CN102532337A

CN102532337A - 一种利用组织培养方法生产甘草多糖的方法

Info

Publication number: CN102532337A
Application number: CN2011104512217A
Authority: CN
Inventors: 高文远; 郭松波; 满淑丽; 吕连媛; 刘辉; 董艳艳; 王娟
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明公开了一种利用组织培养方法生产甘草多糖的方法，包括如下步骤：(1)培养诱导甘草无菌苗；(2)从甘草无菌苗下胚轴诱导甘草愈伤组织；(3)选择生长速度快、质地松散、淡黄色的甘草愈伤组织，用镊子夹碎后转移到液体培养基中进行悬浮培养，获得甘草悬浮细胞；(4)鼓泡式反应器培养甘草悬浮细胞；(5)从步骤(4)所得甘草悬浮细胞中提取甘草多糖得甘草多糖粉末。本发明的悬浮细胞生产出的甘草多糖含量高于野生甘草，具有明显的抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节活性，具有很强的免疫调节、抗疲劳的作用，这种方法不受季节及地域的限制，方便，易操作，具有广阔的开发前景。

Description

一种利用组织培养方法生产甘草多糖的方法

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，具体的说涉及一种甘草细胞培养生产甘草多糖的方法。

背景技术

甘草作为一种传统中药，自古以来就有“十方九草”的美誉，甘草多糖是甘草中三大主要活性成分之一。甘草作为我国常用的大宗药材，国家二级保护植物；是国家专控药材，甘草中有效成分，生物活性强，应用广，价格高，市场需求日益强劲，而野生甘草种子出芽率低，加上掠夺性开采；供求矛盾日益严重；沙漠严重，利用组织培养技术生产甘草活性成分具有广阔的发展前景。自本世纪初，利用植物细胞，组织和器官培养的方法生产药用活性物质的研究取得了惊人的进展，已有近1000种植物进行过细胞培养方面的研究，据估计，已经从400多种植物中建立了组织和细胞培养物，并从中分离出600多种代谢产物，甘草悬浮细胞生产出的甘草多糖含量高于野生甘草，具有明显的抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节活性，具有很强的免疫调节、抗疲劳的作用，具有广阔的开发前景。甘草细胞悬浮培养，利用本实验室自行研发的一种适合细胞悬浮培养的生物反应器，中国专利申请号201110255311.9发明名称：一种植物组织培养用鼓泡式生物反应器。同时经对现有技术文献的检索发现，中国专利申请号200810040456.5，发明名称为：利用组织培养生产大豆异黄酮的方法的专利中公开了一种利用大豆愈伤组织生产大豆异黄酮的方法，该方法的成功为组织培养技术生产目的产物提供一种可能。目前甘草资源缺乏，通过细胞培养方式生产甘草多糖具有广阔前景，并还未见报道。

发明内容

为了现有技术中的问题，本发明提供了一种甘草细胞培养生产甘草多糖的方法，解决目前甘草资源缺乏的问题。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种利用组织培养方法生产甘草多糖的方法，包括如下步骤：

(1)培养诱导甘草无菌苗：取成熟的甘草种子，用消毒液消毒灭菌，然后将无菌种子接种到萌发培养基上，经过培养得到甘草无菌苗；

(2)利用无菌苗颈段诱导愈伤组织：切取上一步得到的无菌苗颈段，接到愈伤组织诱导培养基中，每28天继代培养1次，连续继代培养3次得到稳定的愈伤组织；

(3)甘草悬浮细胞的诱导：挑选形状松散、颜色浅的愈伤组织诱导悬浮细胞，经挑选，继代培养得到稳定高产的细胞系；

(4)甘草悬浮细胞鼓泡式反应器的培养：挑选稳定高产的细胞系，利用自行研发设计的鼓泡式生物反应器培养，得到成熟的甘草细胞；

(5)甘草多糖的提取：用水提醇沉法提取步骤(4)所得甘草多糖，用sevage去蛋白，得到甘草多糖。

所述步骤(1)甘草无菌苗的诱导方法为：挑选颗粒饱满，呈深绿色的甘草种子，用5％～15％的次氯酸钠在磁力搅拌器上对种子进行搅拌灭菌，转速为200r/min～500r/min，温度为20℃～30℃，灭菌时间20min～40min，MS培养中含2％-5％蔗糖，灭菌前pH 5～6，接种在含MS固体培养基的三角瓶内，放在20～28℃光照培养箱中，培养30～35天，得到甘草无菌苗。

所述步骤(2)甘草愈伤组织是从甘草无菌苗下胚轴诱导得来，经多次筛选继代后，生长状态稳定；愈伤组织继代培养基为MS培养基，附加2，4-D(0.5～2mg·L^-1)，NAA(0.5～2mg·L^-1)，6-BA(0.1～0.3mg·L^-1)，2～5％蔗糖，灭菌前pH 5～6，继代周期25～30天。

所述步骤(3)甘草悬浮细胞培养基成分为3/4MS培养基，附加2，4-D(0.5～2mg·L^-1)，NAA(0.5～2mg·L^-1)，6-BA(0.1～0.3mg·L^-1)，2～5％蔗糖，初次培养3～5天后，将悬浮的大块愈伤组织过滤除去，悬浮细胞每隔15～20天继代一次；摇床转速110～120r·min^-1，培养温度(20～28)℃；经过数次传代筛选，最终获得性能优异的细胞系。

所述步骤(4)甘草悬浮细胞鼓泡式反应器培养是指：利用自行设计的5L鼓泡式反应器，接种量为5％～10％的鲜重甘草细胞，发酵罐通气量为200L/min～500L/min，培养基成分为3/4MS培养基，附加2，4-D(0.5～2mg·L^-1)，NAA(0.5～2mg·L^-1)，6-BA(0.1～0.3mg·L^-1)，2～5％蔗糖，PH值为5～9，培养周期为15～20天。

所述步骤(5)甘草多糖的提取是指：取甘草细胞粉末，加入15～25倍重量的蒸馏水，静置5～12h，水浴1～5次，每次1～3h，重复水浴2～5次，合并滤液，浓缩到一定体积，以无水乙醇调制终浓度为50～90％，0～6℃静置过夜，去上清液，用sevage法去蛋白，干燥，粉碎，得到甘草多糖粉末。

本发明的有益效果为：本发明的生产方法利用甘草愈伤组织，诱导产生甘草悬浮细胞，在鼓泡式发酵罐中生产甘草多糖，悬浮细胞生产出的甘草多糖含量高于野生甘草，具有明显的抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节活性，具有很强的免疫调节、抗疲劳的作用，这种方法不受季节及地域的限制，方便，易操作，具有广阔的开发前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

第一步，甘草无菌苗的获得：挑选颗粒饱满，呈深绿色的甘草种子，用10％的次氯酸钠在磁力搅拌器上对种子进行搅拌灭菌，转速为300r/min，温度为25℃，灭菌时间30min，MS培养中含3％蔗糖，灭菌前pH 5.9，接种在含MS固体培养基50ml的三角瓶内，放在25℃光照培养箱中，培养30天，得到甘草无菌苗。

第二步，甘草愈伤组织的获得：甘草愈伤组织是从甘草无菌苗下胚轴诱导得来，经多次筛选继代后，生长状态稳定。愈伤组织继代培养基为MS培养基，附加2，4-D(1mg·L^-1)，NAA(1mg·L^-1)，6-BA(0.2mg·L^-1)，3％蔗糖，灭菌前pH 5.9，继代周期28天。

第三步，甘草悬浮细胞的获得：选择生长速度快、质地松散、淡黄色的甘草愈伤组织，用镊子夹碎后转移到液体培养基中进行悬浮培养。培养及成分为3/4MS培养基，附加2，4-D(1mg·L^-1)，NAA(1mg·L^-1)，6-BA(0.2mg·L^-1)，3％蔗糖，初次培养3天后，将悬浮的大块愈伤组织过滤除去，悬浮细胞每隔18天继代一次。摇床转速110～120r·min^-1，培养温度(20～28)℃。经过数次传代筛选，最终获得性能优异的细胞系。

第四步，甘草悬浮细胞鼓泡式反应器培养：利用自行设计的5L鼓泡式反应器，接种量为8％的鲜重甘草细胞，发酵罐通气量为300L//min，培养及成分为3/4MS培养基，附加2，4-D(1mg·L^-1)，NAA(1mg·L^-1)，6-BA(0.2mg·L^-1)，3％蔗糖，PH值为5.9，培养周期为18天。

第五步，甘草多糖的提取：取甘草细胞粉末，加入20倍重量的蒸馏水，静置12h，沸水浴提取，提取时间1h。重复水浴提取3次，合并滤液，浓缩到一定体积，以无水乙醇调制终浓度为75％，4℃静置过夜，去上清液，用sevage法去蛋白，干燥，粉碎得到甘草多糖粉末。

经过本发明方法诱导出的高产细胞系结合生物反应器的培养，使得甘草细胞干重增值倍数达到11倍，甘草多糖含量达到10％。本发明的方法工艺简单，为生产甘草多糖提供一种新的途径，此方法是中药生物工程的一种，不受季节和地域的限制。

Claims

1.一种利用组织培养方法生产甘草多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述生产甘草多糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)甘草无菌苗的诱导方法为：挑选颗粒饱满，呈深绿色的甘草种子，用5％～15％的次氯酸钠在磁力搅拌器上对种子进行搅拌灭菌，转速为200r/min～500r/min，温度为20℃～30℃，灭菌时间20min～40min，MS培养中含2％-5％蔗糖，灭菌前pH 5～6，接种在含MS固体培养基的三角瓶内，放在20～28℃光照培养箱中，培养30～35天，得到甘草无菌苗。

3.根据权利要求1所述生产甘草多糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)甘草愈伤组织是从甘草无菌苗下胚轴诱导得来，经多次筛选继代后，生长状态稳定；愈伤组织继代培养基为MS培养基，附加2，4-D(0.5～2mg·L^-1)，NAA(0.5～2mg·L^-1)，6-BA(0.1～0.3mg·L^-1)，2～5％蔗糖，灭菌前pH 5～6，继代周期25～30天。

4.根据权利要求1所述生产甘草多糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)甘草悬浮细胞培养基成分为3/4MS培养基，附加2，4-D(0.5～2mg·L^-1)，NAA(0.5～2mg·L^-1)，6-BA(0.1～0.3mg·L^-1)，2～5％蔗糖，初次培养3～5天后，将悬浮的大块愈伤组织过滤除去，悬浮细胞每隔15～20天继代一次；摇床转速110～120r·min^-1，培养温度(20～28)℃；经过数次传代筛选，最终获得性能优异的细胞系。

5.根据权利要求1所述生产甘草多糖的方法，其特征在于，所述步骤(4)甘草悬浮细胞鼓泡式反应器培养是指：利用自行设计的5L鼓泡式反应器，接种量为5％～10％的鲜重甘草细胞，发酵罐通气量为200L/min～500L/min，培养基成分为3/4MS培养基，附加2，4-D(0.5～2mg·L^-1)，NAA(0.5～2mg·L^-1)，6-BA(0.1～0.3mg·L^-1)，2～5％蔗糖，PH值为5～9，培养周期为15～20天。

6.根据权利要求1所述生产甘草多糖的方法，其特征在于，所述步骤(5)甘草多糖的提取是指：取甘草细胞粉末，加入15～25倍重量的蒸馏水，静置5～12h，水浴1～5次，每次1～3h，重复水浴2～5次，合并滤液，浓缩到一定体积，以无水乙醇调制终浓度为50～90％，0～6℃静置过夜，去上清液，用sevage法去蛋白，干燥，粉碎，得到甘草多糖粉末。