CN107488600A - 一株高产耐氧化低温葡萄糖氧化酶的黑曲霉 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种生产低温葡萄糖氧化酶的黑曲霉及其生产方法。所述黑曲霉为黑曲霉(Aspergillu niger)CH870，保藏编号为CGMCC No.14138。该菌株发酵生产的葡萄糖氧化酶的发酵液酶活达到2300U/ml以上，所生产的葡萄糖氧化酶在pH2.0‑8.0范围内稳定，最适反应温度20℃，稳定性好，且具有耐氧化性，30mmol过氧化氢条件下，剩余酶活为100％；200mmol过氧化氢条件下，剩余酶活为90.8％，应用广泛。

Description

一株高产耐氧化低温葡萄糖氧化酶的黑曲霉

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种耐氧化性提高的低温葡萄糖氧化酶及其生产方法。

背景技术：

葡萄糖氧化酶(GOD)能够专一地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，葡萄糖氧化酶在食品、医药及生物等领域都有着广泛的应用。

由于葡萄糖氧化酶能够催化葡萄糖消耗氧气，产生葡萄糖酸和过氧化氢，所以它在食品行业中应用非常广泛，主要表现在以下四个方面：去除食品中残留的葡萄糖、脱氧、杀菌、测定食品中葡萄糖含量。

葡萄糖氧化酶作为新型的绿色酶制剂，在1999年被国家列为12种被允许使用的饲料添加剂之一。葡萄糖氧化酶促生长的作用机理是：在动物饲料中添加的葡萄糖氧化酶能具有抗氧化的功能，能够清除掉牲畜应激状态下在肠道上皮细胞产生的大量自由基，来保护肠道上皮细胞的完整性。

医学上尿糖试纸用来测定糖尿病人尿液中的葡萄糖含量，原理是根据葡萄糖氧化酶酶促反应产生过氧化氢，过氧化氢被过氧化氢酶进一步分解可以产生水和氧，氧将试纸上的还原型并且无色邻联甲苯胺染料氧化为蓝色物质，蓝色物质生成量与葡萄糖浓度成比例，将试纸颜色的深浅与标准色板比较，判断尿中葡萄糖的含量多少。葡萄糖氧化酶氧速率法测定葡萄糖的准确度高、线性范围广、反应特异性强、重复性良好。

目前国际上研制成功的酶传感器有几十种，Updike和Hicks于1967年首次将GOD膜覆盖在铂电极上从而制成酶传感器，它用于定量的检测血清中葡萄糖的含量，并且成功地制成了第一支葡萄糖生物传感器。

葡萄糖氧化酶(GOD)广泛分布于动物、植物及微生物体内。但由于在动植物体内含量较少，并且提取上有一定的局限性，故较少采用。

在微生物中，葡萄糖氧化酶的生产主要采用霉菌发酵法，一般采用曲霉和青霉做为生产菌种，如黑曲霉、米曲霉、青霉、乳酸克鲁维酵母和脆壁克鲁维酵母，是工业生产GOD的普遍酶原。目前，国内外均采用微生物发酵法生产葡萄糖氧化酶。由于霉菌在一定条件下产生葡萄糖氧化酶的能力强，因此，葡萄糖氧化酶的工业化生产主要采用黑曲霉(Aspergillu niger)和青霉菌(Penicilliunnotation)。但葡萄糖氧化酶几乎全部依赖于进口，生产成本也随之提高。因此，筛选产葡萄糖氧化酶酶活较高的菌株，具有重大的实际应用价值。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将提供一株高产耐氧化低温葡萄糖氧化酶的黑曲霉菌株。

所述黑曲霉是本实验室经物理诱变和化学复合诱变后得到一株耐氧化性提高的高产低温葡萄糖氧化酶菌株，经鉴定其属于黑曲霉，具体为黑曲霉(Aspergillu niger)CH870，该菌株已于2017年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.14138。

本发明还提供一种发酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的葡萄糖氧化酶的液态微生物发酵生产方法，具体如下：

以黑曲霉(Aspergillu niger)CH870为生产菌种；

(1)种子罐培养：

罐压0.05-0.08MPa，培养温度30℃，通风量30m³/h，搅拌转速180r/min，pH控制7.0；培养至菌体染色深、粗壮，无杂菌，结束培养；

种子罐培养基：葡萄糖20％，蛋白胨25％，(NH₄)₂SO₄ 5％，K₂HPO₄ 1％，MgSO₄·7H₂O0.5％，pH 7.0；

(2)发酵罐培养

罐压0.05-0.08Mpa，培养温度30℃，搅拌转速300r/min，pH控制6.5-7.0；通风量：0-40h为30m³/h，40-58h为45m³/h，58h-放罐为40m³/h；当pH升至7.0时，开始补料，控制pH在6.5-7.0；

发酵培养基(质量体积比)：蔗糖12.30％、蛋白胨0.41％、NaNO₃ 0.6％、KH₂PO₄0.2％、KCl 0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.07％、CaCO₃1％，pH 7.0；

补料培养基(质量体积比)：蔗糖20％，玉米浆30％，氯化钙0.5％，pH 7.0。

(3)放罐

发酵罐培养至96-110h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐；

经测定，发酵完成后葡萄糖氧化酶的发酵液酶活达到2300U/ml以上；

(4)葡萄糖氧化酶的提取

发酵液-预处理-压滤-超滤-标准化-精滤-调配-灌装-检测-成品。

本发明还提供一种采用来自黑曲霉(Aspergillu niger)CH870的葡萄糖氧化酶，所述葡萄糖氧化酶具有如下特性：

(1)pH：在pH 2.0-8.0范围内稳定；

(2)温度：在40℃以下较为稳定，最适反应温度20℃；在35℃条件下保温1h仍能保持90％以上的活性，当温度升至40℃时，酶活随着保温时间的延长酶活下降为70％左右，45℃时其热稳定性明显减弱；

(3)耐氧化性：30mmol过氧化氢条件下，剩余酶活为100％；200mmol过氧化氢条件下，剩余酶活为90.8％.

有益效果：

本发明提供了一株黑曲霉，该菌株发酵生产的葡萄糖氧化酶的发酵液酶活达到2300U/ml以上，所生产的葡萄糖氧化酶在pH 2.0-8.0范围内稳定，最适反应温度20℃，稳定性好，且具有耐氧化性，30mmol过氧化氢条件下，剩余酶活为100％；200mmol过氧化氢条件下，剩余酶活为90.8％，应用广泛。

附图说明：

图1为不同温度下葡萄糖氧化酶的相对酶活曲线；

图2为不同pH下葡萄糖氧化酶的相对酶活曲线；

图3为葡萄糖氧化酶的热稳定性曲线；

图4为葡萄糖氧化酶的pH稳定性曲线；

具体实施方式：

以下通过具体实施例对本发明做更详细的说明：

实施例1菌株的诱变选育

孢子悬液的制备：将原始菌株斜面上的孢子用适量的无菌生理盐水洗脱，置于预先灭菌带玻璃珠的三角瓶中，于摇床上振荡20min后，用灭菌的脱脂棉过滤去菌丝至分散的单孢子悬液，用血球计数板进行计数。稀释成10⁸个/mL的孢子悬液。

微波诱变：将装有5mL孢子悬液的试管置于含冰块的烧杯中，使用频率为2450MHz，输出功率为700W的微波炉，按不同的时间逐个对试管进行照射，稀释梯度为10^-1～10^-6。取各剂量的10^-4～10^-6 3个稀释度的孢子悬液0.2mL，涂布于平板培养基上，30℃培养2～3d，计算菌落数，绘制致死率曲线。挑取筛选平板(筛选平板培养基：底层培养基：马铃薯20％、葡萄糖2％、NaNO₃ 0.2％、K₂HPO₄ 0.1％、KCl 0.05％、MgSO₄ 0.05％、琼脂1.5％～2.0％；上层培养基：葡萄糖2％、可溶性淀粉1％、KI 0.17％、磷酸缓冲液0.1mol/L、琼脂1.5-2.0％，pH5.5。)上蓝色颜色圈较大单菌落接种到斜面上，进行培养至孢子产生，再通过液体培养基测定每个斜面的菌株的葡萄糖氧化酶酶活。选择葡萄糖氧化酶产量较高，并且能够稳定遗传3代以上的菌株，作斜面保藏，并且作为进一步硫酸二乙酯诱变的出发菌株。

硫酸二乙酯(DES)诱变：取5mL孢子悬液加入到体积为25mL的三角瓶中，再加入0.2mL的DES(体积浓度50％)，振荡不同时间，再加入0.5mL的硫代硫酸钠(85％)终止反应。稀释梯度为10^-1～10^-6。取各剂量的10^-4～10^-6 3个梯度的孢子悬液0.2mL，涂布于平板培养基上，倒置在培养箱培养，30℃培养2～3d。计算菌落数，绘制致死率曲线。挑取筛选平板上蓝色圈较大的单菌落接种到斜面上，进行培养至孢子产生，再通过液体培养基测定每个斜面的菌株的葡萄糖氧化酶酶活，选取酶活高的菌株进行保存。重复上述步骤进行诱变以及筛选，筛选出一株耐氧化性提高的高产低温葡萄糖氧化酶菌株CH870，该菌株生长速度较快，产孢子量少，抗氧化性能提高、发酵产酶温度较低，酶活较高且能稳定遗传，摇瓶发酵酶活比出发菌株提高了5.6倍。

葡萄糖氧化酶高产菌株CH870的稳定性传代实验

将葡萄糖氧化酶高产菌株CH870培养好的新鲜斜面，用无菌铁铲取一接种环菌苔接种到发酵摇瓶中(发摇瓶酵培养基：葡萄糖6％、蛋白胨0.3％、NaNO₃0.4％、KH₂PO₄ 0.2％、KCl 0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.07％、CaCO₃1％、pH自然，115℃灭菌20min)，30℃，220r/min培养96h，测定酶活。将该菌株连续传代10次的摇瓶结果如表1所示：

表1.菌株CH870稳定性检测结果

将该突变菌株传代培养10代，实验结果由表2可以看出，该突变菌株的遗传稳定性好。

实施例2菌株CH870液体发酵生产葡萄糖氧化酶及其提取

(1)种子罐培养：

罐压0.05-0.08MPa，培养温度30℃，通风量30m³/h，搅拌转速180r/min，pH控制7.0；培养至菌体染色深、粗壮，无杂菌，结束培养得种子液；

种子罐培养基：葡萄糖20％，蛋白胨25％，(NH₄)₂SO₄ 5％，K₂HPO₄ 1％，MgSO₄·7H₂O0.5％，pH 7.0；

(2)发酵罐培养

5％接种量将种子液接种至发酵培养基，罐压0.05-0.08Mpa，培养温度30℃，搅拌转速300r/min，pH控制6.5-7.0；通风量：0-40h为30m³/h，40-58h为45m³/h，58h-放罐为40m³/h；当pH升至7.0时，开始补料，控制pH在6.5-7.0；

发酵培养基：蔗糖12.30％、蛋白胨0.41％、NaNO₃ 0.6％、KH₂PO₄ 0.2％、KCl0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.07％、CaCO₃1％，pH 7.0。

补料培养基：蔗糖20％，玉米浆30％，氯化钙0.5％，pH 7.0。

(3)放罐

发酵罐培养至100h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐；

(4)葡萄糖氧化酶的提取

发酵液-预处理-压滤-超滤-标准化-精滤-调配-灌-检测-成品。

a.预处理：放罐后，测量发酵液体积，然后调pH至4.0左右，按照发酵液的体积依次加入2％苯甲酸钠，3％膨润土，4％珍珠岩，最后加入发酵液的1倍体积的水；

b.压滤：配料完毕后，开启各阀门进料，开始时进料速度要适当控制不要太快，使进料压力缓慢上升，同时观察压滤液的清晰度，压滤液清晰后放入清液罐；

c.超滤：起滤前，放掉卷式膜中的保养碱水后，用清水置换，然后放掉膜内残水。开始超滤，进口压力控制在0.4Mpa左右，出口压力控制在0.3Mpa左右，温度控制在25℃以下。超滤至成品活力要求时，打入配兑罐。

d.精滤：精滤按照超滤液的体积加入1‰苯甲酸钠，0.5‰山梨酸钾以及成品要求的各种配料，调pH，搅拌1h后进料精滤。

e.调配、灌装：按产品规格的要求，进行酶活力的调配，灌装。

表2是进行6批发酵的发酵周期和发酵液酶活力，平均发酵液酶活力为：2454U/mL。

表2. 3L小罐发酵实验结果

批次	发酵周期(h)	发酵酶活力(U/mL)
			1	100	2389
2	100	2476
			3	100	2467
4	100	2567
			5	100	2436
6	100	2387

由表2可以看出，诱变菌株CH870发酵水平较稳定，发酵酶活均达到了2300U/ml以上。

实施例3葡萄糖氧化酶酶活测定方法

底物体系：用1mL的移液枪移取2mL 0.07g/L邻联茴香胺溶液，1mL 5％葡萄糖溶液于刻度试管中。用0.5mL的移液管移取0.1mL 0.1g/L辣根过氧化物酶溶液于同一刻度试管中。将该底物体系置于恒温水浴锅中30℃保温10min。

酶活测定：用移液枪吸取0.1mL稀释后的酶液于底物中摇匀，以空白管为对照，迅速用可见分光光度计测定在460nm处吸光值。读取初始吸光度值为A₀并计时，每隔1min记录一次吸光度值A_n，共测定5min。

由测得的吸光度值，按下式计算酶液酶活：X1(U/mL)

ΔA_n+1＝A_n+1-A_n(n＝0,1,2,3,4)

ΔA_平均＝(ΔA₁+ΔA₂+ΔA₃+ΔA₄+ΔA₅)/5

X1＝ΔA_平均×f/(11.3×t×V1/V2)

式中：11.3—消光系数；

t-反应时间，min；

V1-酶液体积，mL；

V2-反应液总体积，mL；

f-酶液稀释倍数。

实施例4最适反应温度

取实施例2制备的葡萄糖氧化酶成品，根据实施例3所述的酶活测定方法，溶解制成酶液后在pH6.0时，分别在10、15、20、25、30、35、40、45、50℃条件下测定葡萄糖氧化酶活力，计算相对酶活力。结果如图1所示，最适反应温度为20℃，在10℃时也具有较高的酶活。由实验结果可知，该突变菌株所产葡萄糖氧化酶的最适反应温度明显低于其他来源的葡萄糖氧化酶，而低温葡萄糖氧化酶可以广泛用于低温保鲜、药品及食品的生产中，具有很大的市场应用价值，在工业生产中具有广泛的应用价值。

实施例5最适反应pH

取实施例2制备的葡萄糖氧化酶成品，溶解制成酶液后根据实施例3所述的酶活测定方法，在温度为20℃条件下，分别测定在pH值在4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5条件下葡萄糖氧化酶活力，计算相对酶活力。测定结果如图2所示，葡萄糖氧化酶的酶活在pH为5.5时酶活最高。

实施例6热稳定性

取实施例2制备的葡萄糖氧化酶成品，根据实施例3所述的酶活测定方法，溶解后将酶液分别置于20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70℃条件下保温处理60min，保温结束后测定其相对酶活(相对酶活是经不同温度保温处理后的酶活与初始酶活的比值，定义初始酶活为100％)，其实验结果如图3所示。在35℃条件下保温1h仍能保持90％以上的活性，当温度升至40℃时，酶活随着保温时间的延长酶活下降为70％左右，45℃时其热稳定性明显减弱。

诱变菌株CH870产生的低温葡萄糖氧化酶经过温和的热处理就可以使酶活力丧失，而较低温和的温度处理不会影响产品的品质，因此，可以有效的改善并提高产品的质量。

实施例7耐酸碱性

取实施例2制备的葡萄糖氧化酶成品，根据实施例3所述的酶活测定方法，分别用0.1m的NaOH或0.1M的HCl将酶液的pH调整为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，分别置于室温条件下静置24h后，在温度为20℃、pH5.5条件下测定其相对酶活力(相对酶活是经不同pH条件处理后的酶活与初始酶活的比值，定义初始酶活为100％)。测定结果如图4所示，在pH2.0-8.0的条件下24h后，相对酶活力仍然保持在80％以上。

实施例8出发菌株与诱变菌株CH870所产葡萄糖氧化酶耐氧化性实验比较

根据实施例2的方法，分别以出发菌株与诱变菌株CH870为生产菌株发酵生产葡萄糖氧化酶，发酵结束后将发酵液离心取上清得粗酶液。将原始菌株产生的葡萄糖氧化酶与诱变菌株CH870产生的葡萄糖氧化酶分别经不同浓度的过氧化氢处理，处理温度为20℃，处理时间为2h，缓冲液为pH5.5的磷酸缓冲液。处理结束后加入一定量的过氧化氢酶除去未反应的过氧化氢，终止反应，然后测定各组葡萄糖氧化酶的相对酶活(相对酶活是经过氧化氢处理后的酶活与初始酶活的比值，定义初始酶活力为100％)，其相对酶活见表3：

表3.原始菌株与诱变菌株CH870葡萄糖氧化酶的耐氧化性比较

葡萄糖氧化酶在反应过程中会产生过氧化氢，因此，该酶具有抗菌杀菌的作用，但是过氧化氢的积累也会抑制葡萄糖氧化酶的活性，研究发现，当过氧化氢的浓度达到30mmol时就会对葡萄糖氧化酶的活性产生抑制作用，因此，选育耐氧化性的葡萄糖氧化酶高产菌株有十分重要的意义。由表3的实验结果可以看出，当过氧化氢的浓度达到30mmol时，原始菌株的葡萄糖氧化酶活性降为原来的90.7％，而诱变菌株酶活几乎没变。经相同浓度的过氧化氢处理后，诱变菌株的耐氧化性能明显高于对照菌株，因此，诱变菌株CH870在实际应用中具有更高的价值。

Claims (4)

1.一株高产低温葡萄糖氧化酶的黑曲霉，其特征在于，所述黑曲霉为黑曲霉(Aspergillu niger)CH870，保藏编号为CGMCC No.14138。

2.采用权利要求1所述的黑曲霉生产葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，具体如下：

(1)种子罐培养：

罐压0.05-0.08MPa，培养温度30℃，通风量30m³/h，搅拌转速180r/min，pH控制7.0；培养至菌体染色深、粗壮，无杂菌，结束培养；

(2)发酵罐培养

罐压0.05-0.08Mpa，培养温度30℃，搅拌转速300r/min，pH控制6.5-7.0；通风量：0-40h为30m³/h，40-58h为45m³/h，58h-放罐为40m³/h；当pH升至7.0时，开始补料，控制pH在6.5-7.0；

(3)放罐

发酵罐培养至96-110h，酶活增长缓慢，菌体开始部分自溶，即可放罐；

(4)葡萄糖氧化酶的提取

发酵液-预处理-压滤-超滤-标准化-精滤-调配-灌装-检测-成品。

3.如权利要求2所述的黑曲霉生产葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，

种子罐培养基：葡萄糖20％，蛋白胨25％，(NH₄)₂SO₄ 5％，K₂HPO₄ 1％，MgSO₄·7H₂O0.5％，pH 7.0；

发酵培养基：蔗糖12.30％、蛋白胨0.41％、NaNO₃ 0.6％、KH₂PO₄ 0.2％、KCl 0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.07％、CaCO₃ 1％，pH 7.0；

补料培养基：蔗糖20％，玉米浆30％，氯化钙0.5％，pH 7.0。

4.权利要求1所述高产低温葡萄糖氧化酶的黑曲霉的应用。