CN110511294A - 一种甘草多糖的制备方法及其应用 - Google Patents
一种甘草多糖的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种甘草多糖的制备方法及其应用，该方法将甘草茎自然干燥，机械粉碎，并过筛分离杂质，石油醚脱脂，无水乙醇脱色素,自然风干后用热水提取，离心，浓缩，无水乙醇沉淀，再离心，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，制备出水溶性多糖。该方法提取得到的甘草多糖的提取率达到7.8%。该多糖部位被验证具有抗氧化活性，从天然植物中寻找新抗氧化剂，是现代医药和食品行业发展的新方向；研究多糖及其衍生物的抗氧化作用，开发新的天然抗氧化剂，具有重要的现实意义。本研究可为甘草多糖在抗氧化和抗衰老功能性食品中的应用开发提供参考。
Description
技术领域
本发明涉及一种甘草多糖的制备方法及其应用。通过该方法获得的甘草粗多糖可作为治疗或预防抗氧化疾病相关的药物或保健品的制备原料。
背景技术
甘草属(Glycyrrhiza L.)隶属于豆科、蝶形花亚科、山羊豆族、甘草亚族，为多年生草本植物，其家族并不十分庞大，主要分布在欧亚大陆，美洲有两种、非洲和大洋洲各只有一种。甘草在我国约有8种，集中分布于三北地区(东北、华北和西北各省区)，而以新疆、内蒙古、宁夏和甘肃为中心产区。甘草属中的多数种分布极为狭窄，有的已经濒临灭绝，只有少数种属于广布种。甘草具有调和诸药之功效，是中药配伍中用量最大的草药，因而《本草纲目》将其列为百药之首为甘草赢得了“中草药之王”、“国老”等美誉。甘草不仅在传统中医药中占有一席之地，也是现代制药工业的重要原料，同时在食品、保健品、化妆品、烟草、轻工、石油、消防等许多行业中也有着非常重要的作用。野生甘草资源面临枯竭。我国甘草蕴存量建国初期约为200—250万吨，目前已下降到50—70万吨。
多糖是一种天然高分子，广泛存在于植物、微生物、藻类和动物体。多糖是单糖通过糖苷键连接而成的聚合物，也是生命体不可缺少的重要组成部分，人们从动物、植物、微生物中提取分离了大量多糖和多糖类物质用作治疗或辅助治疗药物。多糖在细胞与细胞信息交流、细胞吸附、以及免疫系统分子识别方面扮演着极其重要的作用。多糖已成为天然药物及保健品研发中的重要组成部分，国外多数制药公司都有从事糖类药物的研发。研究发现多糖具有抗氧化，抗肿瘤，抗凝血及免疫调节等多种功能。多糖是药用植物最重要的活性成分之一，植物多糖以其广泛的治疗作用和极低的细胞毒性，在医药、食品、化妆品和环境治理等领域具有广阔的应用前景。因此，近年来，关于多糖的研究越来越受到人们的关注，已成为当今研究的“热点”。从自然资源提取得到的一些多糖已经引起生物化学和药理学领域的极大重视，尤其是中药多糖，由于中药的独特作用及对中药作用机制的深入研究，更为受到关注。我国在活性多糖的分离、纯化、分子结构确定及量效关系控制等方面已取得重大突破，达到世界领先水平。
甘草为常用中药材应用极其广泛，例如可以作为免疫调节剂、饲料添加剂、抗病毒制剂、肿瘤治疗辅助药物以及抗氧化剂等。现代研究发现，甘草含有多种活性成分，主要是三萜类、黄酮类、甘草多糖类，另外还有香豆素类、氨基酸类、生物碱类、挥发油类及多种微量元素等。甘草多糖(简称GP)是从甘草中提取的活性多糖，研究表明甘草多糖主要由鼠李糖、葡聚糖、阿拉伯糖和半乳糖组成。甘草多糖含有大量的还原结构，这些结构决定其强还原性。对多糖结构的研究表明，多糖的生物活性大多与其空间结构密切相关。研究表明，多糖是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞，提高机体的免疫功能，而对正常细胞无毒副作用。有报道GP在体内和体外均能提高自然杀(NK)细胞活性和抗体依赖细胞介导的细胞毒效应，具有激活小鼠淋巴细胞增殖的作用，选择性增强辅助性T淋巴细胞的增殖能力和活性，调节多种细胞因子的生成与分泌。比较发现，体内给药的增强作用较体外试验增强作用明显。还有试验表明，从甘草中分离的3种酸性多糖(GR－2Ⅱa、GR－2Ⅱb、GR－2ⅡC)具有明显的抗补体活性，且GR－2ⅡC具有促有丝分裂活性。
人体时刻都在进行着氧化还原反应，若在病理或应激状态下，就能引起机体氧化与抗氧化状态失衡，就会产生过量的自由基，这些过量的自由基就会对机体造成伤害。人体自身已经形成了抗氧化系统，包括抗氧化酶原系统、内源性抗氧化物及具有抗氧化活性的必需营养素。以上抗氧化系统帮助机体清除内源性的活性氧化自由基，但是对氧化自由基的消除功能会随着机体的衰老而减退。当机体细胞组织受到活性氧、自由基的氧化胁迫时，就会使细胞组织中的脂质、蛋白质、糖类等大分子物质，发生各种氧化反应，进而导致细胞结构和功能的破坏，从而导致伤害和病变，导致一些疾病。大量研究表明，多糖具有免疫调节、抗氧化、降血糖和抗衰老等作用。抗氧化是多糖最重要的生物活性之一，近年来国内外学者关于多糖抗氧化活性作了大量的研究工作。目前，有很多种多糖已被发现有体内外的抗氧化作用，多糖能够消除活性氧自由基，对活性氧产生的伤害有明显的改善作用。
随着社会的发展和生活质量的提高，药品消费也逐渐从以化学药品为主向以天然资源为原料的植物药转变，中药在治疗、康复保健和提高人体免疫能力方面有独特的优势，己成为世界医药产业的重要组成部分。
多糖的种类繁多，不同种多糖其提取分离方法各不相同。提取多糖大多采用不同温度的水、弱酸及稀碱溶液作提取溶剂。多糖的提取方法大致分为以下几种。
(1)溶剂提取法
溶剂提取法一般使用的溶剂为水、弱酸、稀碱等。后两种提取法提取率较高，但是极易破坏多糖的结构及活性。热水浸提法既传统提取法耗时较长，提取率较低，但安全性高，不易破坏多糖的理化性质。
(2)酶法提取
酶具有高度专一性，酶法提取就是利用了这一特性。酶法是通过酶反应将原料组织分解，加速有效成分的释放和提取，选择适宜条件将影响提取的杂质分解去除，促进某些极性低的脂溶性成分转化成糖。同时酶法提取还可以针对原料组分中含有的杂质进行选择性降解，可利用蛋白酶或复合酶，降解并除去其中大部分的蛋白质等，使提取分离的更加彻底，提取率更高。由于酶法条件温和、易去除杂质、回收率高和节约能耗等优点，因此酶法提取的应用前景十分广阔。
(3)超声波提取
超声波辅助提取法是利用超声波的独特空化作用产生极大压力，使原料细胞的细胞壁极易破碎同时使整个生物体破碎，植物细胞内的有效成分得以释放、直接进入溶剂并充分混合，从而提高提取率。超声波提取实验环境较温和，其提取温度较低，可以避免因温度高而破坏水溶性多糖的生物活性，并具有能耗少、节约资源等多种优点。
(4)微波提取
提取过程中，微波辐射导致植物细胞内的极性物质产生大量热量，使得细胞内的温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞，导致细胞内部和细胞壁水分减小，细胞收缩，表面出现裂纹，胞外溶剂容易进入细胞内，溶解并释放胞内多糖，因此应用微波加热提取手段能够显著缩短萃取时间，较大程度地提高多糖的萃取效率。与传统热水浸提法相比，微波辅助提取法效率更高，耗时少，并且大大降低了对多糖空间结构的破坏。
(5)超临界流体萃取法
在超临界状态下，超临界流体与目标物接触，使其依次把极性、沸点和分子量大小不同的成分萃取出来，当恢复到常压和常温时，溶解在流体中的成分立即以溶于吸收液的液体状态与气态流体分开，从而达到萃取目的。超临界萃取技术萃取能力强，提取效率高，生产周期短，容易发现新的活性成分，极少损失易挥发组分或破坏生理活性物质，没有溶剂残留，产品质量高。
(6)超高压提取法
超高压提取法是指在常温条件下，利用100-1000mpa的超高压范围内的静压力作用于原料液，由于细胞内外具有渗透性，可以快速的进入细胞内外部达到压力平衡，同时细胞内的有效成分也能达到充分的溶解平衡，在平衡时迅速卸压，细胞内的有效成分会因为细胞内外的渗透压力差突然增大而冲出细胞外，穿过细胞的重重阻碍转移到细胞外的提取液中，从而达到提取有效成分的目的。超高压提取法在常温下进行的条件可避免有效成分因热效应破坏结构变化和生理活性，同时超高压提取一般在密闭环境下操作，溶剂挥发极少，大大减少了对环境的污染，达到了绿色环保的技术要求。
生命活动的氧化代谢过程不断产生各种活性氧自由基，如DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基等。这些活性氧自由基除参与细胞的生理代谢过程外，还会引起细胞膜和DNA的损伤，导致生物膜脂质过氧化和通透性降低，引发多种疾病如癌症、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病等。尽管机体存在氧化防御和修复机制，但并不能完全有效的阻止过量自由基造成的机体损伤，因此补充外源抗氧化剂就显得十分必要。然而许多合成抗氧化剂存在诸多的安全问题，所以天然抗氧化剂的研究与开发引起人们的广泛关注。大量研究表明，多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖和抗衰老等作用。而这些作用与多糖的抗氧化活性密不可分。抗氧化是多糖最重要的生物活性之一。近年来国内外学者关于多糖抗氧化活性作了大量的研究工作。
发明内容
本发明目的在于，提供一种甘草多糖的制备方法及其应用，该方法将甘草根自然干燥，机械粉碎，并过筛分离杂质，石油醚脱脂，无水乙醇脱色素，自然风干后用溶剂进行提取，提取后将提取液离心，浓缩，无水乙醇沉淀，再离心，将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，制备出水溶性多糖。该方法提取得到的甘草多糖的提取率达到7.8％。该甘草多糖部位被验证具有抗氧化活性，从天然植物中寻找新抗氧化剂，是现代医药和食品行业发展的新方向；研究多糖及其衍生物的抗氧化作用，开发新的天然抗氧化剂，具有重要的现实意义。本研究可为甘草多糖在抗氧化和抗衰老功能性食品中的应用开发提供参考。
本发明所述的一种甘草多糖的制备方法，该方法以甘草根为原料，用热水作为溶剂进行提取，具体操作按下列步骤进行：
a、采集甘草根，在阴凉处自然晾干之后机械粉碎，粉碎时间为60-180秒，过60目筛，分离杂物，得到甘草粉末物；
b、将步骤a中得到的甘草粉末按料液重量比1:5加入石油醚，室温搅拌6-8小时，反复提取3-4次至未有油脂提取出为止，然后按料液重量比为1:5加入无水乙醇，搅拌回流3-4小时，反复提取3次至未有色素提取出为止，过滤，自然风干至未有石油醚和乙醇溶剂残留为止，得到脱脂脱色素的甘草粉；
c、按重量比1:30，将步骤b得到的脱脂脱色素甘草粉加水，在温度100℃下搅拌提取3次，提取时间每次1小时，合并提取液，在7000rpm，温度4℃，离心10min，浓缩，得到多糖浓缩液备用；
d、按体积比1:4将步骤c得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，温度4℃过夜，在8000rpm，温度4℃，离心10min，再将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，得到水溶性甘草多糖。
所述方法获得的甘草多糖在制备抗氧化生物活性的药物中的用途。
本发明所述的一种甘草多糖的制备方法，其优点是得到多糖得率高，易于放大中试，而其在保留多糖原有的物理和化学性质以及营养成分基础上，通过利用低温或真空或冷冻干燥干技术，避免了传统烘干或减压抽滤而有些化合物失去活性的缺点。该甘草多糖被验证具有抗氧化活性，对DPPH自由基，羟基自由基和ABTS+有清除能力。甘草多糖不仅有广泛的生物活性，改善人体免疫性能等活性。从天然植物中寻找新抗氧化剂，是现代医药和食品行业发展的新方向。研究多糖及其衍生物的抗氧化作用，开发新的天然抗氧化剂，具有重要的现实意义。本研究可为甘草多糖在抗氧化和抗衰老功能性食品中的应用开发提供参考。
附图说明
图1为水溶性甘草粗多糖对DPPH自由基的清除能力图；
图2为水溶性甘草粗多糖对OH羟自由基的清除能力图；
图3为水溶性甘草粗多糖对ABBTS+自由基的清除能力图。
具体实施方式
实施例1
a、采集甘草根，在阴凉处自然晾干之后机械粉碎，粉碎时间为60秒，过60目筛，分离杂物，得到甘草粉末物；
b、将步骤a中得到的甘草粉末按料液重量比1:5加入石油醚，室温搅拌6小时，反复提取3次至未有油脂提取出为止，然后按料液重量比为1:5加入无水乙醇，搅拌回流3小时，反复提取3次至未有色素提取出为止，过滤，自然风干至未有石油醚和乙醇溶剂残留为止，得到脱脂脱色素的甘草粉；
c、按重量比1:30，将步骤b得到的脱脂脱色素甘草粉加水，在温度100℃下搅拌提取3次，提取时间每次1小时，合并提取液，在7000rpm，温度4℃，离心10min，浓缩，得到多糖浓缩液备用；
d、按体积比1:4将步骤c得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，温度4℃过夜，在8000rpm，温度4℃，离心10min，再将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，得到水溶性甘草多糖。
实施例2
a、采集甘草根，在阴凉处自然晾干之后机械粉碎，粉碎时间为120秒，过60目筛，分离杂物，得到甘草粉末物；
b、将步骤a中得到的甘草粉末按料液重量比1:5加入石油醚，室温搅拌7小时，反复提取4次至未有油脂提取出为止，然后按料液重量比为1:5加入用无水乙醇，搅拌回流4小时，反复提取3次至未有色素提取出为止，过滤，自然风干至未有石油醚和乙醇溶剂残留为止，得到脱脂脱色素的甘草粉；
c、按重量比1:30，将步骤b得到的脱脂脱色素甘草粉加水，在温度100℃下搅拌提取3次，提取时间每次1小时，合并提取液，在7000rpm，温度4℃，离心10min，浓缩，得到多糖浓缩液备用；；
d、按体积比1:4将步骤c得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，温度4℃过夜，在8000rpm，温度4℃，离心10min，再将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，得到水溶性甘草多糖。
实施例3
a、采集甘草根，在阴凉处自然晾干之后机械粉碎，粉碎时间为180秒，过60目筛，分离杂物，得到甘草粉末物；
b、将步骤a中得到的甘草粉末按料液重量比1:5加入石油醚，室温搅拌8小时，反复提取4次至未有油脂提取出为止，然后按料液重量比为1:5加入用无水乙醇，搅拌回流4小时，反复提取3次至未有色素提取出为止，过滤，自然风干至未有石油醚和乙醇溶剂残留为止，得到脱脂脱色素的甘草粉；
c、按重量比1:30，将步骤b得到的脱脂脱色素甘草粉加水，在温度100℃下搅拌提取3次，提取时间3小时，合并提取液，在7000rpm，温度4℃，离心10min，浓缩，得到多糖浓缩液备用；；
d、按体积比1:4将步骤c得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，温度4℃过夜，在8000rpm，温度4℃，离心10min，再将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，得到水溶性甘草多糖。
实施例4
将实施例1-实施例3中获得的任意一种甘草多糖样品经红外光谱图分析结果显示：样品中均含有OH基团，其在3400cm-1附近处有吸收表明含有OH基团；在1000cm-1附近处有吸收表明该多糖含有C-O-H基团；在1600cm-1附近处有吸收表明有糖类化合物水合震动峰；这些数据表明提取物是确实属于多糖类化合物的特征，甘草多糖UV分析结果证实：该糖不含蛋白质。
实施例5
甘草多糖的抗氧化活性试验：
DPPH自由基清楚实验：
将实施例1-实施例3中获得的任意一种甘草多糖样品配成浓度为0.0125、0.0625、0.125、0.25、0.375、0.5、0.75、1.0mg/ml的溶液，进行清除DPPH(二苯基苦基苯肼)自由基能力的抗氧化活性试验；
分别取不同浓度的样品溶液2.0mL和0.2mmol/L DPPH乙醇溶液2.0mL，加入10ml容量瓶中，温度37℃避光反应30min，在517nm下测吸光度值Ai，2.0mL DPPH溶液加2.0mL蒸馏水的吸光度值为A0，2.0mL无水乙醇加2.0mL样品溶液吸光度值为Aj，以蒸馏水作为空白，清除率按公式(1)计算：
清除率/％＝[1－(Ai－Aj)]/A0×100 (1)
羟自由基清楚实验：
将不同浓度甘草多糖0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0mg/ml的样品70uL与60uL水杨酸-乙醇6mM，以及5uL H2O2(0.1％)混合，在室温下反应30min，在510nm下测量吸光度，以BHT为参照，每个实验重复三次，并运用公式(1)计算清除率；
ABTS+自由基清楚实验：
将50uL不同浓度甘草粗多糖和150μL ABTS+自由基(吸光度在0.7±0.02)混合，在室温反应10分钟后，在730nm出测定吸光度，以BHT为参照，每个实验重复三次，并运用公式(1)计算清除率。
本发明所述的一种甘草多糖的制备方法及其应用，通过本发明所述方法获得的甘草多糖体外抗氧化活性分析表明甘草多糖具有清除DPPH自由基，羟自由基和ABTS+自由基的能力；甘草多糖当其浓度为1mg/ml时，对DPPH自由基的清除能力达83.13％；当其浓度为2mg/ml时，对羟自由基的清除能力达24.07％；并当其浓度为0.4mg/ml时，对ABTS+自由基的清除能力达48.44％。
因此该甘草多糖部位可以当成一个潜在的抗氧化剂，在食品、医药及保健品领域有广阔的应用前景；本研究可为甘草多糖在抗氧化和抗衰老功能性食品中的应用开发提供参考。
Claims (2)
1.一种甘草多糖的制备方法，其特征在于该方法以甘草根为原料，用热水作为溶剂进行提取，具体操作按下列步骤进行：
a、采集甘草根，在阴凉处自然晾干之后机械粉碎，粉碎时间为60-180秒，过60目筛，分离杂物，得到甘草粉末物；
b、将步骤a中得到的甘草粉末按料液重量比1:5加入石油醚，室温搅拌6-8小时，反复提取3-4次至未有油脂提取出为止，然后按料液重量比为1:5加入无水乙醇，搅拌回流3-4小时，反复提取3次至未有色素提取出为止，过滤，自然风干至未有石油醚和乙醇溶剂残留为止，得到脱脂脱色素的甘草粉；
c、按重量比1:30，将步骤b得到的脱脂脱色素甘草粉加水，在温度100℃下搅拌提取3次，提取时间每次1小时，合并提取液， 在7000rpm，温度4℃，离心10 min，浓缩，得到多糖浓缩液备用；
d、按体积比1:4将步骤c得到的多糖浓缩液用无水乙醇进行沉淀，温度4℃过夜，在8000rpm，温度4℃，离心10min，再将多糖沉淀物进行真空冷冻干燥，得到水溶性甘草多糖。
2.一种如权利要求1所述方法获得的甘草多糖在制备抗氧化生物活性的药物中的用途。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191129 |
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