CN103667159A - 一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法及培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法以及培养基，所述用于芽孢杆菌的高密度培养方法包括以下步骤：S1、菌种的驯化；S2、摇瓶种子培养；S3、种子罐种子培养；S3、发酵罐高密度发酵培养。所述发酵培养基础培养基的成分包括蛋白胨，酵母浸粉，葡萄糖，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰，氯化钙，豆粕。所述发酵培养基补充培养基为葡萄糖溶液；所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量3-4%所述用于芽孢杆菌的高密度培养方法适用于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的高密度培养。采用本发明所提供的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其发酵液中芽孢杆菌的芽孢形成率可在90%以上，芽孢密度最低在120亿/毫升以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法及培养基。
背景技术
实践证明，随着抗生素饲料添加剂的使用，在抑制病原菌的同时，也抑制了动物消化道内的正常菌群，破坏了菌群的生态平衡，使得致病菌大量增殖，引发二次感染或内源性感染。而且，抗生素的频繁大量使用，会引起耐药菌株的产生，增加动物的易感性，造成免疫机能的减退而引发肠道疾病及其由此造成的环境污染。此外，抗生素的残留也极大的威胁人类健康，其防病、治病的效果也越来越不理想。
因此，各国纷纷通过立法手段禁止或限制使用抗生素，研发出能代替抗生素的新型饲料添加剂成为发展的必然趋势。微生物饲料添加剂因其安全性、无毒、物残留及有利于生态环境的可持续发展成为抗生素替代品的首选，而芽孢杆菌是微生物制剂中应用最广泛的一种微生物制剂。
近年来许多研究发现，芽孢杆菌对动物和人的病原菌具有显著的拮抗作用，芽孢杆菌的芽孢具有耐热、抗干燥、便于运输和使用等优点。在西方国家芽孢杆菌已开始应用于人的功能食品和动物饲料添加剂。枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属中的一种，革兰氏阳性需氧菌，是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，因其无毒、无残留、无污染，同时具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，对改善动物消化道微环境、促进动物营养的消化吸收、提高动物饲料的转化率和增强畜禽免疫力起到重要作用，以被越来越多的研制成动物饲料添加剂，广泛应用于畜牧业、饲料等行业。
但是，目前对枯草芽孢杆菌的研究主要集中在抑菌作用、抑菌物质的分离纯化与表征、以及枯草芽孢杆菌的产酶特点和在豆粕中的应用效果研究等，而在提高枯草芽孢杆菌菌体产量的发酵技术方面、高密度培养工艺则报道较少。
国内外文献报道的芽孢杆菌培养技术，发酵液芽孢密度多数在30-100亿/毫升之间，生产水平较低。如，湖南省微生物研究所（公布号CN 102433283 A）所述枯草芽孢杆菌ACCC10619的发酵培养培养方法，采用葡萄糖、淀粉、酵母粉、蛋白胨、豆饼粉、无机盐等作为培养基，只在30升发酵罐上进行试验，最高活菌数为150亿/毫升（没有说明是芽孢）。福州大学（公布号CN 102586153 A）所述的发酵培养方法，采用蛋白胨，可溶性淀粉，无机盐等作为培养基，发酵液芽孢浓度最高只有43亿。
因此，现有的高密度发酵培养技术在实际培养时芽孢密度不高，不适合推广使用，生产成本高。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法及培养基，旨在解决现有高密度发酵培养技术培养芽孢杆菌时所得芽孢密度不高的问题。
本发明的技术方案如下：
一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其中，包括如下步骤：
S1、菌种的驯化：将斜面保存的菌种用生理盐水稀释后经80°C水浴热处理5~20分钟后，涂布在LB平板培养基上，30-37°C培养24~72小时；挑取单菌落于生理盐水中再经80°C水浴热处理5~20分钟，涂布在LB平板培养基上；重复上述步骤一次；
S2、摇瓶种子培养；
S3、种子罐种子培养；
S3、发酵罐高密度发酵培养：按照5-10%的接种量将二级种子罐种子液转入发酵罐的发酵培养基础培养基，在温度30-37°C，搅拌130-230转/分钟条件下进行发酵；发酵至培发酵培养基础培养基的残糖含量在1%以下，用发酵培养基补充培养基补糖，所述发酵培养基补充培养基补糖在发酵前9小时内补完，补糖后培养液中的残糖控制在2%以下；当发酵液PH值低于6.0时用碱液将PH调节到7.0-7.5范围内，直到发酵结束；
其中，所述发酵培养基础培养基的成分包括：蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3-0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0-10克/升；
所述发酵培养基补充培养基为葡萄糖溶液；所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量3-4%。
所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其中，步骤S2中，具体包括以下步骤：
将经过驯化后的菌种接种到一级摇瓶培养基，在30-37°C，150-250转/分钟的条件下摇瓶培养30-36小时，摇瓶结束后，种子液在70~90℃水浴中热处理3-7分钟；
按2~15%的接种量将一级摇瓶种子液接入二级摇瓶培养基中，在30-37°C，150-250转/分钟的条件下摇瓶培养6~15小时。
所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其中，，步骤S3中，具体包括以下步骤：
按照1-3%的接种量将二级摇瓶种子液接种到一级种子罐，在30-37°C，搅拌130-230转/分钟条件下培养 6-10小时，至OD600值达到8-12或以上时，转入二级种子罐培养；按照3-10%的接种量将一级种子罐种子转入二级种子罐，在30-37°C，130-230转/分钟条件下培养4-12小时，至OD600值达到10-16或以上时，转入发酵罐进行发酵培养；
所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其中，，步骤S2中，所述一级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，PH为7.0-7.5；
所述二级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，PH值为7.0-7.5。
所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其中，，步骤S3中，所述一级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，所述一级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5；
所述二级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0-10克/升，所述二级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5。
所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其中，，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
一种用于芽孢杆菌的培养基，其中，所述用于芽孢杆菌的培养基包括发酵培养基础培养基和发酵培养基补充培养基；
其中，蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3-0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0-10克/升； ph值在7.0-7.5内；
所述发酵培养基补充培养基为葡萄糖溶液；所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量3-4%。
所述的用于芽孢杆菌的培养基，其中，所述用于芽孢杆菌的培养基，还包括一级摇瓶培养基二级摇瓶培养基和二级摇瓶培养基；所述一级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，PH为7.0-7.5；
所述二级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，PH值为7.0-7.5。
所述的用于芽孢杆菌的培养基，其中，所述用于芽孢杆菌的培养基，还包括一级种子罐种子培养基和二级种子罐种子培养基；所述一级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，所述一级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5；所述二级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0-10克/升，所述二级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5。
所述的用于芽孢杆菌的培养基，其中，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
有益效果：本发明中提供一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法以及培养基，所述用于芽孢杆菌的高密度培养方法以及培养基适用于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的高密度培养。采用本发明所提供的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，得到的发酵液中芽孢杆菌的芽孢形成率可在90%以上，芽孢密度最低在120亿/毫升以上。
具体实施方式
本发明提供一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法及培养基，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明中提供一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法，适用于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，此用于芽孢杆菌的高密度培养方法能有效提高两种芽孢杆菌在发酵过程中的培养密度，降低生产成本。
具体地，所述用于芽孢杆菌的高密度培养方法，包括如下步骤：
第一，菌种的驯化：
将斜面保存的菌种用生理盐水稀释后经80°C水浴热处理5~20分钟后，涂布在LB平板培养基上，30-37°C培养24~72小时后，挑取单菌落于无菌生理盐水中再经80°C水浴热处理5~20分钟，涂布于LB平板培养基上；重复上述步骤一次（此处重复上述步骤一次，是指挑取单菌落于生理盐水中水浴加热处理，再涂布于LB平板培养基上）。另外，可以从LB平板培养基上挑取单菌落传代于LB试管斜面作为备用菌种。对菌种进行驯化，是为了提高菌体在发酵罐中的芽孢形成率，采用上述步骤驯化菌种，有利于保证所得到的菌种在发酵培养过程中充分转化为芽孢。
第二，摇瓶种子培养：
在本发明中，摇瓶种子培养分为两级：
一级摇瓶种子培养：从LB平板培养基上接一环经过驯化后的斜面菌种到一级摇瓶培养基，500毫升三角瓶装液100毫升，在30-37°C， 150-250转/分钟的条件下摇瓶培养30-36小时。摇瓶结束后，种子液在70~90℃水浴中热处理3-7分钟后备用。所述一级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，PH7.0-7.5；优选为蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化钠10克/升。
二级摇瓶种子培养：按2~15%接种量将一级摇瓶种子接入二级摇瓶培养基，500毫升三角瓶装液200毫升，在30-37°C， 150-250转/分钟的条件下摇瓶培养6~15个小时。所述二级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，所述二级摇瓶培养基的PH值为7.0-7.5；优选为蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化钠10克/升，葡萄糖20克/升。摇瓶培养结束后，作为种子液备用。
第三，种子罐种子培养：
在本发明中，种子罐种子培养分为两级：
一级种子罐种子培养：按照1-3%的接种量将二级摇瓶种子液接种到一级种子罐，种子罐装液量为总体积的40-60%，在30-37°C，搅拌130-230转/分钟，通气比1:0.5-1，罐压0.05Mpa条件下培养 6-10小时，至OD600值达到8-12或以上时，可以转入二级种子罐培养。所述一级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，所述一级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5；优选为蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化钠10克/升，葡萄糖20克/升。
二级种子罐种子培养：按照3-10%的接种量将一级种子罐种子转入二级种子罐，二级种子罐装液量为总体积的40-60%，在30-37°C，130-230转/分钟，通气比1:0.5-1，罐压0.05Mpa条件下培养时间6-12小时，当OD600值达到10-16或以上时，可以转入发酵罐进行发酵培养。所述二级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0-10克/升，所述二级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5；优选为蛋白胨20克/升，酵母浸粉10克/升，葡萄糖20克/升，磷酸氢二钠4克/升，磷酸二氢钾4克/升，硫酸镁0.65克/升，硫酸锰0.5克/升，氯化钙0.2克/升，豆粕0-10克/升。
第四，发酵罐高密度发酵培养：
按照5-10%的接种量将二级种子罐种子转入发酵罐，发酵罐的装液量40-70%。在发酵温度30-37°C，罐压0.5Mpa，通风比1:0.5-1，搅拌130-230转/分钟条件下发酵。发酵约3-4小时，培养液OD600达到20左右，残糖含量在1%以下时开始补糖；每30-60分钟补糖一次，补糖后培养液中的残糖控制在2%以下，糖液分3-4次在发酵9小时前补完。当补糖开始后，通风量逐步提升，最高至1:1.3，维持搅拌转速不变。在补糖后发酵液PH值会下降，当发酵液PH值低于6.0时需要补碱液或氨水（也可以为纯碱），将PH调节到6.0-6.7范围内。发酵约20-26小时结束。发酵培养基基础料配方为：蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3-0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0-10克/升；优选为蛋白胨20克/升，酵母浸粉10克/升，葡萄糖20克/升，磷酸氢二钠4克/升，磷酸二氢钾4克/升，硫酸镁0.65克/升，硫酸锰0.5克/升，氯化钙0.2克/升，豆粕0-10克/升。发酵培养基补料配方为：发酵液总量3-4%的葡萄糖，配制成浓度为40-50%的葡萄糖溶液，灭菌后备用。
上述步骤即为本发明用于芽孢杆菌的高密度培养方法，所述方法中主要改进在于：1、在接种培养前，先对菌种进行驯化，菌种的驯化方法有利于保证所得到的菌种在发酵培养过程中充分转化为芽孢；2、根据芽孢杆菌的生理特点及代谢规律，通过调整培养基的组成和配比，使培养基的配方碳氮比（C：N）平衡，以利于菌体的高密度繁殖和芽孢的形成；在培养基中的C：N的比例基本不变的情况下，可以调整各成分的比例和浓度，以变化培养基的成分；3、本发明中设有流加葡萄糖的技术方案，葡萄糖在菌体的生长期补加，克服了葡萄糖对菌体代谢和繁殖的抑制作用，更有利于菌体的高密度生长繁殖；4、发酵过程中PH值控制在菌体生长繁殖的最适合范围，有利于菌体的生长繁殖；发酵过程中流加液碱可以调节发酵液PH值；流加氨水可以代替液碱调节PH值的同时可以补充菌体需要的快速利用氮源，从而可以减少培养基配方中的有机氮源，节约生产成本，因此，流加氨水是优选方案。
本发明中还提供一种用于芽孢杆菌的培养基，所述培养基包括发酵培养基础培养基和发酵培养基补充培养基；
其中，所述发酵培养基础培养基的成分包括：蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3-0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0-10克/升； ph值在7.0-7.5内；
所述发酵培养基补充培养基为葡萄糖溶液；所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量3-4%；所述葡萄糖溶液的浓度为40-50%，经灭菌后备用。
所述用于芽孢杆菌的培养基，还包括一级摇瓶培养基二级摇瓶培养基和二级摇瓶培养基；所述一级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，所述一级摇瓶培养基的PH为7-7.5；
所述二级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，所述二级摇瓶培养基的PH值为7.0-7.5。
所述用于芽孢杆菌的培养基，还包括一级种子罐种子培养基和二级种子罐种子培养基；所述一级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，所述一级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5；
所述二级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0-10克/升，所述二级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5。
以下通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：枯草芽孢杆菌的高密度培养
以枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）为菌种，经过如下步骤进行：
1）菌种的驯化：为了提高菌体在发酵罐中的芽孢形成率，需要对菌种驯化。将斜面保存菌种用生理盐水稀释后经80°C水浴热处理10分钟后，涂布在LB平板培养基上，35°C培养48小时后挑取单菌落于无菌生理盐水中再经80°C水浴热处理10分钟，重复上述步骤一次。挑取单菌落传代与LB试管斜面作为备用菌种。
2）一级摇瓶种子培养：接一环经过驯化后的斜面菌种到一级摇瓶培养基，500毫升三角瓶装液100毫升，在35°C，转速200转/分钟条件下摇瓶培养30-36小时。一级摇瓶培养基的配方为：蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化钠10克/升，PH7.5。摇瓶结束后，种子液在80°C水浴中热处理5分钟后备用。
3）二级摇瓶种子培养：按10%的接种量将一级摇瓶种子接入二级摇瓶培养基，500毫升三角瓶装液200毫升，在35°C，200转/分钟条件下摇瓶培养8小时。二级摇瓶培养基的配方为：蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化钠10克/升，葡萄糖20克/升，PH值7.5。摇瓶培养结束后，作为种子液备用。
4）一级种子罐种子培养：按照2%的接种量将二级摇瓶种子液接种到一级种子罐，种子罐装液量为总体积的40%，在35°C，搅拌转速180转/分钟，通气比1: 1，罐压0.05Mpa条件下培养6小时，OD600值达到8时，转入二级种子罐培养。其中，一级种子罐种子培养基配方为：蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化钠10克/升，葡萄糖20克/升，PH7.5。
5）二级种子罐种子培养：按照10%的接种量将一级种子罐种子转入二级种子罐，二级种子罐装液量为总体积的40%，在35°C，搅拌转速180转/分钟，通气比1:0.5-1，罐压0.05Mpa条件下培养时间12小时，OD600值达到16，转入发酵罐进行发酵培养。其中，二级种子罐培养基配方为：蛋白胨20克/升，酵母浸粉10克/升，葡萄糖20克/升，磷酸氢二钠4克/升，磷酸二氢钾4克/升，硫酸镁0.65克/升，硫酸锰0.5克/升，氯化钙0.2克/升，豆粕 10克/升，PH值7.5。
6）发酵罐高密度发酵培养：按照5%的接种量将二级种子罐种子转入发酵罐，发酵罐的装液量60%。在发酵温度35°C，罐压0.5Mpa，通风比1:1，搅拌180转/分钟条件下发酵，发酵约4小时，培养液OD600达到20左右，残糖含量在1%以下时开始补糖；每 60分钟补糖一次，补糖后培养液中的残糖控制在2%以下，糖液分3-4次在发酵9小时前补完。当补糖开始后，通风量逐步提升，最高至1:1.3，维持搅拌转速不变。在补糖后发酵液PH值会下降，当发酵液PH值低于6.0时需要补碱液或氨水，将PH调节到7.0-7.5范围内。发酵约24-26小时结束。其中，发酵培养基基础料配方为：蛋白胨20克/升，酵母浸粉10克/升，葡萄糖20克/升，磷酸氢二钠4克/升，磷酸二氢钾4克/升，硫酸镁0.65克/升，硫酸锰0.5克/升，氯化钙0.2克/升，豆粕 10克/升；发酵培养基补料配方为：发酵液总量3%的葡萄糖，配制成浓度为40%的葡萄糖溶液，灭菌后备用。
经过上述条件的培养，发酵液中枯草芽孢杆菌的芽孢形成率在90%以上，芽孢密度最低在120亿/毫升以上。
实施例2：地衣芽孢杆菌的培养
以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为菌种，经过如下步骤进行：
1）菌种的驯化：将斜面保存菌种用生理盐水稀释后经80°C水浴热处理10分钟后，涂布在LB平板培养基上，35°C培养48小时后挑取单菌落于无菌生理盐水中再经80°C水浴热处理10分钟，重复上述步骤一次。
2）一级摇瓶种子培养：接一环经过驯化后的斜面菌种到一级摇瓶培养基，500毫升三角瓶装液100毫升，在35°C，转速200转/分钟的条件下摇瓶培养36小时，其中，一级摇瓶培养基的配方为：蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化钠10克/升，PH7.0；摇瓶结束后，种子液在80°C水浴中热处理5分钟后备用。
3）二级摇瓶种子培养：按10%的接种量将一级摇瓶种子接入二级摇瓶培养基，500毫升三角瓶装液200毫升，在35°C，200转/分钟的条件下摇瓶培养8小时。二级摇瓶培养基的配方为：蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化钠10克/升，葡萄糖20克/升，PH值7.0。摇瓶培养结束后，作为种子液备用。
4）一级种子罐种子培养：按照3%的接种量将二级摇瓶种子液接种到一级种子罐，种子罐装液量为总体积的50%，在35°C，搅拌转速180转/分钟，通气比1:0.5，罐压0.05Mpa条件下培养10小时，OD600值达到12时，可以转入二级种子罐培养。其中，一级种子罐种子培养基配方为：蛋白胨10克/升，酵母浸粉5克/升，氯化钠10克/升，葡萄糖20克/升，PH7.0。
5）二级种子罐种子培养：按照10%的接种量将一级种子罐种子转入二级种子罐，二级种子罐装液量为总体积的50%，在35°C，搅拌转速180转/分钟，通气比1:0.5-1，罐压0.05Mpa条件下培养时间6小时， OD600值达到10-16时，转入发酵罐进行发酵培养。其中，二级种子罐培养基配方为：蛋白胨20克/升，酵母浸粉10克/升，葡萄糖20克/升，磷酸氢二钠4克/升，磷酸二氢钾4克/升，硫酸镁0.65克/升，硫酸锰0.5克/升，氯化钙0.2克/升 ，PH值7.0。
6）发酵罐高密度发酵培养：按照10%的接种量将二级种子罐种子转入发酵罐，发酵罐的装液量70%。在发酵温度35°C，罐压0.5Mpa，通风比1:1，搅拌180转/分钟条件下发酵，发酵约4小时，培养液OD600达到20左右，残糖含量在1%以下时开始补糖；每30分钟补糖一次，补糖后培养液中的残糖控制在2%以下，糖液分3-4次在发酵9小时前补完。当补糖开始后，通风量逐步提升，最高至1:1.3，维持搅拌转速不变。在补糖后发酵液PH值会下降，当发酵液PH值低于6.0时需要补碱液或氨水，将PH调节到7.0-7.5范围内。发酵约24-26小时结束。其中，发酵培养基基础料配方为：蛋白胨20克/升，酵母浸粉10克/升，葡萄糖20克/升，磷酸氢二钠4克/升，磷酸二氢钾4克/升，硫酸镁0.65克/升，硫酸锰0.5克/升，氯化钙0.2克/升 ；发酵培养基补料配方为：发酵液总量4%的葡萄糖，配制成浓度为50%的葡萄糖溶液，灭菌后备用。
经过上述条件的培养，发酵液中地衣芽孢杆菌的芽孢形成率在90%以上，芽孢密度最低在150亿/毫升以上。
综上所述，本发明中提供一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法以及培养基，所述用于芽孢杆菌的高密度培养方法以及培养基适用于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的高密度培养。经过上述实施例可以发现，采用本发明所提供的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其发酵液中芽孢杆菌的芽孢形成率可在90%以上，芽孢密度最低在120亿/毫升以上。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、菌种的驯化：将斜面保存的菌种用生理盐水稀释后经80°C水浴热处理5~20分钟后，涂布在LB平板培养基上，30-37°C培养24~72小时；挑取单菌落于生理盐水中再经80°C水浴热处理5~20分钟，涂布在LB平板培养基上；重复上述步骤一次；
S2、摇瓶种子培养；
S3、种子罐种子培养；
S3、发酵罐高密度发酵培养：按照5-10%的接种量将二级种子罐种子液转入发酵罐的发酵培养基础培养基，在温度30-37°C，搅拌130-230转/分钟条件下进行发酵；发酵至培发酵培养基础培养基的残糖含量在1%以下，用发酵培养基补充培养基补糖，所述发酵培养基补充培养基补糖在发酵前9小时内补完，补糖后培养液中的残糖控制在2%以下；当发酵液PH值低于6.0时用碱液将PH调节到7.0-7.5范围内，直到发酵结束；
其中，所述发酵培养基础培养基的成分包括：蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3-0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0-10克/升；
所述发酵培养基补充培养基为葡萄糖溶液；所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量3-4%。
2.根据权利要求1所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，步骤S2中，具体包括以下步骤：
将经过驯化后的菌种接种到一级摇瓶培养基，在30-37°C，150-250转/分钟的条件下摇瓶培养30-36小时，摇瓶结束后，种子液在70~90℃水浴中热处理3-7分钟；
按2~15%的接种量将一级摇瓶种子液接入二级摇瓶培养基中，在30-37°C，150-250转/分钟的条件下摇瓶培养6~15小时。
3.根据权利要求1所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，步骤S3中，具体包括以下步骤：
按照1-3%的接种量将二级摇瓶种子液接种到一级种子罐，在30-37°C，搅拌130-230转/分钟条件下培养 6-10小时，至OD600值达到8-12或以上时，转入二级种子罐培养；按照3-10%的接种量将一级种子罐种子转入二级种子罐，在30-37°C，130-230转/分钟条件下培养4-12小时，至OD600值达到10-16或以上时，转入发酵罐进行发酵培养。
4.根据权利要求2所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，步骤S2中，所述一级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，PH为7.0-7.5；
所述二级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，PH值为7.0-7.5。
5.根据权利要求3所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，步骤S3中，所述一级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，所述一级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5；
所述二级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0-10克/升，所述二级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5。
6.根据权利要求1~5任一所述的用于芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
7.一种用于芽孢杆菌的培养基，其特征在于，所述用于芽孢杆菌的培养基包括发酵培养基础培养基和发酵培养基补充培养基；
其中，蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3-0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0-10克/升； ph值在7.0-7.5内；
所述发酵培养基补充培养基为葡萄糖溶液；所述葡萄糖溶液中的葡萄糖含量为发酵液总量3-4%。
8.根据权利要求7所述的用于芽孢杆菌的培养基，其特征在于，所述用于芽孢杆菌的培养基，还包括一级摇瓶培养基二级摇瓶培养基和二级摇瓶培养基；所述一级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，PH为7.0-7.5；
所述二级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，PH值为7.0-7.5。
9.根据权利要求7所述的用于芽孢杆菌的培养基，其特征在于，所述用于芽孢杆菌的培养基，还包括一级种子罐种子培养基和二级种子罐种子培养基；所述一级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨5~15克/升，酵母浸粉3-7克/升，氯化钠5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，所述一级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5；所述二级种子罐种子培养基的成分包括蛋白胨15~25克/升，酵母浸粉5~15克/升，葡萄糖15~25克/升，磷酸氢二钠2~6克/升，磷酸二氢钾2~6克/升，硫酸镁0.6~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，豆粕0-10克/升，所述二级种子罐种子培养基的PH为7.0-7.5。
10.根据权利要求7~9任一所述的用于芽孢杆菌的培养基，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。
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