CN105647815B - 一种提高米曲霉曲酸产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高米曲霉曲酸产量的方法,属于发酵工程技术领域。具体地,通过改变培养基关键组分的浓度与接种条件控制米曲霉的菌落形态为球形(菌体处于最佳产酸形态),进而提高曲酸产量。当菌体形态为菌球时,米曲霉(A.oryzae)的产酸能力比菌丝时明显提高,曲酸产量可达15.11g/L。同时,菌球直径范围为0.25~0.35mm时,单位细胞曲酸积累量最高为0.778g/g。本发明优化了种子培养基中葡萄糖、酵母提取物浓度和孢子浓度,控制菌球大小,从而提高了米曲霉单位细胞曲酸产量,具有很好的应用前景。

Description

一种提高米曲霉曲酸产量的方法
技术领域
本发明涉及发酵工程领域,具体地涉及通过优化培养基关键组分浓度和孢子浓度,控制菌球大小,从而提高米曲霉曲酸产量的方法。
背景技术
曲酸是一种与葡萄糖结构相似的有机酸,是由好氧微生物利用糖类发酵产生的次级代谢产物,广泛存在于酒类、酱油及豆瓣酱等酿造产品中。目前,国内外主要利用米曲霉(Aspergillumsoryzae)及不产黄曲霉毒素的黄曲霉(Aspergillusflavus)发酵生产曲酸。由于具有抑菌能力、抗氧化性、抑制酪氨酸酶活性、与金属离子螯合等性质,曲酸常用作防腐剂、杀虫剂、抗菌剂等,被广泛应用在医药、农业、食品及化妆品等各个行业。
曲霉作为典型的丝状真菌,液态深层发酵与其他单细胞微生物相比,一个显著的特征是个体形态具有明显的变化,易形成多种形态,使其发酵过程变得复杂与难以控制。丝状真菌在液态发酵过程中菌体形态主要分为丝状、球状、团状,这主要由自身的遗传特性与环境因素共同影响。菌体的形态受多个基因调控,影响曲霉属菌体形态发育的基因主要有hypA/podA、hypC、swoF和sepA等。通过这些基因编码的蛋白质维持菌丝极性、控制细胞大小或细胞间隔膜的间距、组织肌动蛋白微丝和促进菌丝尖端生长等来改变菌体形态。影响菌体形态的环境因素主要包括培养基组成(如碳氮源的种类及浓度、磷酸盐的水平、金属离子的添加等)、环境条件(如温度、pH、转速、溶解氧及二氧化碳水平、机械剪切力、通气量等)、接种量、孢子形状、表面活性剂的种类、补料方式等。
对于丝状真菌而言,菌体的外观和微观上的变化与酶、代谢产物的合成及分泌有着密切的关系,也会导致整个发酵过程参数(如流变性等)截然不同,对目标产物的产率有重要影响。发酵不同产物达到最高发酵强度的菌体最佳形态也不相同。然而,目前关于米曲霉菌体形态和曲酸生产的研究还有不足,本领域迫切需要开发有效提高曲酸产量的方法。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种提高米曲霉曲酸产量的方法。
为实现上述目的,本发明涉及两方面的技术方案:
本发明的第一方面,提供了一种提高米曲霉产量的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(i)从保藏管中取一环孢子悬液接种于斜面培养基,25~35℃培养4~6d;
(ii)将培养4~6d的成熟孢子用无菌生理盐水洗下,经玻璃珠打散后过滤制成孢子悬浮液,并用血球计数板计数;
(iii)将孢子悬浮液转接至种子培养基中,培养转速150~250r/min,在25~35℃下培养20~40h;
(iv)按6~15%(v/v)的接种量,将液体种子接种到发酵培养基,转速150~250r/min,25~35℃下恒温摇床培养3~5d;
其中,步骤(iv)中所述的液体种子的菌球直径为0.25~0.35mm。
在另一优选例中,所述发酵培养基的装液量为250mL三角瓶中装20~40mL培养基。
本发明的第二方面,提供了一种提高米曲霉曲酸产量的方法,包括种子液中菌球直径的控制。
在另一优选例中,所述菌球直径为0.1~0.5mm,较佳的0.2~0.4mm,最佳的0.25~0.35mm。
在另一优选例中,所述方法包括种子培养基关键组分对菌球直径的影响。
在另一优选例中,所述方法包括孢子悬浮液浓度对菌球直径的影响。
在另一优选例中,所述种子培养基中的葡萄糖浓度为60~160g/L。
在另一优选例中,所述种子培养基中的酵母提取物浓度为2.5~15g/L。
在另一优选例中,所述孢子悬浮液的孢子浓度为107~108个/mL。
在另一优选例中,所述孢子悬浮液的接种量为6~15%。
所述种子培养基为:葡萄糖60~160g/L,玉米淀粉10g/L,酵母提取物2.5~15g/L,KH2PO45g/L,MgSO4·7H2O2.5g/L。生孢培养基为:葡萄糖50g/L,玉米淀粉10g/L,酵母提取物5g/L,KH2PO45g/L,MgSO4·7H2O2.5g/L,琼脂20g/L。发酵培养基为:葡萄糖120g/L,酵母提取物3g/L,豆饼粉5g/L,KH2PO42g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了葡萄糖浓度对菌球直径的影响。
图2显示了酵母提取物浓度对菌球直径的影响。
图3显示了孢子浓度对菌体形态及菌球直径的影响。
图4显示了菌丝与菌球形态对曲酸产量的影响。
图5显示了菌球直径与单位细胞合成曲酸能力的关系。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次意外地发现一种提高米曲霉曲酸产量的方法。实验表明,米曲霉菌球的直径随着葡萄糖浓度提高而增大,随着酵母提取物浓度提高菌球直径先减小后增大。米曲霉发酵生产曲酸的最佳形态为菌球,并且菌球直径与曲酸合成能力关系密切,菌球直径为0.25~0.35mm时,单位细胞曲酸积累量最高。
通用材料和方法
1.培养方法
生孢培养:从-70℃的甘油保藏管中取一环孢子悬液接种于斜面培养基,30℃恒温培养箱中培养5d。
种子培养:将培养5d的成熟孢子用无菌生理盐水洗下,经玻璃珠打散后过滤制成孢子悬浮液,用血球计数板计数。将孢子悬浮液转接至种子培养基中,培养转速200r/min,在30℃下恒温摇床培养30h。
发酵培养:按10%(v/v)的接种量,将液体种子接种到发酵培养基中,发酵培养基的装液量为250mL三角瓶中装入30mL培养基,转速200r/min,30℃下恒温摇床培养4d。
2.分析方法
曲酸含量测定:采用三氯化铁比色法测定。
生物量测定:采用干重法,将发酵液经滤纸过滤后用蒸馏水洗涤,置于干燥箱中65℃烘干至恒重,用称重法测定其生物量。
菌体形态测定:光学显微镜观察并拍摄,菌球直径用显微镜标尺测量。
粘度测定:取30mL发酵液用BrookfieldDV-S数显粘度计进行测定,选用转子型号为4#,转速为60%。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1葡萄糖浓度对菌球直径的影响
将生孢培养基中的孢子用无菌生理盐水洗下,制成孢子悬浮液后,接种到含有不同葡萄糖浓度(60~160g/L)的种子培养基中,培养30h后测定菌球大小。结果表明,随着种子培养基中葡萄糖浓度的逐渐增大,A.oryzae菌球直径也随之由0.23mm增大到0.463mm(见图1)。
实施例2酵母提取物浓度对菌球直径的影响
同实施例1中孢子悬浮液的制备,然后接种到含有不同酵母提取物浓度(2.5~15g/L)的种子培养基中,于30℃条件下,培养30h后测定菌球大小。结果显示,酵母提取物对A.oryzae菌球大小的影响不同于葡萄糖,当酵母提取物浓度从2.5g/L提高至10g/L时,A.oryzae菌球直径从0.52mm降低到0.265mm,之后随着酵母提取物浓度继续提高菌球直径也增大(见图2)。
实施例3孢子浓度对菌球形成的影响
制备不同浓度的孢子悬浮液,分别接种到相同配方的种子培养基中,培养30h后测定菌球大小。结果如图2所示,当孢子悬浮液浓度为107~108个/mL时,A.oryzae主要形成菌球(见图3Aa/c),且在一定范围内菌球直径与孢子浓度呈负相关,即孢子悬浮液浓度越高,菌球直径越小,接种孢子浓度为2×107个/mL的菌球直径为是孢子浓度为1.2×108个/mL的3.61倍(见图3B)。
实施例4基于形态的曲酸发酵优化
将种子液培养过程中获得的不同形态的菌体,接种至发酵培养基。在本实施例中,测定了曲酸产量,研究了菌体形态对A.oryzae生产曲酸的影响。当菌体形态为菌球时,A.oryzae的产酸能力较高,曲酸产量达到15.11g/L,相比菌丝明显提高(见图4),A.oryzae发酵生产曲酸的最佳形态为菌球。
实施例5菌球直径对曲酸产量的影响
将不同大小的菌球接种到发酵培养基中进行发酵培养,测定曲酸产量。菌球直径对曲酸产量有一定的影响,最佳菌球直径范围为0.25~0.35mm,此时单位细胞曲酸积累量最高为0.778g/g(见图5)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (8)

1.一种提高米曲霉曲酸产量的方法,其特征在于,所述方法是通过改变种子培养基中的葡萄糖和酵母提取物浓度及孢子浓度来控制菌球直径;所述菌球直径为0.25~0.35mm;所述种子培养基为:葡萄糖60~160g/L,玉米淀粉10g/L,酵母提取物2.5~15g/L,KH2PO45g/L,MgSO4·7H2O 2.5g/L。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还包括制备种子液的步骤:将米曲霉接种于生孢培养基中,然后用无菌生理盐水将成熟孢子洗下,玻璃珠打散后将孢子悬浮液接种至种子培养基中。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述孢子悬浮液浓度为106~108个/mL。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,将种子液以3~20%的接种量接种至发酵培养基中。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,生孢培养基为:葡萄糖50g/L,玉米淀粉10g/L,酵母提取物5g/L,KH2PO4 5g/L,MgSO4·7H2O 2.5g/L,琼脂20g/L。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,发酵培养基为:葡萄糖120g/L,酵母提取物3g/L,豆饼粉5g/L,KH2PO4 2g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述种子培养条件为:转速200r/min,30℃恒温培养30h。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述发酵培养条件为:发酵培养基的装液量为250mL三角瓶中装20~40mL培养基,转速200r/min,30℃恒温发酵4d。
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曲酸生产菌的60Co-γ射线诱变选育及表征;解西玉等;《食品工业科技》;20101201;第31卷(第12期);第212-213页,参见摘要、第212页右栏第2段、第213页左栏倒数第1段、表2 *
米曲霉转化蔗糖及糖蜜生产曲酸的研究;李军委;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20140315;B018-36,参见第13页倒数第1-3段、第15页倒数第3段、第18页倒数第1段-第19页第1段、第22页第1段、第23页第2段和倒数第1段、第24页第1段、第30页倒数第1段-第31页第1段、图2-1、图2-2、图2-8 *

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