CN115869343A - 一种山东灵芝胞外醇沉物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种山东灵芝胞外醇沉物在制备抗肿瘤药物中的应用，将保藏编号为CGMCC NO.40284的山东灵芝（Ganderma shangdongense）的胞外醇沉物用于制备抗肿瘤药物。该用途为开发新的潜在抗肿瘤药物提供了有效途径，同时为开发山东灵芝这一宝贵资源提供了一定的理论基础。

Description

一种山东灵芝胞外醇沉物在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种山东灵芝胞外醇沉物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

山东灵芝Ganodermashandongense担子果一年生，有柄，木栓质或木质，无气味、味苦，干燥后质量轻。菌盖形状多变，匙形或圆形。

癌症是全球范围内的重大公共卫生问题，为癌症患者寻找新的肿瘤治疗药物一直是学术界的热门研究领域。天然产物活性剂在肿瘤治疗中发挥了重要的作用。其中，药用真菌作为传统保健物在我国已有悠久的历史。根据文献报道，药用真菌的抗肿瘤作用在肺癌、肠癌、肝癌及乳腺癌等多种体内外模型中得到验证。它们具有复杂多样的生物活性成分和不同的抗肿瘤机制，主要通过直接作用于肿瘤细胞和调节机体的免疫系统以增强机体免疫力两种方式实现抗肿瘤作用。而在药用真菌中寻找活性好的资源作为抗癌新型药物研究的材料是当下研究的热点。

发明内容

本发明提供一种山东灵芝胞外醇沉物在制备抗肿瘤药物中的应用，旨在测定山东灵芝胞外醇沉物对六种细胞体外增殖的抑制活性，即肺癌细胞（A549）、卵巢癌细胞（SKOV3）、乳腺癌细胞（MCF-7）、肝癌细胞（HepG₂）、食管癌细胞（ECA-109）和宫颈癌细胞（Hela）。体外抗肿瘤活性评价结果可用于抗癌药物的筛选工作，且有利于在细胞水平上对药物作用的分子生物学机理进行深入的研究。通过乙醇醇沉的方法可将发酵液中醇溶性蛋白质和糖类等大分子物质析出，在醇沉物里多糖和蛋白质占主要成分。对山东灵芝胞外醇沉物中多糖成分进行纯化分析。该方法为开发新的潜在抗肿瘤药物提供了新资源，同时为开发山东灵芝这一宝贵药用真菌资源提供一定的理论基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种山东灵芝胞外醇沉物在制备抗肿瘤药物中的应用，将保藏编号为CGMCC NO.40284 的灵芝菌种（Ganodermashandongense）的胞外醇沉物用于制备抗肿瘤药物。

所述的胞外醇沉物的制备方法为：

（1）将平板活化6-7d的山东灵芝菌种转接到液体菌种培养基中，25-29℃、110-150rpm摇床中震荡培养6-7d后，作为液体菌种，以5-10%的接种量转接到液体发酵培养基中扩大培养8-10d。培养结束后，用200目纱网进行过滤，得到发酵液和菌丝；其中所述山东灵芝（Ganodermashandongense）的保藏编号为CGMCC NO.40284。

（2）将过滤的发酵液加热并浓缩至原始体积的1/10，后加入1-4倍70-95%乙醇进行醇沉，醇沉24-48h后，置5000r/min离心机中离心10min，所得沉淀经冷冻干燥后，即为胞外醇沉物。

优选地，所述的山东灵芝液体菌种活化的过程为：接种量为每瓶10块0.5cm²平板菌种块，培养的前1-3天，温度设定25-27℃，转速110r/min，避光振荡培养；培养的第3-7天，温度设定27-29℃，转速130-150r/min，避光振荡培养。

优选地，所述的山东灵芝液体发酵扩大培养的过程为：液体菌种接种量5-10%，培养的第1-5天，温度设定27-29℃，转速130-150r/min，避光振荡培养；培养的第5-8天，温度设定25-27℃，转速110-130r/min，避光振荡培养。

优选地，液体菌种活化培养基为：马铃薯20%，合欢木屑1%，葡萄糖2%。

优选地，液体发酵扩大培养的培养基为：玉米面1%，麸皮1%，蔗糖2%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.3%，KH₂PO₄0.1%，MgSO₄·7H₂0 0.05%。

有益效果

本发明通过将山东灵芝胞外醇沉物用于体外细胞试验，发现其具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用。

山东灵芝胞外醇沉物对供试六种肿瘤细胞株中的4种细胞株有不同程度的增殖抑制作用。其中，对肺癌细胞A549和卵巢癌细胞SKOV3的增殖抑制作用效果显著，在供试浓度范围内（2.5mg/mL-62.5mg/mL）抑制率均达50%以上。本试验结果为药用真菌来源抗肿瘤药物的筛选提供了可靠的资源支撑，为山东灵芝抗肿瘤药物的开发提供了理论基础。

菌种保藏信息

保藏时间：2022.8.24；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏编号：CGMCC NO.40284；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；

分类命名：山东灵芝Ganodermashandongense。

附图说明

图1为山东灵芝胞外醇沉物对A549细胞抑制率；

图2 为山东灵芝胞外醇沉物对SKOV3细胞抑制率

图3 为山东灵芝胞外醇沉物洗脱曲线；

图4为山东灵芝胞外醇沉物对HepG₂细胞不同时间浓度抑制效果；

图5为 山东灵芝胞外醇沉物对ECA-109细胞不同时间浓度抑制效果；

图6为山东灵芝胞外醇沉物对MCF-7细胞不同时间浓度抑制效果；

图7为山东灵芝胞外醇沉物对Hela细胞不同时间浓度抑制效果；

图8为山东灵芝纯化组分TOP-1 HPLC结果；

图9为纯化组分TOP-1分子量分布结果；

图10为纯化组分TOP-1刚果红试验结果；

图11为纯化组分TOP-1红外光谱分析结果。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂药品

表1试剂药品

1.1.2 供试菌株

供试菌种为从合欢树上采集新鲜子实体后通过组织分离和菌种纯化而得到，该菌株分类命名为山东灵芝Ganodermashandongense，已于2022.8.24保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.40284。

子实体形态特征：菌盖匙形至圆形。菌盖直径6-6.5cm，厚1.2-2.8cm。菌盖表面有中度漆状光泽，浅黄褐色至黄褐色。菌盖表面有细微的同心环痕和沟纹。菌盖边缘锐或钝，幼时浅黄褐色至乳白色，成熟时变为黄褐色，与菌盖同色。菌柄呈扁平状或近圆柱形，侧生或背侧生，黄褐色至红褐色，长3-5cm，直径1-1.5cm。孔口表面幼时为白色，被触摸后变为褐色或深褐色，干燥时为淡黄色，多角形或近圆形。每毫米3-4个，管壁薄。菌肉为乳白色，无同心环纹，厚可达2.5cm，未见黑色壳质线。菌管浅黄褐色，硬木栓质,不分层，厚0.3-0.5cm。

显微结构特征：菌丝三体系；骨架菌丝占绝大多数，棕黄色，厚壁至亚实心，多二分枝；生殖菌丝有锁状联合，无色，薄壁，不常见；缠绕菌丝浅棕色，厚壁且内腔窄，至亚实心；以上３种类型菌丝KI-，CB+；在KOH试剂中组织颜色变黑。菌肉菌丝：骨架菌丝1.7-4.5μm；生殖菌丝1.5-3μm；缠绕菌丝1-2.5μm。菌管菌丝：骨架菌丝2.2-5μm；生殖菌丝2-3.5μm；缠绕菌丝1.6-2.3μm。担子17-30×7-13μm；拟担子17-30×7-13μm。

菌种分子鉴定：子实体及菌丝体经试剂盒提取DNA，并以ITS5/ITS4引物扩增和测序，子实体和菌丝体共同的rDNA-ITS序列如下：

TCTGTTGCGACTGCGGACGACATTATCGAGTTTTTGACTGGGTTGTAGCTGGCCTTCAGAGGCATGTGCACGCCCTGCTCAATCCACTCTACACCTGTGCATTTACTGTGGGTTTCAGATCGTGAAGCGGGCTCTTTTACGGGCCCGTGAAGCGCTTCTGTGCCTGCGTTTATTACAAACCCTGTAAAGTATCAGAATGTGTATTGCGATGTAACGCATGTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATCTTCAACCTATAAGCCTTTGCGGTTTGTAGGCTTGGACTTGGAGGCTTGTCGGCCCTCGTCGGTCGGCTCCTCTTAAATGCATTAGCTTGATTCCTTGCGGATCGGCTGTCGGTGTGATAATGTCTACGCCGCGACCGTGAAGCGTTTGGCGAGCTTCTAATCGTCTTGTATGGAGACAACGTTATGACCTCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATAAA

1.1.3供试培养基

液体菌种培养基：马铃薯20%，合欢木屑1%，葡萄糖2%。

液体发酵培养基：玉米面1%，麸皮1%，蔗糖2%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.3%，KH₂PO₄0.1%，MgSO₄·7H₂0 0.05%。

方法

1.2.1胞外醇沉样品制备

将平板活化6d的山东灵芝菌种转接到液体菌种培养基中，27℃、110-130rpm摇床中震荡培养6d后即得液体菌种。液体菌种以10%的接种量转接到液体发酵培养基中扩大培养8d后培养结束。

发酵全液经200目纱网过滤，滤液即为发酵液。将过滤的发酵液加热并浓缩至原始体积的1/10，后加入4倍95%乙醇进行醇沉，醇沉24h后，置5000r/min离心机中离心10min，所得沉淀经冷冻干燥后，即为胞外醇沉物。

肿瘤细胞增殖抑制试验

样品溶液配制：称取625mg样品于离心管中，加入10mL细胞完全培养基，超声溶解，离心5000 rpm，5 min，收集上清液，沉淀经烘干后称重并记录。上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，得到62.5 mg/mL样品溶液。依次稀释，制备12.5 mg/mL、2.5mg/mL、0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.02 mg/mL的6种样品溶液。

铺板：按传代培养方法制细胞悬液。将细胞悬液接种到96孔板，每孔接种100μL细胞悬液。放入5% CO₂、37℃的二氧化碳恒温培养箱中培养。

上样：将原来孔中的细胞悬液吸出，依次设置阴性对照组、阳性对照组和药物组，后放入5% CO₂、37℃的二氧化碳恒温培养箱中培养。

测吸光值：培养相应时间后将孔中培养基吸出，加入20μL 5 mg/mL的MTT溶液和80μL细胞完全培养基，放入CO₂培养箱中孵育4h。每孔加入150μL DMSO，放至水平摇床上轻轻震摇15 min，记录酶标仪于490 nm处的OD值。

细胞增殖抑制率（%）=（对照组OD值-加药组OD值）/对照组OD值×100%

1.2.3多糖的分离纯化

称取1g胞外醇沉样品，溶于10mL蒸馏水，1000r/min离心10min，保留上清液，通过DEAE-52纤维素柱分级纯化，沉淀烘干称重。

DEAE-52纤维素柱预处理和装柱

称取100.0g DEAE-52纤维素粉末于装有去离子水500mL的烧杯中，浸没泡至2h后抽滤，去除杂质。用0.5mol/L HCl溶液、去离子水、0.5mol/L NaOH溶液对DEAE-52纤维素进行预处理。即可将DEAE-52纤维素灌装至层析柱中。

使用纤维素柱 (26 mm ×46 cm)应当在装填前用去离子水反复彻底清洗，以避免柱内有杂质污染，对后续实验造成影响。将色谱柱垂直安装在钢架上，加入蒸馏水至色谱柱容量的1/3左右，不宜超过1/2。在装柱过程中应当始终保持处理过的纤维素溶液湿润，将其搅拌均匀后再进行填充。在填充过程中应当保证纤维素溶液均匀地沿着管壁滑下，使其自然沉降以避免气泡。在分步填充纤维素溶液的时，应当先用玻璃棒轻轻搅拌纤维素表面层，以防止来回添加的纤维素溶液之间形成边界层。

装柱完成后，用去离子水平衡至层析柱柱床体积不变为止，即可进行上样分离操作。

洗脱与收集

称取1g胞外醇沉样品溶于5mL蒸馏水中，充分混匀后15000r/min离心10min，吸取上清上样。用蒸馏水，0.05mol/mL、0.1mol/mL、0.2mol/mL及0.3mol/mL的NaCl作洗脱剂，分管连续收集洗脱液，洗脱速度2mL/min，每个梯度收集30-35管。收集结束后，对奇数号的收集管中的洗脱液利用蒽酮硫酸法进行多糖含量测定，记录吸光值。绘制洗脱曲线，根据峰值结果，分别合并多糖高峰纯化组分冷冻干燥后保存备用。

DEAE-52纤维素柱的再生、保存.

将使用过的纤维素溶液用1-2mol/L NaOH清洗过柱，至少使用四个柱体积的溶液进行清洗，然后再用0.5mol/L NaOH和HCl处理，最后用蒸馏水反复洗至中性即可再次利用。试验结束，存放在20%乙醇中，4℃冰箱长期保存。

多糖含量测定

参考田雪梅等人的方法（田雪梅2014）。

多糖结构表征测定

1.2.5.1 单糖组分分析

1.2.5.2标准混合单糖的制备

将适量的各种标准单糖溶解于装有70%的甲醇溶液的试管中，配制成10mg/mL的标准单糖溶液。等量吸取所得的各种单糖溶液至离心管中，混匀。混匀后在60℃水浴下挥干甲醇，获得标准混合单糖。

多糖样品的处理

分别称取10mg的多糖样品于含有2mL 4mol/L的三氟乙酸的安瓿瓶中，溶解封管后在120℃下进行水解反应，反应时间持续6h。反应结束后对水解液进行减压干燥将三氟乙酸挥干。干燥后，沉淀用少量三氟乙酸溶解，充分溶解后转移至离心管，进行10000r/min离心10min，取上清液于离心管中，真空干燥，备用。

样品及标准混合糖的衍生化

依次将PMP-甲醇溶液和NaOH各40μL加入标准混合多糖及多糖样品中，混匀封口，在70°C水浴中进行衍生反应，反应时间持续2h，加入40μL HCl停止反应。加入有机溶剂正丁醚对反应物进行多次萃取，充分萃取后进行离心，移去离心液的表层有机相，以除去溶液中过量的PMP。保留PMP-单糖层，加超纯水稀释离心后保留水层，采用0.22μm针筒式滤膜过滤。

将经过衍生化的样品采用高效液相色谱仪检测单糖组成。

分子量测定

根据GPC实验原理测定分子量，将0.2g高峰纯化组分多糖置于10mL离心管中溶解，加蒸馏水定容到10mL，离心取上清液。用凝胶色谱仪对样品上清液进行分子量测定。

刚果红试验

配制刚果红溶液和1mol/L NaOH溶液，按表2加入试剂进行刚果红试验测定样品分子结构中是否含有三股螺旋构象。试剂添加完成后，混匀静置10min使反应充分的进行。反应结束后利用ddH₂O进行调零，在400nm-700nm波段范围进行全波长扫描，测定样液的最大吸收波长。设置另一对照反应体系，该体系不加入纯化组分。

最大吸收波长为横坐标，NaOH浓度为纵坐标，绘制刚果红溶液最大吸收波长随NaOH浓度变化趋势图。

表2 刚果红试验中各种试剂的添加量

1.2.8 红外光谱分析

对高峰纯化组分进行红外光谱(IR)分析测定，精确称取5mg干燥的纯化组分，采用傅里叶变换红外分析光谱仪进行分析。

结果与分析

2.1山东灵芝胞外醇沉物体外抑制肿瘤细胞增殖结果

由图1可知，山东灵芝胞外醇沉物对A549细胞的体外增殖抑制作用随时间的增加而显著增加。在0.02mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL几个较低浓度下有较弱的抑制增殖作用，抑制率均在20%以下，在2.5mg/mL、12.5mg/mL、62.5mg/mL几个较高药物浓度下，均表现出与阳性对照组极显著差异的高效抑制作用。当浓度达到2.5mg/mL和12.5mg/mL时，其增殖抑制率均在50%以上，当浓度为62.5mg/mL时抑制率可达90%以上。

如图2所示，随作用时间的增加，胞外醇沉物对SKOV3细胞的体外增殖抑制作用呈线性关系。药物作用48h，胞内醇沉物在较低浓度0.02mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL下有较弱的抑制作用，抑制率均在30%左右；在12.5mg/mL和62.5mg/mL的较高浓度下，对肿瘤细胞的抑制作用良好，与阳性对照组存在极显著差异，抑制率均在50%以上。药用作用96h，浓度为62.5mg/mL药物组的抑制率可达90%以上。

如图3所示，胞外醇沉物在浓度为62.5mg/mL时，才对HepG₂细胞表现出抑制效果，抑制率60%左右。在加药24h，浓度0.02mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、 2.5mg/mL、12.5mg/mL时表现出较弱的抑制作用且随着时间的延长逐渐消失。总体来看，胞外醇沉物对 HepG₂无显著抑制效果。

如图4所示，胞外醇沉物只在62.5mg/mL浓度下对ECA-109细胞表现出一定的抑制作用，在其他浓度下均无显著抑制作用。

如图5所示，胞外醇沉物对MCF-7细胞只在浓度为62.5mg/mL时抑制率可达80%以上。但在其他5个浓度时均无显著抑制作用。

如图6所示，胞外醇沉物仅在浓度62.5mg/mL时，对Hela细胞表现出一定的抑制作用，其他浓度无显著抑制作用。

综合分析，山东灵芝胞外醇沉物对A549细胞和SKOV3细胞具有显著的体外增殖抑制作用。

山东灵芝胞外醇沉物DEAE-52洗脱结果

由图7可知，采用DEAE-52纤维素柱对山东灵芝胞外醇沉物进行分离纯化，得到去离子水洗脱组分、0.05mol/mL NaCl洗脱组分和0.1mol/mL NaCl洗脱组分，各组分所占比例分别为92.86%、5.11%和2.03%。其中以去离子水的洗脱组分为主要组分，本试验中将其命名为TOP-1。将高峰组分的洗脱液合并，浓缩，冷冻干燥，得到纯化产品。多糖得率57.69%。经测定，山东灵芝多糖经DEAE-52纤维素分离纯化得到的纯化组分TOP-1的多糖含量为74.53%。

山东灵芝TOP-1组分单糖测定结果

由图8中高效液相色谱分析结果可知，TOP-1组分含有7种单糖，依次为：甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)。摩尔比为：甘露糖：鼠李糖：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖=1:1.34:1.67:1.96:2.20:2.37:2.41

2.4山东灵芝TOP-1组分多糖含量测定结果

由图9的试验结果可知，TOP-1组分整体分子量处于13950—45870Da之间，Mw/Mn为1.12，其中多糖分子的Mw为19640Da、Mn为17510Da。试验结果表明该TOP-1多糖的分子量的分布跨度较小，分子链长短分布均匀且集中。

山东灵芝TOP-1组分刚果红试验结果

由图10可知，在0-0.4mol/mL浓度梯度的NaOH溶液下，TOP-1最大吸收波长不断上升，在0.4mol/mL浓度的NaOH下达到最大值，继续加大 NaOH溶液浓度，纯化组分TOP-1的最大吸收波长下降。这是由于NaOH的-OH破坏了TOP-1多糖分子内的三股螺旋结构。表明纯化组分TOP-1能够与刚果红形成配位物，该结果提示纯化组分TOP-1分子结构中存在三股螺旋构象。

山东灵芝TOP-1组分红外光谱测试结果

如图11所示，红外光谱（4000cm^-1-400cm^-1）扫描结构表明：TOP-1多糖具有9个吸收峰。O-H的伸缩振动在3272.46cm^-1处形成较宽的中吸收峰，这是纯化组分TOP-1中的O-H相互之间形成氢键或与水分子的O-H形成氢键，同时也是多糖的特征峰；2927.68cm^-1处有中吸收的窄峰，此峰为由于C-H的伸缩振动形成的反对称峰，1652.10cm^-1处的中吸收峰是C=C与TOP-1多糖分子内其他高能键相互作用形成的伸缩振动峰；1405.81cm^-1和1323.14cm^-1处出现峰值则证明该多糖具有O-H变角振动引起的面外弯曲振动峰是多糖的特征吸收峰。图谱在1023.67cm^-1处的峰值为C-O的伸缩振动峰，是吡喃环中的伸缩振动引起的，表明了TOP-1中含有吡喃型糖环。

讨论

多糖的化学构成是其生物学活性的物质基础，多糖构成与功能之间密不可分。初步探索了山东灵芝多糖的结构组成，推断山东灵芝多糖TOP-1组分是一种具有三股螺旋构象和多种官能团，以葡萄糖残基等为主链，同时含有木糖和阿拉伯糖分支的的吡喃型糖环糖肽。

试验结果表明，山东灵芝胞外醇沉物对供试六种肿瘤细胞株中的4种细胞株有不同程度的增殖抑制作用。其中，对肺癌细胞A549和卵巢癌细胞SKOV3的增殖抑制作用效果显著，在供试浓度范围内（2.5mg/mL-62.5mg/mL）抑制率均达50%以上。本试验结果为药用真菌来源抗肿瘤药物的筛选提供了可靠的资源支撑，为山东灵芝抗肿瘤药物的开发提供了理论基础。

Claims (6)

1.一种山东灵芝胞外醇沉物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，将保藏编号为CGMCC NO. 40284的山东灵芝（Ganderma shangdongense）的胞外醇沉物用于制备抗肿瘤药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的胞外醇沉物的制备方法为：

（1）将平板活化6-7d的山东灵芝菌种转接到液体菌种培养基中，25-29℃、110-150rpm摇床中震荡培养6-7d后，作为液体菌种，以5-10%的接种量转接到液体发酵培养基中扩大培养8-10d；

培养结束后，用200目纱网进行过滤，得到发酵液和菌丝；其中所述山东灵芝（Ganderma shangdongense）的保藏编号为CGMCC NO.40284；

（2）将过滤的发酵液加热并浓缩至原始体积的1/10，后加入1-4倍70-95%乙醇进行醇沉，醇沉24-48h后，置5000r/min离心机中离心10min，所得沉淀经冷冻干燥后，即为胞外醇沉物。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的山东灵芝液体菌种活化的过程为：接种量为每瓶10块0.5cm²平板菌种块，培养的前1-3天，温度设定25-27℃，转速110r/min，避光振荡培养；培养的第3-7天，温度设定27-29℃，转速130-150r/min，避光振荡培养。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的山东灵芝液体发酵扩大培养的过程为：液体菌种接种量5-10%，培养的第1-5天，温度设定27-29℃，转速130-150r/min，避光振荡培养；培养的第5-8天，温度设定25-27℃，转速110-130r/min，避光振荡培养。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，液体菌种活化培养基为：马铃薯20%，合欢木屑1%，葡萄糖2%。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，液体发酵扩大培养的培养基为：玉米面1%，麸皮1%，蔗糖2%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.3%，KH₂PO₄ 0.1%，MgSO₄·7H₂0 0.05%。

Images