CN103387621A

CN103387621A - 利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法

Info

Publication number: CN103387621A
Application number: CN2013103711034A
Authority: CN
Inventors: 乔飞; 徐立; 王荣香; 江雪飞; 李志英; 赵小青; 丛汉卿; 王茂媛; 李丽; 黄碧兰; 李克烈
Original assignee: Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Current assignee: Tropical Crops Genetic Resources Institute CATAS
Priority date: 2013-08-23
Filing date: 2013-08-23
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2033-08-23
Also published as: CN103387621B

Abstract

本发明公开了一种利用美丽鸡血藤非胚性单细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，含以下步骤：取美丽鸡血藤外植体，在愈伤诱导培养基上进行培养，获得非胚性愈伤组织；将非胚性愈伤组织在愈伤增殖培养基上进行增殖培养，获得生长迅速疏松的细胞团；将细胞团接种至细胞悬浮启动培养基中培养，获得液体培养的单细胞悬浮系；将单细胞悬浮系离心沉淀后，取沉淀接种至液体增殖培养基中，获得悬浮细胞；将悬浮细胞，水提取后，在提取液中加水无水乙醇至溶液中乙醇的体积百分含量为60～75%，取上清液，旋蒸后，获得牛大力粗多糖。该方法具有生产周期短、不占用耕地、产量稳定、有效成分含量高、不破坏自然资源的特点，具有极大的开发利用价值。

Description

利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法

技术领域

本发明涉及一种利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法。

背景技术

美丽鸡血藤为豆科蝶形花亚科鸡血藤属多年生藤状灌木植物，分布于热带和亚热带地区。其膨大的根（药材名：牛大力）为野生名贵南药。牛大力始载于《生草药性备要》，近代本草中多有收载，是多种中成药的主要原料。牛大力具有补肺滋肾、清热止咳、舒筋活络等功效,主治肺虚咳嗽、咳血、肾虚、腰膝酸痛、遗精、白带、风湿痹痛、跌打损伤、慢性肝炎等。此外，牛大力在两广、海南被广泛用做煲汤、药膳、药酒的原料，具有调节肺、脾、肾三脏功能和增强机体抗病能力的功效。

多糖是多种中草药的有效成分之一，在保健食品中作为添加剂也有广泛应用，同时作为为广谱免疫调节剂在日常洗化用品比如沐浴露、润肤霜等中添加。牛大力多糖是牛大力的主要有效成分之一,具广泛的生物活性。和众多重要中草药多糖一样，牛大力多糖被发现具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤的功效，是一种高效的、多功能的天然抗氧化剂和自由基清除剂。目前，牛大力多糖的生产原料主要依靠挖掘野生美丽鸡血藤植物资源获得，而利用悬浮培养的细胞作为牛大力多糖来源的尚未见报道。

利用悬浮细胞系生产植物功能性次生代谢产物已在1000多种植物上有过相关研究，可以有效的生产各种天然化合物，如生物碱、蛋白质、糖类、药物、香料天然色素以及其他活性产物。并且已有众多成功的例子，例如，紫杉醇、紫草宁、迷迭香酸和人参皂甙已经具备工业化生产技术。在细胞系的选择上，可以利用单细胞或细胞团进行培养，其中单细胞体系具在细胞类型的一致性、生长周期的稳定性、生长高效等方面的优势。

美丽鸡血藤植物种质资源由于长期不合理的采挖已经遭到严重破坏，在我国仅剩零星分布，资源几近枯竭。在自然条件下，牛大力一般三到五年后有块根形成，但有的牛大力种质栽培3年仍不见根系膨大，面对在医药、药膳、药酒、食品添加剂、化妆品、保健品等方面庞大的市场，原材料明显不足。并且，在人工栽培过程中，日照、水肥、土壤条件等多种因素制约其块根的膨大。

目前，传统获取牛大力多糖的方法是通过挖取野生美丽鸡血藤膨大的块根加工而成，或者人工种植的美丽鸡血藤。但是，前者已经导致野生美丽崖豆藤资源几近枯竭，而后者，采用人工种植的方法，由于该植物生长周期较长，需要长时间占用大量耕地，并且产量和品质受到自然条件和人工栽培技术的影响，牛大力多糖的产量和品质难以保证。所以，用细胞培养的方法来生产牛大力多糖，是未来的一种发展方向。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，该方法具有生产周期短、不占用耕地、产量稳定、有效成分含量高、不破坏自然资源的特点。

本发明上述所要解决的技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，含以下步骤：

（1）取美丽鸡血藤外植体，在愈伤诱导培养基上进行培养，获得非胚性愈伤组织；

（2）将步骤（1）中获得的非胚性愈伤组织在愈伤增殖培养基上进行增殖培养，获得生长迅速疏松的细胞团；

（3）将步骤（2）获得的细胞团接种至细胞悬浮启动培养基中培养，获得液体培养的具有轴性分裂特征的非胚性悬浮细胞系；

（4）将步骤（3）获得的非胚性悬浮细胞系离心沉淀后，取沉淀接种至液体增殖培养基中，获得生长周期稳定、生长迅速的悬浮细胞，该悬浮细胞为适合于提取牛大力多糖的非胚性悬浮细胞系；

（5）取步骤（4）获得的悬浮细胞，水提取1～3次，合并提取液，在提取液中加水无水乙醇至溶液中乙醇的体积百分含量为60～75%，取上清液，旋蒸后，获得牛大力粗多糖。

本发明步骤（1）中所述的美丽鸡血藤外植体培养前优选经含切段和消毒工序等处理。

本发明所述的美丽鸡血藤外植体优选为美丽鸡血藤的幼茎。

本发明所述幼茎长度优选为1～2cm，优选含有1～2个腋芽。

本发明步骤（1）中所述的愈伤诱导培养基配方优选为：MS培养基+蔗糖20～40g/L+6-BA1～3mg/L+NAA0.1～1mg/L+0.8～1.2%琼脂，pH为5.55～5.95，培养温度为24～28℃，光照强度2000～4000Lux，每日光照时长为8～12小时，培养时间为25～35天。

进一步优选的，本发明提供的愈伤诱导培养基配方为：MS培养基+蔗糖30g/L+6-BA3mg/L+NAA0.5mg/L+0.8g/L，pH5.85，培养温度为27℃，光照强度3000Lux，每日光照时长为12小时，培养时间为20～30天。

本发明步骤(1)中采用的愈伤诱导培养基配方和培养方法可保证外植体保持活力并且迅速分化获得松散的细胞团，该细胞团围绕幼茎基部生长，所获得细胞具有典型的轴性生长特征，当该细胞团直径达到0.5～1cm后，转接至愈伤增殖培养基。

本发明步骤（2）中所述的愈伤增殖培养基配方优选为：MS培养基+蔗糖20～40g/L+6-BA3～4mg/L+Picloram0.5～1mg/L+0.8%琼脂，pH为5.65～5.85，培养温度为25～28℃，培养方式为暗培养，培养周期为28～35天，非胚性愈伤组织接种大小为0.125～0.25cm³，经过一个培养周期，非胚性愈伤组织体积增加6～10倍。

进一步优选的，本发明提供的愈伤增值培养基配方为：MS培养基+蔗糖30g/L+6-BA4mg/L+Picloram0.5mg/L+0.8g/L琼脂，pH5.85，培养温度为27℃，暗培养，培养周期为30天。

本发明愈伤增殖培养基配方和培养方法可以满足美丽鸡血藤细胞伸长生长和细胞分裂的双重要求，细胞分裂和细胞膨大伸长就有较为明显的周期，且细胞类型一致，具有非胚性细胞的特征。

本发明步骤（3）中所述的细胞悬浮启动培养基配方优选为：MS培养基+蔗糖18～22g/L+6-BA0.25～1mg/L+Picloram0.5～2mg/L，pH为5.65～5.85；培养温度为24～27℃，培养方式为暗培养，培养周期为10天，接种量为细胞悬浮启动培养基体积的1/10～1/20，120～150rpm回旋式震荡培养。

进一步优选的，本发明提供的细胞悬浮培养启动培养基配方为：MS培养基+蔗糖20g/L+6-BA1mg/L+Picloram1mg/L,pH5.85，培养温度为27℃，暗培养，培养周期为10天，接种松散愈伤组织体积3cm³至含有30mL培养液的100mL三角瓶中，150rpm回旋式震荡培养。

本发明经过细胞悬浮启动培养基培养，细胞分散充分，在细胞分裂间期，形成了以具有轴性的长条形细胞为特征的单细胞悬系。

本发明步骤（4）中所述的液体增殖培养基配方优选为：MS培养基+蔗糖25～35g/L+6-BA0.5～2mg/L+Picloram0.5～4mg/L，pH5.65～5.85，培养温度为24～27℃，暗培养，120～150rpm回旋式震荡培养，培养7～10天获得稳定的非胚性悬浮细胞系，稳定后的非胚性悬浮细胞系生长周期为10天，继代周期为7～10天，继代时接种量为增殖培养基体积的1/6～1/10。

进一步优选的，液体维持培养基配方为：MS培养基+蔗糖30g/L+6-BA0.5mg/L+Picloram0.5mg/L,pH5.85，培养温度为27℃，暗培养，150rpm回旋式震荡培养。稳定后的细胞系生长周期为10天；继代培养时，接种量为培养体积的1/6。

本发明通过液体维持培养基进行液体培养，可迅速获得细胞类型一致、生长迅速、增值系数高的细胞，可为牛大力多糖的提取提供充足的原料。

本发明步骤（5）中水提取时的温度优选为95～100℃，提取时间优选为40～80min。

本发明步骤（5）中旋蒸时的温度优选为48～55℃。

本发明具有如下优点：

（1）本发明方法具有不占用耕地、产量稳定、有效成分含量高、不破坏自然资源的特点，具有极大的开发利用价值；

（2）本发明方法获得的细胞为非胚性细胞，细胞保持了外植体（幼茎）伸长生长明显的特征；并且细胞充分分散，增值效率极高；

（3）本发明方法获得的细胞细胞类型单一，生长周期一致，产量易于调控；

（4）本发明方法可工厂化生产牛大力多糖，摆脱了对自然条件的依赖；

（5）和种植牛大力相比（3～5年），本发明方法生产周期短（7～10天），生产规模便于控制，投资风险小。

附图说明

图1为本发明实施例1中制备的美丽鸡血藤悬浮培养非胚性细胞的形态特征；

图2为本发明实施例2中本发明方法提取的牛大力粗多糖和牛大力药材获取的提取物（标准品）谱带对比；

图3为本发明实施例1中制备获牛大力多糖的紫外光谱扫描分析。

具体实施方式

实施例1

美丽鸡血藤非胚性单细胞悬浮细胞系的获取和利用美丽鸡血藤非胚性单细胞悬浮培养细胞生产牛大力粗多糖

（一）美丽鸡血藤非胚性单细胞悬浮细胞系的获取

（1）取美丽鸡血藤幼茎作为外植体，该幼茎长度为1～2cm，含有1～2个腋芽，表面消毒后，切成1cm小段，接种至愈伤诱导培养基（MS培养基+蔗糖30g/L+6-BA3mg/L+NAA0.5mg/L+0.8g/L琼脂，pH5.85），27℃培养，光照强度3000Lux，每日光照时长为12小时，30天后获得非胚性愈伤组织，非胚性愈伤组织的直径约为0.5cm；

（2）将直径约为0.5cm（非胚性愈伤组织接种大小为0.125～0.25cm³，）的非胚性愈伤组织转移至愈伤增殖培养基（MS培养基+蔗糖30g/L+6-BA4mg/L+Picloram0.5mg/L+0.8g/L琼脂,pH5.85），27℃暗培养，培养周期为30天，30天后获得生长迅速的疏松细胞团，直径为1～1.5cm（经过一个培养周期，非胚性愈伤组织体积增加6～10倍）；

（3）将这些生长迅速的细胞团约5cm³，转移至含有30mL细胞悬浮培养启动培养液（基）（MS培养基+蔗糖20g/L+6-BA1mg/L+Picloram1mg/L,pH5.85）的100mL三角瓶中，27℃、150rpm回旋式震荡暗培养10天，获得液体培养的具有轴性分裂特征的非胚性悬浮细胞系（unicellular suspension）；

（4）将上述细胞系转移至50mL离心管中，1000g离心5分钟，弃上清，取沉淀的细胞5mL，接种至含有30mL液体增殖培养液（基）（MS培养基+蔗糖30g/L+6-BA0.5mg/L+Picloram0.5mg/L,pH5.85）的100mL三角瓶中，27℃、150rpm回旋式震荡暗培养10天，即可获得适合于提取牛大力多糖的非胚性悬浮细胞；

（5）用该方法获得的细胞生长迅速，每10天继代一次，接种量为液体增殖培养基体积的1/6～1/10，增殖系数为6^d/10（d为接种后的天数）；细胞形态一致，长条形，长宽比约为2～3:1，细胞分裂具有轴性，见图1中所示。

（二）悬浮培养细胞牛大力浸膏的制备生产

取培养了10天的悬浮细胞1L，100℃加热1小时，过滤后保存提取液，在残渣中加1L蒸馏水，重复以上步骤1次，合并提取液，用纱布过滤杂质后，加无水乙醇使乙醇浓度达到60～75%，静置沉淀12小时，取上清，50℃旋转蒸发至恒重，获得牛大力提取物（牛大力多糖）9.484g。用同样的方法，从100g牛大力干药材切片中可获得浸膏7.993g。即用本发明生产的悬浮细胞，每0.843L细胞含有的牛大力浸膏（多糖）相当于牛大力原药材干样100g含有的浸膏（多糖）。

实施例2

美丽鸡血藤悬浮培养细胞主要化学成分的鉴定

（1）TLC鉴定：分别取1L美丽鸡血藤悬浮细胞和100g牛大力干药材（作为对照）加蒸馏水至1L，100℃加热1小时，过滤后保存提取液，在残渣中加1L蒸馏水，重复以上步骤1次，合并提取液。取美丽鸡血藤供试液和牛大力提取液各5μL，上样于同一5cmх4cm Merck SG60F₂₄₅预制板上,以氯仿一甲醇(体积比6:1)展开，用5～10%的浓硫酸乙醇溶液作为显色剂，加热显色。结果显示供试样品和牛大力药材获取的提取物（标准品）谱带一致（图2），说明两者成分一致，主要成分为牛大力多糖。

（2）硫酸-蒽酮法测定牛大力多糖的含量：参照植物总糖测定的国标（GB6194-86）所示方法测定，以牛大力药材提取物为参照，每升美丽崖豆藤细胞培养物可获得0.99g总糖，相当于100g牛大力药材所含总糖。

（3）牛大力多糖的紫外光谱扫描分析：配置实施例1中制备的牛大力提取物，浓度为167μg/mL的细胞浸膏，用紫外分光光度计在190nm～300nm范围进行扫描，在201nm处呈现多糖特征吸收峰（图3）。该吸收曲线和牛大力药材多糖提取物吸收曲线（参考暨南大学硕士学位论文，郑元生，2009年）形状、吸收峰一致。

以上3种方法表明用本方法获得的牛大力提取物和牛大力药材提取的主要成分牛大力多糖相一致，主要为牛大力多糖。

显然，上述内容只是为了说明本发明的特点，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员根据本发明在相应的技术领域做出的变化应属于本发明的保护范畴。

Claims

1.一种利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是含以下步骤：

2.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：步骤（1）中所述的美丽鸡血藤外植体培养前经含切段和消毒工序处理。

3.根据权利要求2所述的利用美丽鸡血藤非胚性单细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：所述的美丽鸡血藤外植体为美丽鸡血藤的幼茎。

4.根据权利要求3所述的利用美丽鸡血藤非胚性单细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：所述幼茎长度为1～2cm，含有1～2个腋芽。

5.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：步骤（1）中所述的愈伤诱导培养基配方为：MS培养基+蔗糖20～40g/L+6-BA1～3mg/L+NAA0.1～1mg/L+0.8～1.2%琼脂，pH为5.55～5.95，培养温度为24～28℃，光照强度2000～4000Lux，每日光照时长为8～12小时，培养时间为25～35天。

6.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：步骤（2）中所述的愈伤增殖培养基配方为：MS培养基+蔗糖20～40g/L+6-BA3～4mg/L+Picloram0.5～1mg/L+0.8%琼脂，pH为5.65～5.85，培养温度为25～28℃，培养方式为暗培养，培养周期为28～35天，非胚性愈伤组织接种大小为0.125～0.25cm³，经过一个培养周期，非胚性愈伤组织体积增加6～10倍。

7.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：步骤（3）中所述的细胞悬浮启动培养基配方为：MS培养基+蔗糖18～22g/L+6-BA0.25～1mg/L+Picloram0.5～2mg/L，pH为5.65～5.85；培养温度为24～27℃，培养方式为暗培养，培养周期为10天，接种量为细胞悬浮启动培养基体积的1/10～1/20，120～150rpm回旋式震荡培养。

8.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是步骤（4）中所述的液体增殖培养基配方为：MS培养基+蔗糖25～35g/L+6-BA0.5～2mg/L+Picloram0.5～4mg/L，pH5.65～5.85，培养温度为24～27℃，暗培养，120～150rpm回旋式震荡培养，培养7～10天获得稳定的非胚性悬浮细胞系，稳定后的非胚性悬浮细胞系生长周期为10天，继代周期为7～10天，继代时接种量为增殖培养基体积的1/6～1/10。

9.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：步骤（5）中水提取时的温度为95～100℃，提取时间为40～80min。

10.根据权利要求1所述的利用美丽鸡血藤非胚性单细胞悬浮培养生产牛大力多糖的方法，其特征是：步骤（5）中旋蒸时的温度为48～55℃。