CN103146624A - 一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，通过人工诱变育种，及工艺配方、培养条件的优化，使得原本在不同条件下培养，且分别具有不同生理功能的三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3，通过固体培养、摇瓶种子制备，然后将三株地衣芽孢杆菌的摇瓶种子液合瓶后，经过一级种子液制备、二级种子液制备，最后于同一发酵罐内发酵培养。采用本发明的混合发酵工艺，抑菌能力提高10～15%，芽孢率提高了16～23%，节约成本200%。
Description
技术领域
本发明涉及一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，属于微生物发酵领域。
背景技术
地衣芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的一种，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌，能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。广泛应用于医药、农药、食品、饲料加工、环境污染等行业。地衣芽孢杆菌是我国20世纪90年代起开发利用的新型微生态制剂，其消长直接影响该制剂的疗效和产量的高低。目前，地衣芽孢杆菌的生产方法按发酵方式可分为固体发酵和液体发酵。但长期以来，无论采用那何种发酵方式，生产成本一直据高不下，工业生产成本难以大幅度降低。国内外已有许多学者对地衣芽孢杆菌的发酵条件进行研究，以求提高产量，降低生产成本。
保藏于中国农业微生物菌种保藏中心的三株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）L1、L2、L3，其中，保藏编号为ACCC11080的地衣芽孢杆菌L1，具有分解木质素，促进生长的功能；保藏编号为ACCC10613的地衣芽孢杆菌L2，能产生杆菌肽，具有抑制细菌性及霉菌性根腐病的功能；保藏编号为ACCC11106的地衣芽孢杆菌L3，能抗梨黑星病。目前，上述三株地衣芽孢杆菌的发酵方式通常为：单株发酵得到L1、L2、L3的发酵液，然后将所得发酵液混合，再进行浓缩、制粒、干燥，从而得到最终产品。采用此发酵方式，生产成本较高，且受发酵工艺的影响，批次制得的产品性能并不稳定。为此，开发合理的地衣芽孢杆菌发酵方式，降低生产成本，是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷与不足，提供一种抑菌能力高、生产成本低的地衣芽孢杆菌混合发酵工艺。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，所述地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）分别为L1、L2、L3，保藏于中国农业微生物菌种保藏中心；其中，L1的保藏编号为ACCC11080，L2的保藏编号为ACCC10613，L3的保藏编号为ACCC11106；包含以下步骤：
a）固体斜面培养：将三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3在无菌条件下分别接种于斜面培养基上进行分别培养，其中：地衣芽孢杆菌L1的培养条件为30～37℃，24～48h，地衣芽孢杆菌L2的培养条件为25～30℃，24～48h，地衣芽孢杆菌L3的培养条件为28～32℃，24～48h；
b）理化因子诱变：将步骤a）中制得的固体斜面培养物，在无菌条件下，用0.9%的生理盐水制备成浓度为108～109个/ml（血球计数浓度）的菌悬液；并将制得的菌悬液按致死率70%～90%的处理剂量进行紫外诱变处理，进行摇瓶筛选，根据摇瓶筛选结果，选择正突变的菌株，进行亚硝基胍诱变处理，用0.9%的生理盐水将亚硝基胍诱变处理后的反应液稀释后涂布分离平板，接入分离平板培养基，于30℃培养48h，至长出单菌落；
c）摇瓶筛选：无菌条件下，将步骤b）中制得的单菌落从分离平板上分别接入斜面培养基，于30℃培养48h，得单菌落斜面；然后将单菌落斜面一对一接入种子摇瓶培养基，于30℃恒温振荡培养22h，得筛选种子液；再在无菌条件下，将筛选种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，于30℃恒温振荡培养48h，以芽孢率、抑菌能力（生物圈）、生物量为指标，进行摇瓶初筛、摇瓶一次复筛及摇瓶二次复筛；
d）根据步骤c）中的二次复筛结果，选取芽孢率≥90%、抑菌圈≥20mm、生物量≥20%的菌株，用接种针接入斜面培养基，于30℃培养48h，得二代种子斜面，然后在无菌条件下，将二代种子斜面用接种铲接入种子摇瓶培养基，于30℃培养22h，得摇瓶种子液；
e）发酵培养：将步骤d）中的摇瓶种子液合瓶，然后接种种子罐培养基，经过一级种子液和二级种子液制备后，进入发酵罐接种发酵培养基进行培养，培养温度为30±0.5℃，罐压：0.03～0.05MPa，pH值为6.3～6.6，流量1:0.3～1:0.8，转速300rpm，至芽孢率大于85%时放罐。
进一步地：步骤a）、c）和d）中所述的斜面培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖0.2～2.5%、蔗糖0.5～3.5%、酵母粉0.1～2.0%、牛肉膏0.5～1.5%、胰蛋白胨0.5～3.0%、磷酸氢二铵0.1～2.0%、氯化钠0.5～3.5%、硫酸锰0.005～0.1%、硫酸铵0.5～3.5%、磷酸氢二钾0.1～0.5%、硫酸镁0.1～0.5%、琼脂1.5～2.2%，余量为水；pH值为6.5～7.5。
进一步地：步骤b）中所述的紫外诱变处理方式为：将菌悬液暴露在256nm波长的紫外线下，距离30cm，振摇60s、90s、120s、然后于暗光处，30℃培养16h。
进一步地：步骤b）中所述的亚硝基胍诱变处理方式为：将菌悬液与200mg/L的亚硝基胍溶液等体积混合，于37℃下作用30min，而后立即用等量的pH8.0的磷酸缓冲液终止反应。
进一步地：步骤b）中所述的分离平板培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖0.2～2.5%、酵母粉0.1～2.0%、牛肉膏0.5～1.5%、胰蛋白胨0.5～3.0%、氯化钠0.5～3.5%、硫酸锰0.005～0.1%、硫酸铵0.5～3.5%、磷酸氢二钾0.1～0.5%、硫酸镁0.1～0.5%、琼脂1.5～2.2%，余量为水；pH为6.5-7.5。
进一步地：步骤c）中所述的摇瓶发酵培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖2～4.5%、黄豆饼粉1～3.5%、玉米粉0.8～2.0%、酵母粉0.2～1.0%、磷酸二氢钾0.2～1.0%、磷酸氢二钠0.2～1.0%、硫酸镁0.02～0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
进一步地：步骤c）与步骤d）中所述的种子摇瓶培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖1.0～2.5%、黄豆饼粉1.0～2.5%、酵母粉0.2～1.0%、蛋白胨0.2～1.0%、玉米浆0.2～1.5%、磷酸二氢钾0.2～1.0%、磷酸氢二钠0.2～1.0%、硫酸镁0.02～0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
进一步地：步骤e)中所述的种子罐培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖1.0～2.5%、黄豆饼粉1.0～2.5%、酵母粉0.2～1.0%、蛋白胨0.2～1.0%、玉米浆0.2～1.5%、磷酸二氢钾0.2～1.0%、磷酸氢二钠0.2～1.0%、硫酸镁0.02～0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
进一步地：步骤e）中所述的发酵培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖2～4.5%、黄豆饼粉1～3.5%、玉米粉0.8～2.5%、酵母粉0.2～2.5%、磷酸二氢钾0.2～2.5%、磷酸氢二钠0.2～2.5%、硫酸镁0.02～0.25%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
本发明有益效果在于，相对于常规的单株分别发酵，然后将所得发酵液混合，再进行浓缩、制粒、干燥，从而获得产品的方法，本发明通过诱变育种，改变了菌种的成长特性，优化了发酵工艺，使得原本在不同培养条件下培养，且分别具有不同生理功能的三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3，通过固体培养、摇瓶种子制备，然后将三株地衣芽孢杆菌的摇瓶种子液合瓶，经过一级种子制备、二级种子制备，最后于同一发酵罐内发酵培养，从而降低了生产成本。
附图说明
图1为了常规单株发酵工艺的流程图；
图2为本发明所述三株混合发酵工艺的流程图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。
本发明具体实施方式中所述的三株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）L1、L2、L3，已保藏于中国农业微生物菌种保藏中心，其中，地衣芽孢杆菌L1的保藏编号为：ACCC11080，其作用为：分解木质素，具有促生长功能；所述的地衣芽孢杆菌L2的保藏编号为：ACCC10613，其作用为：产生杆菌肽，具有抑制细菌性及霉菌性根腐病的功能；所述的地衣芽孢杆菌L3的保藏编号为：ACCC11106，其作用为抗梨黑星病。
实施例1 菌株筛选
1、固体斜面培养
将三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3在无菌条件下分别接种于斜面培养基上进行培养，其中：地衣芽孢杆菌L1的培养条件为37℃，24h，地衣芽孢杆菌L2的培养条件为30℃，24h，地衣芽孢杆菌L3的培养条件为32℃，24h；
按重量百分比计，所用的斜面培养基组分为：葡萄糖0.5%、蔗糖0.5%、酵母粉1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、磷酸氢二铵0.1%、氯化钠0.5%、硫酸锰0.005%、硫酸铵0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.1%、琼脂1.5%，余量为水，pH为7.2。
2、理化因子诱变
取上述固体斜面培养物，在无菌条件下，用0.9%的生理盐水制备菌悬液，浓度控制在108～109个/ml（血球计数浓度）；
然后将上述菌悬液暴露在256nm波长的紫外线下，距离30cm，分别振摇60s、90s、120s，然后于暗光处，30℃培养16h；
在无菌条件下，将上述UV处理的菌悬液，用0.9%的生理盐水梯度稀释至10-1～10-6个/ml（血球计数浓度），涂布于分离平板，于30℃培养48h，然后按照致死率为70%～90%的处理剂量，进行摇瓶筛选；按重量百分比计，所用的分离平板培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖0.5%、酵母粉1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、氯化钠0.5%、硫酸锰0.005%、硫酸铵0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.1%、琼脂1.5%，余量为水，pH为7.2；
根据上述摇瓶筛选结果，选择正突变的菌株，用pH6.0的磷酸缓冲液制备菌悬液，血球计数浓度为107～109个/ml；
将1ml上述菌悬液与1ml的200mg/L的亚硝基胍溶液等体积混合，于37℃下作用30min，而后立即用2ml的pH8.0的磷酸缓冲液终止反应，
用0.9%的生理盐水将上述反应液梯度稀释至10-1～10-6个/ml（血球计数浓度），涂布分离平板，于30℃培养48h，直至长出单菌落，所用的分离平板培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖0.5%、酵母粉1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、氯化钠0.5%、硫酸锰0.005%、硫酸铵0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.1%、琼脂1.5%，余量为水，pH为7.2；
在无菌条件下，将上述单菌落从分离平板上接入斜面培养基，于30℃培养48h，得单菌落斜面，按重量百分比计，所用斜面培养基组分为：葡萄糖0.5%、蔗糖0.5%、酵母粉1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、磷酸氢二铵0.1%、氯化钠0.5%、硫酸锰0.005%、硫酸铵0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.1%、琼脂1.5%，余量为水，pH为7.2。
将上述单菌落斜面一对一接入种子摇瓶培养基，于30℃恒温振荡培养22h，得初筛种子液；按重量百分比计，所用的种子摇瓶培养基组分为：葡萄糖2.0%、黄豆饼粉1.0%、酵母粉1.0%、蛋白胨0.5%、玉米浆0.2%、磷酸二氢钾0.2%、磷酸氢二钠0.2%、硫酸镁0.02%、碳酸钙0.5%，余量为水，pH为7.0，并在120℃下灭菌30min；
然后在无菌条件下，将初筛种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，于30℃恒温振荡培养48h，按重量百分比计，所用的摇瓶发酵培养基为：葡萄糖4%、黄豆饼粉1%、玉米粉0.8%、酵母粉0.5%、磷酸二氢钾0.2%、磷酸氢二钠0.2%、硫酸镁0.05%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5，然后以芽孢率、抑菌能力（抑菌圈）、生物量为指标进行初筛，根据初筛结果，选取芽孢率、抑菌圈及生物量比对照株高的菌株进入一次复筛，初筛结果见表1：
表1 初筛结果
根据表1的初筛结果，以芽孢率、抑菌圈及生物量排序，选择芽孢率、抑菌圈及生物量均比对照出发菌株L1、L2、L3高的菌株进行一次复筛；本实施例中选取L1-3、L1-8、L1-13、L1-14、L2-5、L2-8、L2-13、L2-18、L2-26、L3-1、L3-6、L3-11、L3-17、L3-28与对照菌株L1、L2、L3进行一次复筛。
将上述筛选出的菌株一对一接入种子摇瓶培养基，于30℃恒温培养22h，得一次复筛种子液，然后在无菌条件下，将一次复筛种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，一只种子瓶转接3只发酵瓶，而后以30℃恒温振荡培养48h，然后以芽孢率、抑菌能力（抑菌圈）、生物量为指标进行一次复筛，所用的一次复筛种子摇瓶培养基与发酵摇瓶培养基，与摇瓶初筛所用培养基相同。根据一次复筛结果，选取芽孢率、抑菌圈及生物量比对照株高的菌株进入二次复筛，但优选芽孢率≥90%、抑菌圈≥20mm、生物量≥15%的菌株。一次复筛结果见表2：
表2 一次复筛结果
根据表2的一次复筛结果，以芽孢率、抑菌圈及生物量排序，选择芽孢率、抑菌圈及生物量均比对照出发菌株高的菌株进行二次复筛，本实施例中选取L1-3、L1-13、L2-13、L2-18、L3-1、L3-17与对照菌株L1、L2、L3进行二次复筛。
将上述筛选出的菌株一对一接入种子摇瓶培养基，于30℃恒温培养22h，得二次复筛种子液，然后在无菌条件下，将种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，一只种子瓶转接5只发酵瓶，而后以30℃恒温振荡培养48h，然后以芽孢率、抑菌能力（抑菌圈）、生物量为指标，选取用于混合发酵的菌株。所用的二次复筛种子摇瓶培养基与发酵摇瓶培养基，与摇瓶初筛所用培养基相同；根据二次复筛结果，选取芽孢率≥90%、抑菌圈≥20mm、生物量≥20%的菌株，进入本发明的混合发酵工艺。二次复筛结果见表3：
表3 二次复筛结果
根据表3的二次复筛结果，本实施例中选取中试放大所用菌株为：L1-13、L2-18、L3-17。需要说明的是，L1-13、L2-18、L3-17只是本实施例中筛选出的用于混合发酵的菌株。发明人经过多次反复试验得出，通过上述筛选方式筛选菌株，只要满足芽孢率≥90%、抑菌圈≥20mm、生物量≥20%的菌株，均适用于本发明的混合发酵工艺。
表4示出了菌株L1-13、L2-18、L3-17与对照菌株L1、L2、L3经过初筛、一次复筛、二次复筛后的各项参数对比。
表4 L1、L2、L3与L1-13、L2-18、L3-17筛选参数对比
从表4可以得出：以原本具有不同培养条件的L1、L2、L3为出发菌株，经过理化因子诱变处理，获得突变株L1-13、L2-18、L3-17，突变株不仅能在相同培养条件下生长繁殖，而且产孢率、抑菌能力（抑菌圈）及繁殖能力对比出发菌株均有明显的提升。
实施例2-4 混合发酵实验
实施例2
在无菌条件下，将L1-13、L2-18、L3-17的单菌落斜面（母斜面）从4℃冰箱取出，用75%的酒精棉球擦拭外壁后，带入无菌室。在超净工作台上，用无菌接种铲，从母斜面上刮取0.1cm2的菌苔，迅速接入无菌的斜面培养基中，从上到下以“S”线均匀涂布。包扎后，于30℃培养48h，得L1-13、L2-18、L3-17的二代种子斜面，编号为L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2，培养结束后，于4℃冰箱保藏。按重量百分比计，所用的斜面培养基组分为：葡萄糖0.2%、蔗糖0.5%、酵母粉0.5%、牛肉膏0.9%、胰蛋白胨0.8%、磷酸氢二铵0.1%、氯化钠0.5%、硫酸锰0.005%、硫酸铵0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.1%、琼脂1.5%、余量为水；pH为6.5-7.5，并于120℃灭菌30min。
无菌条件下，将二代种子斜面L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2从4℃冰箱取出，用75%的酒精棉球擦拭外壁后，带入无菌室。在超净工作台上，用无菌接种铲，从母斜面上刮取1cm2的菌苔，迅速接入无菌的种子摇瓶培养基，每接一瓶，更换一只接种铲，每批种子液接种20瓶，于30℃，180rpm振荡培养22h，得L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2的摇瓶种子液。按重量百分比计，所用种子摇瓶培养基组分为：葡萄糖1.0%、黄豆饼粉1.5%、酵母粉0.5%、蛋白胨0.2%、玉米浆1.0%、磷酸二氢钾0.2%、磷酸氢二钠0.2%、硫酸镁0.05%、碳酸钙0.5%、余量为水；pH为6.5-7.0，并于120℃下灭菌30min。每500ml三角摇瓶装100ml培养基。
在无菌条件下，先选取15瓶上述摇瓶种子液分别合瓶（将所需的摇瓶种子液合并在一起），即得L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2种子液各1500ml；然后将每株剩余的5瓶种子液，混合在一起，即得L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2混合种子液1500ml。
接种一级种子罐：将合瓶的种子液投入一级种子罐中接种一级种子罐培养基进行培养。罐压0.03～0.05MPa，流量1:0.3～1:0.8，pH6.3～6.6，转速300rpm，温度30±0.5℃。
接种二级种子罐：工艺配制二级种子罐培养基，于120℃灭菌30min。同时用同样的温度对导种管路进行灭菌1h，保压待移种。当一级种子罐培养至22-26h，生物量大于25%，结晶紫染色均匀，菌体成均一杆状，且无芽孢产生，无杂菌时，打开导种管路以10%的接种量，将一级种子液接入二级种子罐中进行培养。培养条件：罐压0.03～0.05MPa，流量1:0.3～1:0.8，pH6.3～6.6，转速300rpm，温度30±0.5℃。
按重量百分比计，接种一级种子与二级种子的种子罐培养基组分为：葡萄糖1%、黄豆饼粉1.5%、玉米浆1.0%、酵母粉0.5%、蛋白胨0.2%、磷酸二氢钾0.2%、磷酸氢二钠0.2%、硫酸镁0.05%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为：6.5-7.0。
接种发酵罐：工艺配制发酵罐培养基，于120℃灭菌30min。同时用同样的温度对导种管路进行灭菌1h，保压待移种。当二级种子罐培养至22-26h，生物量大于25%，结晶紫染色均匀，菌体成均一杆状，且有15%芽孢产生，无杂菌时，打开导种管路以10%的接种量，将二级种子液接入发酵罐中。培养条件：罐压0.03～0.05MPa，流量1:0.3～1:0.8，pH6.3～6.6，转速300rpm，温度30±0.5℃；按重量百分比计，所用的发酵摇瓶培养基组分为：葡萄糖2%、黄豆饼粉3.5%、玉米粉2%、酵母粉0.2%、磷酸二氢钾0.2%、磷酸氢二钠0.2%、硫酸镁0.05%、碳酸钙0.5%、余量为水。pH为6.5-7.0。
作为对照，对照菌株L1、L2、L3的单菌落斜面同时经过上述混合发酵工艺。
自接种后每4h取生化样检测还原糖、氨基氮、pH、生物量，自镜检有芽孢产生，开始记录活菌数（平板计数法）和产孢率。当芽孢率大于85%时放罐，试验结果见表5-表6：
表5 L1F2、L2F2、L3F2与L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2二代斜面单株发酵结果比较
| 菌号 | 芽孢率% | 抑菌圈mm | 生物量% | 芽孢形态 |
| L1F2对照株 | 60% | 20 | 14 | 小、空孢、大小不一 |
| L1-13F2突变株 | 80% | 28 | 29 | 均一，芽孢偏中生 |
| L2F2对照株 | 65% | 16 | 14 | 小、空孢、大小不一 |
| L2-18F2突变株 | 85% | 28 | 29 | 均一，芽孢偏中生 |
| L3F2对照株 | 65% | 20 | 14 | 小、空孢、大小不一 |
| L3-17F2突变株 | 80% | 28 | 29 | 均一，芽孢偏中生 |
表6 L1F2 L2F2 L3F2混合发酵与L1-13F2 L2-18F2 L3-17F2
二代斜面混合发酵结果比较
实施例3
在无菌条件下，将L1-13、L2-18、L3-17的单菌落斜面（母斜面）从4℃冰箱取出，用75%的酒精棉球擦拭外壁后，带入无菌室。在超净工作台上，用无菌接种铲，从母斜面上刮取0.1cm2的菌苔，迅速接入无菌的斜面培养基中，从上到下以“S”线均匀涂布。包扎后，于30℃培养48h，得L1-13、L2-18、L3-17的二代种子斜面，编号为L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2，培养结束后，于4℃冰箱保藏。按重量百分比计，所用斜面培养基组分为：葡萄糖1.0%、蔗糖1.0%、酵母粉1.0%、牛肉膏0.5%、胰蛋白胨0.5%、磷酸氢二铵0.5%、氯化钠0.8%、硫酸锰0.005%、硫酸铵1.0%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.3%、琼脂1.6%、余量为水；pH为6.5-7.5。
无菌条件下，将二代种子斜面L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2从4℃冰箱取出，用75%的酒精棉球擦拭外壁后，带入无菌室。在超净工作台上，用无菌接种铲，从母斜面上刮取1cm2的菌苔，迅速接入无菌的种子摇瓶培养基中，每接一瓶，更换一只接种铲，每批种液接种20瓶，于30℃，180rpm振荡培养22h，得L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2的摇瓶种子液。按重量百分比计，所用种子摇瓶培养基组分为：葡萄糖1.5%、黄豆饼粉1.0%、酵母粉1.0%、蛋白胨1.0%、玉米浆0.2%、磷酸二氢钾0.5%、磷酸氢二钠0.5%、硫酸镁0.02%、碳酸钙0.5%、余量为水；pH为6.5-7.0，并于120℃下灭菌30min。每500ml三角摇瓶装100ml培养基。
在无菌条件下，先选取15瓶摇瓶种子液分别合瓶（将所需的摇瓶种子液合并在一起），即得L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2种子液各1500ml；然后将每株剩余的5瓶种子液，混合在一起，即得L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2混合种子液1500ml。
接种一级种子罐：将合瓶的种子液投入一级种子罐中接种一级种子罐培养基进行培养。罐压0.03～0.05MPa，流量1:0.3～1:0.8，pH6.3～6.6，转速300rpm，温度30±0.5℃。
接种二级种子罐：工艺配制二级种子培养基，于120℃灭菌30min。同时用同样的温度对导种管路进行灭菌，时间1h，保压待移种。当一级种子罐培养至22-26h，生物量大于25%，结晶紫染色均匀，菌体成均一杆状，且无芽孢产生，无杂菌时，打开导种管路以10%的接种量，将一级种子液接入二级种子罐中进行培养。培养条件：罐压0.03～0.05MPa，流量1:0.3～1:0.8，pH6.3～6.6，转速300rpm，温度30±0.5℃。
按重量百分比计：接种一级种子与二级种子的种子罐培养基组分为：葡萄糖1.5%、黄豆饼粉1.0%、玉米浆0.2%、酵母粉1.0%、蛋白胨1.0%、磷酸二氢钾0.5%、磷酸氢二钠0.5%、硫酸镁0.02%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为：6.5-7.0。
接种发酵罐：工艺配制发酵罐培养基，于120℃灭菌30min。同时用同样的温度对导种管路进行灭菌，时间1h，保压待移种。当二级种子罐培养至22-26h，生物量大于25%，结晶紫染色均匀，菌体成均一杆状，且有约15%芽孢产生，无杂菌时，打开导种管路以10%的接种量，将二级种子液接入发酵罐中。培养条件：罐压0.03～0.05MPa，流量1:0.3～1:0.8，pH6.3～6.6，转速300rpm，温度30±0.5℃；按重量百分比计，所用的发酵摇瓶培养基组分为：葡萄糖3%、黄豆饼粉2.5%、玉米粉1.5%、酵母粉0.5%、磷酸二氢钾0.4%、磷酸氢二钠0.5%、硫酸镁0.06%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
作为对照，对照菌株L1、L2、L3的单菌落斜面同时经过上述混合发酵工艺。
自接种后每4h取生化样检测还原糖、氨基氮、pH、生物量，自镜检有芽孢产生，开始记录活菌数（平板计数法）和产孢率。当芽孢率大于85%时放罐，试验结果见表7-表8：
表7 L1F2、L2F2、L3F2与L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2二代斜面单株发酵结果比较
| 菌号 | 芽孢率% | 抑菌圈mm | 生物量% | 芽孢形态 |
| L1F2对照株 | 65% | 18 | 15 | 小、空孢、大小不一 |
| L1-13F2突变株 | 81% | 25 | 27 | 均一，芽孢偏中生 |
| L2F2对照株 | 60% | 18 | 15 | 小、空孢、大小不一 |
| L2-18F2突变株 | 80% | 25 | 27 | 均一，芽孢偏中生 |
| L3F2对照株 | 60% | 18 | 15 | 小、空孢、大小不一 |
| L3-17F2突变株 | 75% | 28 | 30 | 均一，芽孢偏中生 |
表8 L1F2 L2F2 L3F2混合发酵与L1-13F2 L2-18F2 L3-17F2
二代斜面混合发酵结果比较
实施例4
在无菌条件下，将L1-13、L2-18、L3-17的单菌落斜面（母斜面）从4℃冰箱取出，用75%的酒精棉球擦拭外壁后，带入无菌室。在超净工作台上，用无菌接种铲，从母斜面上刮取0.1cm2的菌苔，迅速接入无菌的斜面培养基中，从上到下以“S”线均匀涂布。包扎后，于30℃培养48h，得L1-13、L2-18、L3-17的二代种子斜面，编号为L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2，培养结束后，于4℃冰箱保藏。按重量百分比计，所用斜面培养基组分为：葡萄糖2.5%、蔗糖3.5%、酵母粉2.0%、牛肉膏1.5%、胰蛋白胨3.0%、磷酸氢二铵2.0%、氯化钠3.5%、硫酸锰0.1%、硫酸铵3.5%、磷酸氢二钾0.5%、硫酸镁0.5%、琼脂2.2%、余量为水；pH为6.5-7.5。
无菌条件下，将二代种子斜面L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2从4℃冰箱取出，用75%的酒精棉球擦拭外壁后，带入无菌室。在超净工作台上，用无菌接种铲，从母斜面上刮取1cm2的菌苔，迅速接入无菌的种子摇瓶培养基中，每接一瓶，更换一只接种铲，每批种液接种20瓶，于30℃，180rpm振荡培养22h，得L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2的摇瓶种子液。按重量百分比计，所用种子摇瓶培养基组分为：葡萄糖2.5%、黄豆饼粉2.5%、酵母粉0.2%、蛋白胨0.2%、玉米浆1.5%、磷酸二氢钾1.0%、磷酸氢二钠1.0%、硫酸镁0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水；pH为6.5-7.0，并于120℃下灭菌30min。每500ml三角摇瓶装100ml培养基。
在无菌条件下，先选取15瓶摇瓶种子液分别合瓶（将所需的种子摇瓶液合并在一起），即得L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2种子液各1500ml；然后将每株剩余的5瓶种子液，混合在一起，即得L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2混合种子液1500ml。
接种一级种子罐：将合瓶的种子液投入一级种子罐中接种一级种子罐培养基进行培养。罐压0.03～0.05MPa，流量1:0.3～1:0.8，pH6.3～6.6，转速300rpm，温度30±0.5℃。
接种二级种子罐：工艺配制二级种子罐培养基，于120℃灭菌30min。同时用同样的温度对导种管路进行灭菌，时间1h，保压待移种。当一级种子罐培养至22-26h，生物量大于25%，结晶紫染色均匀，菌体成均一杆状，且无芽孢产生，无杂菌时，打开导种管路以10%的接种量，将一级种子液接入二级种子罐中进行培养。培养条件：罐压0.03～0.05MPa，流量1:0.3～1:0.8，pH6.3～6.6，转速300rpm，温度30±0.5℃。
按重量百分比计：接种一级种子与二级种子的种子罐培养基组分为：葡萄糖2.5%、黄豆饼粉2.5%、玉米浆1.5%、酵母粉0.2%、蛋白胨0.2%、磷酸二氢钾1.0%、磷酸氢二钠1.0%、硫酸镁0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为：6.5-7.0。
接种发酵罐：工艺配制发酵罐培养基，于120℃灭菌30min。同时用同样的温度对导种管路进行灭菌，时间1h，保压待移种。当二级种子罐培养至22-26h，生物量大于25%，结晶紫染色均匀，菌体成均一杆状，且有约15%芽孢产生，无杂菌时，打开导种管路以10%的接种量，将二级种子液接入发酵罐中。培养条件：罐压0.03～0.05MPa，流量1:0.3～1:0.8，pH6.3～6.6，转速300rpm，温度30±0.5℃；按重量百分比计，所用的发酵摇瓶培养基组分为：葡萄糖4.5%、黄豆饼粉1%、玉米粉0.8%、酵母粉0.2%、磷酸二氢钾1.0%、磷酸氢二钠1.0%、硫酸镁0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
作为对照，对照菌株L1、L2、L3的单菌落斜面同时经过上述混合发酵工艺。
自接后每4h取生化样检测还原糖、氨基氮、pH、生物量，自镜检有芽孢产生，开始记录活菌数（平板计数法）和产孢率。当芽孢率大于85%时放罐，试验结果见表9-表10：
表9 L1F2、L2F2、L3F2与L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2二代斜面单株发酵结果比较
| 菌号 | 芽孢率% | 抑菌圈mm | 生物量% | 芽孢形态 |
| L1F2对照株 | 62% | 16 | 15 | 小、空孢、大小不一 |
| L1-13F2突变株 | 80% | 27 | 27 | 均一，芽孢偏中生 |
| L2F2对照株 | 60% | 20 | 18 | 小、空孢、大小不一 |
| L2-18F2突变株 | 75% | 29 | 30 | 均一，芽孢偏中生 |
| L3F2对照株 | 65% | 16 | 15 | 小、空孢、大小不一 |
| L3-17F2突变株 | 85% | 29 | 29 | 均一，芽孢偏中生 |
表10 L1F2 L2F2 L3F2混合发酵与L1-13F2 L2-18F2 L3-17F2二代斜面混合发酵结果比较
结果分析
1）发酵效果分析：从表5-表10可以看出：相同条件下，无论单株发酵还是混合发酵，在产孢率、抑菌能力（抑菌圈）、生物量及芽孢形态方面，突变株比对照株均有明显提高，无论是对照组还是突变株，采用三株地衣芽孢杆菌混合发酵的结果要优于单株发酵。抑菌能力提高10～15%，芽孢率提高了16～23%。
2）拮抗性分析：表11示出了三株地衣芽孢杆菌抑菌能力及相互间拮抗性试验结果。
表11 三株地衣芽孢杆菌抑菌能力及相互间拮抗性试验结果
3）发酵成本分析：单株单罐发酵与三株混合单罐发酵直接生产成本比较见表12：
表12 单株单罐发酵与三株混合单罐发酵直接生产成本比较
从表12可以看出，相对于单株单罐发酵，采用三株混合单罐发酵的生产成本每批节约了约200%。
4）用于农作物的效果分析：三株地衣芽孢杆菌采用混合发酵工艺与单株发酵工艺后所制得的产品，用于农作物的效果比较见表13：
其中：1#样品为三株地衣芽孢杆菌突变株L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2按照本发明实施例4中的培养液，分别经过二代斜面制备、摇瓶种子液制备、一级种子液和二级种子液制备、发酵液制备后，进行单株发酵，然后发酵罐1、2、3的发酵液混合，再经浓缩、造粒、干燥，得单株发酵样品1#。即每一菌株均经过如附图1所示的流程：
2#样品为三株地衣芽孢杆菌突变株L1-13F2、L2-18F2、L3-17F2按照本发明实施例4中的培养液，分别经过二代斜面制备、摇瓶种子液制备后，三株地衣芽孢杆菌突变株混合三级发酵获得发酵液，然后经浓缩、制粒、干燥，得混合发酵样品2#。即每一菌株均经过如附图2所示的流程：
表13 用于农作物的效果比较
Claims (9)
1.一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，所述地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）分别为L1、L2、L3，保藏于中国农业微生物菌种保藏中心；其中，L1的保藏编号为ACCC11080，L2的保藏编号为ACCC10613，L3的保藏编号为ACCC11106；其特征在于，包含以下步骤：
a）固体斜面培养：将三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3在无菌条件下分别接种于斜面培养基上进行分别培养，其中：地衣芽孢杆菌L1的培养条件为30～37℃，24～48h，地衣芽孢杆菌L2的培养条件为25～30℃，24～48h，地衣芽孢杆菌L3的培养条件为28～32℃，24～48h；
b）理化因子诱变：将步骤a）中制得的固体斜面培养物，在无菌条件下，分别用0.9%的生理盐水制备成浓度为108～109个/ml（血球计数浓度）的菌悬液；然后将制得的菌悬液进行紫外诱变处理，按照致死率70%～90%的处理剂量进行摇瓶筛选，根据摇瓶筛选结果，选择正突变的菌株，进行亚硝基胍诱变处理，并用0.9%的生理盐水将亚硝基胍诱变处理后的反应液稀释后涂布分离平板，接入分离平板培养基，于30℃培养48h，至长出单菌落；
c）摇瓶筛选：无菌条件下，将步骤b）中制得的单菌落从分离平板上分别接入斜面培养基，于30℃培养48h，得单菌落斜面；然后将单菌落斜面一对一接入种子摇瓶培养基，于30℃恒温振荡培养22h，得筛选种子液；再在无菌条件下，将筛选种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基，于30℃恒温振荡培养48h，以芽孢率、抑菌能力（抑菌圈）、生物量为指标，进行摇瓶初筛、摇瓶一次复筛及摇瓶二次复筛；
d）根据步骤c）中的二次复筛结果，选取芽孢率≥90%、抑菌圈≥20mm、生物量≥20%的菌株，分别用接种针接入斜面培养基，于30℃培养48h，得二代种子斜面，然后在无菌条件下，将二代种子斜面用接种铲接入种子摇瓶培养基，于30℃培养22h，得摇瓶种子液；
e）发酵培养：将步骤d）中的摇瓶种子液合瓶，然后接种种子罐培养基，经过一级种子液和二级种子液制备后，进入发酵罐接种发酵培养基进行培养，培养温度为30±0.5℃，罐压：0.03～0.05MPa，pH值为6.3～6.6，流量1:0.3～1:0.8，转速300rpm，至芽孢率大于85%时放罐。
2.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤a）、c）、d）中所述的斜面培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖0.2～2.5%、蔗糖0.5～3.5%、酵母粉0.1～2.0%、牛肉膏0.5～1.5%、胰蛋白胨0.5～3.0%、磷酸氢二铵0.1～2.0%、氯化钠0.5～3.5%、硫酸锰0.005～0.1%、硫酸铵0.5～3.5%、磷酸氢二钾0.1～0.5%、硫酸镁0.1～0.5%、琼脂1.5～2.2%、余量为水，pH为6.5～7.5。
3.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤b）中所述的紫外诱变处理方式为：将菌悬液暴露在256nm波长的紫外线下，距离30cm，分别振摇60s、90s、120s，然后于暗光处，30℃培养16h。
4.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤b）中所述的亚硝基胍诱变处理方式为：将菌悬液与200mg/L的亚硝基胍溶液等体积混合，于37℃下作用30min，而后立即用等量的pH8.0的磷酸缓冲液终止反应。
5.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤b）中所述的分离平板培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖0.2～2.5%、酵母粉0.1～2.0%、牛肉膏0.5～1.5%、胰蛋白胨0.5～3.0%、氯化钠0.5～3.5%、硫酸锰0.005～0.1%、硫酸铵0.5～3.5%、磷酸氢二钾0.1～0.5%、硫酸镁0.1～0.5%、琼脂1.5～2.2%、余量为水，pH为6.5-7.5。
6.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤c）中所述的摇瓶发酵培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖2～4.5%、黄豆饼粉1～3.5%、玉米粉0.8～2.0%、酵母粉0.2～1.0%、磷酸二氢钾0.2～1.0%、磷酸氢二钠0.2～1.0%、硫酸镁0.02～0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
7.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤c）与步骤d）中所述的种子摇瓶培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖1.0～2.5%、黄豆饼粉1.0～2.5%、酵母粉0.2～1.0%、蛋白胨0.2～1.0%、玉米浆0.2～1.5%、磷酸二氢钾0.2～1.0%、磷酸氢二钠0.2～1.0%、硫酸镁0.02～0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
8.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤e)中所述的种子罐培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖1.0～2.5%、黄豆饼粉1.0～2.5%、酵母粉0.2～1.0%、蛋白胨0.2～1.0%、玉米浆0.2～1.5%、磷酸二氢钾0.2～1.0%、磷酸氢二钠0.2～1.0%、硫酸镁0.02～0.1%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
9.根据权利要求1所述的一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺，其特征在于：步骤e)中所述的发酵培养基，其组分按重量百分比计为：葡萄糖2～4.5%、黄豆饼粉1～3.5%、玉米粉0.8～2.5%、酵母粉0.2～2.5%、磷酸二氢钾0.2～2.5%、磷酸氢二钠0.2～2.5%、硫酸镁0.02～0.25%、碳酸钙0.5%、余量为水，pH为6.5-7.0。
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Legal Events
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Application publication date: 20130612 |