CN105543149A - 一株新的巨大芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株新的巨大芽孢杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105543149A
CN105543149A CN201610081336.4A CN201610081336A CN105543149A CN 105543149 A CN105543149 A CN 105543149A CN 201610081336 A CN201610081336 A CN 201610081336A CN 105543149 A CN105543149 A CN 105543149A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus megaterium
organic fertilizer
biological organic
fermentation
bar
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610081336.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105543149B (zh
Inventor
何兵
赖金龙
陶宗娅
付倩
韩娜
李维
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Normal University
Original Assignee
Sichuan Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Normal University filed Critical Sichuan Normal University
Priority to CN201610081336.4A priority Critical patent/CN105543149B/zh
Publication of CN105543149A publication Critical patent/CN105543149A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105543149B publication Critical patent/CN105543149B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/11—Bacillus megaterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F17/00—Preparation of fertilisers characterised by biological or biochemical treatment steps, e.g. composting or fermentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F3/00—Fertilisers from human or animal excrements, e.g. manure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W30/00—Technologies for solid waste management
    • Y02W30/40—Bio-organic fraction processing; Production of fertilisers from the organic fraction of waste or refuse

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fertilizers (AREA)

Abstract

本发明公开了一种巨大芽孢杆菌，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCC？NO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(Bacillus？megaterium？JD4)。本发明还公开了前述巨大芽孢杆菌的用途，以及用前述巨大芽孢杆菌发酵制备的有机肥添加剂和生物有机肥。本发明巨大芽孢杆菌具有良好的产蛋白酶活力，能够高效降解有机物，可用于制备生物有机肥，应用前景良好。

Description

一株新的巨大芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株新的巨大芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
随着我们经济的发展，工业、农业废弃物对环境造成了巨大的压力。据统计，全国每年约产生7亿顿秸秆、40亿吨畜牧业废弃物、城市污泥0.2亿吨、城市生活垃圾约2亿吨等。把废弃物制成生物有机肥，能有效解决废弃物污染问题，对保护环境及节本增效意义重大。
在生物有机肥制备过程中，添加功能菌或功能菌群为基础的菌剂，可以加快有机肥制备进程、促进腐熟、调节有机肥中各种营养元素的含量，提高有机肥品质，是一种新型高效有机肥生产技术。
巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为革兰氏阳性菌，能形成芽孢，其芽孢的抗辐射能力强，能在葡萄糖、铵盐培养基上生长，好氧，在自然界中分布广泛。近年来研究表明，巨大芽孢杆菌是一种具有多种功能的安全高效、无残留、无毒副作用的优良菌株，已广泛地应用于生产生物有机肥、生产磷细菌肥料、农药降解、抗生素合成以及酶工业等。
目前，在生产生物有机肥时，巨大芽孢杆菌只是作为混合发酵菌群之一，常与枯草芽孢杆菌及其它微生物一起使用，未见单独使用巨大芽孢杆菌发酵制备生物有机肥的报道。
另外，公告号为CN103468613B的专利公开了一种巨大芽孢杆菌JSSW-JD-2F5，其蛋白酶水解能力(Up)为8.59±1.54，水解能力不强，说明其对有机物质的降解能力较弱，生产的生物有机肥中有机质含量低，质量不佳。
发明内容
本发明提供了一种新的巨大芽孢杆菌，还提供了用前述巨大芽孢杆菌制备的有机肥添加剂和生物有机肥。
本发明提供了一种巨大芽孢杆菌，它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)。
本发明的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)，于2016年1月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其地址为：中国·武汉·武汉大学，保藏号为CCTCCNO：M2016033。
本发明提供了一种菌种发酵液的制备方法，步骤如下：
a、取保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28～37℃、150～170rpm培养24～48h，得到600nm下吸光值为1.0～1.2的种子菌悬液；
b、取步骤a制备的种子菌悬液，接种于巨大芽孢杆菌液体发酵培养基中，接种量为培养基体积的1.0～5.0％(v/v)，28～37℃，150～170rpm培养48～72h，即可；
其中，所述发酵培养基包括如下配比的组分：葡萄糖4.0～50.0g/L，玉米干粉14.0～150.0g/L，氯化钠4.5～5.0g/L。
进一步地，所述发酵培养基包括如下配比的组分：20.0～25.0g/L，玉米干粉70.0～75.0g/L，氯化钠4.5～5.0g/L；和/或，所述发酵培养基的pH为6.8～7.2。
本发明还提供了上述方法制备得到的菌种发酵液。
本发明还提供了保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)或上述菌种发酵液在制备有机肥添加剂、生物有机肥、饲料添加剂、水质改良剂中的用途。
有机肥添加剂：是指为了加快有机肥制备进程或/和提高有机肥产品质量，在有机肥物料中加入的微生物、有机或无机物质。
生物有机肥：是指特定功能微生物与主要以动植物残体如畜禽粪便、农作物秸秆等为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。
本发明还提供了一种生物有机肥，它是以保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)为发酵菌堆肥得到。
进一步地，堆肥时，接种包含保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)的菌液；优选地，所述菌液为权利要求4所述的菌种发酵液。
其中，所述生物有机肥为畜禽粪便有机肥或秸秆有机肥；
优选地，所述生物有机肥为鸡粪、猪粪或秸秆堆肥。
其中，上述生物有机肥的制备方法如下：
取含水量为53～60％的鸡粪85～90重量份、秸秆或菌渣10～15重量份、权利要求4所述的菌种发酵液0.075-0.1重量份，混匀，得发酵原料混合物；对发酵原料混合物堆积发酵；
优选地，所述堆积发酵的方法如下：
1)调节发酵原料混合物的水分含量为50～55％(w/w)，然后制成条剁；
2)对条剁进行翻堆3～4次，每次翻堆的时间为条剁中层温度达到55-60℃后静置48h；
3)当条剁中层温度下降至30-40℃时，取出，将堆肥水分降至30％以下，粉碎，即可。
其中，上述生物有机肥的制备方法如下：
取含水量为60—65％的猪粪90～93重量份、锯末或粉碎谷壳7～10重量份、权利要求4所述的菌种发酵液0.075-0.1重量份，混匀，得发酵原料混合物；对发酵原料混合物堆积发酵；
优选地，所述堆积发酵的方法如下：
1)调节发酵原料混合物的水分含量为55～65％(w/w)，然后制成条剁；
2)对条剁进行翻堆3～4次，每次翻堆的时间为条剁中层温度达到55-60℃后静置48h；
3)当条剁中层温度下降至30-40℃时，取出，将堆肥水分降至30％以下，粉碎，即可。
本发明保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)，菌体生长快、酶系丰富，具有良好的产蛋白酶活力，其蛋白酶水解能力(Up)为83.60±4.84，远远高于已报道的同种菌株，能够高效降解有机物，在生物有机肥、饲料添加剂、水质改良剂领域具有较好的应用前景。
采用本发明保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)制备有机肥添加剂，可直接利用玉米干粉为原料，成本低廉而且发酵效率高，发酵48～72h后就可获得含有高浓度蛋白酶、有效活菌的发酵液，将发酵液作为有机肥添加剂，施加到鸡粪、猪粪及秸秆等原料中，制备的生物有机肥有机质、养分含量高，病原菌清除彻底、重金属含量低，，质量良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1本发明巨大芽孢杆菌的干酪素水解圈
具体实施方式
实验材料均为市售品。
实施例1本发明巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)的分离鉴定
1、鉴定方法
从绵阳市三台县农田中的腐烂小麦秸秆中分离得到本发明菌株，进行如下形态学和分子生物学鉴定。
(1)菌株形态及生理生化特征
参照《伯杰鉴定细菌学手册》(第9版)(Holtetal,1994)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等,2001)等相关文献，按常规方法鉴定菌株的形态、生理生化特性。
(2)分子生物学特征
采用菌落PCR技术扩增菌株16SrDNA基因序列，具体操作：将细菌接种在平板上，37℃培养24h。取单一菌落悬浮于50μL无菌蒸馏水中，100℃水浴加热5min，上清液为PCR模板DNA。菌株16SrDNA扩增采用通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TTGGTTACCTTGTTACGACTT)为上下游引物对菌株进行PCR扩增。
凝胶电泳检测扩增效果合格后，将PCR产物送至成都擎科生物公司测序。将所得16SrDNA序列在NCBI网站进行Blast比对，分析菌株分类地位。
2、鉴定结果
(1)形态特征
本发明菌株的孢子囊椭圆或柱状，中生到端生；孢子囊不明显膨大；革兰氏染色阳性；菌落圆形或不规则，表面褶皱。本发明菌株符合芽孢杆菌属的特征。
(2)16SrDNA序列及分析
本发明菌株的16SrDNA基因序列长度为1447bp，序列如下：
1ACTTCCCCCAATCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGA
61CTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTA
121TTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGC
181AGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTG
241CCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTT
301GACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGA
361ATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGA
421CACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATC
481TCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAA
541CCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGAC
601CGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCC
661TAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTC
721CCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGT
781TCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCAC
841TCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACT
901TAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACG
961TATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGT
1021ACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAAC
1081CTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTAC
1141TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTC
1201AGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCG
1261CGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAA
1321CAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACC
1381CACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCG
1441ACTTGCA
根据16SrDNA基因序列网上序列比对，将其鉴定为芽孢杆菌属。
(3)生理生化特征
菌株的生理生化特征见表1。
表1菌株的生理生化特征
实验项目 鉴定结果 实验项目 鉴定结果
革兰氏染色 阳性 细胞形状 杆状
形成芽孢 + 厌氧琼脂上生长 +
接触酶 + 在50℃生长 +
V-P - 70g/LNaCl生长 +
在65℃生长 - 干酪素分解 +
淀粉水解 + 柠檬酸盐利用 +
从葡萄糖产酸产气 -
由表1可见，本发明菌株产生芽孢、接触酶阳性、V-P测定阴性、淀粉水解、干酪素分解、利用柠檬酸盐，符合巨大芽孢杆菌的特征。
结合菌体形态特征、分子生物学特征以及生理生化特征鉴定结果，将本发明分离菌株鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，命名为巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)，并于2016年1月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCCNO：M2016033。
实施例2本发明巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)的产酶特性检测
1、实验方法
(1)菌种活化：无菌开启菌种管，无菌操作，将本发明巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)菌种划线接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，37℃培养24h后，备用；
(2)产酶特性测定：用接种针取少量上述步骤(1)中的菌种分别点种于酪素培养基平皿和淀粉培养基平皿，每种培养基重复点种3次，37℃培养48h。
其中，酪素培养基组成：Na2HPO41.07g/L，KH2PO40.36g/L，干酪素4g/L，蒸馏水1000mL，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min。
淀粉培养基组成：蛋白胨10.0g/L，NaCl5g/L，牛肉膏5g/L，可溶性淀粉2g/L，蒸馏水1000mL，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min。
2、实验结果
在酪素培养基平皿上的菌落出现透明圈，说明菌株具有产蛋白酶能力。
在培养好的淀粉培养基平皿中滴加数滴碘-碘化钾染液，使染液均匀覆盖平皿，菌落出现透明圈，表明菌株具有产淀粉酶能力。
用公式Up＝(D/d)2来表示水解能力的大小，D为透明圈直径(mm)，d为菌落直径(mm)。
分别利用酪素培养基和淀粉培养基，测定了本发明菌株的产蛋白酶、淀粉酶能力，测定结果见表2。
表2产酶特性测定结果
酶 淀粉酶 蛋白酶
菌落直径(mm) 3.55±0.39 1.88±0.87
透明圈直径(mm) 7.68±0.42 17.20±0.62
水解能力(Up) 4.75±0.61 83.60±4.84
由表2可见，本发明巨大芽孢杆菌JD4产淀粉酶、产蛋白酶能力。
在相同条件下，本发明巨大芽孢杆菌JD4的产蛋白酶能力(83.60±4.84)远远高于已报道的巨大芽孢杆菌菌株(8.59±1.54)，能够高效降低有机质，可用于制备有机肥添加剂、饲料添加剂、水质改良剂等。
实施例3本发明有机肥添加剂的制备
一、制备菌种发酵液
1、菌种活化：无菌开启菌种管，无菌操作，将本发明本发明巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)菌种划线接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，28～37℃培养24～48h后，封口膜密封后4℃保存，备用；
2、种子菌悬液的制备：将活化的菌种接种至已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28～37℃，150～170rpm培养24～48h后，封口膜密封后4℃保存，备用；
3、筛选最适发酵培养基：
培养基A：葡萄糖4.0～5.0g/L，玉米干粉14.0～15.0g/L，氯化钠4.5～5.0g/L，pH6.8～7.2；
培养基B：葡萄糖20.0～25.0g/L，玉米干粉70.0～75.0g/L，氯化钠4.5～5.0g/L，pH6.8～7.2；
培养基C：葡萄糖40.0～50.0g/L，玉米干粉140.0～150.0g/L，氯化钠4.5～5.0g/L，pH6.8～7.2。
将不同发酵培养基以发酵瓶容积25％～30％(v/v)的装量装入发酵瓶中，121℃灭菌20min。
取步骤2的种子菌悬液，于28～37℃，150～170rpm震荡10min混匀后，测定种子菌悬液OD600吸光值为1.0～1.2，以发酵瓶中培养基体积的1.0％～5.0％(v/v)的接种量接入发酵瓶中，发酵瓶置于摇床中，28～37℃，150～170rpm培养72h，得到三种不同的发酵液。
二、菌种发酵液的性能测定
取三种发酵液，逐步梯度稀释法进行平板计数，统计菌落数，进行有效活菌数测定。
有效活菌数测定结果见表3。
表3浓缩发酵液中有效活菌数测定结果
由表3可见，三种培养基下发酵得到的发酵液中，以培养基B发酵得到的发酵液中巨大芽孢杆菌JD4有效活菌数最高，为11×109CUF/mL。
综上，三种菌种发酵液均含有蛋白酶、有效活菌，可作为有机肥添加剂使用。其中以培养基B发酵得到的发酵液中蛋白酶活力最高，有效活菌数最多，使用效果最佳。
实施例4本发明鸡粪有机肥的制备
一、有机肥的制备
1、原料预处理：
取新鲜鸡粪85～90g(新鲜鸡粪含水量53～60％，含有机质22.5％，含氮1.63％)、秸秆或菌渣10～15g，加入有机肥添加剂，混匀，得发酵原料混合物；
所述有机肥添加剂为实施例3中用培养基B发酵得到的发酵液0.075-0.1g，用水稀释1倍后使用。
2、堆肥发酵：
调节发酵原料混合物的水分含量为50～55％(w/w)，得待堆积混合物；
将待堆积混合物制成条剁，条剁宽度2.5～3.0米、高度0.7～1.4米，采用翻抛机翻堆增氧，翻堆3～4次，每次翻堆的时间为条剁中层温度达到55℃后静置48h。
3、腐熟保肥阶段：经一次发酵12d，堆肥腐熟，水分及体积减小，发酵条剁中层温度降低，稳定下降至30-40℃时，将其从发酵槽转运至后发酵车间。
4、堆肥后处理：采用自然风干、晾晒的等方法将水分降至30％以下，粉碎后，检测基础理化性质。
二、有机肥质量检测
有机肥中有机质含量、总养分(包括：氮、磷和钾)、水分及酸碱度的测定参照有机肥料NY525-2012的规定进行；蛔虫卵死亡率按GB/T19524.2的规定执行；粪大肠杆菌按GB/T19524.1的规定进行；重金属的测定按GB18877的规定进行。
检测结果显示：本发明有机肥中，有机质含量45％～53％、总养分含量≥5.5％(所述总养分包括全氮、全钾、全磷的总质量分数)、水分含量13％～30％、pH值为6.0～8.5，符合有机肥料的技术指标；另外，本发明有机肥的蛔虫卵死亡率98％～100％、粪大肠杆菌菌群数≤40个/g；所述有机肥中，在每千克干物质中，产品中的砷As、汞、铅、镉、铬均未超标，均符合肥料的质量标准。
因此，本发明有机肥有机质、养分含量高，病原菌清除彻底、重金属含量低，质量良好。
实施例5本发明猪粪有机肥的制备
一、有机肥的制备
1、原料预处理：取新鲜猪粪(经干湿分离后含水量60—65％，含有机质16％，含氮0.85％)90～93g、锯末或粉碎谷壳7～10g，加入有机肥添加剂，混匀，得发酵原料混合物；
所述有机肥添加剂为实施例3中用培养基B发酵得到的发酵液0.075-0.1g，用水稀释1倍后使用。
2、堆肥发酵：
调节发酵原料混合物的水分含量为55～65％(w/w)，得待堆积混合物；
将待堆积混合物制成条剁，条剁宽度3.0～3.5米、高度1.2～1.8米，采用翻抛机翻堆增氧，翻堆3～4次，每次翻堆的时间为条剁中层温度达到55℃后静置48h。
3、腐熟保肥阶段：当条剁堆肥的温度下降至30～40℃时，将其从发酵槽转运至后发酵车间。
4、堆肥后处理：采用自然风干、晾晒的等方法将水分降至30％以下，粉碎后，检测基础理化性质。
二、有机肥质量检测
有机肥中有机质含量、总养分(包括：氮、磷和钾)、水分及、酸碱度的测定参照有机肥料NY525-2012的规定进行；蛔虫卵死亡率按GB/T19524.2的规定执行；粪大肠杆菌按GB/T19524.1的规定进行；重金属的测定按GB18877的规定进行。
检测结果显示：本发明有机肥中，有机质含量≥55％、总养分含量≥5％(所述总养分包括全氮、全钾、全磷的总质量分数)、水分含量21％～28％、pH值为5.5～8.5，符合有机肥料的技术指标；另外，本发明有机肥的蛔虫卵死亡率98％～100％、粪大肠杆菌菌群数≤50个/g；所述有机肥中，在每千克干物质中，产品中的砷As、汞、铅、镉、铬均未超标，均符合肥料的质量标准。
因此，本发明有机肥有机质、养分含量高，病原菌清除彻底、重金属含量低，质量良好。
综上，本发明保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)，具有良好的产蛋白酶活力，能够高效降解有机物，可用于制备生物有机肥、饲料添加剂、水质改良剂。本发明制备的生物有机肥，有机质、养分含量高，应用前景良好。

Claims (10)

1.一种巨大芽孢杆菌，其特征在于：它是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)。
2.一种菌种发酵液的制备方法，其特征在于：步骤如下：
a、取保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)，接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28～37℃、150～170rpm培养24～48h，得到600nm下吸光值为1.0～1.2的种子菌悬液；
b、取步骤a制备的种子菌悬液，接种于巨大芽孢杆菌液体发酵培养基中，接种量为培养基体积的1.0～5.0％(v/v)，28～37℃，150～170rpm培养48～72h，即可；
其中，所述发酵培养基包括如下配比的组分：葡萄糖4.0～50.0g/L，玉米干粉14.0～150.0g/L，氯化钠4.5～5.0g/L。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基包括如下配比的组分：20.0～25.0g/L，玉米干粉70.0～75.0g/L，氯化钠4.5～5.0g/L；5和/或，所述发酵培养基的pH为6.8～7.2。
4.权利要求2或3所述方法制备得到的菌种发酵液。
5.保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)或权利要求4所述的菌种发酵液在制备有机肥添加剂、生物有机肥、饲料添加剂、水质改良剂中的用途。
6.一种生物有机肥，其特征在于：它是以保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)为发酵菌堆肥得到。
7.根据权利要求6所述的生物有机肥，其特征在于：堆肥时，接种包含保藏号：CCTCCNO：M2016033的巨大芽孢杆菌JD4(BacillusmegateriumJD4)的菌液；优选地，所述菌液为权利要求4所述的菌种发酵液。
8.根据权利要求6所述的生物有机肥，其特征在于，所述生物有机肥为畜禽粪便有机肥或秸秆有机肥；
优选地，所述生物有机肥为鸡粪、猪粪或秸秆堆肥。
9.根据权利要求7所述的生物有机肥，其特征在于，制备方法如下：
取含水量为53～60％的鸡粪85～90重量份、秸秆或菌渣10～15重量份、权利要求4所述的菌种发酵液0.075-0.1重量份，混匀，得发酵原料混合物；对发酵原料混合物堆积发酵；
优选地，所述堆积发酵的方法如下：
1)调节发酵原料混合物的水分含量为50～55％(w/w)，然后制成条剁；
2)对条剁进行翻堆3～4次，每次翻堆的时间为条剁中层温度达到55-60℃后静置48h；
3)当条剁中层温度下降至30-40℃时，取出，将堆肥水分降至30％以下，粉碎，即可。
10.根据权利要求7所述的生物有机肥，其特征在于，制备方法如下：
取含水量为60—65％的猪粪90～93重量份、锯末或粉碎谷壳7～10重量份、权利要求4所述的菌种发酵液0.075-0.1重量份，混匀，得发酵原料混合物；对发酵原料混合物堆积发酵；
优选地，所述堆积发酵的方法如下：
1)调节发酵原料混合物的水分含量为55～65％(w/w)，然后制成条剁；
2)对条剁进行翻堆3～4次，每次翻堆的时间为条剁中层温度达到55-60℃后静置48h；
3)当条剁中层温度下降至30-40℃时，取出，将堆肥水分降至30％以下，粉碎，即可。
CN201610081336.4A 2016-02-04 2016-02-04 一株新的巨大芽孢杆菌及其应用 Expired - Fee Related CN105543149B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610081336.4A CN105543149B (zh) 2016-02-04 2016-02-04 一株新的巨大芽孢杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610081336.4A CN105543149B (zh) 2016-02-04 2016-02-04 一株新的巨大芽孢杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105543149A true CN105543149A (zh) 2016-05-04
CN105543149B CN105543149B (zh) 2019-03-08

Family

ID=55822707

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610081336.4A Expired - Fee Related CN105543149B (zh) 2016-02-04 2016-02-04 一株新的巨大芽孢杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105543149B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107593769A (zh) * 2017-08-24 2018-01-19 暨南大学 巨大芽孢杆菌yjb3在促进植物生长和生防中的应用
CN109370944A (zh) * 2018-11-20 2019-02-22 江南大学 一株产蛋白酶的芽孢杆菌及其在堆肥中的应用
CN110172417A (zh) * 2019-05-07 2019-08-27 重庆科技学院 一株芽孢杆菌及其应用
CN114480181A (zh) * 2022-01-04 2022-05-13 山东蔚蓝生物科技有限公司 一株用于污泥堆肥除臭的巨大芽孢杆菌及其应用
CN114907152A (zh) * 2022-06-23 2022-08-16 河北冀微生物技术有限公司 巨大芽孢杆菌rl-126菌株在促进农作物秸秆腐熟中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030065948A (ko) * 2002-02-02 2003-08-09 동신건설 주식회사 오폐수처리에 적합한 미생물제제 및 이의 제조방법
CN103468613A (zh) * 2013-09-12 2013-12-25 江苏省苏微微生物研究有限公司 一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030065948A (ko) * 2002-02-02 2003-08-09 동신건설 주식회사 오폐수처리에 적합한 미생물제제 및 이의 제조방법
CN103468613A (zh) * 2013-09-12 2013-12-25 江苏省苏微微生物研究有限公司 一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J DEEPA ARUL PRIYA ET AL.: "Isolation, Purification and Characterisation of an Organic Solvent-Tolerant Ca2+-Dependent Protease from Bacillus megaterium AU02", 《APPL BIOCHEM BIOTECHNOL》 *
赵铭鑫等: "α-淀粉酶和蛋白酶高产菌株的诱变选育", 《烟草农学》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107593769A (zh) * 2017-08-24 2018-01-19 暨南大学 巨大芽孢杆菌yjb3在促进植物生长和生防中的应用
CN107593769B (zh) * 2017-08-24 2020-04-14 暨南大学 巨大芽孢杆菌yjb3在促进植物生长和生防中的应用
CN109370944A (zh) * 2018-11-20 2019-02-22 江南大学 一株产蛋白酶的芽孢杆菌及其在堆肥中的应用
CN109370944B (zh) * 2018-11-20 2020-09-04 江南大学 一株产蛋白酶的芽孢杆菌及其在堆肥中的应用
CN110172417A (zh) * 2019-05-07 2019-08-27 重庆科技学院 一株芽孢杆菌及其应用
CN110172417B (zh) * 2019-05-07 2023-04-21 重庆科技学院 一株芽孢杆菌及其应用
CN114480181A (zh) * 2022-01-04 2022-05-13 山东蔚蓝生物科技有限公司 一株用于污泥堆肥除臭的巨大芽孢杆菌及其应用
CN114907152A (zh) * 2022-06-23 2022-08-16 河北冀微生物技术有限公司 巨大芽孢杆菌rl-126菌株在促进农作物秸秆腐熟中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105543149B (zh) 2019-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101659934B (zh) 用于防除连作香蕉巴拿马枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料
CN109022327B (zh) 一种微生物混合菌剂的制备方法及在高温堆肥中的应用
CN101333510B (zh) 一种处理污泥制备生物有机肥料的方法及其专用发酵剂
CN105199962B (zh) 一种微生物秸秆腐熟剂及其制备方法和应用
CN102286376B (zh) 一种高效发酵床用微生物菌剂及其制备方法
CN105176881B (zh) 一种生产活性生物有机肥的工程菌剂及其生产活性生物有机肥的方法
CN102731177B (zh) 一种堆肥有机原料中有机污染物生物清消二步法
CN103937695B (zh) 一种处理畜禽养殖污水的复合生物菌剂及其制造方法
CN105543149B (zh) 一株新的巨大芽孢杆菌及其应用
CN109402015A (zh) 一株热噬淀粉芽孢杆菌及其应用
CN109293411A (zh) 微生物腐熟剂的制备方法及其在降低畜禽粪便抗生素残留中的应用
CN103896646A (zh) 一种微生物有机肥的制备方法
CN113773987B (zh) 一种提高有机废弃物好氧发酵效率的生物菌剂及其制备方法
CN103045511A (zh) 一株具有解磷解钾功能的产纤维素酶地衣芽孢杆菌及其应用
CN112375720A (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其应用
CN106854627A (zh) 一种促进亮斑扁角水虻幼虫生长的复合菌剂及应用
CN102851246B (zh) 一种嗜热栖热菌utm802及其应用
CN113773986B (zh) 一种用于冬季有机固废好氧发酵快速升温的菌剂及其制备方法
CN109957527A (zh) 一种直接分解农作物秸秆发酵产沼气的专用微生物复合菌剂制备及其应用方法
CN105754888A (zh) 地衣芽孢杆菌及微生物菌剂和它们在发酵床养殖中的应用
CN105886436A (zh) 用于降解植物纤维性废弃物的组合物或复合菌剂
CN105331553A (zh) 一种养殖和屠宰固体废弃物高温快速堆肥复合菌剂的制备方法
CN105037045A (zh) 一种大豆营养液及其制备方法和使用方法
CN108277187A (zh) 用于市政污泥高效生物干化的微生物菌剂
CN104560817A (zh) 一株产植酸酶的嗜热地衣芽孢杆菌utm102 及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190308