CN103468613A

CN103468613A - 一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法和应用

Info

Publication number: CN103468613A
Application number: CN2013104136932A
Authority: CN
Inventors: 孙梅; 匡群; 陈秋红; 夏飞; 高亮; 施大林; 张宪中; 何义进; 陈林; 刘俊美
Original assignee: WUXI CITY ANIMAL HUSBANDRY AND FISHERIES TECHNOLOGY EXTENSION STATION; WUXI ZUDAI FARMS Co Ltd; JIANGSU INSTITUTE OF SUWEI MICROBIOLOGY RESEARCH
Current assignee: WUXI CITY ANIMAL HUSBANDRY AND FISHERIES TECHNOLOGY EXTENSION STATION; WUXI ZUDAI FARMS Co Ltd; JIANGSU INSTITUTE OF SUWEI MICROBIOLOGY RESEARCH
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2033-09-12
Also published as: CN103468613B

Abstract

一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法和应用，属于微生物制剂技术领域。本发明一种巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）JSSW-JD-2F5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.8045。采用固体发酵，公开了巨大芽孢杆菌JSSW-JD-2F5固体发酵菌剂的制备方法，及该固体发酵菌剂的应用，用作畜禽渔业养殖饲料的添加剂，按质量百分比0.01%～0.05%的比例将菌剂添加入饲料中。该菌剂产品含有高浓度活菌、活性酶及生理活性物质，活菌浓度达1.0×10¹⁰CFU/g以上，能满足饲用微生物添加剂对活菌数的要求；该菌剂的应用不仅可改善养殖环境，而且对提高饲料利用率，促进动物生长具有重要意义，因此在畜禽渔养殖中应用广泛。

Description

一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法和应用

技术领域

本发明涉及一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法和应用，属于微生物制剂技术领域。

背景技术

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）属于芽孢杆菌属，它能依靠多种碳源生长，因而分布十分广泛。巨大芽孢杆菌分泌的多种酶系具有应用价值，如淀粉酶应用于面包生产，青霉素酰胺酶应用于合成新型人工抗生素等。另外,一些巨大芽孢杆菌能产生具有抑菌作用的蛋白质，可进一步提纯抑菌蛋白作为农用抗生素，或者克隆其编码基因用于抗真菌病害的转基因植物的研究等方面。可以说，巨大芽孢杆菌是一种具有多种功能的安全高效，无残留、无毒副作用的优良菌种。目前，在实际应用方面，巨大芽孢杆菌大多作为生产菌种用于生物有机肥的生产。

本专利涉及一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法，目前尚无巨大芽孢杆菌此方面的专利。目前巨大芽孢杆菌的生产主要采用液体发酵方法，例如专利CN101619302A 一种巨大芽孢杆菌的液体发酵工艺，需要全套的发酵罐装置，糖类、蛋白胨等精细原料，发酵原料和生产方式成本高，使得产品价格较贵，畜禽渔养殖用户难以接受；且液体产品运输和贮存上都不太方便，若要制备成固体菌剂则需要通过离心、过滤、吸附干燥等工序，工艺程序多；此外，目前市场上的巨大芽孢杆菌制剂主要用作生物肥料，应用领域较窄，且有效活菌数较低。

本发明中的巨大芽孢杆菌JSSW-JD-2F5具有丰富的酶系，如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶等，对有机物具有良好的同化利用能力；其优异的纤维素分解能力，使其能直接发酵利用麸皮、豆粕、食用菌菌糠等粗纤维含量高的农副产品，制备的固体发酵菌剂作为饲料添加剂，能提高饲料利用率，促进消化吸收，促进养殖动物生长，增强动物免疫力和抗病力，提高成活率；减少畜禽粪便中氮、磷及氨气、吲哚等有害气体排放，改善养殖生态环境；在水产养殖中应用，能分解水体中的残饵、水生生物排泄物及尸体等，改善水质，节水减排，提高水产动物免疫力、抗病力。此外，巨大芽孢杆菌JSSW-JD-2F5具有解磷作用，能降解一些顽固的难降解的杀虫剂和土壤中的有机磷，可以用来生产解磷固钾肥，对改善土壤环境具有十分重要的作用。

本发明采用固体发酵方法制备巨大芽孢杆菌菌剂，与巨大芽孢杆菌液体发酵相比，直接发酵麸皮、豆粕、食用菌菌糠等农副产品，不需要添加糖类、蛋白胨等精细原料，成本低廉，没有大量高浓度COD发酵废水排出，菌体生长过程中产生的活性酶及生理活性物质可以保留在菌剂中；发酵产量高，有效活菌浓度高，芽孢浓度高，且发酵后不需要离心、过滤、吸附等工序，直接干燥后即可使用，工艺简单；菌株酶系丰富、尤其是纤维素酶活力强，不仅可用作微生物饲料添加剂广泛应用于畜禽渔养殖中，还可以作为微生物解磷固钾肥、池塘水质改良剂等用于土壤、水体环境的改善。

麸皮、豆粕、菌糠等农副产品含有较丰富的碳水化合物、蛋白质、矿物质、维生素等营养成分，是良好的动物饲料来源，但其高纤维、低容量等特征限制了其在饲料资源方面的有效利用。本发明利用巨大芽孢杆菌的固体发酵过程提高对这些饲料原料中植物性纤维资源的降解及蛋白质的水解，代谢转化产生有益于动物机体的生物活性作用的小分子产物，更利于被动物肠道吸收利用，对动物生长起到促进作用。同时，益生菌以活菌形式进入肠道后，改变肠道微生物区系，产生的蛋白酶、淀粉酶等活性酶作用，促进对饲料原料的水解，提高氨基酸、矿物元素的吸收利用，从而提高动物生长或生产性能。因此，一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法和应用对综合循环利用农副产品资源，提高动物生长性能具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种巨大芽孢杆菌及其固体发酵制备菌剂的方法和应用。

本发明的技术方案：一种巨大芽孢杆菌，其分类命名为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）JSSW-JD-2F5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 8045，保藏日期2013年8月19日。

所述巨大芽孢杆菌JSSW-JD-2F5固体发酵菌剂的制备方法，步骤为：

（1）菌种活化：出发菌株为巨大芽孢杆菌JSSW-JD-2F5，无菌开启菌株JSSW-JD-2F5的冻干保藏菌种，划线接种于LB琼脂试管斜面，28～37℃培养36～48h，然后划线转接于LB琼脂茄子瓶斜面，28～37℃培养36～48h；镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即为成熟；

（2）种子菌悬液的制备：将成熟的种子用无菌水从斜面上刮洗下来，放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶，振荡分散菌泥，制成均匀的菌悬液，备用；

（3）固体发酵培养：

固体发酵培养基组成：按质量百分比计，食用菌菌糠5.0%～10.0%，麸皮15.0%～30.0%，豆粕1.0%～4.0%，CaO 0.05%～1.0%，自来水调节补足至100%；

将固体发酵培养基以发酵瓶容积计10%～20%（w/v）的装量装入发酵瓶中，并用八层纱布封口，121℃灭菌30min；将步骤（2）制备的菌悬液在80℃水浴中加热10 min，以固体发酵培养基质量计1.0%～10.0%（v/w）的接种量接入发酵瓶内灭菌的固体发酵培养基中，发酵瓶置于恒温培养箱，28～37℃培养，每隔12h拍打发酵瓶壁，使瓶中物料疏散、混匀，发酵培养36～48h，取样镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即发酵结束；

（4）巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂的制备：将步骤（3）所得含巨大芽孢杆菌活菌的发酵产物在40～50℃下烘干，粉碎机粉碎，过40目筛，即制得巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂成品，以系列稀释法进行平板计数，芽孢浓度不低于1.0×10¹⁰CFU/g。

用所述方法制备的巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂的应用，用作畜禽渔业养殖饲料的添加剂，将巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂按质量百分比0.01%～0.05%的比例添加入饲料中。

本发明的有益效果：

1、巨大芽孢杆菌JSSW-JD-2F5菌株酶系丰富，具有淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶活性，尤其是纤维素酶活力强。

2、本发明中巨大芽孢杆菌的固体发酵方法与现有的巨大芽孢杆菌液体发酵方法相比，直接发酵麸皮、豆粕、食用菌菌糠等农副产品，不需要添加糖类、蛋白胨等精细原料，成本低廉，没有大量高浓度COD发酵废水排出，菌体生长过程中产生的活性酶及生理活性物质可以保留在菌剂中，且发酵后不需离心、过滤、吸附等工序，直接干燥后即可使用，工艺简单。

3、发酵时间短，发酵产量高，发酵36～48h即可获得高浓度的有益活菌和芽孢。

4、菌剂产品中含有高浓度活菌、活性酶及生理活性物质，活菌浓度达1.0×10¹⁰CFU/g以上，能满足饲用微生物添加剂对活菌数的要求；将巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂应用于畜禽渔养殖中，不仅可改善养殖环境，而且对提高饲料利用率，促进动物生长具有重要意义，因此在畜禽渔养殖中应用广泛。

生物材料样品保藏：一种巨大芽孢杆菌，其分类命名为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）JSSW-JD-2F5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO. 8045，保藏日期为2013年8月19日。

菌株巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）JSSW-JD-2F5的形态特征为：柱状到椭圆，单个或呈短链排列，（1.2～1.5）×（2.0～4.0）微米，能运动，革兰氏阳性，芽孢（1.0～1.2）×（1.5～2.0）微米，椭圆形，中生或次端生。菌落圆形或不规则形，奶油色，可光滑，可起皱褶。

菌株JSSW-JD-2F5的细胞形态和生理生化特征见表1：

表1 JSSW-JD-2F5的细胞形态和生理生化特征

16SrRNA基因序列测定结果见SEQ ID NO: 1；

gyrB基因序列测定结果SEQ ID NO: 2。

附图说明

图1 巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂对猪舍氨气浓度的影响。

具体实施方式

实施例1：巨大芽孢杆菌JSSW-JD-2F5的产酶特性测定

（1）菌种活化：

无菌开启菌株JSSW-JD-2F5的冻干保藏菌种，划线接种于LB琼脂试管斜面，30℃培养40h，然后划线转接于LB琼脂茄子瓶斜面，30℃培养40h。镜检，90%以上菌体已形成芽孢，得成熟种子。

（2）产酶特性测定

用接种针取少量上述步骤（1）中菌种分别点种于淀粉水解培养基平皿、酪素培养基平皿、纤维素培养基平皿和脂肪酶培养基平皿，每种培养基重复点种3次，30℃培养24h。在培养好的淀粉水解培养基平皿上，滴加少量卢哥氏碘液，轻摇，使碘液均匀覆盖平皿，菌落周围出现透明圈，说明菌株具有产淀粉酶能力；在酪素培养基平皿上的菌落周围出现透明圈，说明菌株具有产蛋白酶能力；在纤维素培养基平皿上的菌落周围出现透明圈，说明菌株具有产纤维素酶能力；用公式Up=(D/d)²来表示水解能力的大小，D为透明圈直径（mm），d为菌落直径（mm）；脂肪酶培养基平皿底部出现红色小球，说明脂肪被水解，为阳性反应，记为“+”，否者为阴性，记为“-”。

淀粉水解培养基（g/L）：蛋白胨 10.0，NaC1 5.0，牛肉膏 3.0，可溶性淀粉 2.0，琼脂粉 15.0，pH 7.0～7.2。

酪素培养基：取5.0 g脱脂奶粉溶于50.0 mL蒸馏水中，另称1.5 g琼脂粉溶于50.0 mL蒸馏水中，将两液分开灭菌，待冷至45～50℃时，将两液混匀倒平皿。

纤维素培养基（g/L）：K₂HPO₄0.5，MgSO₄·7H₂O 0.25，CMC-Na 1.88，刚果红 0.2，琼脂粉 15.0，明胶 2.0，pH 7.0。

油脂水解培养基（g/L）：蛋白胨 10.0，NaCl 5.0，牛肉膏 3.0，植物油 10.0，1.6%中性红水溶液1.0 mL，琼脂粉 15.0，pH 7.2～7.4。

产酶特性测定结果如下：

表2 产酶特性测定结果

注：结果以平均值±标准差表示。

由表2可见，巨大芽孢杆菌JSSW-JD-2F5在淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶鉴别培养基上均产生分解圈，24h淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶透明圈与菌落大小比分别为5.81、8.59、31.63，产酶能力由大到小依次是纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶；脂肪酶培养基平皿底部24h出现红色小球，说明脂肪被水解。结果显示，巨大芽孢杆菌JSSW-JD-2F5具有较强的淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶活性，纤维素酶活性尤为显著。它的这一特性使其对有机物具有良好的分解能力，在提高饲料蛋白质和能量的利用率以及改善水体、土壤生态环境方面具有潜在的应用价值。

实施例2：巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂的制备

（1）菌种活化：

（2）种子菌悬液的制备：将成熟的种子用无菌水从斜面上刮洗下来，放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶，振荡分散菌泥，制成均匀的菌悬液，备用。

（3）固体发酵培养：将固体发酵培养基以10%(w/v)的装量装入发酵瓶中，并用八层纱布封口，121℃灭菌30min；将（2）中菌悬液在80℃水浴中加热10 min，以2%（v/w）的接种量接入灭菌的固体发酵培养基中，每隔12h拍打发酵瓶壁，使瓶中物料疏散、混匀，30℃发酵培养46h，取样镜检，90%以上菌体已形成芽孢，发酵结束。

固体发酵培养基组成：按质量百分比计，杏鲍菇菌糠8.0%，麸皮20.0%，豆粕2.0%，CaO 0.5%，用自来水补足100%。

（4）巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂的制备：将含巨大芽孢杆菌活菌的发酵产物在45℃下低温干燥24h，粉碎机粉碎，过40目筛，即制得巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂成品，以系列稀释法进行平板计数，活菌数浓度为2.2×10¹⁰CFU/g，芽孢率为90.9%，水分含量6.0%。

应用实施例1：巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂饲喂太湖鸡

试验选择出生重相近的1日龄健康太湖鸡300只，随机分为对照组和试验组2组，每组3个平行，每个平行50只鸡，分别于同一养殖大棚内地面平养。对照组，只饲喂基础日粮，不添加巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂，试验组在基础日粮中添加0.05%(w/w)的巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂。在开食前各组全部称出出生重量，出生后24h开食，将巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂和饲料充分混匀后饲喂。试验从1日龄开始，试验期56天，每周称重1次，到8周龄时，试验数据用单因子方差分析进行差异显著性检验，结果如下：

表3 巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂对太湖鸡生长的影响

注：结果以平均值±标准差表示，同列数据肩标字母相同表示差异不显著（P>0.05），同列数据肩标字母不同表示差异显著（P<0.05）。

由表3结果可见，试验组与对照组比较，试验组比对照组平均增重提高16.3%，料重比降低13.1%，存活率提高，且差异显著（P<0.05）。以上结果表明，在太湖鸡饲料中添加巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂能促进太湖鸡的生长发育，它具有提高增重，提高饲料转化率，降低料重比，提高存活率的作用。因此，该巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂能够作为生长促进剂使用。

应用实施例2：巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂饲喂猪

将120头健康保育猪随机分为对照组和试验组2组，每组3个平行，每个平行20头猪，对照组，只饲喂基础日粮，不添加巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂，试验组在基础日粮中添加0.03%(w/w)的巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂。猪舍采用物联网传感器对温度、二氧化碳及臭味物质氨气进行连续监测，取每天8:00的监测数据进行比较。试验结果如图1所示。

图1结果可见：饲喂10d后，试验组比对照组氨气浓度减少33.3%，表明巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂具有降低猪舍臭味物质氨气浓度的作用。

应用实施例3：巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂对渔产品养殖水的作用

分别将水库水、鱼塘水、螃蟹池塘水装入50L的塑料水桶中，每个水桶装40L水，向水桶中分别添加0.01%(w/v)巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂，未添加菌剂的水体作为对照，每组做3个平行。试验地点通风、阳光充足，每天上午8:00测量水体温度，水体平均温度在20～25℃范围内。各水桶环境条件基本一致。每天取样，用美国哈希公司DR2800分光光度计检测3种养殖水体中的亚硝酸盐、氨氮浓度，观察水中亚硝酸盐、氨氮的变化情况。

试验结果可见：随着试验时间的延长，试验组水体中的亚硝酸盐、氨氮浓度均明显降低，处理7d后，水库水、鱼塘水、螃蟹池塘水中亚硝酸盐浓度分别降低95.6%、98.3%、72.5%，氨氮浓度分别降低21.4%、23.1%、27.9%，而对照组的亚硝酸盐、氨氮浓度均未见降低，甚至稍有上升趋势。这表明巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂在上述3种水体中均具有较强的降解亚硝酸盐、氨氮的作用。

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 1442

<212> 16SrRNA基因序列测定结果

atcatctgtc ccaccttagg cggctagctc cttacggtta ctccaccgac ttcgggtgtt 60

acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 120

atgctgatcc gcgattacta gcgattccag cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc 180

cgaactgaga atggttttat gggattggct tgacctcgcg gtcttgcagc cctttgtacc 240

atccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 300

caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca ccttagagtg cccaactaaa tgctggcaac 360

taagatcaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 420

gacaaccatg caccacctgt cactctgtcc cccgaagggg aacgctctat ctctagagtt 480

gtcagaggat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa acccacatgc 540

tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc 600

ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt 660

agcactcatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccacgct 720

ttcgcgcctc agcgtcagtt acagaccaaa aagccgcctt cgccactggt gttcctccac 780

atctctacgc atttcaccgc tacacgtgga attccgcttt tctcttctgc actcaagttc 840

cccagtttcc aatgaccctc cacggttgag ccgtgggctt tcacatcaga cttaagaaac 900

cgcctgcgcg cgctttacgc ccaataattc cggataacgc ttgccaccta cgtattaccg 960

cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtacgagcag 1020

ttactctcgt acttgttctt ccctaacaac agagttttac gacccgaaag ccttcatcac 1080

tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc 1140

ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct 1200

atgcatcgtt gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcacc gcgggcccat 1260

ctgtaagtga tagccgaaac catctttcaa tcatctccca tgaaggagaa gatcctatcc 1320

ggtattagct tcggtttccc gaagttatcc cagtcttaca ggcaggttgc ccacgtgtta 1380

ctcacccgtc cgccgctaac gtcataggaa gcaagcttct aatcagttcg ctcgacttgc 1440

at 1442

<210> SEQ ID NO: 2

<211> 800

<212> gyrB基因序列测定结果

atgggcagac tgccgttgag ttatcttacg gttcttcatg ccggaggtaa atttggcggc 60

ggcggctata aagtatccgg tggattacac ggtgtaggtg cctcagttgt taacgcgctt 120

tctacctctt tggaagtgca cgtacatcgt gatggtaaag ttcattatca aaaatatgaa 180

cgaggtgtac cggcagctga cttaaaagta gttggagaaa cagataaaac aggtactgtt 240

attcaattcc atccagacgg tgaaattttt acagaaacgc tggaatacga ttttgatacg 300

ttagctaatc gtctgcgtga gttagctttc ttaaatcgcg gcattaaaat cacgattgaa 360

gacaaacgtg aagaagataa aagacgtgaa taccactatg aaggcgggat taagtcttac 420

gttgaacact taaaccgttc aaaagaagtg attcacgaag agccgatcta tattgaaggt 480

aatcgagaca acatttctgt agaaattgct attcaatata acgatagcta tacaagtaat 540

ttatattctt ttgcaaacaa cattcacaca tatgaaggtg gaacgcacga agcaggattt 600

aaaacagcgt taacgcgtgt aattaacgac tatgcacgta aaaacagcgt atttaaagac 660

agtgacgcca atctaacggg tgaagatgtt cgtgaaggaa ttacagctat catctctatt 720

aagcacccag atccgcagtt tgaaggacaa acaaaaacaa agctgggaaa tagtgaagca 780

agaacaatta ctgactctgt 800

Claims

1.一种巨大芽孢杆菌，其分类命名为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）JSSW-JD-2F5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 8045。

2.权利要求1所述巨大芽孢杆菌JSSW-JD-2F5固体发酵菌剂的制备方法，其特征在于步骤为：

（3）固体发酵培养：

将固体发酵培养基以发酵瓶容积计w/v 10%～20%的装量装入发酵瓶中，并用八层纱布封口，121℃灭菌30min；将步骤（2）制备的菌悬液在80℃水浴中加热10 min，以固体发酵培养基质量计v/w 1.0%～10.0%的接种量接入发酵瓶内灭菌的固体发酵培养基中，发酵瓶置于恒温培养箱，28～37℃培养，每隔12h拍打发酵瓶壁，使瓶中物料疏散、混匀，发酵培养36～48h，取样镜检，当90%以上菌体形成芽孢时，即发酵结束；

3.用权利要求2所述方法制备的巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂的应用，其特征在于用作畜禽渔业养殖饲料的添加剂，将巨大芽孢杆菌固体发酵菌剂按质量百分比0.01%～0.05%的比例添加入饲料中。