CN109251951A

CN109251951A - 一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法

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Publication number: CN109251951A
Application number: CN201811477815.3A
Authority: CN
Inventors: 郑涛
Original assignee: Individual
Current assignee: Heilongjiang Kunjian Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-12-05
Filing date: 2018-12-05
Publication date: 2019-01-22
Anticipated expiration: 2038-12-05
Also published as: CN109251951B

Abstract

本发明公开了一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，该方法的步骤包括：（1）母种的活化扩繁；（2）摇瓶菌种的制备；（3）种子液的制备；（4）一氧化氮和乙烯协同诱导处理；（5）半连续液体培养。本发明采用的半连续液体培养方法可有效延长灵芝菌丝体的对数生长期，提高灵芝液体培养生物量，提高灵芝多糖产量，与常规的分批培养方法相比，本发明工艺合理，操作简单，可节省反复洗罐、灭菌等非发酵时间，提高了生产效率和设备利用率，降低了生产成本，可以用于大规模生产灵芝多糖，是一种很有应用前景的灵芝液体培养方法。

Description

一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法

技术领域

本发明涉及药用真菌生产技术领域，具体而言，涉及一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法。

背景技术

药用真菌通常是指用于医药的大型真菌（蕈菌），常见种类包括冬虫夏草、蝉花、灵芝、茯苓、猪苓、桑黄、木耳、雷丸、云芝等。这些药用菌在我国都有上千年的应用历史，它们虽功效不同，但最大的优点，也是它们的共同点就是无毒副作用。近代医学研究表明，药用真菌不仅具有传统的益气、强身、祛病、通经、益寿等功能，还具有增强人体免疫力，抗肿瘤抗癌的功效。因此药用真菌是食品、保健品和药物方面最具潜力的微生物种类之一。药用真菌多糖是一类生物活性物质，具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、免疫调节、抗感染、抗病毒、抗凝血、降血糖、抗辐射、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成、控制细胞分裂和分化、调节细胞的生长与衰老等，是目前药用真菌研究领域的一个热点。

灵芝（Ganoderma lucidum）又称灵芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，属于担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，灵芝菌属。灵芝药用在中国已有2000多年的历史，被历代医药家视为滋补强壮、扶正固本的神奇珍品。按本草纲目记载“灵芝性平，味苦，无毒，主胸中结，益心气，补中，增智慧，不忘，久服轻身不老，延年神仙”。研究表明灵芝对人体有益的成分有数千种，归纳起来主要是甾醇类、三萜类、生物碱、多糖类、氨基酸多肽类，其中灵芝多糖（Ganoderma Lucidum polysaccharides，GLP）是灵芝中主要的一类活性成分，能够提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，消除自由基，抑制肿瘤、抗辐射，提高肝脏、骨髓、血液合成DNA、RNA、蛋白质能力；灵芝多糖还具有刺激宿主非特异性抗性、免疫特异反应以及抑制移植肿瘤生理活性的特性；对心血管疾病、气喘、过敏、神经衰弱、胃热等有显著效果，还具有降血压、降血脂、降血瘀、改善血液循环、皮肤美容等作用，可广泛应用于医药、保健品和化妆品行业。

我国药用真菌资源丰富，但是由于人们对野生药用真菌的盲目采集，使许多药用真菌的天然资源趋于枯竭，这其中就包括灵芝，因此现在市场上的灵芝多为人工栽培。传统上，灵芝多糖就是从人工栽培的灵芝子实体中提取。然而人工栽培由于受自然环境的影响，培养周期长、产品的质量难以控制、受地域限制等，次级代谢产物灵芝多糖的质量和产量难以控制。从生物学的观点看，由于微生物本身的固有特点，便于实现工业化大规模生产，因此，近年来大量学者进行了液体培养产灵芝多糖的研究。与人工栽培相比，液体培养具有培养周期短、工艺简单、原料易得、成本低等优点，因此受到研究者的广泛关注。

目前灵芝液体培养主要采用分批培养的方式，即在一个密闭系统内（如发酵罐）投入一定量的培养基，接入少量的灵芝菌种后在适宜的条件下进行培养，使菌体生长繁殖，积累代谢产物，完成一个生长周期。而提高灵芝多糖产量的方法主要是在此基础上优化发酵条件以及培养基。但是分批培养也存在一些缺点，例如每批培养都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，耗费的人力、物力较大，整体上来说生产连续性不强，生产效率较低。在分批培养的后期，由于培养基的营养成分大量消耗，无法满足菌体的生长，存在着多糖类代谢产物消耗现象，因此很难进一步提高多糖产量。

半连续培养也是一种微生物液体培养方式，是在分批培养的基础上，周期性地放出部分发酵液，然后再补加相同体积的新鲜培养基，使发酵罐内培养基的总体积基本保持不变。此种培养方式可以及时补充营养物质，使微生物保持快速生长，增加目标代谢产物的合成，还可以起到缓解产物抑制和避免有害代谢产物积累的作用。而且对于整个生产过程而言，半连续培养还能够减少反复清洗、灭菌等繁琐工序，提高生产效率，降低生产成本。半连续培养技术已在工业生产领域逐步得到应用，但是很少见于食用真菌的发酵培养。本发明团队根据灵芝菌体的生长特性，以提高灵芝多糖产量为研究目的，探索出了一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，这对于推动其产业化的进程以及探索其他真菌多糖的高效生产也具有一定意义。

发明内容

针对现有液体培养产灵芝多糖技术存在的缺点，本发明提供了一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，为灵芝多糖的大规模生产以及灵芝多糖产业化发展提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：

（1）母种的活化扩繁

用接种铲挖取保存在PDA斜面上的大小为0.5cm²的灵芝母种，接种到新鲜的PDA斜面试管中，于28℃恒温培养5d，用直径为1cm的打孔器将已活化的灵芝母种接种于PDA平板培养基中央，于28℃恒温培养6~7d，待菌丝长满平板后接种；

（2）摇瓶菌种的制备

用直径1cm的打孔器，从平板上取2~3个大小相同的菌丝块接入装有液体培养基的锥形瓶中，装液量为400mL/1L，于29~31℃、130~150r/min条件下恒温振荡培养3~4d；

（3）种子液的制备

将液体培养基按照60~70%的装液量装入种子罐中进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，等到培养基温度冷却至30℃左右时，将上述摇瓶菌种接入种子罐，接种量为6~10%，培养温度为29~31℃，转速为130~150r/min，培养5~6d即可获得种子液；

（4）一氧化氮和乙烯协同诱导处理

将发酵培养基按照60~70%的装液量装入发酵罐①中进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，等到培养基冷却后，将上述种子液接入发酵罐①，接种量为8~12%，培养温度为29~31℃，转速为110~130r/min，向发酵罐①中先后通入一氧化氮和乙烯高纯气体，进行协同诱导处理8h；

（5）半连续液体培养

a）待协同诱导处理结束后，向发酵罐①中通入净化空气，通气量为0.5~0.7（V/V·min），培养温度和转速不变，培养40h后将转速调整为130~150r/min，通气量调整为1.0~1.2（V/V·min），在此条件下培养18h，然后放出部分体积的发酵液到经过空消灭菌处理的发酵罐②中，再补加相同体积的发酵培养基；

b）发酵罐②中同时也补加相同体积的发酵培养基，培养温度为29~31℃，转速为130~150r/min，通气量为1.0~1.2（V/V·min），发酵液pH调整为4.4~4.6；

c）发酵罐①补加发酵培养基后，在与发酵罐②相同的培养条件下继续培养48h，然后重复放出发酵液到发酵罐②，两个发酵罐补加发酵培养基继续培养48h的操作，如此重复进行3个周期；

d）3个周期结束后，将两个发酵罐的转速调整为110~130r/min，通气量调整为0.5~0.7（V/V·min），培养温度保持不变，培养36h后结束培养，放罐。

所述步骤（2）和步骤（3）中，液体培养基的成分为：葡萄糖20~25g/L，玉米粉11~15g/L，酵母浸粉1.8~2.2g/L，干酪素3.7~4.3g/L，油菜秸秆粉2.1~2.3g/L，羧甲基纤维素钠3.0~4.0g/L，KH₂PO₄ 1.8~2.2g/L，MgSO₄0.9~1.1g/L，胡萝卜汁26~34ml/L，蚯蚓干粉4.4~5.0g/L，ZnSO₄ 0.07~0.11g/L，四甲基戊二酸 5.4~5.8mg/L，松针提取液12~15ml/L，硬脂酸33~39mg/L，pH调节为5.2~5.4。

所述步骤（3）和步骤（4）中，高压蒸汽灭菌的条件为温度121-123℃，压力0.11-0.13MPa，灭菌时间40-50min。

所述步骤（4）中，发酵培养基的成分为：玉米粉24~28g/L，麦麸15~19g/L，木质素8.5~9.3g/L，酵母破碎液15~20ml/L，椰糠粉3.8~4.4g/L，大豆粉5.5~6.5g/L，羧甲基纤维素钠2.6~3.0g/L，三七药渣5.9~6.5g/L，穿心莲药渣3.3~3.9g/L，茯苓药渣5.2~5.8g/L，松针提取液12~15ml/L，KH₂PO₄ 1.8~2.2g/L，MgSO₄0.9~1.1g/L，硝酸镧13~15mg/L，有机硅消泡剂30~40mg/L，初始pH调节为5.2~5.4。

所述步骤（4）中，通入的一氧化氮和乙烯高纯气体的体积比为1:1，通入量分别为发酵罐容积的10%。

所述步骤（5）中，放出发酵液的体积为发酵培养基的15~25%。

所述发酵培养基的成分中，酵母破碎液的制备方法为：将酵母菌种接种到YEPD培养基中，在35℃、转速170r/min的恒温摇床上培养3d，取酵母发酵液于5000r/min条件下离心15min，收集沉淀，用蒸馏水冲洗几次，加入适量的生理盐水，用超声波破碎仪进行破碎；将破碎液在10000r/min、4℃的条件下离心10min，取上清液加入生理盐水稀释100倍。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明采用一氧化氮和乙烯协同诱导处理灵芝种子液，有利于提高灵芝菌丝体生物量和灵芝多糖产量；在整个灵芝液体培养过程中，采用了优化的培养基和培养方法，也能够显著促进灵芝菌丝体的生长生物量和代谢产物的合成，有利于灵芝多糖的积累。

2、本发明采用的半连续液体培养方法可有效延长灵芝菌丝体的对数生长期，使灵芝菌丝体能够保持较长时间的活力，从而加速繁殖和代谢产物的合成，达到高效生产灵芝多糖的目的。

3、与常规的分批培养方法相比，本发明工艺合理，操作简单，可节省反复洗罐、灭菌等非发酵时间，还能提高生产效率和设备利用率，从而降低生产成本，可以用于大规模生产灵芝多糖，是一种很有应用前景的灵芝液体培养方法。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

各实施例中评价指标的测定方法如下：

1、菌丝体生物量：取一定量的发酵液用布氏漏斗过滤收集菌丝体，并用蒸馏水冲洗5-6次，然后6000r/min离心10min，分别收集上清液与沉淀。取沉淀放入烘箱，60℃~80℃烘干至恒重，称重即为灵芝菌丝体生物量；

2、胞外多糖含量：将菌丝体生物量测定中收集的上清液置于60℃真空减压浓缩至原体积的1/4，加入4倍体积无水乙醇，醇沉15h后，4000r/min离心15min，收集沉淀烘干至恒重，得胞外粗多糖，通过苯酚-硫酸法测得胞外多糖的含量；

3、胞内多糖含量：将菌丝体生物量测定中收集的沉淀研磨成粉末，加入蒸馏水摇匀，料液比为1:20，静置30min，置于90℃恒温水浴锅浸提2h。用布氏漏斗抽滤，获得滤液。将滤液置于60℃真空减压浓缩至原体积的1/4，加入4倍体积无水乙醇，醇沉15h后，4000r/min离心15min，收集沉淀烘干至恒重，得胞内粗多糖，通过苯酚-硫酸法测得胞内多糖的含量。

实施例1

采用灵芝品种紫芝作为试验材料，按照本发明的一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法进行试验，具体步骤如下：

（1）母种的活化扩繁

（2）摇瓶菌种的制备

用直径1cm的打孔器，从平板上取2~3个大小相同的菌丝块接入装有液体培养基的锥形瓶中，装液量为400mL/1L，于30℃、140r/min条件下恒温振荡培养3~4d；

液体培养基的成分为：葡萄糖22.5g/L，玉米粉13g/L，酵母浸粉2.0g/L，干酪素4.0g/L，油菜秸秆粉2.2g/L，羧甲基纤维素钠3.5g/L，KH₂PO₄ 2.0g/L，MgSO₄1.0g/L，胡萝卜汁30ml/L，蚯蚓干粉4.7g/L，ZnSO₄ 0.09g/L，四甲基戊二酸 6.6mg/L，松针提取液14ml/L，硬脂酸36mg/L，pH调节为5.3；

（3）种子液的制备

将液体培养基按照65%的装液量装入5L种子罐中进行高压蒸汽灭菌，高压蒸汽灭菌的条件为温度122℃，压力0.12MPa，灭菌时间45min，灭菌结束后，等到培养基冷却至30℃以下时，将上述摇瓶菌种接入种子罐，接种量为8%，培养温度为30℃，转速为140r/min，培养5~6d即可获得种子液；

（4）一氧化氮和乙烯协同诱导处理

将发酵培养基按照65%的装液量装入30L的发酵罐①中进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件与上述步骤中相同，灭菌结束后，等到培养基冷却至30℃以下时，将上述种子液接入发酵罐①，接种量为10%，培养温度为29℃，转速为120r/min，向发酵罐①中先后通入一氧化氮和乙烯高纯气体，通入的一氧化氮和乙烯高纯气体的体积比为1:1，通入量分别为发酵罐容积的10%，进行协同诱导处理8h；

发酵培养基的成分为：玉米粉26g/L，麦麸17g/L，木质素8.9g/L，酵母破碎液17.5ml/L，椰糠粉4.1g/L，大豆粉6.0g/L，羧甲基纤维素钠2.8g/L，三七药渣6.2g/L，穿心莲药渣3.6g/L，茯苓药渣5.5g/L，松针提取液13.5ml/L，KH₂PO₄ 2.0g/L，MgSO₄1.0g/L，硝酸镧14mg/L，有机硅消泡剂35mg/L，初始pH调节为5.3；其中酵母破碎液的制备方法为：将酵母菌种接种到YEPD培养基中，在35℃、转速170r/min的恒温摇床上培养3d，取酵母发酵液于5000r/min条件下离心15min，收集沉淀，用蒸馏水冲洗几次，加入适量的生理盐水，用超声波破碎仪进行破碎；将破碎液在10000r/min、４℃的条件下离心10min，取上清液加入生理盐水稀释100倍；

（5）半连续液体培养

a）待协同诱导处理结束后，向发酵罐①中通入净化空气，通气量为0.6（V/V·min），培养温度和转速不变，培养40h后将转速调整为140r/min，通气量调整为1.1（V/V·min），在此条件下培养18h，然后放出20%体积的发酵液到经过空消灭菌处理的发酵罐②中，发酵罐②的容积为60L，再补加相同体积的发酵培养基；

b）发酵罐②中同时也补加相同体积的发酵培养基，培养温度为29℃，转速为140r/min，通气量为1.1（V/V·min），发酵液pH调整为4.5；

d）3个周期结束后，将两个发酵罐的转速调整为120r/min，通气量调整为0.6（V/V·min），培养温度保持不变，培养36h后结束培养，放罐。

实施例2

本实施例是为了验证本发明采用的液体培养基对灵芝种子液中菌丝体生物量的影响，具体过程如下：

（1）母种的活化扩繁（与实施例1相同）；（2）摇瓶菌种的制备与（3）种子液的制备操作方法与实施例1相同，将采用的液体培养基替换为以下几种：培养基①葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏4g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄ 1g/L；培养基②葡萄糖36g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏2g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄ 0.5g/L，VB1 0.05g/L；培养基③土豆汁15g/L，麦麸3g/L，葡萄糖3g/L，MgSO₄ 3.0g/L，KH₂PO₄1.5g/L，这些培养基均来源于灵芝液体培养（发酵培养）的相关文献。测定种子液的菌丝体生物量，结果如下表1。

分析表1的数据可以得出，采用本发明的液体培养基，灵芝菌丝体生物量达到了16.35 g/L，明显高于其他组。种子液的质量直接影响着下一步的半连续液体培养，本发明的液体培养基营养更丰富全面，培养的菌丝体生长旺盛，有利于后续灵芝多糖的积累。

实施例3

本实施例是为了验证本发明的一氧化氮和乙烯协同诱导处理对灵芝菌丝体生物量和多糖含量的影响，具体过程如下：

（1）母种的活化扩繁、（2）摇瓶菌种的制备、（3）种子液的制备这3步与实施例1相同，（4）一氧化氮和乙烯协同诱导处理这1步进行以下试验：①一氧化氮单独诱导处理，②乙烯单独诱导处理，③不处理，（5）半连续液体培养与实施例1相同。

发酵结束后，测定灵芝发酵液的菌丝体生物量、胞外多糖含量、胞内多糖含量，结果如下表2。

分析表2的数据可以得出，与不处理相比，使用一氧化氮或乙烯单独诱导处理均能提高灵芝菌丝体生物量和多糖含量；而使用本发明的一氧化氮和乙烯协同诱导处理，灵芝菌丝体生物量、胞外多糖含量和胞内多糖含量都达到最大值，显著高于不进行诱导处理，并且与一种气体单独诱导处理相比，效果也更好。一氧化氮（NO）是一种气体生物信号分子，广泛参与真菌生长发育过程和次生代谢产物的积累，乙烯是一种重要的植物激素，对植物的生长发育、果实成熟都有重要影响，对于某些真菌的菌丝体生长也有显著促进作用。本研究发现使用一定浓度的一氧化氮和乙烯共同处理灵芝种子液，能够产生协同效应，从而显著提高灵芝菌丝体生物量、提高灵芝多糖含量。

实施例4

本实施例是为了验证本发明的发酵培养基对灵芝菌丝体生物量和多糖含量的影响，具体过程如下：

（1）母种的活化扩繁、（2）摇瓶菌种的制备、（3）种子液的制备这3步与实施例1相同，（4）一氧化氮和乙烯协同诱导处理这1步，将采用的发酵培养基替换为以下几种：培养基①葡萄糖35g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉2.5g/L、KH₂PO₄0.8g/L、MgSO₄0.5g/L、0.05g/L维生素B1；培养基②玉米粉15g/L，麸皮10g/L，豆饼粉5g/L，葡萄糖20g/L，KH₂PO₄1.5g/L，甘草提取液5ml/L；培养基③黄豆粉10g/L，酵母泥5g/L，葡萄糖10g/L，MgSO₄ 1g/L，KH₂PO₄0.5g/L，这些培养基均来源于灵芝液体培养的相关文献，（5）半连续液体培养与实施例1相同。

发酵结束后，测定灵芝发酵液的菌丝体生物量、胞外多糖含量、胞内多糖含量，结果如下表3。

分析表3的数据可以得出，采用本发明的发酵培养基，灵芝菌丝体生物量和多糖含量均显著高于其他组。培养基是影响菌丝体生长和代谢产物合成的重要因素，本发明的发酵培养基采用多种碳源、氮源相结合，还额外添加了营养物质如酵母破碎液、松针提取液，促进剂如羧甲基纤维素钠、硝酸镧，中药成分如三七药渣、穿心莲药渣、茯苓药渣，都有利于促进灵芝菌丝体生长和代谢产物的合成，从而提高菌丝体生物量和多糖含量。

实施例5

本实施例是为了验证本发明的半连续液体培养过程中，转速的阶段控制对灵芝菌丝体生物量和多糖含量的影响，具体过程如下：

（1）母种的活化扩繁、（2）摇瓶菌种的制备、（3）种子液的制备、（4）一氧化氮和乙烯协同诱导处理与实施例1相同，（5）半连续液体培养中，发酵罐①和发酵罐②转速恒定，均为140r/min，其它与实施例1相同。

发酵结束后，测定灵芝发酵液的菌丝体生物量、胞外多糖含量、胞内多糖含量，结果如下表4。

分析表4的数据可以得出，与恒定转速相比，采用本发明的阶段转速控制方法，灵芝发酵液的菌丝体生物量、胞外多糖含量、胞内多糖含量都得到了提高。灵芝是一种丝状真菌，对剪切力非常敏感。当搅拌转速较低时，剪切力低，对菌丝体没有伤害，但发酵液混合不均匀，从而影响氧和其他营养物质的传递；当搅拌转速较高时，流体混合和氧传递效果好，但剪切力高，对菌丝体有伤害。因此，应该选择合适的搅拌转速平衡流体混合、氧传递和剪切力，从而提高灵芝菌丝体的产物合成能力。本发明根据灵芝菌体生长特性控制搅拌转速，当灵芝菌丝体生长处于迟滞期时，对溶氧需求还不高，因此搅拌转速可以控制在较低水平，当灵芝菌丝体生长处于对数期时，菌体大量繁殖，溶氧需求增大，适当提高搅拌转速，当灵芝菌丝体生长处于稳定期时，过量的氧供应对菌体细胞内合成代谢可能有抑制作用，因此可以再适当降低搅拌转速。

实施例6

本实施例是为了验证本发明的半连续液体培养过程中，对发酵液pH的控制对灵芝菌丝体生物量和多糖含量的影响，具体过程如下：

（1）母种的活化扩繁、（2）摇瓶菌种的制备、（3）种子液的制备、（4）一氧化氮和乙烯协同诱导处理与实施例1相同，（5）半连续液体培养，发酵罐①和发酵罐②中，只将发酵培养基初始pH调节为5.3，在培养过程中不控制发酵液的pH，其它与实施例1相同。

发酵结束后，测定灵芝发酵液的菌丝体生物量、胞外多糖含量、胞内多糖含量，结果如下表5。

分析表5的数据可以得出，与不控制pH相比，采用本发明的控制发酵液pH方法，灵芝发酵液的菌丝体生物量、胞外多糖含量、胞内多糖含量都得到了提高，尤其是胞外多糖含量差异更显著。pH是影响真菌生长和发酵生产真菌多糖的重要因素，真菌生长最适pH和产物形成最适pH不尽相同。对灵芝菌丝体而言，当pH值为5.3左右时，有利于菌体的生长和胞内多糖的积累，当pH值为4.5左右时有利于胞外多糖的积累，而胞外多糖的含量是显著高于胞内多糖的，因此本发明对发酵液的pH进行控制，以求能够获得最多的胞外多糖产量。

实施例7

本实施例是为了比较本发明的半连续液体培养方法与分批培养方法对灵芝菌丝体生物量和多糖含量的影响，具体过程如下：

（1）母种的活化扩繁、（2）摇瓶菌种的制备、（3）种子液的制备、（4）一氧化氮和乙烯协同诱导处理与实施例1相同，（5）液体培养：待协同诱导处理结束后，向发酵罐中通入净化空气，通气量为0.6（V/V·min），培养温度和转速不变，培养40h后将转速调整为140r/min，通气量调整为1.1（V/V·min），在此条件下培养6d。

S5发酵结束后，对制得的灵芝发酵液进行菌丝体生物量、胞外多糖含量、胞内多糖含量检测，检测方法同实施例1。

分析表6的数据可以得出，与分批培养相比，采用本发明的半连续培养方法，灵芝发酵液的菌丝体生物量、胞外多糖含量、胞内多糖含量都得到了显著提高。并且采用本发明的方法一次培养可以同时获得2个发酵罐的产量，大大提高了生产效率，降低了生产成本。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims

1.一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：

（1）母种的活化扩繁

（2）摇瓶菌种的制备

（3）种子液的制备

（4）一氧化氮和乙烯协同诱导处理

（5）半连续液体培养

2.根据权利要求1所述的一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，其特征在于，所述步骤（2）和步骤（3）中，液体培养基的成分为：葡萄糖20~25g/L，玉米粉11~15g/L，酵母浸粉1.8~2.2g/L，干酪素3.7~4.3g/L，油菜秸秆粉2.1~2.3g/L，羧甲基纤维素钠3.0~4.0g/L，KH₂PO₄ 1.8~2.2g/L，MgSO₄0.9~1.1g/L，胡萝卜汁26~34ml/L，蚯蚓干粉4.4~5.0g/L，ZnSO₄0.07~0.11g/L，四甲基戊二酸 5.4~5.8mg/L，松针提取液12~15ml/L，硬脂酸33~39mg/L，pH调节为5.2~5.4。

3.根据权利要求1所述的一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）中，高压蒸汽灭菌的条件为温度121-123℃，压力0.11-0.13MPa，灭菌时间40-50min。

4.根据权利要求1所述的一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，发酵培养基的成分为：玉米粉24~28g/L，麦麸15~19g/L，木质素8.5~9.3g/L，酵母破碎液15~20ml/L，椰糠粉3.8~4.4g/L，大豆粉5.5~6.5g/L，羧甲基纤维素钠2.6~3.0g/L，三七药渣5.9~6.5g/L，穿心莲药渣3.3~3.9g/L，茯苓药渣5.2~5.8g/L，松针提取液12~15ml/L，KH₂PO₄ 1.8~2.2g/L，MgSO₄0.9~1.1g/L，硝酸镧13~15mg/L，有机硅消泡剂30~40mg/L，初始pH调节为5.2~5.4。

5.根据权利要求1所述的一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，通入的一氧化氮和乙烯高纯气体的体积比为1:1，通入量分别为发酵罐容积的10%。

6.根据权利要求1所述的一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，其特征在于，所述步骤（5）中，放出发酵液的体积为发酵培养基的15~25%。

7.根据权利要求4所述的一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分中，酵母破碎液的制备方法为：将酵母菌种接种到YEPD培养基中，在35℃、转速170r/min的恒温摇床上培养3d，取酵母发酵液于5000r/min条件下离心15min，收集沉淀，用蒸馏水冲洗几次，加入适量的生理盐水，用超声波破碎仪进行破碎；将破碎液在10000r/min、4℃的条件下离心10min，取上清液加入生理盐水稀释100倍。