CN105349462A - 一株龙舌兰芽孢杆菌Hexi1及其在堆肥中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株龙舌兰芽孢杆菌Hexi1，其分离自有机肥厂牛粪堆肥车间的高温堆体，堆体温度≥60℃，具备实验室高温降解淀粉、蛋白质和纤维素能力。本发明还公开了龙舌兰芽孢杆菌Hexi1在堆肥中的应用，将龙舌兰芽孢杆菌Hexi1进行液体发酵，将发酵液接种至堆肥原料中，有效促进了堆体温度的提升，提高了堆体的蛋白酶活和纤维素酶活，加快了堆体总碳和纤维素的降解，从而推动堆肥的进行，最终提高了堆肥效率。

Description

一株龙舌兰芽孢杆菌Hexi1及其在堆肥中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株龙舌兰芽孢杆菌Hexi1及其在堆肥中的应用。
背景技术
随着畜禽养殖业的迅速发展，畜禽粪便大量堆积造成的环境污染问题已日益严重。由于好氧堆肥具有经济、简便等优点，既处理了污染又生产出了优质有机肥，一直以来就是我国处理禽粪便的主要方式。堆肥化是微生物对有机废物进行生物化学降解的过程，微生物是堆肥过程的主体。微生物菌种在一定条件下对某些有机废物具有很强的分解能力，其具有活性强、繁殖快、分解有机物迅速等特点，能加速堆肥反应的进程，缩短堆肥反应的时间。然而，在堆肥过程中木质纤维素等分子产生破坏、断裂和分解的主要阶段是在堆肥高温阶段，但高温使微生物种群活性受到很大的抑制，表现为种类单一，数量减少，比中温阶段要少1-2个数量级，无疑限制了有机废物的快速降解。因此，分离获得高温菌株，将其接种至堆肥堆体中，强化堆肥，缩短堆肥时间，提高堆肥效率，成为了众多肥料厂的重要手段。由此，分离获得高温堆肥菌株变得异常重要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株龙舌兰芽孢杆菌Hexi1，该龙舌兰芽孢杆菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2014年11月19日；保藏编号为CGMCCNO.10013。菌株Hexi1在LB平板上的菌落呈灰白色，不透明，无光泽，边缘不整齐，中间白色，干燥，革兰氏染色阳性。明胶水解、淀粉水解、氧化酶反应、接触酶反应、吲哚、脲酶及硝酸盐还原均呈阳性。葡萄糖、木糖、纤维二糖、蔗糖利用均呈阳性。7wt％NaCl生长。16SrDNA序列构建的系统发育树分析表明，菌株Hexi1位于Bacillustequilensis分支上,结合生理生化试验将Hexi1鉴定为龙舌兰芽孢杆菌。
上述龙舌兰芽孢杆菌Hexi1分离至有机肥厂牛粪堆肥车间的高温堆体，堆体温度≥60℃，具备实验室高温降解淀粉、蛋白质和纤维素能力。
本发明的另一个目的是提供上述龙舌兰芽孢杆菌Hexi1在堆肥中的应用。
上述龙舌兰芽孢杆菌Hexi1在堆肥中的应用，是将龙舌兰芽孢杆菌Hexi1进行液体发酵，将发酵液接种至堆肥原料中推动堆肥进程。
本发明的有益效果：
本发明以有机肥厂牛粪堆肥车间的高温堆体(堆体温度≥60度)为分离源，分离出了一株龙舌兰芽孢杆菌Hexi1，具备实验室高温降解淀粉、蛋白质和纤维素能力。将龙舌兰芽孢杆菌Hexi1发酵液接种于堆肥堆体中，有效促进了堆体温度的提升，提高了堆体的蛋白酶活和纤维素酶活，加快了堆体总碳和纤维素的降解，从而推动堆肥的进行，最终提高了堆肥效率。
附图说明
图1为实施例1菌株Hexi1在CMC-刚果红平板产生的透明圈。
图2为实施例1菌株Hexi1和相近菌株的16SrRNA序列构建的系统发育树。
图3为实施例3接种菌株Hexi1发酵液处理和对照堆体的温度变化图。
图4为实施例3接种菌株Hexi1发酵液处理和对照堆体的蛋白酶酶活变化图。
图5为实施例3接种菌株Hexi1发酵液处理和对照堆体的纤维素酶酶活变化图。
图6为实施例3接种菌株Hexi1发酵液处理和对照堆体的总碳含量变化图。
图7为实施例3接种菌株Hexi1发酵液处理和对照堆体的总氮含量变化图。
图8为实施例3接种菌株Hexi1发酵液处理和对照堆体的总磷(五氧化二磷)含量变化图。
图9为实施例3接种菌株Hexi1发酵液处理和对照堆体的总钾(氧化钾)含量变化图。
图10为实施例3接种菌株Hexi1发酵液处理和对照堆体的纤维素含量变化图。
生物材料保藏信息
菌株Hexi1，分类命名为龙舌兰芽孢杆菌Bacillustequilensis；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2014年11月19日；保藏编号为CGMCCNO.10013。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
实施例1菌株Hexi1的分离及鉴定
从有机肥厂牛粪堆肥车间的高温堆体中剪取5g堆肥高温样品(堆体温度≥60度)放入盛有45mL无菌水的三角瓶中，170rpm振荡30min制成悬液，然后依次配备浓度为10-5、10-6、10-7、10-8的稀释液。从10-5、10-6、10-7、10-8稀释液中取0.1mL溶液分别涂布于细菌分离培养基：牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂、20.0g、去离子水1000mL，调pH7.2～7.4后0.11MPa121℃灭菌20min(每个浓度在各培养基上重复3次)，将涂布好的平板在60℃培养箱中培养3天后取出。
仔细观察培养后平板上菌落的特征，用无菌接种环将不同特征的单个菌落挑出，划线培养直至纯化。在分离过程中依据培养基上菌落的外观形状、透明程度、结合度、颜色、边缘、表面状况、生长速度、气味等，并结合在高倍显微镜下观察到的菌株个体形态进行判断，分离菌株。将纯化的菌种转接入液体牛肉膏蛋白胨培养基中，置于高温摇床中培养至对数期。取等体积菌液与灭菌30v/v％甘油混合，于-80℃保藏菌种。
将所分离菌株分别接种至淀粉培养基(淀粉培养基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、可溶性淀粉2.0g、琼脂20.0g、去离子水1000mL，pH调至7.0后，0.11MPa121℃灭菌20min)、脱脂牛奶培养基(脱脂牛奶培养基：脱脂奶粉10.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl5.0g、琼脂20.0g、去离子水1000mL，pH调至7.0后，0.11MPa121℃灭菌20min)和CMC培养基(CMC培养基：羧甲基纤维素钠10.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、NaCl5.0g、KH2PO41.0g、琼脂20.0g、去离子水1000mL，pH调至7.0后0.11MPa121℃灭菌20min)。
将接种后的淀粉培养基置于60℃的培养箱中培养至菌落丰厚后，将培养好的平板取出，加入少量的卢哥尔氏碘液，以均匀覆盖于培养基上为宜，若菌落周围出现无色透明圈或由于碘试剂的颜色而使培养基有轻度发黄，则说明淀粉已被水解。透明圈的大小反映该菌水解淀粉能力的强弱。测量菌落的透明圈直径H(mm)和菌落直径c(mm)，以Hc值定量比较水解能力的大小。将接种后的脱脂牛奶培养基平板置于60℃的培养箱中培养至菌落丰厚。若细菌产生蛋白酶,则会在菌落的周围出现清晰的透明圈。测量菌落的透明圈直径H(mm)和菌落直径c(mm)，计算Hc值。将接种后的CMC培养基平板置于60℃的培养箱中培养至菌落丰厚。将培养好的平板取出，往平板中加入适量1mg·mL-1的刚果红溶液，以覆盖整个平板为宜，染色1h；弃去染液，加入适量1mol·L-1的NaCl溶液，洗涤1h。若细菌产生纤维素酶，则会在菌落的周围出现清晰的透明圈。测量菌落的透明圈直径H(mm)和菌落直径c(mm)，计算Hc值。
最后挑选出一株菌株Hexi1，该菌株能够高效的60℃条件下水解淀粉、降解纤维素(图1)和分解蛋白。该菌株在LB平板上的菌落呈灰白色，不透明，无光泽，边缘不整齐，中间白色，干燥，革兰氏染色阳性。明胶水解、淀粉水解、氧化酶反应、接触酶反应、吲哚、脲酶及硝酸盐还原均呈阳性。葡萄糖、木糖、纤维二糖、蔗糖利用均呈阳性。7wt％NaCl生长。16SrDNA序列构建的系统发育树分析表明(图2)，菌株Hexi1位于Bacillustequilensis分支上，结合生理生化试验将Hexi1鉴定为龙舌兰芽孢杆菌。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期为2014年11月19日；保藏编号为CGMCCNO.10013。
实施例2菌株Hexi1发酵液的生产
将实施例1的菌株Hexi1(CGMCCNO.10013)接种至PDA培养液，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为：pH6.0～7.0，发酵温度为55℃，搅拌速度为180～300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为48h，使发酵液中含菌或芽孢量≥1×1010个/ml。所用PDA培养液配制方法为，以配制1L培养基为例：用200g土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7.2-7.4，121℃灭菌20min。
实施例3原位堆肥实验
将畜禽粪便及辅料(砻糠)初步拌匀后，按照0.01mLg-1(干重)接入实施例2的菌株Hexi1发酵液后，再砌成条状，设定未接种菌株Hexi1发酵液的为对照。条剁长45米、宽3米、高1.5米。第1、3、5、8、12和16天使用翻抛机(LYFP280A江阴市联业生物科技有限公司生产)翻堆，并在第0、1、3、5、9、13、17、21、25天采样。每天上午8点，下午2点测定堆体温度。
随着堆肥的进程，菌株Hexi1发酵液的接入能够有效增强堆体的温度，堆体在第14天时，温度即开始下降(图3)。所采集样品回实验室测定蛋白酶酶活(图4)和纤维素酶酶活(图5)，结果表明，菌株Hexi1发酵液的接入，能够有效促进堆体这两种酶活的增加。
随着堆肥的进程，处理和对照样品中的总碳(图6)和总氮(图7)含量呈现相似的趋势，但仍可以看出菌株Hexi1发酵液的接入加快了总碳含量的降低，但总氮含量整体上高于对照。总磷(五氧化二磷)(图8)和总钾(氧化钾)(图9)含量在处理和对照样品中未显示出显著性的差异。图10结果表明，菌株Hexi1发酵液的接入进一步加快了堆体中纤维素的降解。综合所有结果可知，菌株Hexi1发酵液的添加有效促进了堆体温度的提升，提高了堆体的蛋白酶活和纤维素酶活，加快了堆体总碳和纤维素的降解，从而推动堆肥的进行，最终提高了堆肥效率，相比于对照，接菌处理在第14天时即达到降温期。综合推测，堆体已经腐熟。

Claims (4)

1.一株龙舌兰芽孢杆菌Hexi1，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.10013。
2.根据权利要求1所述的龙舌兰芽孢杆菌Hexi1，其特征在于，其分离至有机肥厂牛粪堆肥车间的高温堆体，堆体温度≥60度，具备实验室高温降解淀粉、蛋白质和纤维素能力。
3.权利要求1所述的龙舌兰芽孢杆菌Hexi1在堆肥中的应用。
4.根据权利要求3所述的龙舌兰芽孢杆菌Hexi1在堆肥中的应用，其特征在于，将龙舌兰芽孢杆菌Hexi1进行液体发酵，将发酵液接种至堆肥原料中推动堆肥进程。
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