CN105753998B

CN105753998B - 一种桃胶多糖降解产物pgp‑1及其制备方法和应用

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Publication number: CN105753998B
Application number: CN201610043173.0A
Authority: CN
Inventors: 冉艳红; 刘天祥; 李弘剑; 周天鸿; 王伟; 杨晓萍
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2016-01-23
Filing date: 2016-01-23
Publication date: 2018-04-10
Anticipated expiration: 2036-01-23
Also published as: CN105753998A

Abstract

本发明提供了一种桃胶多糖降解产物PGP‑1，所述PGP‑1中不含有中性多糖，所述PGP‑1的分子量分布在1×10⁵～1×10⁶范围内，所述PGP‑1由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成；所述阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的摩尔比为0.637:0.054:0.073:0.022:0.556。本发明的提供的PGP‑1制备简单，并能够显著促进双歧杆菌的增长，抑制屎肠球菌的增长，且具备较强的对羟基自由基和DPPH˙自由基的清除能力，具备显著抑制Hela细胞生长的能力，Galectin‑3介导的细胞凝集抑制实验表明，其能够显著抑制Galectin‑3介导的鸡血红细胞、Hela细胞以及MCF‑7细胞的凝集。

Description

一种桃胶多糖降解产物PGP-1及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于桃胶多糖制备技术领域，更具体地，涉及一种桃胶多糖降解产物PGP-1及其制备方法和应用。

背景技术

桃胶为蔷薇科植物桃或山桃树皮中分泌出来的树脂。关于桃胶的药用价值，中医古籍广有记载。桃胶性平，味甘苦，擅长活血消肿、通淋止痛，止渴、消渴。临床运用对血淋、石淋、糖尿病等症均有良效。

我国桃胶资源丰富，是一种优质的中药资源。国内外均有关于桃胶多糖组成的报道，但是天然多糖的酶水解一直以来都是世界性难题，高效多糖水解酶菌株的筛选及相关研究一直备受人们的关注。由于多糖空间构象的位阻作用，单一酶很难将多糖完全解聚。由于桃胶本身短螺旋结构的保护及侧链所产生的位阻，使得一般的阿拉伯半乳聚糖水解酶如半乳糖苷酶、阿拉伯糖苷酶和半乳糖醛酸酶等都很难将其降解。本课题组采用前期研究的成果，采用具有分解桃胶能力的微杆菌A5在桃胶培养基中诱导产酶的方法来水解桃胶多糖，并进行分离纯化，期望得到一种经过酶解后的产物，能够展现更高的生物学活性，从而为桃胶多糖的进一步提取和应用提供技术支持。

发明内容

本发明根据目前桃胶多糖提取技术中的不足，提供了一种桃胶多糖降解产物PGP-1及其制备方法和应用。

本发明的技术目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种桃胶多糖降解产物PGP-1，所述PGP-1中不含有中性多糖，所述PGP-1的分子量分布在1×10⁵～1×10⁶范围内，所述PGP-1由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半半乳糖组成；所述阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半半乳糖的摩尔比为 0.637:0.054:0.073:0.022:0.556。

本发明所述桃胶多糖降解产物PGP-1的制备方法，包括如下步骤：

S1. 将菌种活化，得到种子液；

S2. 将S1中所得种子液接种至桃胶培养基，进行发酵培养，S2中发酵温度为20~40℃，初始桃胶浓度4~8%，培养基pH为4~6，摇床转速为160~200rpm，得到发酵液；

S3.将S2中所得发酵液进行分离纯化，得到所述PGP-1；

所述S1中菌种为微杆菌A5，所述微杆菌A5于2009年8月7日保存于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M209174；

所述S3中包括如下步骤：

S31.将S2中所得发酵液离心，得到桃胶多糖液，然后过滤，依次将过滤产物经过脱蛋白、醇沉、冷冻干燥后，得到冷冻干燥产物；

S32.将S31中所得干燥产物经过阴离子交换、浓缩、透析、除杂、冷冻干燥后即得所述PGP-1。

本课题组采用前期研究的成果，在特定酶解条件下，采用具有分解桃胶能力的微杆菌A5在桃胶培养基中诱导产酶的方法来水解桃胶多糖，并结合分离纯化工艺，提取得到了桃胶多糖PGP-1。

经菌体降解后获得的多糖产物中会有培养基来源的无机盐及醇不溶的小分子等杂质，以及菌体及菌体分泌的蛋白及其它代谢产物。可按分子大小和形状分级（如分级沉淀、超滤、分子筛、层析等），也可按分子所带基团的性质分级（如按电荷性质分级的电泳、离子交换层析等）进而对多糖降解产物进行分离提取。

同时，本发明中发现，PGP-1经过DEAE-Cellulose 52阴离子交换柱的方式可以获得，但是经过Sephadex G200柱层析和有机溶剂洗脱的分离方式不能将经过发酵后的桃胶粗多糖产品分离开来。

优选地，所述阴离子交换中使用的交换柱为DEAE-Cellulose 52，洗脱为采用NaCl溶液进行梯度洗脱。

更优选地，所述NaCl溶液的梯度洗脱浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L。

优选地，所述S2中发酵温度为30℃，初始桃胶浓度8%，培养基pH为4，摇床转速为160rpm，接种量为3%。。

优选地，所述S1中菌种活化为将所述菌种在4℃保存斜面菌种，营养琼脂平板划线，37℃倒置培养24h，从平板挑单克隆转接到LB试管培养基，于200rpm转速，37℃下震荡培养12h。

优选地，所述S31中脱蛋白采用Sevage法脱蛋白，所述S31中醇沉为采用75%的乙醇；

所述S32中浓缩为采用聚乙二醇8000进行浓缩处理，所述透析为采用截留分子量200的透析袋。

本发明中发酵液的分离纯化步骤如下所示：

。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的提供的PGP-1制备简单，并能够显著促进双歧杆菌的增长，抑制屎肠球菌的增长，且具备较强的对羟基自由基和DPPH˙自由基的清除能力，对Galectin-3介导的细胞凝集抑制实验表明，其能够显著抑制Galectin-3介导的鸡血红细胞、Hela细胞以及MCF-7细胞的凝集。

附图说明：

图1为实施例2中桃胶粗多糖经过DEAE-52阴离子交换柱NaCl梯度洗脱曲线。

图2为PGP-1的GPC凝胶色谱图。

图3为PGP-1的分子量分布图。

图4为 PGP-1的红外光谱图。

图5为PGP-1的GC-MS图。

图6为PGP-1的MALDI-TOF-MS图。

图7为PGP-1和PGP-2对几种肠道菌生长的影响。

图8为PGP-1的抗氧化活性影响。

图9为PGP-1对Hela细胞毒性和细胞生长抑制作用。

图10为PGP-1对Hela细胞增殖的影响。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：微杆菌降解桃胶制备发酵液：

1、菌种活化

4℃保存斜面菌种，营养琼脂平板划线，37℃倒置培养24h，从平板挑单克隆转接到LB试管培养基，6ml/支，200rpm，37℃，震荡培养12h。

1.8%的LB液体培养基：3.6g复合LB，去离子水定容至200ml，PH=4, 121℃,20分钟灭菌备用。

菌种为微杆菌A5，于2009年8月7日保存于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M209174；

2、摇瓶培养

将活化后的种子液接种至桃胶摇瓶培养基中,500ml三角瓶，装液量为200ml,初始桃胶浓度为8%、初始pH=4,接种量为3%，培养温度为30℃、160rpm震荡培养24h。培养后的发酵液用于后续桃胶多糖降解产物的分离。

桃胶多糖培养基的制备：准确称取桃胶多糖，去离子水定容到200ml，PH=4。121℃,15分钟灭菌备用。

实施例2：将实施例1所得发酵液进行分离纯化：

先将实施例1制备得到的发酵液与Sevage试剂（氯仿∶戊醇或正丁醇（以4∶1或5∶1比例混合）按一定比例混合，然后离心除去介于提取液与Sevage试剂交界处的变性蛋白质，然后采用75%的乙醇来沉淀上述物质，得到桃胶粗多糖。

选用DEAE-Cellulose 52阴离子交换来进一步纯化桃胶粗多糖，具体如下：

取10g DEAE-52加入500ml水，浸泡24h，使纤维素颗粒充分膨胀，去除悬浮的细颗粒。其后转移到布氏漏斗（内垫200目的尼龙网）中抽滤，用200ml 0.5mol/L NaOH–NaCl溶液浸泡4h，转移到布氏漏斗（内垫200目的尼龙网）中抽滤，用蒸馏水洗至中性，抽干后转移到烧杯中，用200ml 0.5mol/L HCl浸泡4h。再转移到布氏漏斗内抽滤，用蒸馏水洗至中性，抽干后转移至烧杯中，如此酸碱反复轮洗，直至洗出液无色澄清为止。最后用150ml 0.02mol/L，PH=6.5的磷酸缓冲液浸泡20min, 脱气后装柱,备用。

DEAE-Cellulose 52阴离子交换树脂柱的制备：先将 1.8×40cm 的层析柱垂直架好，用适量的水溶液先润洗检漏，保持底部有少许水溶液，然后把预先处理好的 DEAE-52搅匀，随即将此悬浊液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的 1/4-1/3 时打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂，严防气泡产生。控制其流速，让200m1 (约5倍柱体积)的用0.02mol/L，pH=6.5的磷酸缓冲液平衡流过固定相，使其达到平衡，固定相高度恒定为30cm。

样品经5000rpm离心10min。取上清液过0.22um微孔滤膜，上样。桃胶多糖的上样体积为5ml,上样浓度为10g/L。

DEAE-Cellulose 52阴离子交换树脂柱的洗脱采用不同浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，洗脱浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L，分别收集洗脱产物。

先用200ml双蒸水洗脱后用盐浓度为0～1.0mol/L的NaCl进行洗脱，每个浓度洗脱体积为100ml,流速控制在1ml/min,部分收集器控制速度在5min/管。

经DEAE-Cellulose 52阴离子交换色谱分离纯化结果如图1所示，从图1中可以看出，双蒸水洗脱组分并没有吸收峰出现，可说明经A5微杆菌降解所产生的多糖溶液中并不含有中性多糖。

本发明在该阶段同时采用过Sephadex G200凝胶过滤色谱和75%的乙醇进行分离纯化，经过洗脱后并没有将桃胶多糖组分进一步分离开来，说明经过发酵后的降解产物并不能通过该方式进行天然产物的提取。

洗脱完成后将洗脱产物采用聚乙二醇8000进行浓缩处理。步骤为将洗脱液装入透析袋，置于饱和聚乙二醇8000溶液中，4℃过夜，袋内溶剂即被聚乙二醇吸收，达到样品浓缩的目的。

然后将浓缩后的溶液放入透析袋（截留分子量200）中流水透析48h，在0.1M NaCl洗脱组分中得到所述PGP1。

实施例3：PGP-1的鉴定：

1、PGP1的纯度鉴定和分子量测定

采用Shodex KS-802和 KS-804 串联柱，示差折光检测器，通过Agilent1100series高效液相色谱仪，以不同相对分子质量的葡聚糖(P-5、P-10、P-20、P-50、 P-100、 P-200、P-400 和 P-800)作为标准品，做出标准曲线，测定多糖的纯度及相对分子质量。

如图2所示，在13.191min时有一个纯度较高的单一峰出现，说明PGP-1是纯度较高的均一组分。如图3所示，PGP-1的相对分子质量在1×10⁵～1×10⁶的范围内。

2、PGP1的IR 光谱分析

称取 5mg 的PGP1进行 KBr 压片，在 400～4000cm^-1之间扫描。

如图4所示，PGP-1含有多糖的在4000~400cm^-1区具有多糖类物质的一般特征，3410cm^-1处为O─H的伸缩振动吸收峰；在更低的区域2888cm^-1处为C─H（主要包括CH、CH2、CH3）的伸缩振动吸收峰，这两组峰是糖类化合物的特征吸收峰。在2400cm^-1处存在微弱的N-H伸缩振动吸收峰，在1640cm^-1处存在COO^-的特征吸收峰，1500～1200 cm^-1处存在的几个吸收峰（1281 cm^-1、1344 cm^-1、1468 cm^-1）是C-H变角振动，1113 cm^-1处的吸收峰是C-O-C的变角振动引起的，961cm^-1处的峰为D-葡萄糖的振动引起，842 cm^-1处为吡喃糖β型C-H变角振动。

3、PGP1的GC-MS 分析

多糖的水解：取 10mg 多糖加入 3mL 2mol/L 的 TFA 溶液，封管 100℃水解90min, 旋转蒸发仪蒸干，加入2ml甲醇，蒸干，以充分带走 TFA,反复2次。残基加入2ml双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，旋蒸，加入甲醇3ml，反复3次，旋蒸至粉末，110度烘箱烘干。

乙酰化衍生物：取出烘干样品，加入 1mL 的吡啶，1mL 的乙酸酐， 100℃反应1h,冷却,然后加入3mL甲苯,减压浓缩蒸干,重复4-5次,以除去多余的醋酐。将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗,加入少量蒸馏水充分震荡后,除去上层水溶液,如此重复4次。氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥,定容至10mL。

GC条件：Agilent 7890a Hp-5 (Agilent 19091J-413)色谱柱(30m×0.25mm×320µm)；程序升温条件为：起始温度140°C，以1.5°C/min升温至200°C/min；最后以10°C /min升温至250°C，保持5min；进样口温度为250°C，检测器温度为250°C/min，氢气流量30mL/min，空气流量400mL/min；载气为N2，流速为1mL/min。

PGP-1的乙酰化衍生物的色谱图见图5，单糖定性采用与标准样保留时间对照、标准样品质谱图对照和质谱检索三种方法结合鉴定，由此所得PGP-1的单糖组成及摩尔比见表1。

表1 PGP-1的GC-MS 分析

	阿拉伯糖	木糖	甘露糖	葡萄糖	半乳糖
						保留时间	16.646	17.609	27.641	28.19	28.7
摩尔比	0.637	0.054	0.073	0.022	0.556

由图 5及表 1 可以看出PGP-1的单糖的组成为阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。摩尔比为0.637:0.054:0.073:0.022:0.556。

4、PGP-1的MALDI-TOF-MS分析

取PGP-1多糖样品1mg溶解到10μl的TFA中，进行MALDI-TOF-MS分析，结果如图6所示。

由图6得出，后面的峰从877.5～1493.9范围内，每个峰之间相差分子量为44，推断PGP-1主要由酸性多糖组成，其中含有大量的糖醛酸。877.5处对应的是由6个阿拉伯单糖脱水缩合并且被氧化形成的六阿拉伯糖醛酸、921.6处对应的是6个阿拉伯单糖形成的六阿拉伯糖二醛酸、965.6处对应的是6个木糖单糖形成的六木糖三醛酸、1009.6处对应的是六木糖四醛酸、1053处对应的是六阿拉伯糖五醛酸、1097.7处对应的是六木糖六醛酸、1141.7处对应的是由三个木糖和四个阿拉伯糖脱水缩合后被氧化形成的三木糖四阿拉伯糖五醛酸、1185.7处对应的是三木糖四阿拉伯糖六醛酸、1229.8处对应的是三木糖四阿拉伯糖七醛酸、1273.8处对应的是三葡萄糖四甘露糖三醛酸、1317、3处对应的是三半乳糖四葡萄糖四醛酸，综上可知PGP-1是由聚合度不同的糖醛酸所组成的酸性多糖。

实施例4：效果验证：

1、PGP-1对几种肠道菌生长的影响

(1)将药物妈咪爱一包(1g/包)和金双歧一片（0.5g/片）分别用无菌0.9%NaCl溶解，配成0.01g/ml的菌液，并稀释10^-4倍制成样品菌液，用混合平板培养的方法，每个平板菌液1ml，分别加100mg，200mg，500mg和1000mg的PGP-1做三个重复，以不加任何糖样为空白对照。

(2)将KF培养基于恒温培养箱中37℃培养24h，选择性培养屎肠球菌；TPY培养基置于CO₂培养箱中37℃厌氧培养24h，选择性培养双歧杆菌；营养琼脂培养基于恒温培养箱中37℃培养24h，选择性培养枯草杆菌。

(3)培养24h后将各培养基取出，通过将实验组与对照组的菌体数量做对比来评估不同浓度的PGP-1对三种菌生长的影响。

结果如图7所示，其中a、b和c分别代表对屎肠球菌、双歧杆菌和枯草杆菌的影响，从图7中可知，PGP-1能够显著促进上述几种肠道菌的生长。

2、1）PGP-1对羟基自由基清除效果：

原理为利用 H₂O₂与 Fe²⁺混合产生羟自由基，即：H₂O₂+ Fe²⁺→·OH+ H₂O₂+ Fe²⁺。再在体系内加入水杨酸捕捉羟自由基并产生有色物质，该物质在510 nm 处有最大吸收。用该吸光值来表示羟自由基的含量。

具体步骤如下：反应体系中含1ml8.8mmol/LH₂O₂,1ml9mmol/LFeSO₄,1ml9mmol/L水杨酸-乙醇，1ml待测溶液，其中H₂O₂最后加入并启动整个反应。37℃反应0.5h,12000r/min离心6min,然后以双蒸水作参比，在510nm下测定吸光度。考虑待测溶液本身的吸光度不同，以1.0ml9mmol/LFeSO₄溶液、1.0ml9mmol/L水杨酸-乙醇溶液、1.0ml不同浓度的样品溶液、1.0ml蒸馏水作为样品的本底吸收值。空白组用蒸馏水代替样品溶液，对照组用蒸馏水代替过氧化氢溶液。

式中：A₀─为空白对照液的吸光度；

A₁─为加入样品溶液后的吸光度；

A₂─为不加H₂O₂样品溶液本底的吸光度。

2）、PGP-1对DPPH˙自由基的清除

分别取2.0ml不同浓度的样品溶液于试管中，加入2.0ml 1.0×10^-4mmol/L的DPPH˙溶液，混合均匀，避光静置30min后，以等体积蒸馏水和50%乙醇混合液作为空白调零，于517nm处测定吸光度A₁,同时测定2.0ml样品溶液与2.0ml 50%乙醇混合液的吸光度A2，以及2.0ml 50%乙醇混合液的吸光度A₀。

；

结果如图8所示，PGP-1具备显著的对羟基自由基和DPPH˙自由基的清除能力。

3、对Hela细胞毒性实验

(1)接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化液消化贴壁的单层Hela培养细胞，用含10%胎牛血清和双抗（青霉素100U/ml和100μg/ml链霉素）的DMEM完全培养基中培养液配制成单个细胞悬液，调细胞悬液内细胞的浓度，使细胞悬液浓度为1.0 ×10⁴个/ml，再将细胞悬液接种细胞于96孔培养板中，一次接种2个培养板，每块培养板每孔加入上述细胞悬液180µl。

(2)培养细胞：将接种好的培养板置入饱和湿度、37℃、5% CO₂培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，用移液枪轻轻吸取培养板中的上清液、弃去。

(3)实验分组：对照组（等量PBS）、实验组PGP-1组,将 PGP-1组设6个浓度组：5µg/ml、25µg/ml、50µg/ml、100µg/ml、200µg/ml、500µg/ml。各组分别干预宫颈癌细胞 Hela 细胞 48、72h，以上实验分组中各组设置 3 个平行孔，重复3次。

(4)呈色：分别在培养箱中培养到48h、72h后，往 96 孔板每孔中加入 20µl 5mg·L-1 MTT 溶液，继续置于 37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养 4 小时，然后终止培养，用移液枪小心吸除每孔内上清培养液，再往每孔加DMSO 150µl，然后在摇床上震荡10min，待甲攢充分溶解后用酶联免疫检测仪比色。

(5)比色：在酶联免疫检测仪的 570nm 波长处测定 96孔板上每个孔的光密度值(OD 值)，往空白孔中加入蒸馏水，用于调零。

(6)计算公式：细胞生长抑制率(IR)=(1－加PGP-1组平均OD 值/正常对照组平均OD 值)×100%。

4、对Hela细胞生长抑制实验

（1)接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化液消化贴壁的单层培养细胞，用含 10%新生小牛血清 RPMI-1640 培养液配制成单个细胞悬液，调细胞悬液内细胞的浓度，使细胞悬液浓度为 5.0×10⁴个/ml，再将细胞悬液接种细胞于96孔培养板中，一次接种3个培养板，每块培养板每孔加入上述细胞悬液180µl。

(3)实验分组：对照组（等量PBS）、实验组PGP-1组,将 PGP-1组设3个浓度组：25µg/ml、50µg/ml、100µg/ml。各组分别干预宫颈癌细胞 Hela 细胞 24、48、72h，以上实验分组中各组设置 3 个平行孔，重复3次。

(4)分别在培养箱中培养到24、48h、72h后，取出在室温或者 37℃下，用胰酶消化液消化贴壁细胞，制成细胞悬液。取盖玻片、计数载玻片各一块，先用 PBS 清洗干净，再用75%酒精反复擦拭计数载玻片和盖玻片，然后风干，盖上盖玻片，用 10µl 移液枪吸取细胞悬液 5µl 由盖玻片一侧缓慢的滴入计数载玻片中，使载玻片和盖玻片之间均匀的充满细胞悬液体。

(5)再用10×物镜显微镜下，观察计数载玻片上四角计数格内所含细胞的总数X。计数原则：细胞压中线时，数上不数下，数左不数右，细胞团块合计为一个细胞。将计数所得细胞总数代入公式，得出细胞密度＝X/4×10⁴个/ml（细胞数/毫升原液）。

结果如9和10所示，从图9中得出，当PGP-1浓度大于25μg/ml时，随着时间的增长，Hela细胞的生长受到抑制。当PGP-1浓度500μg/ml时，与对照组相比48h细胞存活率降低了约10%，72h细胞存活率降低了约25%。

从图10中得知，与对照相比，0-3天，随着PGP-1浓度的增加，细胞的增殖受到明显抑制。

5、PGP-1抑制半乳凝集素-3活性：

（1）鸡红细胞的分离纯化：采集新鲜的鸡血，倒入盛有 Alsever 液的烧杯中摇匀，防止凝血。加入5倍体积 0.15 M NaCl 将鸡血洗五次，2500 rpm 离心10 min；弃上清，向沉淀中加入0.02M PBS，将细胞悬起，制成4%的悬液，再用5倍体积0.15 M NaCl将细胞洗4次，2500 rpm 离心 10 min，弃上清；用0.02M PBS 悬起沉淀，用 PBS 洗细胞2次，最后将细胞用PBS悬起，4℃条件保存。

（2）Hela细胞的培养: 将Hela细胞从液氮罐中取出复苏，培养于含10%胎牛血清和双抗（青霉素100U/ml和100μg/ml链霉素）的DMEM完全培养基中，放置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞融合度达到90%左右时进行传代或者保种。

（3）乳腺癌MCF-7细胞的培养：同(2)。

（4）Hela细胞的处理：从CO2培养箱中取出Hela细胞,于超净台下用0.25%胰蛋白酶消化液消化贴壁的单层培养细胞，然后2500 rpm 离心 10 min，弃上清；用0.02M PBS 悬起沉淀，用 PBS 洗细胞2次，最后将细胞用PBS悬起，4℃条件保存。

（5）乳腺癌MCF-7细胞的处理：同（4）

（6）细胞凝集最适的Galectin-3浓度筛选：用 PBS 配制不同浓度的 Galectin-3溶液，同时将制备好的红细胞用 PBS 稀释成 4%悬液。于V型96孔板中分别加入不同浓度（25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml）的 Galectin-3，再向每孔中依次加入 25μl 生理盐水、25μl1% BSA 以及 25μl 4%鸡红细胞，总体积为 100µl。室温静置 30 min，观察红细胞凝集情况。用Hela细胞和乳腺癌细胞系MCF-7时筛选最适Galectin-3浓度的方法与鸡血红细胞相同。

（7）PGP-1对Galectin-3 活性抑制作用：

样品准备：取不同浓度（25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml）的PGP-1为25μl分别与Galectin-3 混合，室温静置10 min。

加样：实验孔依次加入：1%BSA、糖样与 Galectin-3 的混合物，混匀后加入 4%的红细胞。阳性对照孔依次加入：1%BSA、Galactose 与 Galectin-3 混合物，混匀后加入 4%的红细胞。阴性对照孔依次加入：1%BSA 、0.15 M NaCl与 Galectin-3 混合物，混匀后加入4%的红细胞25μl。

观察：室温静置90min 后观察红细胞的凝集程度，用完全抑制红细胞凝集所需糖样的最小浓度表示糖样的抑制活性，即完全抑制红细胞凝集所需糖样浓度越小，表示该糖样的抑制能力强，与Galectin-3的结合能力越强。

Hela细胞与乳腺癌MCF-7细胞的凝集实验步骤与鸡血红细胞的凝集实验相同。

从以上实验获得，PGP-1 对Galectin-3介导的血细胞凝集作用的最小抑制浓度（MIC）为25μg/ml。

对Galectin-3介导Hela细胞的凝集中，当PGP-1浓度为400μg/ml时，Galectin-3介导的细胞凝集消失，PGP-1的最小抑制浓度（MIC）为400μg/ml。

对MCF-7细胞的凝集抑制中得到，当PGP-1糖浓度为200μg/ml时，Galectin-3介导的细胞凝集消失，PGP-1的最小抑制浓度（MIC）为200μg/ml。

Claims

1.一种桃胶多糖降解产物PGP-1，其特征在于，所述PGP-1中不含有中性多糖，所述PGP-1的分子量分布在1×10⁵～1×10⁶范围内，所述PGP-1由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成；所述阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的摩尔比为 0.637:0.054:0.073:0.022:0.556。

2.一种权利要求1所述的桃胶多糖降解产物PGP-1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1. 将菌种活化，得到种子液；

S3. 将S2中所得发酵液进行分离纯化，得到所述PGP-1；

所述S3中包括如下步骤：

S31. 将S2中所得发酵液离心，得到桃胶多糖液，然后过滤，依次将过滤产物经过脱蛋白、醇沉、冷冻干燥后，得到冷冻干燥产物；

S32. 将S31中所得干燥产物采用DEAE-Cellulose 52阴离子交换柱，并经NaCl溶液按照以下浓度进行梯度洗脱：0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L；洗脱液浓缩、透析、除杂、冷冻干燥后即得所述PGP-1。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S2中发酵温度为30℃，初始桃胶浓度8%，培养基pH为4，摇床转速为160rpm，接种量为3%。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S1中菌种活化为将所述菌种在4℃保存斜面菌种，营养琼脂平板划线，37℃倒置培养24h，从平板挑单克隆转接到LB试管培养基，于200rpm转速，37℃下震荡培养12h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S31中脱蛋白采用Sevage法脱蛋白，所述S31中醇沉为采用75%的乙醇；

6.权利要求1所述的桃胶多糖降解产物PGP-1在制备促进肠道益生菌和天然多糖抗氧化剂、抗肿瘤产品中的应用。

7.权利要求1所述的桃胶多糖降解产物PGP-1在制备抑制血红细胞、Hela细胞、乳腺癌MCF-7细胞聚集产品中的应用。

8.一种半乳凝集素-3抑制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的桃胶多糖降解产物PGP-1；

所述PGP-1抑制半乳凝集素-3介导的红细胞聚集的最小抑制浓度为25μg/ml；所述PGP-1抑制半乳凝集素-3介导的Hela细胞聚集的最小抑制浓度为400μg/ml；所述PGP-1抑制半乳凝集素-3介导的MCF-7细胞聚集的最小抑制浓度为200μg/ml。