(2)堆肥发酵：有机肥发酵基料堆放于发酵仓内后，采用人工翻堆发酵，5天翻堆1次，堆温50度以上维持10天以上，共堆肥发酵30-40天，停止翻堆，使堆肥进入下一阶段；

(3)后熟发酵：后熟堆放10天后，第9次采集样品后，发酵结束。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的液态接种体制备方法如下：

将-80℃甘油管保存的NJAU-N20菌种于LB固体培养基平板划线活化，37℃培养箱培养24小时，挑取NJAU-N20单菌落于3ml液体试管37℃，170r/min震荡培养10小时，菌液作为种子液；以1％(v/v)的接种量将一种子液转接至LB液体摇瓶中，37℃，170r/min培养至对数中期OD₆₀₀＝1.0，4℃离心收集菌体，菌体用蒸馏水洗涤3次，等体积蒸馏水重悬备用。

6.按照权利要求4和5所述的方法制备有机肥。

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