CN108409884A - 一种具有抗炎活性的辣木叶多糖mlp100-3组分、其纯化工艺及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有抗炎活性的辣木叶多糖MLP100‑3组分。所述辣木叶多糖MLP100‑3的单糖组成比例为，鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖的质量比为1.2‑1.3∶4.5‑5.4∶4.2‑5.5∶3.4‑4.0∶5.6‑6.6∶5.9‑6.5。本发明还提供了辣木叶多糖MLP100‑3的纯化方法。本发明所述辣木叶多糖组分MLP100‑3在小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7体外炎症模型中呈现出较好的抑制NO及炎症因子TNF‑α生成的能力，该发明可应用于调节机体免疫功能以及抗炎药物的开发与利用中。

Description

一种具有抗炎活性的辣木叶多糖MLP100-3组分、其纯化工艺 及其应用
技术领域
本发明属于天然产物化学领域，具体地说，涉及一种由天然辣木提取纯化的辣木叶多糖MLP100-3及其具有抗炎、调节机体免疫功能的用途。
背景技术
辣木又被称作鼓槌树、辣根树，原产于印度北部，是一种多年生热带、亚热带落叶乔木，在全世界范围内共有14个品种，广泛种植在亚洲、非洲热带和亚热带地区。辣木的叶、花、籽、根以及种子都可以直接食用，具有高钙、高蛋白质、高纤维和低脂质的特性。除食用价值较高外，辣木还能够增强人体免疫力，促进身体健康，预防疾病，在印度、非洲等国家或地区用于治疗疾病，被称为保健之宝。临床证明，辣木在治疗糖尿病、骨质疏松、高血压、预防感染、抗病毒、抗炎症、抗肿瘤等方面也发挥着重要作用。
炎症反应是临床上比较常见的一类病理过程，是机体与炎症因子相互抗争时的反应。炎症的本质是机体免疫系统清除外来异物抗原或自身坏死组织细胞的过程，在临床上表现为红、肿、热、痛、功能障碍。当病原入侵机体发生炎症反应时，会诱发机体产生一系列细胞免疫反应，使巨噬细胞活化并分泌一系列细胞因子来对抗病原体。革兰氏阴性菌胞壁成分中的脂多糖(LPS)作为一种内毒素，其生物学效应包括刺激巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞等释放炎性介质，主要的炎性介质包括TNF-α，IL-1β和IL-6等，也包括NO和PGE2等较重要的继发性炎症介质，它们会促进炎症反应的进行，同时持续刺激并活化巨噬细胞，进而激发一系列连锁反应，从而导致机体损伤的加重。
目前，辣木多糖的提取工艺主要有热水浸提法、酸碱提取法。如陈瑞娇提出以1:20料液比，80℃水浴提取3次，每次1.5h，可以使辣木多糖的提取率达到15.86％，此法虽然工艺简单，但提取耗时较长；还有相关研究证明也可以使用热水浸提-稀碱溶液连用法进行辣木多糖的提取，但提取得到的多糖水溶性较差，并且碱法提取条件严格，较难达到预期效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗炎活性的辣木叶多糖MLP100-3。
本发明的再一目的在于提供该辣木叶多糖MLP100-3的纯化工艺。
本发明的还一目的在于提供该辣木叶多糖MLP100-3的应用。
本发明通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种具有抗炎活性的辣木叶多糖MLP100-3组分，所述辣木叶多糖MLP100-3的单糖组成比例为鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖的质量比为1.2-1.3∶4.5-5.4∶4.2-5.5∶3.4-4.0∶5.6-6.6∶5.9-6.5。
其中优选为，MLP100-3多糖组分的单糖组成比例为，鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖的质量比为1.3∶5.0∶4.2∶4.0∶6.3∶6.5。
制备所述具有抗炎活性的辣木叶多糖MLP100-3组分的方法，其包括以下步骤：
1)称取干燥辣木叶，按1:20-1:30的料液比加入水于80-100℃下浸提90-120min，浓缩后，无水乙醇沉淀过夜。沉淀复溶后利用Sevag法(氯仿：正丁醇＝4:1)脱蛋白，重复3-5次，直至无白色絮状沉淀析出，得到辣木叶粗多糖组分。
2)阴离子交换柱层析分离纯化
将第1)步骤中得到的辣木叶粗多糖提取液经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析(柱填料为弱阴离子二乙基氨基乙基，离子容量为0.11-0.16mmol(Cl-)/mL，XK50/30层析柱，柱床高5cm)分离，分别用蒸馏水、0.1MNaCl溶液、0.2MNaCl溶液、0.4M的NaCl溶液洗脱，收集洗脱组分。
3)经收集得到的洗脱液组分经3500KDa的透析袋透析脱盐，真空冷冻干燥(-80至-85℃，15-35mTorr，24-48h)，得到辣木叶多糖MLP100-3粉末。
与传统工艺相比，该辣木叶多糖采用的热水浸提法优势在于以热水作为提取溶剂，多糖在热水中能够稳定存在、溶解性较好，对多糖的破坏性小；并且该发明能用较小的料液比及较短的提取时间达到较好的提取效果。
经GC-MS单糖组成定量分析可知MLP100-3的单糖组成比例为，鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖的质量比为1.2-1.3∶4.5-5.4∶4.2-5.5∶3.4-4.0∶5.6-6.6∶5.9-6.5。
本发明所述的辣木叶多糖MLP100-3组分在制备抗炎、调节机体免疫功能药物中的应用。
本发明分离纯化得到的辣木叶多糖MLP100-3能够明显抑制炎症细胞小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7中NO以及细胞炎症因子TNF-α的生成，具有良好的抗炎活性。
附图说明
图1为本发明所述辣木叶多糖100％醇沉组分的DEAE-Sepharose Fast Flow洗脱曲线；
图2为本发明所述辣木叶多糖MLP100-3对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7的毒性实验结果；
图3为本发明所述辣木叶多糖MLP100-3对炎症细胞RAW264.7NO产生的抑制作用；
图4为基于气相-质谱(GC-MS)对辣木叶多糖MLP100-3组分的单糖组成分析结果图。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明做进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护之中。
实施例1辣木叶多糖MLP100-3的制备
本实施例的辣木叶多糖MLP100-3的提取纯化过程：
1)称取100g粉碎烘干的辣木叶，按照1:20的料液比加入2000mL水于80℃下浸提120min，经浓缩后加入3倍体积的无水乙醇沉淀过夜，离心，复溶。采用Sevag法(氯仿：正丁醇＝4:1)脱蛋白，得到辣木叶粗多糖组分，重复4次，至无白色絮状沉淀析出。
2)阴离子交换柱层析分离纯化
将步骤1)中得到的辣木叶粗多糖提取液经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析分离，分别用蒸馏水、0.1M NaCl溶液、0.2M NaCl溶液、0.4M的NaCl溶液洗脱。收集洗脱组分。
3)将收集得到的洗脱液组分经MW为3500KDa的透析袋透析脱盐，真空低温冷冻干燥，得到0.4M NaCl溶液洗脱多糖组分MLP100-3粉末。
得到的洗脱曲线如下图1所示。
对比于原始的三氟乙酸法脱蛋白，本发明采用的Sevag法脱蛋白效率高，操作简单。采用3500KDa的透析袋，去除样品内小分子杂质，进一步纯化多糖组分。此外，本发明采用真空低温冷冻干燥，耗时短，有效地降低了样品损耗率。
实施例2辣木叶多糖MLP100-3对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7的毒性实验
将细胞数量为6×104/孔的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7接种于96孔板中，100μL/孔。分别设置空白组、刺激组、不同浓度样品组(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)，于二氧化碳培养箱中(37℃，5％CO2)培养24h后，向每孔中加入10μL 5mg/mL的MTT，阴暗处孵育4h，再加入100μL的DMSO，于振荡器上震荡10min，570nm下测定吸光度。结果如下图2所示。
如图2所示，辣木叶多糖组分MLP100-3在25-100μg/mL浓度范围内均对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7无毒性作用，当MLP100-3浓度达到200μg/mL时对细胞产生了毒副作用。
实施例3辣木叶多糖MLP100-3对炎症细胞RAW264.7NO产生的抑制作用
将细胞数量为6×104/孔的小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7接种于96孔板中,100μL/孔。分别设置空白组、刺激组、不同浓度样品组(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)，于二氧化碳培养箱中(37℃，5％CO2)培养2h后，加入终浓度为1μg/mL的脂多糖(LPS)，继续培养24h。使用NO试剂盒测定培养液上清中的NO含量，50μL培养液+50μL Griess Reagent I+50μL Griess Reagent II，立即于540nm下测定吸光度。以不同浓度亚硝酸钠为标准曲线计算出各组产生的NO浓度。结果如下图3所示。
如图3所示，1μg/mL的LPS能够明显提高小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7中NO的产生。25-200μg/mL的MLP100-3均具有能够降低RAW264.7产生NO的能力，其中，50μg/mL和200μg/mL的MLP100-3能够显著降低NO的产生，抑制率分别达到了64.40％和69.65％。说明该方法制备的辣木叶多糖组分具有较好的抗炎能力。
实施例4辣木叶多糖MLP100-3的傅里叶红外光谱分析
对辣木叶多糖MLP100-3进行傅里叶红外光谱分析(德国BRUKER，型号VERTEX7.0)。该多糖在3407.81cm-1处具有O-H伸缩振动峰；2937.10cm-1处为-CH伸缩振动峰；2144.53cm-1具有累积双键伸缩振动峰；1648.99cm-1处为C＝O伸缩振动峰；1405.33cm-1处具有C-H伸缩振动峰；1240.38cm-1和1045.06cm-1处为吡喃环结构伸缩振动峰。
实施例5辣木叶多糖MLP100-3的单糖组成分析
称取5mg辣木叶多糖MLP100-3，溶解于3mL的2M三氟乙酸中，封口，于100℃下水解4h，70℃下挥干三氟乙酸，向水解的样品中加入5mg盐酸羟胺和0.25mL的吡啶，90℃水浴振荡30min，样品冷却至室温，然后加入0.25mL乙酸酐，90℃水浴振荡30min，冷却至室温。将反应产物于70℃水浴中用氮吹仪吹干后复溶于800μL的氯仿中，取1μL进行GC-MS分析。
采用外标法定量分析单糖组分，7种单糖标准品分别为木糖、鼠李糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、葡萄糖以及半乳糖。将混合单糖标准品配成浓度为25，50，100，200，400μg/mL的储备液，同样条件下进行乙酰化处理。将标准糖样品与MLP100-3多糖样品用于GC-MS分析。以质量浓度c(μg/mL)为横坐标，衍生物的峰面积为纵坐标做出单糖线性回归方程，由此计算出MLP100-3中所含各单糖的含量。结果如图4所示。
由GC-MS结果可知，MLP100-3多糖组分的单糖组成种类及比例为鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1.3∶5.0∶4.2∶4.0∶6.3∶6.5。各单糖所占比例为鼠李糖4.76％，阿拉伯糖18.31％，木糖15.38％，甘露糖14.65％，葡萄糖23.07％，半乳糖23.80％。
实施例6辣木叶多糖MLP100-3的制备及单糖组成分析
1)称取100g粉碎烘干的辣木叶，按照1:25的料液比加入2500mL水于100℃下浸提100min，浓缩处理后加入4倍体积的无水乙醇，沉淀过夜并于6500rpm下离心，收集沉淀。充分复溶，Sevag法(氯仿：正丁醇＝4:1)脱蛋白，重复操作4次，直至将蛋白质去除干净。
2)阴离子交换柱层析分离纯化
将得到的辣木叶粗多糖提取液稀释成5mg/mL，取2mL上样于DEAE-Sepharose FastFlow离子交换柱中，洗脱液分别采用蒸馏水、0.1M NaCl溶液、0.2M NaCl溶液和0.4M的NaCl溶液洗脱。收集各部分洗脱组分。
3)将收集得到的洗脱液组分经MW为3500KDa的透析袋透析脱盐，真空低温冷冻干燥，收集辣木多糖组分MLP100-3粉末。
4)称取5mg干燥后的MLP100-3，用2M的三氟乙酸充分水解，70℃下挥干，加入5mg盐酸羟胺和0.25mL的吡啶，90℃水浴振荡30min，样品冷却至室温，然后加入0.25mL乙酸酐，90℃水浴振荡30min，冷却至室温。用氮吹仪将反应产物吹干，然后复溶于800μL的氯仿中，取1μL进行GC-MS分析。
由GC-MS结果可知，MLP100-3组分中主要的单糖种类以及比例为鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1.3∶4.8∶4.5∶3.8∶6.6∶6.2。各单糖所占比例为鼠李糖4.77％，阿拉伯糖17.64％，木糖16.54％，甘露糖13.97％，葡萄糖24.26％，半乳糖22.79％。
实施例7辣木叶多糖MLP100-3的制备及单糖组成分析
1)称取100g粉碎烘干的辣木叶，按照1:30的料液比加入3000mL水于90℃下浸提120min，向浓缩后使用3倍体积无水乙醇沉淀过夜，离心并收集沉淀。使用Sevag法(氯仿：正丁醇＝4:1)去除多糖溶液中的蛋白质，重复操作4次至无明显絮状沉淀析出。
2)阴离子交换柱层析分离纯化
将得到的辣木叶粗多糖充分复溶，测定多糖浓度为5mg/mL，取3mL上样于DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱中，分别采用蒸馏水、0.1M NaCl溶液、0.2M NaCl溶液和0.4M的NaCl的溶液进行逐步洗脱。将各组分洗脱液收集于EP管内，每管10mL。
5)使用MW为3500KDa的透析袋对0.4MNaCl辣木多糖的洗脱组分进行脱盐处理，然后经真空低温冷冻干燥处理，将辣木多糖组分MLP100-3组分收集起来。
6)准确称取6mg的MLP100-3，用2M的三氟乙酸充分水解，70℃下挥干多余的三氟乙酸，随后加入6mg盐酸羟胺和0.30mL的吡啶，置于90℃的热水浴中充分振荡45min，待样品冷至室温后加入0.30mL的乙酸酐，再次置于90℃水浴条件下振荡45min。用氮吹仪于70℃下将反应产物吹干，用800μL的氯仿将其充分复溶，取出1μL进行GC-MS单糖组成的检测。
由GC-MS检测结果可知，MLP100-3组分中主要的单糖种类以及比例为鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖＝1.2∶4.5∶4.4∶3.4∶6.3∶6.5。各单糖所占比例为鼠李糖4.56％，阿拉伯糖17.11％，木糖16.73％，甘露糖12.92％，葡萄糖23.95％，半乳糖24.71％。
经测定，实施例6、7制备的辣木叶多糖MLP100-3组分也具有明显抑制炎症细胞小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7中NO以及细胞炎症因子TNF-α的生成，具有良好的抗炎活性，可用于制备抗炎、调节机体免疫功能药物。
虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。

Claims (5)

1.一种具有抗炎活性的辣木叶多糖MLP100-3组分，其特征在于，所述辣木叶多糖MLP100-3的单糖组成比例为，鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖的质量比为1.2-1.3∶4.5-5.4∶4.2-5.5∶3.4-4.0∶5.6-6.6∶5.9-6.5。
2.根据权利要求1所述的辣木叶多糖MLP100-3组分，其特征在于，其辣木叶多糖MLP100-3组分采用如下方法制备：
1)称取干燥辣木叶，按1:20-1:30的料液比加入水于80-100℃下浸提90-120min，浓缩后，无水乙醇沉淀过夜。沉淀复溶后利用Sevag法脱蛋白，重复3-5次，直至无白色絮状沉淀析出，得到辣木叶粗多糖组分；
2)阴离子交换柱层析分离纯化
将步骤1)中得到的辣木叶粗多糖提取液经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析分离，用0.4M的NaCl溶液洗脱，收集洗脱组分；
3)经收集得到的洗脱液组分经3500KDa的透析袋透析脱盐，真空冷冻干燥，得到辣木叶多糖MLP100-3粉末。
3.制备权利要求1所述具有抗炎活性的辣木叶多糖MLP100-3组分的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
1)称取干燥辣木叶，按1:20-1:30的料液比加入水于80-100℃下浸提90-120min，浓缩后，无水乙醇沉淀过夜。沉淀复溶后利用Sevag法脱蛋白，重复3-5次，直至无白色絮状沉淀析出，得到辣木叶粗多糖组分。
2)阴离子交换柱层析分离纯化
将第1)步骤中得到的辣木叶粗多糖提取液经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析分离，用0.4M的NaCl溶液洗脱，收集洗脱组分。
3)将收集得到的洗脱液组分经3500KDa的透析袋透析脱盐，真空冷冻干燥，得到辣木叶多糖MLP100-3粉末。
4.根据权利要求3所述的辣木叶多糖MLP100-3的制备方法，其特征在于，所述辣木叶多糖MLP100-3的单糖组成比例为，鼠李糖∶阿拉伯糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖的质量比为1.2-1.3∶4.5-5.4∶4.2-5.5∶3.4-4.0∶5.6-6.6∶5.9-6.5。
5.权利要求1所述的辣木叶多糖MLP100-3组分在制备抗炎、调节机体免疫功能药物中的应用。
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