CN102433283A - 一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺及其制备的菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺及其制备的菌剂和应用，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的保藏编号为ACCC10619，其在液体深层发酵培养，经浓缩，再吸附、干燥，生产一种高浓度的枯草芽孢杆菌粉剂。生产工艺简单，工艺控制便利，生产成本低；以粉剂形式添加到饲料中，贮存、运输使用方便；货架期延长，且活性稳定，无污染，用于猪、鸡饲料，提高动物生产性能。

Description

一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺及其制备的菌剂和应用

技术领域

本发明涉及枯草芽孢杆菌ACCC10619高密度发酵生产的工艺，以及制备得到的菌剂和该菌剂的应用方法。

背景技术

实践证明，随着抗生素饲料添加剂的使用，在抑制病原菌的同时，也抑制了动物消化道内的正常菌群，破坏了菌群的微生态平衡，使得致病菌大量增殖，引发二重感染或内源性感染；其次，抗生素的频繁大量使用，引起耐药菌株的产生，增加动物的易感性，造成免疫机能减退而引发胃肠道疾病及其由此造成的环境污染；此外，抗生素的残留也极大的威胁着人类健康，其防病、治病的效果越来越不理想。

随着抗生素的广泛使用，其导致的耐药性和残留问题日益凸现出来，引起了科学工作者和广大消费者的共同关注。因此，各国纷纷通过立法手段禁止或限制使用抗生素，研发出能替代抗生素的新型饲料添加剂成为发展的必然趋势。微生物饲料添加剂因其安全性、无毒、无残留及有利于生态环境的可持续发展成为抗生素替代品的首选，而芽孢杆菌是微生态制剂中应用最广泛的一种微生态制剂。

已有研究表明，芽孢杆菌在不利环境条件下能够以孢子形式存在，在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持较高的活性，在改善畜禽生产性能、维持肠道菌群平衡、提高消化率等方面均有较好的效果。

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)可产生多种抗菌素及多种酶类，是目前应用较广泛的芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌可以调节动物消化道的微生态平衡、促进消化道酶的活性，以致减少有害菌群对机体的侵害、增强消化吸收。该制剂在国内外均被允许用于饲料添加剂。

芽孢杆菌在液体存放时，需要添加防腐剂，且保质期短，易产生恶臭气味，在饲料加工生产中添加不方便。采用液体发酵后直接吸附干燥，需要大量吸附剂及干燥设施，生产上比较麻烦。

目前，关于枯草芽孢杆菌ACCC10619的高密度生产工艺尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺，以及制备得到的菌剂和该菌剂的应用方法。

一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的保藏编号为ACCC10619；具体包括以下步骤：

1)将经过斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养，然后进行摇瓶发酵培养；所述摇瓶发酵培养条件为：接种量为培养基体积的1～5％，500ml摇瓶中培养基的装量为50～200ml；发酵温度28～34℃，pH值6.8～7.5，摇床转数180～250rpm，培养18～24h；所述发酵培养基由如下质量组分组成：葡萄糖0.5～0.8％、淀粉0.2～0.4％、豆饼粉1～2％、2.2～4.0％硫酸锰0.1～0.3％、磷酸氢二钾0.15～0.45％、磷酸二氢钾0.1～0.2％、硫酸镁0.03～0.06％、酵母粉0.5～1.5％、蛋白胨0.4～0.8％、氯化铁0.005～0.015％、碳酸钙0.05～0.15％，补充水至100％，pH值6.8～7.5；

2)发酵罐发酵条件为：培养基装液量占发酵罐体积的40-70％，接种占培养基体积的1-5％的摇瓶发酵液，发酵温度28-35℃，，通气量1∶0.4～0.7(1立方的发酵液每分钟通气量为0.4～0.7立方)，搅拌转数180～250r/min，发酵时间18～24h。

所述的摇瓶发酵培养条件优选为发酵温度30℃，pH值7.0，摇床转数220rpm；所述发酵培养基优选由如下质量组分组成，葡萄糖0.5％、淀粉0.3％、豆饼粉1.5％、3.08％硫酸锰0.2％、磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、酵母粉1.0％、蛋白胨0.5％、氯化铁0.01％、碳酸钙0.1％，补充水至100％，pH值7.0；发酵罐发酵条件优选为培养基装液量占发酵罐体积的50％，接种占培养基体积3％的摇瓶发酵液，接种时间18h，发酵温度30℃，通气量1∶0.5，搅拌转数220r/min，发酵时间22h。所述的发酵罐发酵完成时，含菌数不低于128×10⁸CFU/ml。

本发明所用的斜面活化培养基，种子摇瓶培养基，摇瓶发酵培养基和发酵罐培养基在使用之前均经过高温灭菌(121℃，30mins)。

一种饲用枯草芽孢杆菌菌剂，是将上述的生产工艺中发酵罐发酵得到的枯草芽孢杆菌发酵液离心，收集菌泥；将菌泥与麦麸混合吸附，吸附后干燥，粉碎制备而成。具体是将所述的发酵罐发酵得到的枯草芽孢杆菌发酵液在离心机3000～5000rpm高速离心10～20min，收集菌泥；将菌泥与麦麸按1∶10～100质量比吸附，吸附后60～80℃干燥1～6h，粉碎到不小于60目制备而成。优选将所述枯草芽孢杆菌发酵液在离心机4000rpm高速离心15min，收集菌泥，将菌泥与麦麸按1∶10质量比吸附，吸附后60℃干燥1h，粉碎。

上述的饲用枯草芽孢杆菌菌剂用于制备抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌的制剂。具体是将菌剂添加到饮水或饲料中。所述的菌剂在养殖动物饲料中添加量满足含菌数为10⁸～10¹⁰CFU/kg(优选10¹⁰CFU/kg)饲料。所述养殖动物为猪或鸡。本发明枯草芽孢杆菌ACCC10619斜面活化(培养基牛肉膏0.3～0.5％，氯化钠0.5～1.0％，蛋白胨0.5～1.0％，补充水至100％；pH 6.8～7.5，置于30～34℃生化培养箱培养18～24h)，接种一接种环到100ml种子液中，进行种子摇瓶培养，温度30℃，摇床转数220r/min，时间18～24h。

种子摇瓶培养基为牛肉膏0.3～0.5％，氯化钠0.5～1.0％，蛋白胨0.5～1.0％，水加至100％；pH 6.8～7.5

优选地，种子摇瓶培养基为牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，蛋白胨1.0％，水加至100％；pH 7.0。

本发明枯草芽孢杆菌ACCC10619益生性的检验方法如下：

采用牛津杯法对抑菌试验菌株的效果进行检测。在直径9cm的灭菌平皿中，注入15ml灭菌好的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，使其冷却凝固，作为底层。分别在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，接种活化好的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、副伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌等(4种指示菌)，于恒温培养箱37℃培养24h，采用平板活菌计数法进行活菌计数后，将指示菌液进行10倍梯度稀释，自稀释度为10^-6～10^-7的指示菌稀释液中，分别取0.2ml指示菌悬液加入培养基中，摇匀，另加入5ml放冷至50℃的培养基，在底层上均匀混合，作为菌层，置于37℃干燥冷却30min，待其充分凝固。在无菌条件下，分别将灭菌后的不锈钢牛津杯(外径8mm，内径6mm)放置于培养基表面，每个培养基平板中等距放置3个牛津杯，用无菌移液管分别吸取等量上述试验培养好的试验菌菌液，加满牛津杯，每个试验菌做3个重复，于37。C恒温培养箱中培养24h，用游标卡尺准确测量抑菌圈的直径，计算其平均值。抑菌圈的大小与抑菌活性的强弱呈正相关，根据形成抑菌圈的大小可以判断试验菌抑菌活性的强弱，检测不同指示菌对抑菌物质的敏感性。有结果可知，枯草芽孢杆菌ACCC10619对大肠杆菌的抑菌圈直径为15.77mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为15.37mm，对副伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径为12.90mm，对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈直径为12.41mm。

本发明的有益效果在于：

本发明选用的枯草芽孢杆菌ACCC10619(菌种购自中国农业微生物菌种保藏管理中心)具有显著的益生性，可显著抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌等致病菌的生长繁殖。

本发明选用的枯草芽孢杆菌ACCC10619具有较强的抗逆性，能耐受95℃水浴10min后，成活率为90％以上。由于饲料加工制粒过程中，温度较高，可达80～90℃，因此动物需耐受这个范围的高温，才能保证微生态菌株的有效性，动物吃到的是活菌。

本发明选用的枯草芽孢杆菌ACCC10619经过本发明特有的液体发酵后，菌密度明显增加，再经过离心、吸附、干燥粉碎后，以粉剂形式添加到饲料中，减少工作量，降低成本，生产中使用方便，货架期延长。

本发明制备的的枯草芽孢杆菌ACCC10619菌剂添加到饲料中，进入动物肠道后，迅速活化、增殖，并同时在肠道微生物环境下形成优势菌群。

本发明制备的的枯草芽孢杆菌ACCC10619菌剂添加到饲料中，动物食用后具有显著益生性和抗逆性，具有提高动物生产性能，减少动物的病害率，降低死淘率。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：

1、本发明枯草芽孢杆菌ACCC10619斜面活化(培养基牛肉膏0.3～0.5％，氯化钠0.5～1.0％，蛋白胨0.5～1.0％，补充水至100％；pH 6.8～7.5，置于30～34℃生化培养箱培养18～24h)，接种一接种环到100ml种子液中，进行种子摇瓶培养；温度30℃，摇床转数220r/min，时间18～24h。

种子摇瓶培养基为牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，蛋白胨1.0％，加水至100％，pH 7.0。

2、将经过斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养，然后进行摇瓶发酵培养；摇瓶发酵培养条件为发酵温度30℃，pH值7.0，摇床转数220rpm；培养18h。发酵培养基由如下组分组成，葡萄糖0.5％、淀粉0.3％、豆饼粉1.5％、3.08％硫酸锰0.2％、磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、酵母粉1.0％、蛋白胨0.5％、氯化铁0.01％、碳酸钙0.1％，补充水至100％，pH值7.0；

3、30L发酵罐发酵条件为：装液量为15L培养基，接种量3％摇瓶发酵液，发酵温度30℃，通气量1∶0.5，搅拌转数220r/min，放罐时间22h。放罐时，含菌数不低于150×10⁸CFU/ml。

本实施例所用的斜面活化培养基，种子摇瓶培养基，摇瓶发酵培养基和发酵罐培养基在使用之前均经过高温灭菌，实施例2和3相同。

4、将发酵罐发酵得到的枯草芽孢杆菌发酵液在离心机4000rpm高速离心15min，收集菌泥，将菌泥与麦麸按1∶10质量比吸附，吸附后60℃干燥1h，粉碎到不小于60目，每克产品含菌数不低于1000亿CFU。

实施例2：

1、本发明枯草芽孢杆菌ACCC10619斜面活化(培养基牛肉膏0.3～0.5％，氯化钠0.5～1.0％，蛋白胨0.5～1.0％，补充水至100％；pH 6.8～7.5，置于30～34℃生化培养箱培养18～24h)，接种一接种环到100ml种子液中，进行种子摇瓶培养；温度30℃，摇床转数220r/min，时间18～24h。

种子摇瓶培养基为牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，蛋白胨1.0％，加水至100％，pH 7.0。

2、将经过斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养，然后进行摇瓶发酵培养；摇瓶发酵培养条件为发酵温度28℃，pH值6.8，摇床转数200rpm；培养20h。发酵培养基由如下组分组成，葡萄糖0.6％、淀粉0.2％、豆饼粉1％、2.58％硫酸锰0.15％、磷酸氢二钾0.15％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.03％、酵母粉1.5％、蛋白胨0.8％、氯化铁0.005％、碳酸钙0.05％，补充水至100％，pH值6.8；

3、30L发酵罐发酵条件为：装液量为12L培养基，接种量1％摇瓶发酵液，发酵温度34℃，通气量1∶0.6，搅拌转数250r/min，放罐时间18h。放罐时，含菌数不低于128×10⁸CFU/ml。

4、将发酵罐发酵得到的枯草芽孢杆菌发酵液在离心机3500rpm高速离心20min，收集菌泥，将菌泥与麦麸按1∶10质量比吸附，吸附后60℃干燥1h，粉碎到不小于60目，每克产品含菌数不低于850亿CFU。

实施例3：

1、本发明枯草芽孢杆菌ACCC10619斜面活化(培养基牛肉膏0.3～0.5％，氯化钠0.5～1.0％，蛋白胨0.5～1.0％，补充水至100％；pH 6.8～7.5，置于30～34℃生化培养箱培养18～24h)，接种一接种环到100ml种子液中，进行种子摇瓶培养；温度30℃，摇床转数220r/min，时间18～24h。

种子摇瓶培养基为牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，蛋白胨1.0％，加水至100％，pH 7.0。

2、将经过斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养，然后进行摇瓶发酵培养；摇瓶发酵培养条件为发酵温度34℃，pH值7.2，摇床转数250rpm；培养时间18h。发酵培养基由如下组分组成，葡萄糖0.75％、淀粉0.4％、豆饼粉2％、3.88％硫酸锰0.3％、磷酸氢二钾0.45％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.06％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.4％、氯化铁0.015％、碳酸钙0.15％，补充水至100％，pH值7.2；

3、30L发酵罐发酵条件为：装液量为21L培养基，接种量4％摇瓶发酵液，发酵温度28℃，通气量1∶0.4，搅拌转数180r/min，放罐时间24h。放罐时，含菌数不低于138×10⁸CFU/ml。

4、将发酵罐发酵得到的枯草芽孢杆菌发酵液在离心机4500rpm高速离心10min，收集菌泥，将菌泥与麦麸按1∶10质量比吸附，吸附后60℃干燥1h，粉碎到不小于60目，每克产品含菌数不低于920亿CFU。

实施例4、本发明产品的动物试验使用效果。

本实例在湖南新五丰湘乡猪场进行，选择健康断奶仔猪120头(28日龄到30日龄断奶后仔猪)，按体重相近原则随机分成4处理，每个处理3个重复，每个重复10头仔猪，分为空白对照组、本发明高密度组和常规发酵组，及市场购买同类产品组，试验期45天，

本发明高密度组：本发明发酵的高密度枯草芽孢杆菌制剂，活菌数≥10¹¹CFU/克，按0.02％量添加到饲料中；含菌数为10⁸～10¹⁰CFU/kg饲料。常规发酵组：枯草芽孢杆菌发酵后，直接吸附，活菌数≥10¹⁰CFU/克，按0.1％量添加到饲料中；

同类产品组：市场购买的枯草芽孢杆菌，活菌数≥10¹⁰CFU/克，按0.1％量添加到饲料中；

试验结果如下表。

结论：以上的试验结果表明，使用本发明技术生产的产品——高密度枯草芽孢杆菌，与枯草芽孢杆菌常规发酵组和市场购买枯草芽孢杆菌同类产品相比，能够有效大幅度提高仔猪生长速度，改善饲料转化利用效率，减少仔猪断奶后腹泻的发生率。

Claims (10)

1.一株饲用枯草芽孢杆菌的高密度生产工艺，所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的保藏编号为ACCC10619；其特征在于，包括以下步骤：

1)将经过斜面活化的菌株进行种子摇瓶培养，然后进行摇瓶发酵培养；所述摇瓶发酵培养条件为：接种量为培养基体积的1～5％，500ml摇瓶中培养基的装量为50～200ml；发酵温度28～34℃，pH值6.8～7.5，摇床转数180～250rpm，培养18～24h；所述发酵培养基由如下质量组分组成：葡萄糖0.5～0.8％、淀粉0.2～0.4％、豆饼粉1～2％、2.2～4.0％硫酸锰0.1～0.3％、磷酸氢二钾0.15～0.45％、磷酸二氢钾0.1～0.2％、硫酸镁0.03～0.06％、酵母粉0.5～1.5％、蛋白胨0.4～0.8％、氯化铁0.005～0.015％、碳酸钙0.05～0.15％，补充水至100％，pH值6.8～7.5；

2)发酵罐发酵条件为：培养基装液量占发酵罐体积的40-70％，接种占培养基体积的1-5％的摇瓶发酵液，发酵温度28-35℃，通气量1∶04～0.7，搅拌转数180～250r/min，发酵时间18～24h。

2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述的摇瓶发酵培养条件为发酵温度30℃，pH值7.0，摇床转数220rpm；所述发酵培养基由如下质量组分组成，葡萄糖0.5％、淀粉0.3％、豆饼粉1.5％、3.08％硫酸锰0.2％、磷酸氢二钾0.3％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.05％、酵母粉1.0％、蛋白胨0.5％、氯化铁0.01％、碳酸钙0.1％，补充水至100％，pH值7.0；发酵罐发酵条件为培养基装液量占发酵罐体积的50％，接种占培养基体积3％的摇瓶发酵液，接种时间18h，发酵温度30℃，通气量1∶0.5，搅拌转数220r/min，发酵时间22h。

3.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述的发酵罐发酵完成时，含菌数不低于128×10⁸CFU/ml。

4.一种饲用枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于，是将权利要求1或2或3所述的生产工艺中发酵罐发酵得到的枯草芽孢杆菌发酵液离心，收集菌泥；将菌泥与麦麸混合吸附，吸附后干燥，粉碎制备而成。

5.根据权利要求4所述的饲用枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于，将所述的发酵罐发酵得到的枯草芽孢杆菌发酵液在离心机3000～5000rpm高速离心10～20min，收集菌泥；将菌泥与麦麸按1∶10～100质量比吸附，吸附后60～80℃干燥1～6h，粉碎到不小于60目，制备而成。

6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，将所述枯草芽孢杆菌发酵液在离心机4000rpm高速离心15min，收集菌泥，将菌泥与麦麸按1∶10质量比吸附，吸附后60℃干燥1h，粉碎。

7.权利要求4所述的饲用枯草芽孢杆菌菌剂的应用方法，其特征在于，用于制备抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌的制剂。

8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，将所述菌剂添加到饮水或饲料中。

9.根据权利要求8所述的应用方法，其特征在于，所述的菌剂在养殖动物饲料中添加量满足含菌数10⁸～10¹⁰CFU/kg饲料。

10.根据权利要求9所述的应用方法，其特征在于，所述养殖动物为猪或鸡。