CN106010982A - 一种麦角甾醇猴头菌液体深层培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种麦角甾醇猴头菌液体深层培养方法，在初筛的基础上，筛选在固体培养基上生长快的猴头菌菌株；再结合物理诱变剂进行紫外诱变，得到一株适于液体深层培养的高产麦角甾醇猴头菌菌株。并通过培养基和培养条件的优化，确定了该猴头菌的液体深层培养方法，该方法可缩短工业化生产菌丝体的周期，提高生物产量。

Description

一种麦角甾醇猴头菌液体深层培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种麦角甾醇猴头菌液体深层培养方法。

背景技术

猴头菌又称猴菜、猴头菇、对脸蘑，属于担子菌亚门猴菇科猴菇属的大型食用菌、药用菌，能够促进血液循环，抑制肿瘤细胞生长，对胃粘膜有很好的保护作用，其中甾醇类物质具有降血脂、预防心血管疾病、延缓衰老等作用，也是多种激素、维生素D合成的前体，在物质运输等方面起着重要作用。近年来，我国消费者对麦角甾醇的需求量呈逐年增长趋势，麦角甾醇高产菌株的选育就显得尤为重要。

目前研究还是以猴头菌子实体居多，但子实体的生产性能不稳定，不能保证对原料质量稳定的要求，而液态深层发酵生产周期短、菌龄一致、菌丝生长速度快、接种简单、不受季节的限制可以周年生产，保证了猴头菌在生产过程中的可控性及目标产物的品质稳定性。通过对猴头菌液态培养基及培养条件的优化，筛选出猴头菌最适深层培养条件，为猴头菌菌丝体高收率的生产提供一条便捷高效的生产途径，进而满足人们日益增长的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种麦角甾醇猴头菌液体深层培养方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种麦角甾醇猴头菌液体深层培养方法，在初筛的基础上，筛选在固体培养基上生长快的猴头菌菌株；再结合物理诱变剂进行紫外诱变，得到一株适于液体深层培养的高产麦角甾醇猴头菌菌株。并通过培养基和培养条件的优化，确定了该猴头菌的液体深层培养方法。

优选的，上述麦角甾醇猴头菌液体深层培养方法，具体步骤如下：

(1)菌种活化、复壮及初筛：转接保藏的猴头菌菌种，分别接种于新鲜斜面培养基活化，23℃培养5～7d；将活化菌种接种于初筛液体培养基中，23℃、150rpm下培养6-8d。取适量猴头菌培养液，经无菌漏斗过滤制备单孢子液；将单孢子液进行梯度稀释；选取连续三个稀释度，将稀释孢子液0.1ml分别涂布于平板培养基中，于23℃下培养分离单菌落；经分离纯化选取菌丝体生长速度快的猴头菌株，截取边缘的幼龄菌丝，转接于斜面培养基，于23℃下培养5d；

(2)菌株紫外诱变：将初筛菌株，以单因素实验中的最合适条件摇瓶培养5-7d后，取20ml的猴头菌发酵液，制备单孢子液；经梯度稀释后，选取连续三个稀释度的单孢子液分别倒入直径为90mm的无菌培养皿，进行紫外线照射；以不经紫外线照射的单孢子液作对照，分别于平板培养基中分离单菌落，每组重复2次。注意避光，黑纸包扎完好，于23℃培养5-7d；

(3)将紫外诱变后分离的单菌落的边缘幼龄菌丝，接种至斜面培养基培养5d，接种至单因素实验基础培养基进行液体发酵6-8d，获得麦角甾醇。

本发明的有益效果是：

上述麦角甾醇猴头菌液体深层培养方法，在初筛的基础上，结合紫外诱变获得的菌株，其在固体培养基上的生长时间缩短，且菌丝体中麦角甾醇含量有所提高；经过连续适当的诱变处理，获得猴头菌的麦角甾醇高产的诱变菌株，可以作为生产菌种，能缩短工业化生产菌丝体的周期，提高生物产量。

附图说明

图1是麦角甾醇标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。

实施例1

1.菌种

猴头菌菌种为天津天狮学院生物与食品工程学院实验室保藏菌种。

2.培养基

2.1斜面、平板培养基

马铃薯30％(煮汁)，蛋白胨0.5％，葡萄糖2％，琼脂1.3％，pH自然。

2.2初筛液体培养基

用2％木屑提取汁溶解：葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.075％，pH自然。

2.3液体发酵培养基

单因素实验基础培养基：葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.075％，pH自然。

分别选择碳源：葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽浸粉、葡萄糖+可溶性淀粉；氮源：蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏；无机盐：磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰；将上述不同碳源、氮源和无机盐分别替代基础培养基中的葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁，分别组成不同的碳源、氮源、无机盐液体发酵培养基。

3.菌种活化、复壮及初筛

转接保藏的猴头菌菌种，分别接种于新鲜斜面培养基活化，23℃培养5～7d。

将活化菌种接种于初筛液体培养基中，23℃、150rpm下培养6-8d。取适量猴头菌培养液，经无菌漏斗过滤制备单孢子液。将单孢子液进行梯度稀释。选取连续三个稀释度，将稀释孢子液0.1ml分别涂布于平板培养基中，于23℃下培养分离单菌落。经分离纯化选取菌丝体生长速度快的猴头菌株，截取边缘的幼龄菌丝，转接于斜面培养基，于23℃下培养5d。

4.菌株紫外诱变

将初筛菌株，以单因素实验中的最合适条件摇瓶培养5-7d后，取20ml的猴头菌发酵液，制备单孢子液。经梯度稀释后，选取连续三个稀释度的单孢子液分别倒入直径为90mm的无菌培养皿，进行紫外线照射。以不经紫外线照射的单孢子液作对照，分别于平板培养基中分离单菌落，每组重复2次。注意避光，黑纸包扎完好，于23℃培养5-7d。

将紫外诱变后分离的单菌落的边缘幼龄菌丝，接种至斜面培养基培养5d，接种至单因素实验基础培养基进行液体发酵6-8d，测定麦角甾醇含量。

5.菌株液态深层发酵培养条件优化

由单因素实验确定最适的碳源、氮源、无机盐种类，进而对碳源用量、氮源用量及无机盐用量进行三因素三水平的正交实验，以菌丝体收率为指标确定猴头菌液态发酵培养基成分的含量。

6.菌丝体收率的测定

发酵液经真空抽滤，得猴头菌菌丝体，80℃干燥8～10h，称重。

7.麦角甾醇的测定

麦角甾醇含量的测定：铁矾显色法。565nm波长下测定吸光度，以麦角甾醇标准品质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

分别测定发酵液、菌丝体、菌丝粉中麦角甾醇的含量，筛选出麦角甾醇产量较高的菌株。

8.结果

8.1碳源对猴头菌菌丝体生成量的影响

表1不同碳源下菌丝体干重

由上表1可知，碳源对猴头菌菌丝体的生长影响特别显著。其中葡萄糖的菌丝体收率为0.4451g/100ml，可以作为液体培养的碳源。

8.2氮源对猴头菌菌丝体生成量的影响

表2不同氮源下菌丝体干重

由上表2可知，氮源对猴头菌菌丝体的生长影响特别显著。其中酵母膏对菌丝生长的促进作用较大，菌丝体干重为0.3990g/100ml，其次为蛋白胨，所生成的猴头菌菌丝体的干重为0.2146g/100ml，所以选择酵母膏和蛋白胨，作为液体培养的氮源。

8.3无机盐对猴头菌菌丝体生成量的影响

表3不同种类无机盐下菌丝体干重

由上表3可知，无机盐对猴头菌菌丝体的生长影响特别显著。液态深层发酵时，在以磷酸二氢钾为无机盐的培养基中，有明显的促进作用，菌丝生长速度快、菌丝球小、数量多、发酵液颜色澄清；以硫酸镁、硫酸锰为无机盐的培养基，菌丝生长不佳，发酵液的颜色均有混浊且偏深色。故选择磷酸二氢钾作为液体培养的无机盐。

8.4培养基成分正交实验分析结果

由表4可知，葡萄糖用量是影响菌丝体收率的最大因素，经极差分析得到优方案为葡萄糖浓度为2％，酵母膏浓度为0.5％，磷酸二氢钾浓度为0.15％。方差分析显示葡萄糖以及酵母膏对于猴头菌菌丝体生成的影响是显著的，其中葡萄糖的影响是特别显著的，而无机盐对其影响则不显著。结合正交实验极差分析结果，表明猴头菌菌丝体生成主要取决于液态培养基中的碳源和氮源。

表4培养基成分正交实验极差分析

8.5培养条件正交实验分析结果

由表5可知，对猴头菌深层发酵菌丝体收率影响最大的培养条件是装液量，经极差分析得到优方案为PH为5.0，装液量为80ml，接种量为6ml，在这个条件下经液体摇瓶培养的菌丝体干重最大，测定结果为0.6889g/100ml。方差分析显示初始PH、装液量及接种量对于猴头菌菌丝体生成的影响均为显著，其中装液量的影响是特别显著的。结合正交实验极差分析结果，表明猴头菌菌丝体生成与培养条件的关系较为密切，包括初始PH、装液量以及接种量。

表5培养条件正交实验极差分析

8.6麦角甾醇含量测定

如图1所示，由标准曲线方程y＝1.2021x－0.0045，测定猴头菌不同样品中麦角甾醇的含量。样品为经液体摇瓶培养后所得猴头菌菌丝粉(水分为8.8％)、湿重菌丝球和猴头菌发酵液，结果见表6。

表6不同样品中麦角甾醇的含量

9.结论

对于猴头菌液态深层发酵优化培养条件和筛选麦角甾醇高产菌株，通过各项实验数据得出以下结论：

1.综合单因素实验和正交实验结果，得出最适猴头菌液态深层培养条件为：葡萄糖2％，酵母膏0.5％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.075％，蛋白胨1％，在PH5.0、装液量80ml、接种量6ml情况下，如果菌种活性良好，于23℃，150r/min摇床培养，猴头菌菌丝体收率可达0.6225g/100ml。

2.诱变实验：比较经过不同时间的紫外照射后菌落的色泽、面积大小等总体生长状况，发现照射40s＞60s＞50s＞对照组；且实验组紫外线照射后，发酵液、菌丝球、菌丝粉中麦角甾醇含量都比对照组高。可见在初筛的基础上，结合紫外诱变获得的菌株，其在固体培养基上的生长时间缩短，且菌丝体中麦角甾醇含量有所提高。相信经过连续适当的诱变处理，获得猴头菌的麦角甾醇高产的诱变菌株，可以作为生产菌种，能缩短工业化生产菌丝体的周期，提高生物产量。

上述参照实施例对本发明所述的一种麦角甾醇猴头菌液体深层培养方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种麦角甾醇猴头菌液体深层培养方法，其特征在于：在初筛的基础上，筛选在固体培养基上生长快的猴头菌菌株；再结合物理诱变剂进行紫外诱变，得到一株适于液体深层培养的高产麦角甾醇猴头菌菌株。并通过培养基和培养条件的优化，确定了该猴头菌的液体深层培养方法。

2.根据权利要求1所述的麦角甾醇猴头菌液体深层培养方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)菌种活化、复壮及初筛：转接保藏的猴头菌菌种，分别接种于新鲜斜面培养基活化，23℃培养5～7d；将活化菌种接种于初筛液体培养基中，23℃、150rpm下培养6-8d。取适量猴头菌培养液，经无菌漏斗过滤制备单孢子液；将单孢子液进行梯度稀释；选取连续三个稀释度，将稀释孢子液0.1ml分别涂布于平板培养基中，于23℃下培养分离单菌落；经分离纯化选取菌丝体生长速度快的猴头菌株，截取边缘的幼龄菌丝，转接于斜面培养基，于23℃下培养5d；

(2)菌株紫外诱变：将初筛菌株，以单因素实验中的最合适条件摇瓶培养5-7d后，取20ml的猴头菌发酵液，制备单孢子液；经梯度稀释后，选取连续三个稀释度的单孢子液分别倒入直径为90mm的无菌培养皿，进行紫外线照射；以不经紫外线照射的单孢子液作对照，分别于平板培养基中分离单菌落，每组重复2次。注意避光，黑纸包扎完好，于23℃培养5-7d；

(3)将紫外诱变后分离的单菌落的边缘幼龄菌丝，接种至斜面培养基培养5d，接种至单因素实验基础培养基进行液体发酵6-8d，获得麦角甾醇。