CN105123518A

CN105123518A - 一种利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法

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Publication number: CN105123518A
Application number: CN201510543062.1A
Authority: CN
Inventors: 蒋盛军; 张德旺
Original assignee: Hainan Mu La Da Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Hainan Mu La Da Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2035-08-31
Also published as: CN105123518B

Abstract

本发明涉及天然产物生物化学技术领域，具体公开一种利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法。该方法采用辣木非胚性细胞生产辣木多糖，获得的非胚性细胞，类型单一，细胞充分分散，增值效率极高，生长周期一致，产量易于调控；对辣木外植体进行诱导增殖培养获得悬浮细胞后，进一步的模拟辣木高温、高光照的自然生长环境，并优选液体复合高糖增殖培养基，选择高浓度的红糖代替蔗糖，培养过程中刺激辣木细胞合成辣木多糖，提高多糖产量。本发明方法可工厂化生产辣木多糖，不占用耕地、产量稳定、有效成分含量高、不破坏自然资源，和种植辣木相比(生产周期3～5年)，本发明方法生产周期缩短至7～10天，生产规模便于控制，投资风险小。

Description

一种利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法

技术领域

本发明涉及天然产物生物化学技术领域，具体涉及一种利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法。

背景技术

辣木，白花菜目辣木科，原产于印度，又称为鼓槌树，是多年生热带落叶乔木，全世界约有14个品种，目前较常食用的品种有以下三种：印度传统辣木、印度改良种辣木(印度T.N.农业大学的改良种，早生且具高豆荚产量)和非洲辣木(原只产于肯尼亚图尔卡纳湖附近及埃塞俄比亚西南部)。辣木的叶片和果荚含有多种矿物质、维生素、20种氨基酸、46种抗氧素、36种自然防炎体和矿物质。研究表明，100克印度传统辣木的新鲜叶片中的维他命E含量约为9毫克，干燥叶片中维他命E含量约为16.2毫克。每100克的辣木中含有的维生素C是柑橘的7倍，铁是菠菜的3倍，维生素A是胡萝卜的4倍，钙质是牛奶的4倍，钾是香蕉的3倍，蛋白质是酸奶的2倍。根据计算，只要三汤匙(约25克)的辣木叶干粉就含有幼儿每日所需270％的维生素A，42％的蛋白质，125％的钙，70％的铁及22％的维生素C。对怀孕和哺乳中的女性而言，辣木叶片和豆荚亦可帮助本人及胎儿或婴儿维持健康，提供大量的铁质、蛋白质、铜、硫和维他命B。

辣木多糖是辣木的主要有效成分之一，具有广泛的生物活性，和众多重要中草药多糖一样，辣木多糖被发现具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤的功效，是一种高效的、多功能的天然抗氧化剂和自由基清除剂，因此，近年来辣木多糖成为人们的研究重点，尤其对于辣木多糖的提取工艺方法的研究逐渐涌现。然而，目前大多的辣木多糖均是采用化学溶媒浸泡的方式，从辣木叶、茎和根中提取，如陈瑞娇发表的一篇题为“辣木叶多糖的提取及分离纯化”的论文，及中国专利CN104829743A公开了一种辣木叶多糖的制备方法及其用途，均采用溶媒浸泡、加热、浓缩提取的方式制备获得辣木多糖。然而一方面由于辣木刚从国外引进，采用人工种植的方法，植物生长周期较长，需要长时间占用大量耕地，并且产量和品质受到自然条件和人工栽培技术的影响，辣木多糖的产量和品质难以保证；另一方面，这种方式提取辣木多糖的产率低，也不容易从辣木种子中提取多糖。因此亟需研究开发出新的制备辣木多糖的工艺方法。

植物细胞悬浮培养是指植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中，于摇床上进行悬浮培养。这些细胞或小的聚集体来自愈伤组织，某个器官或组织，甚至幼嫩的植株。植物细胞悬浮培养具有分散性好、细胞形状及细胞团大小大致相同，而且生长迅速、重复性好、易于控制等有利因素，被广泛用于生理学、细胞学、生物化学、发育生物学及遗传学、分子生物学的研究。利用植物悬浮细胞培养生产职务功能性次生代谢产物已在1000多种植物上有过相关研究，可以有效的生产各种天然化合物，如生物碱、蛋白质、糖类、药物、香料天然色素以及其他活性产物。并且已有众多成功的例子，例如紫杉醇、紫草宁、迷迭香酸和人参皂甙已经实现利用植物细胞悬浮培养的方式实现工业化生产。然而目前还未见基于植物细胞悬浮培养的方式制备获得辣木多糖。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，该方法具有生产周期短、不占用耕地、产量稳定、有效成分含量高、不破坏自然资源的特点。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，包括以下操作步骤：

(1)取辣木外植体，在愈伤诱导培养基上进行培养，获得非胚性愈伤组织；

(2)将步骤(1)中获得的非胚性愈伤组织在愈伤增殖培养基上进行增殖培养，获得生长迅速疏松的细胞团；

(3)将步骤(2)获得的细胞团接种至细胞悬浮启动培养基中培养，获得液体培养的非胚性悬浮细胞系；

(4)将步骤(3)获得的非胚性悬浮细胞系离心沉淀后，取沉淀接种至液体增殖培养基中，获得生长周期稳定、生长迅速的非胚性悬浮细胞系；

(5)将步骤(4)获得的非胚性悬浮细胞系在液体复合高糖增殖培养基中悬浮培养3-7天，离心沉淀，获得适合于提取辣木多糖的非胚性悬浮细胞；

(6)取步骤(5)获得的非胚性悬浮细胞，水提取1～3次，合并提取液，在提取液中加入无水乙醇至溶液中乙醇的体积百分含量为60～75％，取上清液，旋蒸至恒重，获得辣木粗多糖；

其中步骤(5)中所述的液体复合高糖增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖35～55g/L+2，4-D0.5～2mg/L，pH5.5～6.0，培养温度为30～35℃，光照强度4000～6000Lux，每日光照时长为8～12小时，120～150rpm回旋式震荡培养，培养时间为3～7天。

本发明步骤(5)中模拟天然辣木的干旱、高温、强光照的生长条件，采用高温、强光照的培养方式，并采用红糖含量高的液体培养基，对适合于提取辣木多糖的非胚性悬浮细胞进行增殖培养，这种高温、强光照及富糖培养的方式，刺激非胚性悬浮细胞合成高浓度的辣木多糖，提高辣木多糖的产量。

优选的，步骤(1)中所述的愈伤诱导培养基的配方为：MS培养基+红糖20～40g/L+2，4-D1～3mg/L+NAA0.1～1mg/L+质量分数0.8～1.2％琼脂，pH为5.5～6.0，培养温度为24～28℃，光照强度2000～4000Lux，每日光照时长为8～12小时，培养时间为25～35天。

辣木外植体接种至愈伤诱导培养基中按照上述的培养基配方和培养条件进行培养过程中，可以保持外植体的活力并且迅速分化获得松散的细胞团，当细胞团直径达到0.5～1cm后，转接至愈伤增殖培养基。

优选的，步骤(2)中所述的愈伤增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖20～40g/L+2，4-D3～4mg/L+质量分数0.8％琼脂，pH为5.5～6.0，培养温度为25～28℃，培养方式为暗培养，培养周期为28～35天，非胚性愈伤组织接种大小为0.125～0.25cm³/cm³愈伤增殖培养基。

上述愈伤增殖培养基的配方和培养条件可以满足辣木细胞伸长生长和分裂的双重要求，细胞分裂和细胞膨大伸长具有明显的周期，且细胞类型一致，具有非胚性细胞的特征。

优选的，步骤(3)中所述的细胞悬浮启动培养基的配方为：MS培养基+红糖18～22g/L+2，4-D0.25～1mg/L，pH为5.5～6.0；培养温度为24～27℃，培养方式为暗培养，120～150rpm回旋式震荡培养，培养周期为10天，接种量为细胞悬浮启动培养基体积的1/10～1/20。经过细胞悬浮启动培养基培养后，细胞分散充分，形成单细胞悬系。

步骤(4)中所述的液体增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖25～35g/L+2，4-D0.5～2mg/L，pH5.5～6.0，培养温度为24～27℃，暗培养，120～150rpm回旋式震荡培养，培养7～10天获得稳定的非胚性悬浮细胞系，稳定后的非胚性悬浮细胞系生长周期为10天，继代周期为7～10天，继代时接种量为液体增殖培养基体积的1/6～1/10。经过液体维持培养基进行液体培养后，可迅速获得细胞类型一致、生长迅速、增殖系数高的细胞，为辣木多糖的合成提供充足的原料。

步骤(6)中水提取的温度为95～100℃，提取时间为40～80min。

步骤(6)中旋蒸温度为48～55℃。

步骤(1)中所述的辣木外植体为未成熟的辣木种子。未成熟的辣木种子外面包有豆荚，里面的未成熟种子是无菌的，先消毒豆荚，从豆荚中取出未成熟的辣木种子，可以不用消毒，直接接种到愈伤诱导培养基上。

上述消毒豆荚，从豆荚中取出未成熟的辣木种子的具体方式为：用质量浓度为0.1％氯化汞消毒10分钟，用无菌水漂洗后，用无菌刀破开豆荚，用无菌镊子取出无菌种子，同时进一步剥离种子的种衣。

本发明利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，利用植物细胞悬浮培养的原理采用辣木非胚性细胞生产辣木多糖，具有如下优点：

(1)本发明方法获得的非胚性细胞，细胞类型单一，保持了外植体(种子)生长快速的特征；并且细胞充分分散，增值效率极高；生长周期一致，产量易于调控

(2)本发明方法在对辣木外植体进行诱导增殖培养获得生长周期稳定、生长迅速的悬浮细胞后，进一步的模拟辣木高温、高光照的自然生长环境，在高温、高光照条件下进一步刺激促进辣木细胞合成更多的辣木多糖。同时，优选液体复合高糖增殖培养基，选择红糖代替蔗糖，因为红糖是一种复合多糖，有利于促进辣木细胞合成辣木多糖，而且高浓度的红糖进一步刺激辣木细胞合成辣木多糖。

(3)本发明方法可工厂化生产辣木多糖，摆脱了对自然条件的依赖；不占用耕地、产量稳定、有效成分含量高、不破坏自然资源的特点，和种植辣木相比(生产周期3～5年)，本发明方法生产周期缩短至7～10天，生产规模便于控制，投资风险小，具有极大的开发利用价值。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

(1)取辣木未成熟种子作为外植体，将辣木未成熟的豆荚切段，用0.1％氯化汞消毒10分钟，用无菌水漂洗后，用无菌刀破开豆荚，用无菌镊子取出无菌种子，同时进一步剥离种子的种衣，制得辣木外植体；

(2)将步骤(1)制备的辣木外植体接种至愈伤诱导培养基，每瓶培养基接种2粒辣木外植体，在温度27℃，光照强度3000Lux，每日光照时长为12小时条件下，培养30天后获得非胚性愈伤组织，非胚性愈伤组织的直径平均为0.5cm；其中愈伤诱导培养基的配方为：MS培养基+红糖30g/L+2，4-D3mg/L+NAA0.5mg/L+0.8％g/L琼脂，pH5.8；

(3)将步骤(2)培养获得的直径约为0.5cm的非胚性愈伤组织转移至愈伤增殖培养基，接种量为0.2cm³/cm³愈伤增殖培养基，27℃条件下暗培养30天，制得生长迅速的疏松细胞团，直径大约为1～1.5cm；其中愈伤增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖30g/L+2，4-D4mg/L+0.8％g/L琼脂，pH5.8；

(4)将步骤(3)制备的生长迅速的疏松细胞团5cm³，转移至含有50mL细胞悬浮启动培养基的100mL三角瓶中，27℃、150rpm回旋式震荡暗培养10天，获得液体培养的非胚性悬浮细胞系；其中细胞悬浮启动培养基的配方为：MS培养基+红糖20g/L+2，4-D1mg/L，pH5.8；用该方法获得的细胞系生长迅速，每10天继代一次，增殖系数为6；

(5)将步骤(4)制备的非胚性悬浮细胞系转移至50mL离心管中，1000g离心5分钟，弃上清，取沉淀的细胞5mL，接种至含有30mL液体增殖培养基的100mL三角瓶中，27℃、150rpm回旋式震荡暗培养7天，制得生长周期稳定、生长迅速的悬浮细胞；其中液体增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖35g/L+2，4-D0.5mg/L，pH5.8；用该方法获得的悬浮细胞生长周期为10天，继代周期为7～10天；

(6)将步骤(5)制得的悬浮细胞接种至液体复合高糖增殖培养基中，在32℃，光照强度5000Lux，每日光照时长为10小时，130rpm回旋式震荡培养，培养时间为5天，制得适合于提取辣木多糖的非胚性悬浮细胞；其中液体复合高糖增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖40g/L+2，4-D1mg/L，pH5.5；

(7)取步骤(6)制得的悬浮细胞1L加入蒸馏水，加蒸馏水的量为500ml，100℃加热提取1h，过滤保存提取液；在滤渣中加入蒸馏水，重复以上步骤2次，合并提取液；在合并后的提取液用纱布过滤杂质后，加入无水乙醇至提取液中乙醇的体积百分含量为70％，静置沉淀12小时，取上清，50℃旋转蒸发至恒重，获得辣木多糖6.5g。

效果对比试验：调整步骤(6)液体复合高糖增殖培养基的配方为MS培养基+红糖20g/L+2，4-D1mg/L，pH5.5，其他操作步骤和参数条件不变，获得的辣木多糖3.2g，与前面的高糖培养基处理相比，辣木多糖含量显著降低，这表明增加培养基中红糖的含量促进辣木多糖的合成。

按照本实施例步骤(7)同样的提取方法，从100g辣木叶中可获得辣木多糖5.9g。该结果表明本实施例生产的悬浮细胞，每0.90L悬浮细胞含有的辣木多糖相当于辣木叶粉100g含有的多糖，表明利用辣木悬浮培养细胞制备辣木多糖产量高。

实施例2

(2)将步骤(1)制备的辣木外植体接种至愈伤诱导培养基，每瓶培养基接种1粒辣木外植体，在温度24℃，光照强度4000Lux，每日光照时长为8小时条件下，培养25天后获得非胚性愈伤组织，非胚性愈伤组织的直径平均为0.6cm；其中愈伤诱导培养基的配方为：MS培养基+红糖20g/L+2，4-D2mg/L+NAA0.1mg/L+1％g/L琼脂，pH5.5；

(3)将步骤(2)培养获得的直径约为0.6cm的非胚性愈伤组织转移至愈伤增殖培养基，接种量为0.125cm³/cm³愈伤增殖培养基，25℃条件下暗培养35天，制得生长迅速的疏松细胞团，直径大约为1～1.5cm；其中愈伤增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖40g/L+2，4-D3mg/L+0.8％g/L琼脂，pH5.5；

(4)将步骤(3)制备的生长迅速的疏松细胞团5cm³，转移至含有100mL细胞悬浮启动培养基的200mL三角瓶中，24℃、120rpm回旋式震荡暗培养10天，获得液体培养的非胚性悬浮细胞系；其中细胞悬浮启动培养基的配方为：MS培养基+红糖22g/L+2，4-D0.25mg/L，pH5.8；用该方法获得的细胞系生长迅速，每10天继代一次，增殖系数为6；

(5)将步骤(4)制备的非胚性悬浮细胞系转移至50mL离心管中，1000g离心5分钟，弃上清，取沉淀的细胞5mL，接种至含有50mL液体增殖培养基的100mL三角瓶中，24℃、120rpm回旋式震荡暗培养10天，制得生长周期稳定、生长迅速的悬浮细胞；其中液体增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖25g/L+2，4-D2mg/L，pH5.5；用该方法获得的悬浮细胞生长周期为10天，继代周期为7～10天；

(6)将步骤(5)制得的悬浮细胞接种至液体复合高糖增殖培养基中，在30℃，光照强度6000Lux，每日光照时长为8小时，120rpm回旋式震荡培养，培养时间为3天，制得适合于提取辣木多糖的非胚性悬浮细胞；其中液体复合高糖增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖35g/L+2，4-D2mg/L，pH6.0；

(7)取步骤(6)制得的悬浮细胞1L加入蒸馏水，加蒸馏水的量为500ml，96℃加热提取40min，过滤保存提取液；在滤渣中加入蒸馏水，重复以上步骤2次，合并提取液；在合并后的提取液用纱布过滤杂质后，加入无水乙醇至提取液中乙醇的体积百分含量为60％，静置沉淀12小时，取上清，48℃旋转蒸发至恒重，获得辣木多糖7.7g。

效果对比试验：调整步骤(6)中的光照强度为3000Lux，其他操作步骤和参数条件不变，制得辣木多糖6.3g，，该处理与强关照处理相比，辣木多糖含量显著降低，这表明强光照处理促进辣木多糖的合成。

按照本实施例步骤(7)同样的提取方法，从100g辣木叶中可获得辣木多糖5.9g。该结果表明本实施例生产的悬浮细胞，每0.77L悬浮细胞含有的辣木多糖相当于辣木叶粉100g含有的多糖，表明利用辣木悬浮培养细胞制备辣木多糖产量高。

实施例3

(2)将步骤(1)制备的辣木外植体接种至愈伤诱导培养基，每瓶培养基接种1～2粒辣木外植体，在温度28℃，光照强度2000Lux，每日光照时长为10小时条件下，培养35天后获得非胚性愈伤组织，非胚性愈伤组织的直径平均为1cm；其中愈伤诱导培养基的配方为：MS培养基+红糖40g/L+2，4-D1mg/L+NAA1mg/L+1.2％g/L琼脂，pH5.8；

(3)将步骤(2)培养获得的直径约为1cm的非胚性愈伤组织转移至愈伤增殖培养基，接种量为0.25cm³/cm³愈伤增殖培养基，28℃条件下暗培养28天，制得生长迅速的疏松细胞团，直径大约为2～3cm；其中愈伤增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖20g/L+2，4-D3mg/L+0.8％g/L琼脂，pH5.8；

(4)将步骤(3)制备的生长迅速的疏松细胞团5cm³，转移至含有75mL细胞悬浮启动培养基的150mL三角瓶中，25℃、130rpm回旋式震荡暗培养7天，获得液体培养的非胚性悬浮细胞系；其中细胞悬浮培养启动培养基的配方为：MS培养基+红糖18g/L+2，4-D0.75mg/L，pH5.8；用该方法获得的细胞系生长迅速，每10天继代一次，增殖系数为6；

(5)将步骤(4)制备的非胚性悬浮细胞系转移至50mL离心管中，1000g离心5分钟，弃上清，取沉淀的细胞5mL，接种至含有40mL液体增殖培养基的100mL三角瓶中，25℃、130rpm回旋式震荡暗培养8天，制得生长周期稳定、生长迅速的悬浮细胞；其中液体增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖30g/L+2，4-D1mg/L，pH6.0；用该方法获得的悬浮细胞生长周期为10天，继代周期为7～10天；

(6)将步骤(5)制得的悬浮细胞接种至液体复合高糖增殖培养基中，在35℃，光照强度4000Lux，每日光照时长为12小时，150rpm回旋式震荡培养，培养时间为7天，制得适合于提取辣木多糖的非胚性悬浮细胞；其中液体复合高糖增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖55g/L+2，4-D0.5mg/L，pH5.58；

(7)取步骤(6)制得的悬浮细胞1L加入蒸馏水，加蒸馏水的量为500ml，95℃加热提取80min，过滤保存提取液；在滤渣中加入蒸馏水，重复以上步骤2次，合并提取液；在合并后的提取液用纱布过滤杂质后，加入无水乙醇至提取液中乙醇的体积百分含量为75％，静置沉淀12小时，取上清，55℃旋转蒸发至恒重，获得辣木多糖8.9g。

效果对比试验：调整步骤(6)中的培养温度为25℃，其他操作步骤和参数条件不变，制得辣木多糖7.2g，与高温处理相比，低温处理的辣木多糖含量显著降低，这表明高温处理能够促进辣木多糖的合成。

按照本实施例步骤(7)同样的提取方法，从100g辣木叶中可获得辣木多糖5.9g。该结果表明本实施例生产的悬浮细胞，每0.66L悬浮细胞含有的辣木多糖相当于辣木叶粉100g含有的多糖，表明利用辣木悬浮培养细胞制备辣木多糖产量高。

实施例4

效果对比试验：调整步骤(2)～(6)中的红糖为蔗糖，其他操作步骤和参数条件不变，制得辣木多糖7.3g，与红糖处理相比，蔗糖处理的辣木多糖含量显著降低，这表明红糖处理能够促进辣木多糖的合成。

Claims

1.一种利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

(5)将步骤(4)获得的非胚性悬浮细胞系在液体复合高糖增殖培养基中悬浮培养3～7天，离心沉淀，获得适合于提取辣木多糖的非胚性悬浮细胞；

2.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的愈伤诱导培养基的配方为：MS培养基+红糖20～40g/L+2，4-D1～3mg/L+NAA0.1～1mg/L+质量分数0.8～1.2％琼脂，pH为5.5～6.0，培养温度为24～28℃，光照强度2000～4000Lux，每日光照时长为8～12小时，培养时间为25～35天。

3.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的愈伤增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖20～40g/L+2，4-D3～4mg/L+质量分数0.8％琼脂，pH为5.5～6.0，培养温度为25～28℃，培养方式为暗培养，培养周期为28～35天，非胚性愈伤组织接种大小为0.125～0.25cm³。

4.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的细胞悬浮启动培养基的配方为：MS培养基+红糖18～22g/L+2，4-D0.25～1mg/L，pH为5.5～6.0；培养温度为24～27℃，培养方式为暗培养，120～150rpm回旋式震荡培养，培养周期为10天，接种量为细胞悬浮启动培养基体积的1/10～1/20。

5.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的液体增殖培养基的配方为：MS培养基+红糖25～35g/L+2，4-D0.5～2mg/L，pH5.5～6.0，培养温度为24～27℃，暗培养，120～150rpm回旋式震荡培养，培养7～10天获得稳定的非胚性悬浮细胞系，稳定后的非胚性悬浮细胞系生长周期为10天，继代周期为7～10天，继代时接种量为液体增殖培养基体积的1/6～1/10。

6.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤(6)中水提取的温度为95～100℃，提取时间为40～80min。

7.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤(6)中旋蒸温度为48～55℃。

8.根据权利要求1所述的利用辣木非胚性细胞悬浮培养生产辣木多糖的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的辣木外植体为未成熟的辣木种子。