CN110305812B - 一种地衣芽孢杆菌发酵培养工艺 - Google Patents

一种地衣芽孢杆菌发酵培养工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种地衣芽孢杆菌发酵培养工艺，包括种子罐培养阶段和发酵罐培养阶段；所述种子罐培养阶段：包括液化、灭菌、接种、培养步骤；种子罐培养采用的培养基原料包括：玉米粉、豆粕、葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸锰。所述的发酵培养：前4小时通风量1：1‑1.1，后期通风量1:1.2‑1.3；培养温度：37±0.5℃，搅拌速度：前4小时150‑160转/分，4小时后180‑190转/分，培养时间：30±0.5小时。本发明地衣芽孢杆菌的芽孢率达到98%以上。

Description

一种地衣芽孢杆菌发酵培养工艺
技术领域
本发明涉一种地衣芽孢杆菌发酵培养工艺，属于微生物培养技术领域。
背景技术
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种在土壤中常见的革兰氏阳性嗜热细菌。在鸟类，特别是居住在地面的鸟类(如雀科)和水生的鸟类(如鸭)的羽毛中也能找到这种细菌，特别是在其胸部和背部的羽毛中。酶分泌的最适温度为37℃。它可能以孢子形式存在，从而抵抗恶劣的环境；在良好环境下，则可以生长态存在。该细菌可调整菌群失调达到治疗目的，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌。能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。适用于细菌原因引起的肠道菌群失调症以及肠道需要保健的养殖动物；对家禽类动物效果比较显著。
地衣芽孢杆菌是一种包含许多有特殊功能的菌株，在工业、农业、医学等科学领域研究中有广泛的应用价值。目前地衣芽孢杆菌的发酵工艺普遍存在着发酵水平偏低，芽孢形成不一致，芽孢数量和芽孢质量不稳定等缺陷。
发明内容
本发明提供了一种地衣芽孢杆菌发酵培养工艺，要达到以下发明目的：
提高地衣芽孢杆菌发酵培养工艺水平，提高地衣芽孢杆菌的芽孢率和芽孢数量；降低杂菌率，提高地衣芽孢杆菌的稳定性。
为达到该目的，本发明的技术方案是：
一种地衣芽孢杆菌发酵培养工艺，包括种子罐培养阶段和发酵罐培养阶段。
菌种为地衣芽孢杆菌ACCC10146。
第一，种子罐培养
采用100升种子罐：接种量100ml；
种子罐培养采用的培养基原料为：玉米粉、豆粕、葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸锰。
1、种子罐检查无误后，加入适量的水，投入玉米粉和豆粕，用夹套将种子罐内升温至43-50℃，再加入蛋白酶液化一个小时，然后加入中温淀粉酶，升温至62-70℃再液化一个小时。
蛋白酶的加入量为8-15g，中温淀粉酶的加入量为5-10g；
2、液化完毕，加入剩余的培养基和消泡剂，开启三路进气，注意进排汽稳定，升温至121-122℃实消灭菌30分钟，消后体积70升，消后pH控制在6.5-6.8。
所述消泡剂为：二甲基硅油；
3、接种：
实消结束后，种子罐保压降温，当温度降至培养温度37±0.5℃，时准备接种。
接种前准备好酒精棉、钳子、镊子和接种环。将棉花均匀放置到接种环周围，接种环放置到接种口后点火，要求火焰封闭接种口周围。
关闭接种瓶与种子罐之间的阀门，缓慢打开接种口盖，打开后接种口盖不得离开火焰封闭范围。
将种子瓶口在火焰中灼烧后，在火焰封闭范围内打开棉塞，迅速将种子液倒入接种瓶内。在火焰范围内将种子瓶棉塞塞入瓶口后移出接种火焰，接种结束后，将接种口盖关闭。
打开接种瓶和种子罐之间的阀门，使种子自然流入种子罐后，扑灭火焰，移走接种环。
通风、打开搅拌，开始培养。检测种子瓶无菌样。通风量：1：1，培养温度：37±0.5℃，搅拌速度：200转/分，培养时间：10-12小时，转种标准：细菌生长对数期。
第二、发酵罐培养
采用实施例1000升发酵罐。
1、发酵罐检查无误后，加入适量的水，投入玉米粉和豆粕，用夹套升温至43-50℃，再加入蛋白酶液化一个小时，后加入中温淀粉酶升温至62-70℃再液化一个小时。蛋白酶的加入量为80-150g，中温淀粉酶的加入量为50-100g。
2、液化完毕，加入剩余的培养基和消泡剂，开启三路进气，注意进排汽稳定，升温至121-122℃实消灭菌30分钟，消后体积700升，消后pH控制在6.5-6.8。
3、转种
移种管道消毒：移种管道消毒压力0.2mPa，时间1小时。
转种时种子罐压力为0.15mPa ,发酵罐压力为0.05mPa。
4、发酵培养
通风量：前4小时通风量1：1，后期通风量1:1.2；培养温度：37±0.5℃，搅拌速度：前4小时160转/分，4小时后180转/分，培养时间：30小时左右，放罐标准：细菌芽孢率98％以上；放罐处理：利用夹层升温至发酵罐内温度为50℃，维持20分钟，放罐。
与现有技术相比，本发明技术方案具有以下有益效果：
（1）本发明地衣芽孢杆菌的芽孢率达到98%以上，放罐芽孢数为1.2×1010个/ml以上。
（2）本发明地衣芽孢杆菌发酵培养工艺，杂菌率低，产品杂菌数为零。
（3）本发明制备的地衣芽孢杆菌芽孢稳定性好，保质期长，保质期长达2-3年。
具体实施方式
实施例1
一种地衣芽孢杆菌发酵培养工艺，包括种子罐培养阶段和发酵罐培养阶段。
采用的菌种为地衣芽孢杆菌ACCC10146。
第一，种子罐培养
采用100升种子罐：接种量100ml；
种子罐培养采用的培养基为：玉米粉、豆粕、葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸锰。
1、种子罐检查无误后，加入适量的水，投入玉米粉和豆粕，用夹套将种子罐内升温至43-45℃，再加入蛋白酶液化一个小时，然后加入中温淀粉酶，升温至65-67℃再液化一个小时。
蛋白酶的加入量为10g，中温淀粉酶的加入量为6g；
2、液化完毕，加入剩余的培养基和消泡剂，开启三路进气，注意进排汽稳定，升温至121-122℃实消灭菌30分钟，消后体积70升，消后pH控制在6.5-6.6。所述消泡剂为：二甲基硅油。
3、接种
实消结束后，种子罐保压降温，当温度降至培养温度37±0.5℃，时通知菌种室准备接种。
接种前准备好酒精棉、钳子、镊子和接种环。将棉花均匀放置到接种环周围，接种环放置到接种口后点火，要求火焰封闭接种口周围。
关闭接种瓶与种子罐之间的阀门，缓慢打开接种口盖，打开后接种口盖不得离开火焰封闭范围。
将种子瓶口在火焰中灼烧后，在火焰封闭范围内打开棉塞，迅速将种子液倒入接种瓶内。在火焰范围内将种子瓶棉塞塞入瓶口后移出接种火焰，接种结束后，将接种口盖关闭。
打开接种瓶和种子罐之间的阀门，使种子自然流入种子罐后，扑灭火焰，移走接种环。通风、打开搅拌，正常培养。检测种子瓶无菌样。通风量：1：1，培养温度：37±0.5℃，搅拌速度：200转/分，培养时间：10-12小时，转种标准：细菌生长对数期时进行转种。
第二、发酵罐培养
采用实施例1000升发酵罐。
1、发酵罐检查无误后，加入适量的水，投入玉米粉和豆粕，用夹套升温至43-44℃，再加入蛋白酶液化一个小时，后加入中温淀粉酶升温至62-64℃再液化一个小时。蛋白酶的加入量为140g，中温淀粉酶的加入量为100g。
2、液化完毕，加入剩余的培养基和消泡剂，开启三路进气，注意进排汽稳定，升温至121-122℃实消灭菌30分钟，消后体积700升，消后pH控制在6.5-6.8。
采用的发酵罐培养基和种子罐培养基的配方相同。
3、转种
移种管道消毒：移种管道消毒压力0.2mPa，时间1小时。
转种时种子罐压力为0.15mPa ,发酵罐压力为0.05mPa。
4、发酵培养
通风量：前4小时通风量为1：1，4小时后通风量为1:1.2；发酵培养温度：37±0.5℃；搅拌速度：前4小时160转/分，4小时后180转/分；培养时间为30小时，细菌芽孢率98％以上时放罐；放罐处理：利用夹层升温，控制发酵罐内温度为50℃，维持20分钟，放罐，得到地衣芽孢杆菌。
经检测，地衣芽孢杆菌的芽孢率达到98.5%，芽孢形成一致，放罐芽孢数为1.2×1010个/ml；杂菌数为零。
另外，制备的地衣芽孢杆菌芽孢稳定性好，保质期长，保质期长达2年。
实施例2一种地衣芽孢杆菌发酵培养工艺
包括种子罐培养阶段和发酵罐培养阶段。
采用的菌种为地衣芽孢杆菌ACCC10146。
第一，种子罐培养
采用100升种子罐：
种子罐培养采用的培养基为：玉米粉11g/L、豆粕23g/L、葡萄糖4.6g/L、磷酸氢二钾1.7g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、硫酸镁0.8g/L和硫酸锰0.5g/L。
1、种子罐检查无误后，加入适量的水，投入玉米粉和豆粕，用夹套将种子罐内升温至47-49℃，再加入蛋白酶液化一个小时，然后加入中温淀粉酶，升温至68-70℃再液化一个小时。
蛋白酶的加入量为12g，中温淀粉酶的加入量为7g；
2、液化完毕，加入剩余的培养基和消泡剂，开启三路进气，注意进排汽稳定，升温至121-122℃实消灭菌30分钟，消后体积70升，消后pH控制在6.7-6.8。所述消泡剂为：二甲基硅油，加入量为10g。
3、接种
实消结束后，种子罐保压降温，当温度降至培养温度37±0.5℃时准备接种。
接种前准备好酒精棉、钳子、镊子和接种环。将棉花均匀放置到接种环周围，接种环放置到接种口后点火，要求火焰封闭接种口周围。
关闭接种瓶与种子罐之间的阀门，缓慢打开接种口盖，打开后接种口盖不得离开火焰封闭范围。
将种子瓶口在火焰中灼烧后，在火焰封闭范围内打开棉塞，迅速将种子液倒入接种瓶内。在火焰范围内将种子瓶棉塞塞入瓶口后移出接种火焰，接种结束后，将接种口盖关闭。
打开接种瓶和种子罐之间的阀门，使种子自然流入种子罐后，扑灭火焰，移走接种环。接种量100ml。通风、打开搅拌，正常培养。检测种子瓶无菌样。通风量为1：1，培养温度为37±0.5℃，搅拌速度为200转/分，培养时间为10-12小时，转种标准：细菌生长对数期时进行转种。
第二、发酵罐培养
采用实施例1000升发酵罐。
采用的发酵罐培养基为：玉米粉11g/L、豆粕23g/L、葡萄糖2.3g/L、甘露醇1.8 g/L、柠檬酸铁0.9 g/L、脯氨酸0.2 g/L、酪氨酸 0.2g/L、过磷酸钙1.1g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、硫酸镁0.2g/L、硫胺素0.2 g/L和硫酸锰0.5g/L。
1、发酵罐检查无误后，加入适量的水，投入玉米粉和豆粕，用夹套升温至46-48℃，再加入蛋白酶液化一个小时，后加入中温淀粉酶升温至68-70℃再液化一个小时。蛋白酶的加入量为120g，中温淀粉酶的加入量为70g。
2、液化完毕，加入剩余的培养基和消泡剂，开启三路进气，注意进排汽稳定，升温至121-122℃实消灭菌30分钟，消后体积700升，消后pH控制在6.7-6.8。所述消泡剂为：二甲基硅油，加入量为100g。
3、转种
移种管道消毒：移种管道消毒压力0.2mPa，时间1小时。
转种时种子罐压力为0.15mPa ,发酵罐压力为0.05mPa。
4、发酵培养
通风量：前4小时通风量为1：1，4小时后通风量为1:1.2；发酵培养温度：37±0.5℃；搅拌速度：前4小时160转/分，4小时后180转/分；培养时间为30小时，细菌芽孢率99％以上时放罐；放罐处理：利用夹层升温，控制发酵罐内温度为50℃，维持20分钟，放罐，得到地衣芽孢杆菌。
经检测，地衣芽孢杆菌的芽孢率达到99.5%，芽孢形成一致，放罐芽孢数为1.8×1010个/ml；杂菌数为零。
另外，制备的地衣芽孢杆菌芽孢稳定性好，保质期长，保质期长达3年。
除特殊说明的外，本发明所述的百分数均为质量百分数，所述的比值均为质量比。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种地衣芽孢杆菌发酵培养工艺，其特征在于，所述发酵培养工艺包括种子罐培养阶段和发酵罐培养阶段；
采用的菌种为地衣芽孢杆菌ACCC10146；
A.种子罐培养
采用100升种子罐：
种子罐培养采用的培养基为：玉米粉11g/L、豆粕23g/L、葡萄糖4.6g/L、磷酸氢二钾1.7g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、硫酸镁0.8g/L和硫酸锰0.5g/L；
a.种子罐检查无误后，加入适量的水，投入玉米粉和豆粕，用夹套将种子罐内升温至47-49℃，再加入蛋白酶液化一个小时，然后加入中温淀粉酶，升温至68-70℃再液化一个小时；
蛋白酶的加入量为12g，中温淀粉酶的加入量为7g；
b.液化完毕，加入剩余的培养基和消泡剂，开启三路进气，注意进排汽稳定，升温至121-122℃实消灭菌30分钟，消后体积70升，消后pH控制在6.7-6.8；所述消泡剂为：二甲基硅油，加入量为10g；
c.接种
实消结束后，种子罐保压降温，当温度降至培养温度37±0.5℃时准备接种；
接种前准备好酒精棉、钳子、镊子和接种环；将棉花均匀放置到接种环周围，接种环放置到接种口后点火，要求火焰封闭接种口周围；
关闭接种瓶与种子罐之间的阀门，缓慢打开接种口盖，打开后接种口盖不得离开火焰封闭范围；
将种子瓶口在火焰中灼烧后，在火焰封闭范围内打开棉塞，迅速将种子液倒入接种瓶内；在火焰范围内将种子瓶棉塞塞入瓶口后移出接种火焰，接种结束后，将接种口盖关闭；
打开接种瓶和种子罐之间的阀门，使种子自然流入种子罐后，扑灭火焰，移走接种环；接种量100ml；通风、打开搅拌，正常培养；检测种子瓶无菌样；通风量为1：1，培养温度为37±0.5℃，搅拌速度为200转/分，培养时间为10-12小时，转种标准：细菌生长对数期时进行转种；
B.发酵罐培养
采用1000升发酵罐；
采用的发酵罐培养基为：玉米粉11g/L、豆粕23g/L、葡萄糖2.3g/L、甘露醇1.8 g/L、柠檬酸铁0.9 g/L、脯氨酸0.2 g/L、酪氨酸 0.2g/L、过磷酸钙1.1g/L、磷酸二氢钾1.3g/L、硫酸镁0.2g/L、硫胺素0.2 g/L和硫酸锰0.5g/L；
a.发酵罐检查无误后，加入适量的水，投入玉米粉和豆粕，用夹套升温至46-48℃，再加入蛋白酶液化一个小时，后加入中温淀粉酶升温至68-70℃再液化一个小时；蛋白酶的加入量为120g，中温淀粉酶的加入量为70g；
b.液化完毕，加入剩余的培养基和消泡剂，开启三路进气，注意进排汽稳定，升温至121-122℃实消灭菌30分钟，消后体积700升，消后pH控制在6.7-6.8；所述消泡剂为：二甲基硅油，加入量为100g；
c.转种
移种管道消毒：移种管道消毒压力0.2mPa，时间1小时；
转种时种子罐压力为0.15mPa ,发酵罐压力为0.05mPa；
d.发酵培养
通风量：前4小时通风量为1：1，4小时后通风量为1:1.2；发酵培养温度：37±0.5℃；搅拌速度：前4小时160转/分，4小时后180转/分；培养时间为30小时，细菌芽孢率99％以上时放罐；放罐处理：利用夹层升温，控制发酵罐内温度为50℃，维持20分钟，放罐，得到地衣芽孢杆菌；
经检测，地衣芽孢杆菌的芽孢率达到99.5%，芽孢形成一致；杂菌数为零；制备的地衣芽孢杆菌芽孢稳定性好，保质期长，保质期长达3年。
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