CN103865826A

CN103865826A - 一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法

Info

Publication number: CN103865826A
Application number: CN201210544003.2A
Authority: CN
Inventors: 李淘洪; 周来薪
Original assignee: Chongqing Jianghe Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Chongqing Cody biological organic fertilizer Co., Ltd.
Priority date: 2012-12-15
Filing date: 2012-12-15
Publication date: 2014-06-18
Anticipated expiration: 2032-12-15
Also published as: CN103865826B

Abstract

本发明提出了一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法。它以枯草芽孢杆菌为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养，所述发酵培养时添加有促芽孢生成培养基。与现有技术相比，本发明的有益效果是枯草芽孢杆菌是一种应用非常广泛的环保微生物，本发明通过对培养基配方及培养条件的改进，为提高枯草芽孢杆菌的工业化发酵生产率、提高产品有效率和延长产品保持期提供了必要条件，添加促芽孢杆菌生产培养基后，枯草芽孢杆菌芽孢率显著提高，达到95％以上，比目前普遍收获期的80％芽孢率高出15％左右，显著的提高了生产率。

Description

一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法

技术领域

本发明涉及一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种产芽孢的G+细菌，其菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，抑制其它致病菌生长；刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力；能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。对人或动植物没有致病性，兼有生物治病和生物保健作用，已广泛应用于农业、畜牧业及污水废水处理等领域。我国农业部将其列为免做安全鉴定的一级菌种。

枯草芽孢杆菌是一种可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。枯草芽孢杆菌对水产中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害细菌有很强的抑制作用，有效预防水产动物肠炎，烂鳃等疾病。分泌大量几丁质酶的功能，几丁质酶可分解病原真菌的细胞壁而抑制真菌病害，分解养殖池中的有毒有害物质，净化水质；分解池中残饵、粪便、有机物等,具有很强的清理水中垃圾小颗粒的作用；枯草芽孢杆菌改善有害蓝藻泛溢造成的水质浑浊问题，水质由浑变清，具有很强的净化水质功能，具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分；枯草芽孢杆菌可以减少对虾病害发生，可以大大提高对虾产量，从而提高经济效益，生物环保，刺激水产动物免疫器官的发育，增强机体免疫力；减少对虾病害发生，明显提高对虾产量，从而提高经济效益，净化水质，无污染，无残留。

传统水产养殖业中对于水质净化这个领域，使用物理过滤净化的化学物质净化是主要方法，费时费力，对经济能力的要求也很高，同时两种方法不能从根本上解决水质污染的问题，只是把浸染物以另一种形式“贮存”，属于治标不治本的做法。枯草芽孢杆菌用于水质净化，其作用机理就是达到治本的目的，分解降解水体中有毒有害物质的同时，抑制水中有害细菌、藻类生长的，达到彻底净化水质预防水产病害的效果。因此，枯草芽孢杆菌是极具开发前景和应用价值的有用细菌。

目前国内对枯草芽孢杆菌的研究主要集中在菌种的筛选、分离鉴定、抑菌效果、发酵液化学成分的分析、一般培养基的制作，而对于枯草芽孢杆菌的发酵培养方面报道甚少，关于芽孢率的报道更少，现有的培养方法其芽孢率一般为80%左右，其生产率不够理想，人们一直在为提高芽孢率致力研究。

发明内容

本发明提出了一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，解决了现有技术中的不足，通过在发酵培养中加入促芽孢生成培养基，提高了培养的芽孢率。

本发明的技术方案是这样实现的：一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，它以枯草芽孢杆菌为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养，所述发酵培养时添加有促芽孢生成培养基。

其中，所述活化采用的培养基由以下重量百分比的原料组成：牛肉膏0.1-0.5％、蛋白胨0.5-1.5％、葡萄糖0.5-1.5％、氯化钠0.3-0.7％、琼,1-3％，蒸馏水为余量。

进一步的，所述活化采用的培养基由以下重量百分比的原料组成：牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、葡萄糖1.0％、氯化钠0.5％、琼脂2.0％，蒸馏水93.2%。

更进一步的，所述活化培养的条件为：调整PH值7.0-7.2，温度为36.5-37℃，活化20-24h。

其中，所述发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：葡萄糖1.4-1.8％、淀粉0.18-0.26％、豆粕2.8-3.2%、硫酸锰0.05-0.15％、磷酸氢二钾0.25-0.35％、磷酸二氢钾0.1-0.2％、硫酸镁0.02-0.07％、酵母膏0.019-0.025％、氯化铁0.05-0.015％、碳酸钙0.005-0.015％、水为余量。

进一步的，所述发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：葡萄糖1.6％、淀粉0.22％、豆粕3.0%、硫酸锰0.1％、磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、酵母膏0.022％、氯化铁0.01％、碳酸钙0.01％、水94.538%。

更进一步的，所述发酵培养的条件为：pH7.0-7.2；培养温度36.5-37℃、转速190-200r/min、装液量130-150mL/250mL；接种量为10%（v/v），培养时间17-20h。

其中，所述促芽孢生成培养基的添加量按枯草芽孢杆菌体积的0.5%添加，添加进发酵罐的时间为发酵培养开始7-11小时之间。

其中，所述促芽孢生成培养基由以下重量份的原料组成：土壤浸出液800-1200份、牛肉膏7-10份、蛋白胨6-9份、琼脂25-30份。

进一步的，所述促芽孢生成培养基由以下重量份的原料组成：：土壤浸出液900-1100份、牛肉膏8-9份、蛋白胨7-8份、琼脂26-28份。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：枯草芽孢杆菌是一种应用非常广泛的环保微生物，本发明通过对培养基配方及培养条件的改进，为提高枯草芽孢杆菌的工业化发酵生产率、提高产品有效率和延长产品保持期提供了必要条件，添加促芽孢杆菌生产培养基后，枯草芽孢杆菌芽孢率显著提高，达到95％以上，比目前普遍收获期的80％芽孢率高出15％左右，显著的提高了生产率。

具体实施方式

下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中的几个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，它以5L的枯草芽孢杆菌为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养，所述发酵培养时添加有促芽孢生成培养基。

（1）活化培养：

活化采用的培养基由以下原料组成：牛肉膏200g、蛋白胨700g、葡萄糖300g、氯化钠300g、琼脂750g，蒸馏水为47750g。

活化培养的条件为：调整PH值7.0，温度为36.5℃，活化21h。

（2）发酵培养：

将活化后的枯草芽孢杆菌接种到发酵培养基中培养，在发酵培养开始9小时时添加促芽孢生成培养基。

所述发酵培养基由以下原料组成：葡萄糖700g、淀粉125g、豆粕400g、硫酸锰75g、磷酸氢二钾125g、磷酸二氢钾100g、硫酸镁15g、酵母膏12.5g、氯化铁40g、碳酸钙2.5g、水为48405g。

所述促芽孢生成培养基由以下原料组成：土壤浸出液23.8g、牛肉膏0.2g、蛋白胨0.2g、琼脂0.8g。

发酵培养的条件为：pH7.2；培养温度37℃、转速198r/min、装液量130mL/250mL；接种量为10%（v/v），培养时间18h，然后整个培养过程结束。

培养结束时其芽孢率为95.0%。

实施例2：

（1）活化培养：

活化采用的培养基由以下原料组成：牛肉膏150g、蛋白胨500g、葡萄糖500g、氯化钠250g、琼脂1000g，蒸馏水46600g。

活化培养的条件为：调整PH值7.2，温度为37℃，活化24h。

（2）发酵培养：

将活化后的枯草芽孢杆菌接种到发酵培养基中培养，在发酵培养开始10小时时添加促芽孢生成培养基。

所述发酵培养基由以下原料组成：葡萄糖800g、淀粉110g、豆粕1500g、硫酸锰50g、磷酸氢二钾150g、磷酸二氢钾75g、硫酸镁25g、酵母膏11g、氯化铁5g、碳酸钙5g、水47269g。

所述促芽孢生成培养基由以下原料组成：：土壤浸出液24.18g、牛肉膏0.03g、蛋白胨0.19g、琼脂0.60g。

所述发酵培养的条件为：pH7.2；培养温度37℃、转速200r/min、装液量150mL/250mL；接种量为10%（v/v），培养时间20h，然后整个培养过程结束。

培养结束时其芽孢率为95.2%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：它以枯草芽孢杆菌为菌种，经活化后接种到发酵培养基中培养，所述发酵培养时添加有促芽孢生成培养基。

2.根据权利要求1所述的一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述活化采用的培养基由以下重量百分比的原料组成：牛肉膏0.1-0.5％、蛋白胨0.5-1.5％、葡萄糖0.5-1.5％、氯化钠0.3-0.7％、琼脂1-3％，蒸馏水为余量。

3.根据权利要求2所述的一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述活化采用的培养基由以下重量百分比的原料组成：牛肉膏0.3％、蛋白胨1.0％、葡萄糖1.0％、氯化钠0.5％、琼脂2.0％，蒸馏水93.2%。

4.根据权利要求2或3所述的一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述活化培养的条件为：调整PH值7.0-7.2，温度为36.5-37℃，活化20-24h。

5.根据权利要求1所述的一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：葡萄糖1.4-1.8％、淀粉0.18-0.26％、豆粕2.8-3.2%、硫酸锰0.05-0.15％、磷酸氢二钾0.25-0.35％、磷酸二氢钾0.1-0.2％、硫酸镁0.02-0.07％、酵母膏0.019-0.025％、氯化铁0.05-0.015％、碳酸钙0.005-0.015％、水为余量。

6.根据权利要求5所述的一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述发酵培养基由以下重量百分比的原料组成：葡萄糖1.6％、淀粉0.22％、豆粕3.0%、硫酸锰0.1％、磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、酵母膏0.022％、氯化铁0.01％、碳酸钙0.01％、水94.538%。

7.根据权利要求5或6所述的一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为：pH7.0-7.2；培养温度36.5-37℃、转速190-200r/min、装液量130-150mL/250mL；接种量为10%（v/v），培养时间17-20h。

8.根据权利要求1所述的一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述促芽孢生成培养基的添加量按枯草芽孢杆菌体积的0.5%添加，添加进发酵罐的时间为发酵培养开始7-11小时之间。

9.根据权利要求1所述的一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述促芽孢生成培养基由以下重量份的原料组成：土壤浸出液800-1200份、牛肉膏7-10份、蛋白胨6-9份、琼脂25-30份。

10.根据权利要求9所述的一种高密度培养高芽孢率枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述促芽孢生成培养基由以下重量份的原料组成：土壤浸出液900-1100份、牛肉膏8-9份、蛋白胨7-8份、琼脂26-28份。