CN102018731B

CN102018731B - 一种从色钉菇中提取抗氧化活性物质的方法及其应用

Info

Publication number: CN102018731B
Application number: CN 201010546459
Authority: CN
Inventors: 王立安; 孙红; 任永娜; 胡兵; 袁茵
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Chengde Lvyuan Green Food Co., Ltd.
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2030-11-17
Also published as: CN102018731A

Abstract

本发明公开了一种从色钉菇中提取抗氧化活性物质的方法，以及获得的提取物在抗氧化保健品及药物研发中的应用。本发明提供的制备活性物质的方法一：将色钉菇干粉与石油醚混合、搅拌，静置过夜；收集上清液后旋转蒸发浓缩，浓缩物真空干燥得到石油醚提取物浸膏。将子实体粉末烘干备用。还可以将石油醚提取物干粉与乙酸乙酯混合，重复方法一操作，获得乙酸乙酯提取物浸膏。还可以将乙酸乙酯提取物干粉与无水乙醇混合，重复方法一操作，获得乙醇提取物膏状物。获得的三种提取物均具有较强的抗氧化功效，含丰富的抗氧化活性物质，可做为抗氧化保健产品及药物的原料。

Description

一种从色钉菇中提取抗氧化活性物质的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种从色钉菇[Chroogomphus rutilus]中提取抗氧化活性物质的方法，以及提取物在抗氧化保健产品、药品开发中的应用，属于医药制备技术领域。

背景技术

药食用高等真菌作为一类高蛋白、低脂肪、富含微量元素的健康食品，具有很高的营养价值和保健功效。高等真菌可产生多种结构新颖或具有各种生物活性的次生代谢产物，为人类开发新药、保健食品等提供了重要的资源。迄今为止，已经从高等真菌中发现了多糖、甾体类、生物碱、萜类等具有显著生物活性的物质。随着化学、药理学、营养学、临床医学的不断发展，人们对高等真菌的认识和利用将更加广泛深入。近年来，人们对高等真菌的研究已越来越偏重于生物活性的研究，而非过去单纯的化学成分的分离鉴定。

长期以来，在食品保鲜、化妆品制作、保健食品乃至医药领域，人们一直使用人工合成抗氧化剂，如BHT（二叔丁基羟基甲酚），BHA（叔丁基羟基茴香醚），TBHQ（特丁基对苯二酚）和PG（没食子酸丙酯）等。近年研究发现，这些人工合成抗氧化剂存在安全性问题，具有诸多副作用，如对人体的肝、脾、肺均有不利影响，会诱发恶性肿瘤等。因此，近年来，从自然界寻求高效、无毒、安全的天然抗氧化剂的研究已引起各国科学家的重视。抗氧剂依其作用原理可分为：（1）自由基终止剂，如BHA，BHT，TBHQ和天然存在的生育酚等；（2）还原剂，如抗坏血酸及其盐类、亚硫酸及其盐类、核黄素等；（3）鳌合剂，如EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸、植酸等；（4）单旋态氧抑制剂，如胡萝卜素等。目前，已开发利用或正在研究的天然抗氧化剂多来自植物材料，主要有香辛料提取物、茶多酚类、天然黄酮类、维生素类、蛋白质和超氧化物歧化酶（SOD）类、类胡萝卜素、植酸、中草药提取物等几类物质。除植物材料以外，近年，利用高等真菌作材料，研究天然抗氧化剂已成为该领域的新热点。

国内外对高等真菌抗氧化活性物质研究呈以下特点。一是在多种食药用真菌子实体、菌丝体提取物中都发现含有抗氧化活性物质。这些高等真菌中，既有人工栽培的食用菌，也有野生菌。研究表明，不同种类的食用菌抗氧化能力并不相同，说明高等真菌中含有的抗氧化成分多少、种类均有差异。二是对抗氧化能力的测定多用的单一粗提物。如冷水提取物、热水提取物、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、氯仿等提取物。检测方法多采用清除超氧化物自由基、羟自由基、抑制脂质过氧化、亚铁离子螯合等。结果显示，各提取物均有不同程度的抗氧化活性，表明高等真菌中含有的抗氧化物质存在复杂性。定性测定结果显示，子实体、菌丝体中含有的抗氧化物质有：酚类物质、黄酮类物质、类黄酮、萜类物质、维生素C，类胡罗卜素、番茄红素、多糖等。三是仅有少数文献报道了高等真菌抗氧化物质的纯化及结构特点。

色钉菇（Chroogomphus rutilus），又称血红铆钉菇，俗称红蘑、肉蘑、松树伞、松蘑等，在真菌分类上属于担子菌亚门层菌纲、伞菌目、铆钉菇科。是针叶树木重要的外生菌根真菌。国内外对色钉菇的研究主要集中在其所含多的多糖类物质。唐超、王清吉等研究发现低剂量血红铆钉菇多糖对小鼠S180肉瘤的抑制率为76.018%，明显超过抗癌药物环磷酰胺的抑瘤率，具有显著的抑瘤作用；而肝指数、脾指数和胸腺指数与正常小鼠差异不大，能够有效保护免疫器官。Sun Y. X.，Li X.等分析了血红铆钉菇子实体的四种水溶性多糖CRPsA-1、CRPsA-2、CRPsB-1和CRPsB-2的结构，并通过体外抗氧化能力检测，发现CRPsB-1和CRPsB-2具有很好的自由基清除作用和较强的Fe ²⁺ 螯合能力。而采用不同极性的有机化合物分别提取色钉菇中的活性物质并对其活性物质的抗氧化活性进行研究，国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种从色钉菇中提取抗氧化活性物质的方法。

本发明的目的还在于提供上述抗氧化活性提取物在抗氧化保健产品及药物开发中的应用。

本发明的技术构思如下：在化学、生物化合物分离制备技术领域，液-固萃取法是利用溶剂对固体混合物中所需成分的溶解度大，对杂质的溶解度小的原理，把固体物质放于溶剂中长期浸泡而达到萃取的目的。本发明提供的方法是采用极性不同的三种有机溶剂，即非极性的石油醚、中极性的乙酸乙酯、极性的乙醇，分步萃取色钉菇的子实体干粉，获得极性不同的萃取物，即药用活性物质，然后分析不同极性萃取物的抗氧化效果，进而用于开发其用途。

具体的，本发明所说的从色钉菇中提取抗氧化活性物质的方法如下：

方法一：

取烘干后的色钉菇子实体干粉，与石油醚按质量体积比0.1~1克（g）：20毫升（mL）比例混合后，进行如下步骤(A)操作：搅拌2 h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3~5次，合并上清液，将合并后的上清液采用旋转蒸发器于40~45℃减压浓缩，然后用真空干燥箱干燥，得到石油醚提取物浸膏，称重，计算产率。将子实体粉末滤尽，烘干备用。

本发明还可以采取方法二：将方法一得到的石油醚提取后子实体粉末烘干后与乙酸乙酯按质量体积比0.1~1克（g）：20毫升（mL）比例混合后，重复方法一中的步骤(A)操作，即：搅拌2 h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3~5次，合并上清液，将合并后的上清液采用旋转蒸发器于40~45℃减压浓缩，然后用真空干燥箱干燥，得到乙酸乙酯提取物浸膏，称重，计算产率。将子实体粉末滤尽，烘干备用。

本发明还可以采取方法三：将方法二得到的乙酸乙酯提取后子实体粉末烘干后与无水乙醇按质量体积比0.1~1克（g）：20毫升（mL）比例混合后，重复方法一中的步骤（A）操作，即：搅拌2 h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3~5次，合并上清液，将合并后的上清液采用旋转蒸发器于40~45℃减压浓缩，然后用真空干燥箱干燥，得到乙醇提取膏状物，称重并计算产率。

各方法提取物的得率=[每种提取物的质量(g)/子实体干粉的质量(g)]×100%

各提取方法得到的提取物的得率见表1。

表1 色钉菇子实体干粉三种提取物的得率（%）

提取物	石油醚	乙酸乙酯	乙醇
				得率（g/g）	5.145	4.296	3.775

为了实现本发明获得的活性物质应用的目的，申请人进行了以下实验研究：

（1）三种提取物的体外抗氧化活性测定

方法一：采用清除DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基能力方法。具体操作如下：

将色钉菇三种提取物分别用无水甲醇配置成20 mg/mL的母液。随后，用无水甲醇稀释母液，得0.5 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL的样品溶液，用于清除DPPH自由基的检测。

取2 mL不同浓度的样品溶液于试管中，向其中加入2 mL无水乙醇配制的浓度为2×10 ^-4 mol/L的DPPH溶液，混合均匀后避光反应30 min，于517 nm处测定其吸光值。同时测定2 mL不同浓度样品溶液与2 mL无水乙醇的吸光值；2 mL DPPH溶液和2 mL无水甲醇的吸光值。以Vc（维生素C）作为阳性对照。每个实验组重复3次，按下面公式计算样品的DPPH清除率：

样品的DPPH清除率(%)=[A ₀ -(Ai-Aj)]/A ₀ ×100%

其中：A ₀ 是2 mL DPPH +2 mL无水甲醇的吸光值；Ai是2 mL DPPH +2 mL样品液的吸光值；Aj是2 mL DPPH +2 mL无水乙醇的吸光值。

结果：实验数据采用Statistica 6.0进行统计分析，IC ₅₀ 软件计算提取物的IC ₅₀ 值，结果见表2。

表2 色钉菇三种提取物清除DPPH自由基的IC ₅₀ 比较

提取物	Vc	石油醚	乙酸乙酯	乙醇
					IC₅₀值(mg/mL)	0.015	0.382	0.259	1.024

由表2可知：色钉菇的三种提取物特别是乙酸乙酯提取物具有较强的清除DPPH自由基的能力，即具有显著的体外抗氧化活性。

方法二：采用抑制小鼠肝细胞脂质过氧化活性的方法

具体操作如下：

将小白鼠断颈处死后，立刻取肝脏用生理盐水制成5%肝匀浆溶液。按硫代巴比妥酸法测定。以同浓度Vc（维生素C）、BHA（叔丁基羟基茴香醚）为阳性对照，将试管分为空白、对照1组和样品1组，置于冰水浴中预冷，之后于各管中加入鼠肝匀浆悬液200 μL，对照管和样品管中各加入1 mmol/L的FeSO ₄ 溶液50 μL和0.01 mol/L的L-Cys（半胱氨酸）溶液20 μL，样品管中分别加入不同浓度的提取物300 μL，用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH = 7.4) 补充至体积1 mL，置于37℃水浴中温育30 min，取出后立即加入20% TCA（三氯乙酸）溶液0.5 mL，5000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加0.67%TBA（硫代巴比妥酸）溶液1 mL，沸水浴中煮10 min，最后用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH=7.4)调零，然后于532 nm处测其吸光值，并记录数据。实验重复3次。按下面公式计算小鼠肝细胞脂质过氧化抑制率(%)：

肝细胞脂质过氧化抑制率(%)=[A ₀ -(A-A _b )]/A ₀ ×100%

其中：A ₀ 为只加组织匀浆的OD ₅₃₂ 值；A _a 为加样品和组织匀浆的OD ₅₃₂ 值；A _b 为样品的OD ₅₃₂ 值。

结果：实验数据采用Statistica 6.0进行统计分析，IC ₅₀ 软件计算提取物的IC ₅₀ 值，结果见表3。

表3 色钉菇三种提取物对小白鼠肝细胞脂质过氧化的抑制率(%)IC ₅₀ 比较

提取物	BHA	Vc	石油醚	乙酸乙酯	乙醇
						IC₅₀值(mg/mL)	0.007	5.285	5.187	0.122	0.638

由表3可知：色钉菇的三种提取物特别是乙酸乙酯、乙醇提取物均具有较强的抑制小鼠肝细胞脂质过氧化能力的作用，即具有显著的体外抗氧化活性。其活性虽然与强氧化剂BHA相比，略差些，但显著高于Vc。

（2）色钉菇乙醇提取物的体内抗氧化实验

方法：采用D-半乳糖衰老模型。将健康雄性昆明小鼠(体重在23-26 g)适应性饲养7d后，随机分为衰老组(M)，空白对照组(C)，阳性对照组(X1、X2、X3)和给药组(Y1、Y2、Y3)共4组，每组12只。将色钉菇乙醇提取物、阳性对照物Vc用生理盐水配制成所需的浓度。D-半乳糖的注射量为120 mg/(kg·d)。各组处理方法如下：

衰老组(M)：每日皮下注射0.2 mL D-半乳糖，灌胃等量的生理盐水。

空白对照组(C)：每日皮下注射等量的生理盐水。

给药组：每日皮下注射0.2 mL D-半乳糖，分别以浓度为100 mg/(kg·d) (Y1)、200 mg/(kg·d) (Y2)、 400 mg/(kg·d) (Y3)的乙醇提取物灌胃。

阳性对照组：每日皮下注射0.2 mL D-半乳糖，分别以浓度为100 mg/(kg·d) (X1)、200 mg/(kg·d) (X2)、400 mg/(kg·d) (X3)的Vc灌胃。

每天灌胃小鼠1次，每次0.2 mL，连续30 d。各组均在室温(20-25℃)环境下常规饲养，自然光照12 h白天、12 h黑夜，自由饮水、进食。连续灌胃30 d后，禁食24 h。眼眶采血，低温离心分离血清(4℃，3 000 r/min，10 min)，-20℃保存备用。将取血后的小鼠颈椎脱臼处死，取肝用预冷的PBS缓冲液(0.2 mol/L，pH7.4)做成肝匀浆(1.0 g湿组织加9.0 mL缓冲液)，于4℃，6 000 r/min离心10 min，分离上清，-20℃保存备用。采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD（超氧化化物岐化酶）活力(参考试剂盒说明)，二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH-px活力（谷胱甘肽过氧化物酶）(参考试剂盒说明)，硫代巴比妥酸法检测MDA

（丙二醛）含量(参考试剂盒说明)。

结果：在D-半乳糖的作用下，模型组小鼠血浆和肝脏的SOD活力显著下降，与空白对照组比，差异十分显著，说明衰老模型的复制是成功的。

色钉菇乙醇提取物低、中剂量组肝脏组织的SOD的活力均显著高于模型组(p<0.05)，但低于Vc水平；高剂量组小鼠肝脏组织中的SOD的活力超过Vc水平。色钉菇乙醇提取物各剂量组血浆和肝脏GSH-px活力均显著高于同剂量的V _C 阳性对照组(p<0.05)。色钉菇乙醇提取物各剂量组血浆和肝脏MDA含量均低于V _C 阳性对照组，说明色钉菇乙醇相有抑制MDA产生，减少细胞膜脂质过氧化的作用。

色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中粗三萜含量的测定

具体操作方法如下：

将各提取物用甲醇配成1 mg/mL的溶液，精密吸取各提取物0.5 mL分别置于具塞试管中，准确加入5%香草醛的冰醋酸溶液0.4 mL、高氯酸1.6 mL，混匀，置70℃恒温水浴中加热15 min，冷却至室温，并转移至10 mL容量瓶中加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，在560 nm波长处测定光吸收值，根据标准曲线计算各代谢提取物中粗三萜的质量，按下式求出样品粗三萜的含量：

样品粗三萜含量(%)= m/c×v，

其中：m为供试液中粗三萜总量(mg)；c为供试液的浓度(1 mg/mL)；v为供试液体积(mL)。

结果：色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中粗三萜含量分别为（%，mg/mg）：25.73、9.21、13.77。

（4）色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物总酚含量的测定

具体操作方法如下：

将各提取物用甲醇配成1 mg/mL的溶液，精密吸取各提取物1.0 mL分别置于具塞试管中，分别加入1mL Folin-酚试剂，室温放置3~4 min，再加入10% Na ₂ CO ₃ 饱和溶液1 mL，用H ₂ O稀释至10 mL，在暗处反应90 min后，在760 nm处测定其吸收值。根据标准曲线计算各提取物中总酚的百分含量。

各提取物中总酚含量(%)=m/c×v，

其中：m为供试液中总酚总量(mg)；c为供试液的浓度(1 mg/mL)；v为供试液体积(mL)。

结果：色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中总酚含量分别为（%，mg/mg）：53.4、33.92、34.02。

色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中总黄酮含量的测定

将各提取物用甲醇配成1 mg/mL的溶液，精密吸取各提取物1.0 mL分别置于具塞试管中，分别加入1 mL甲醇，再加入10%KOH溶液0.5 mL，室温放置5 min，用甲醇稀释至10 mL，在415 nm处测定其吸收值。根据标准曲线计算各提取物中总黄酮的百分含量。

各提取物中总黄酮含量(%)=m/c×v，

其中：m为供试液中黄酮总量(mg)；c为供试液的浓度(1 mg/mL)；v为供试液体积(mL)。

结果：色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中总黄酮含量分别为（%，mg/mg）：4.62、3.11、2.90。

以上实验结果表明：色钉菇的三种提取物均具有较强的抗氧化功效，含丰富的抗氧化活性物质，可做为抗氧化保健产品及药物的原料。可用于抗氧化保健产品及药品的制备。

本发明取得的有益效果如下：本发明的提取方法从色钉菇中获取了三种活性提取物，并研究了提取物抗氧化活性，在筛选的20多种大型真菌中，其抗氧化活性最强。（1）本发明成本较低，且所用方法简便、易操作。（2）本发明获得的活性提取物具有很高的抗氧化活性，为抗氧化保健产品及药物的研发提供了实用材料。（3）本发明属于纯天然活性物质的提取方法，提取过程中使用的溶剂残留少，对人无害且不会造成环境污染，属于环境友好型。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明。

实施例1 色钉菇石油醚提取物的（提取）制备方法

（1）色钉菇新鲜子实体干燥后粉碎成干粉；

（2）色钉菇子实体干粉与石油醚按质量体积比0.1~1克（g）：20毫升（mL）比例混合后，搅拌2 h，静置过夜，用抽滤和倒吸的方法吸出滤液（上层清液用倒吸法，下层用抽滤法），如此反复抽提3-5次，直到颜色非常浅，合并滤液后于40-45℃减压浓缩；

（3）将子实体粉末滤尽，烘干备用。

（4）将浓缩得到的粘稠状石油醚提取物用真空干燥箱干燥，得石油醚提取物浸膏。称重，计算产率：[产物(g)/干粉总重(g)] ×100%=5.145％。将产物置于-20℃冷冻保存备用。

实施例2 色钉菇乙酸乙酯提取物的（提取）制备方法

（1）将实施例1得到的石油醚提取后子实体粉末烘干后与乙酸乙酯以0.1~1克（g）：20毫升（mL）比例混合，搅拌2小时，静置过夜。用抽滤和倒吸的方法吸出滤液（上层清液用倒吸法，下层用抽滤法），如此反复抽提3-5次，直到颜色非常浅，合并滤液后于40-45℃减压浓缩；

（2）将子实体粉末滤尽，烘干备用。

（3）将浓缩得到的粘稠浸膏用真空干燥箱干燥，得到乙酸乙酯提取物浸膏。称重，计算产率：[产物(g)/干粉总重(g)] ×100%=4.296％。将产物置于-20℃冷冻保存备用。

实施例3 色钉菇乙醇提取物的制备方法

（1）将实施例2得到的乙酸乙酯提取后子实体粉末烘干后与乙醇按质量体积比0.1~1克（g）：20毫升（mL）比例混合，搅拌2 h，静置过夜。用抽滤和倒吸的方法吸出滤液（上层清液用倒吸法，下层用抽滤法），如此反复抽提3-5次，直到颜色非常浅，合并滤液后于40-45℃减压浓缩；

（2）将子实体粉末滤尽，烘干备用。

（3）将浓缩得到的粘稠浸膏用真空干燥箱干燥，得到乙醇提取物膏状物。称重，计算产率：[产物(g)/干粉总重(g)] ×100%=3.775％。将产物置于-20℃冷冻保存备用。

实施例4 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物清除DPPH自由基能力检测

（1）样品的制备：将色钉菇提取物用无水甲醇配置成20 mg/mL的母液，4℃保存备用。母液用无水甲醇或蒸馏水稀释为浓度是0.5 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL的样品溶液，用于清除DPPH的检测；

（2）检测方法：取2 mL不同浓度的样品溶液于试管中，再向其中加入2 mL乙醇配置的浓度为2×10 ^-4 mol/L的DPPH溶液，混合均匀，暗处反应30 min后于517 nm处测定其吸光值；同时测2 mL不同浓度样品溶液与2 mL无水乙醇的吸光值；2 mL DPPH溶液和2 mL无水甲醇的吸光值。以Vc作为阳性对照。每个实验组重复3次，按以下公式计算样品的DPPH清除率：

样品DPPH清除率(%)=[A ₀ -(Ai-Aj)]/A ₀ ×100%

其中：A ₀ 是2 mL DPPH +2 mL无水甲醇的吸光值；Ai是2 mL DPPH +2 mL样品液的吸光值；Aj是2 mL DPPH +2 mL无水乙醇的吸光值；

（3）数据处理：实验数据用Statistica 6.0进行统计分析，并用IC ₅₀ 软件计算提取物的IC ₅₀ 值。Vc、石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物的IC ₅₀ 值分别为：为0.015、0.382、0.259、1.024 mg/mL。

实施例5 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物抑制小鼠肝细胞脂质过氧化活性的检测

（1）样品的制备：将小白鼠断颈处死后，立刻取肝脏用生理盐水制成5%肝匀浆溶液。

（2）检测方法：以同浓度Vc（维生素C）、BHA（叔丁基羟基茴香醚）为阳性对照，将试管分为空白、对照1组和样品1组，置于冰水浴中预冷，之后于各管中加入鼠肝匀浆悬液200 μL，对照管和样品管中各加入1 mmol/L的FeSO ₄ 溶液50 μL和0.01 mol/L的L-Cys（半胱氨酸）溶液20 μL，样品管中分别加入不同浓度的提取物300 μL，用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH = 7.4) 补充至体积1 mL，置于37℃水浴中温育30 min，取出后立即加入20% TCA（三氯乙酸）溶液0.5 mL，5000 r/min离心10 min，取上清液1 mL，加0.67%TBA（硫代巴比妥酸）溶液1 mL，沸水浴中煮10 min，最后用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH=7.4)调零，然后于532 nm处测其吸光值，并记录数据。实验重复3次。按下面公式计算各提取物脂质过氧化抑制率(%)：

各提取物脂质过氧化抑制率(%)=[A ₀ -(A-A _b )]/A ₀ ×100%

（3）数据处理：实验数据采用Statistica 6.0进行统计分析，IC ₅₀ 软件计算提取物的IC ₅₀ 值，BHA、 Vc、石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物的脂质过氧化抑制率IC ₅₀ 值分别为：0.007、5.285、5.187、0.122、0.638 mg/mL。

实施例6 色钉菇乙醇提取物的体内抗氧化实验

方法：采用D-半乳糖衰老模型。将健康雄性昆明小鼠(体重在23-26 g)适

应性饲养7d后，随机分为衰老组(M)，空白对照组(C)，阳性对照组(X1、X2、X3)和给药组(Y1、Y2、Y3)共4组，每组12只。将色钉菇乙醇提取物、阳性对照物Vc用生理盐水配制成所需的浓度。D-半乳糖的注射量为120 mg/(kg·d)。各组处理方法如下：

空白对照组(C)：每日皮下注射等量的生理盐水。

每天灌胃小鼠1次，每次0.2 mL，连续30 d。各组均在室温(20-25℃)环境下常规饲养，自然光照12 h白天、12 h黑夜，自由饮水、进食。连续灌胃30 d后，禁食24 h。眼眶采血，低温离心分离血清(4℃，3 000 r/min，10 min)，-20℃保存备用。将取血后的小鼠颈椎脱臼处死，取肝用预冷的PBS缓冲液(0.2 mol/L，pH7.4)做成肝匀浆(1.0 g湿组织加9.0 mL缓冲液)，于4℃，6 000 r/min离心10 min，分离上清，-20℃保存备用。采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活力(参考试剂盒说明)，二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH-px活力(参考试剂盒说明)，硫代巴比妥酸法检测MDA含量(参考试剂盒说明)。

结果1：色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中SOD活性的影响

SOD在机体的氧化和抗氧化平衡过程中起着重要的作用。SOD能清除超氧阴离子(O ^2- ·)自由基，保护细胞免受损伤。色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中SOD活性的影响结果见表4。

表4 色钉菇乙醇提取物对小鼠的血清和肝组织中SOD活性影响

注：每个值均为：x±SD，n=12；字母a为与衰老模型组相比p<0.05，b为与衰老模型组相比p<0.01。

由表4可见，在D-半乳糖的作用下，模型组小鼠血浆和肝脏的SOD活力显著下降，与空白对照组比，差异十分显著，说明衰老模型的复制是成功的。Vc低剂量组血浆中SOD的活力低于模型组，但肝脏组织的SOD的活力显著高于模型组，其原因可能为低剂的Vc不能明显提高血浆中SOD的活力，但中、高剂量组血浆和肝脏组织的SOD活力均显著高于模型组(p<0.05)。低、中剂量组血浆中SOD的活力低于模型组，高剂量组显著高于模型组，但不能使血浆中的SOD的活力提高到正常水平，因此低于空白对照水平。提取物低、中剂量组肝脏组织的SOD的活力均显著高于模型组(p<0.05)，但低于Vc水平，高剂量组小鼠肝脏组织中的SOD的活力超过Vc水平。说明高剂量的色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝脏组织中SOD的活力影响显著，对清除体内的·O ₂ ^- ，维持氧化和抗氧化的平衡起到具有十分重要的作用。

结果2：色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中GSH-px活性的影响

GSH-px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中GSH-px活性的影响结果见表5。

表5 色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中GSH-px活性影响

由表5可见，模型组小鼠血浆和肝脏组织中GSH-px活力显著低于空白对照组(p<0.05)，而灌服色钉菇乙醇提取物和V _C 的各剂量组血浆和肝脏组织中GSH-px活力均高于模型组，说明色钉菇乙醇提取物和V _C 均可明显提高小鼠血浆和肝脏中GSH-px活力。同时Vc低、中剂量组的小鼠血浆和肝脏组织中GSH-px活力高于模型组，但低于空白对照组，说明中低剂量组的Vc不能使衰老小鼠中GSH-px的活力恢复到正常小鼠水平。色钉菇乙醇提取物各剂量组血浆和肝脏GSH-px活力均显著高于同剂量的V _C 阳性对照组(p<0.05)，说明低、中、高剂量的色钉菇乙醇提取物均能显著提高小鼠血浆和肝脏组织中GSH-px的活力。GSH-px 对活性氧和组织产生的·OH及H ₂ O ₂ 有较强的清除能力，可减轻脂质过氧化对机体组织的损伤，在防止畸变，预防衰老方面有非常重要的作用。

结果3：色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中MDA含量的影响

MDA是在脂质过氧化过程中产生的，因此MDA的量常常可反应机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞的损伤程度。MDA的测定常常与SOD的测定相互配合，SOD活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重度。色钉菇乙醇提取物对小鼠血清和肝组织中MDA含量的影响结果见表6。

表6 色钉菇乙醇提取物对小鼠的血清和肝组织中MDA含量影响

由表6可见，模型组小鼠血浆和肝脏中MDA含量高于空白对照组，而灌服色钉菇乙醇提取物的各剂量组血浆和肝脏MDA含量均显著低于模型组，说明色钉菇乙醇提取物均可明显降低小鼠血浆和肝脏中MDA含量。并且色钉菇乙醇提取物各剂量组血浆和肝脏MDA含量均低于V _C 阳性对照组，特别是在低剂量组时差异显著(p<0.05)，说明色钉菇乙醇提取物在降低MDA含量的效果上好于Vc。说明低、中、高剂量的色钉菇乙醇提取物均能对抗小鼠血浆和肝脏MDA含量的升高。由此表明，色钉菇乙醇相有抑制MDA产生，减少细胞膜脂质过氧化的作用。

实施例7 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中粗三萜含量的测定

(1) 标准曲线的制作

将齐墩果酸(≥98%，中药固体制剂研究中心)用甲醇配成0.2 mg/mL的标准溶液，精密吸取该液0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 mL，分别置于具塞试管中，挥去溶剂，准确加入5%香草醛的冰醋酸溶液0.4 mL、高氯酸1.6 mL，混匀，置70℃恒温水浴中加热15 min，冷却至室温，并转移至10 mL容量瓶中加乙酸乙酯稀释至刻度，摇匀，在560 nm波长处测定光吸收值，以齐墩果酸质量为横坐标（x），吸光值为纵坐标（y）做标准曲线，求出回归方程：y＝8.047x+0.0248，r＝0.9991(n=6)。

粗三萜含量测定方法

取浓度为1 mg/mL的各提取物0.5 mL，按标准曲线的测定方法，测出其在560 nm下的OD ₅₆₀ 值，根据标准曲线计算各代谢提取物中粗三萜的质量，按下式求出各提取物粗三萜的含量：

各提取物粗三萜含量(%)= m/c×v。

其中：m为供试液中粗三萜总量(mg)；c为供试液的浓度(1 mg/mL)；

v为供试液体积(mL)。

数据处理及结果：实验数据均用Statistica 6.0进行统计分析。色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中粗三萜含量分别为（%，mg/mg）：25.73、9.21、13.77。

实施例8 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物总酚含量的测定

(1) 标准曲线的制作

没食子酸(≥98%，中药固体制剂研究中心)为标准品，将没食子酸用甲醇配成0.1 mg/mL的标准溶液，精密吸取该液0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL，分别加入1mL Folin-酚试剂，室温放置3~4 min，再加入10% Na ₂ CO ₃ 饱和溶液1 mL，用H ₂ O稀释至10 mL，在暗处反应90 min后，在760 nm处测定其吸收值。以没食子酸的质量为横坐标（x），吸光值为纵坐标（y）做标准曲线，求出回归方程：y＝0.0097x+0.114，r＝0.9956(n=6)。

总酚含量的测定方法

按标准曲线的测定方法，取浓度为1 mg/mL的各提取物1 mL，测其在760 nm下的OD ₇₆₀ 值，根据标准曲线计算各提取物中总酚的百分含量。

各提取物中总酚含量(%)=m/c×v，

其中：m为供试液中总酚总量(mg)；

c为供试液的浓度(1 mg/mL)；

v为供试液体积(mL)。

数据处理及结果：实验数据均用Statistica 6.0进行统计分析。色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中总酚含量分别为（%，mg/mg）：53.4、33.92、34.02。

实施例9 色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中总黄酮含量的测定

(1)标准曲线的制作

将芦丁(≥98%，中药固体制剂研究中心)用甲醇配成0.1 mg/mL的标准溶液，精密吸取该液0、0. 5、1、1.5、2、2.5 mL，分别加入1 mL甲醇，再加入10% KOH溶液0.5 mL，室温放置5 min，用甲醇稀释至10 mL，在415 nm处测定其吸收值。以芦丁质量为横坐标（x），吸光值为纵坐标（y）做标准曲线，求出回归方程：y=3.189x+0.0063，r ² =0.9991(n=5)。

总黄酮含量的测定方法

按标准曲线的测定方法，取浓度为1 mg/mL的各提取物1 mL，测其在434 nm下的OD ₄₃₄ 值，根据标准曲线计算各提取物中总黄酮的百分含量。

各提取物中总黄酮含量(%)=m/c×v，

其中：m为供试液中黄酮总量(mg)；

c为供试液的浓度(1 mg/mL)；

v为供试液体积(mL)。

数据处理及结果：实验数据均用Statistica 6.0进行统计分析。色钉菇石油醚、乙酸乙酯、乙醇提取物中总黄酮含量分别为（%，mg/mg）：4.62、3.11、2.90。

Claims

1.一种从色钉菇中提取抗氧化活性物质的方法，其特征在于：取烘干后的色钉菇子实体干粉，与石油醚按质量体积比0.1~1克（g）：20毫升（mL）比例混合，搅拌2 h后，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3~5次，合并上清液，将合并后的上清液于40~45℃减压浓缩，然后用真空干燥箱干燥得石油醚提取物浸膏，将子实体粉末滤尽，烘干。

2.根据权利要求1所述的从色钉菇中提取抗氧化活性物质的方法，其特征在于：将石油醚提取后子实体粉末烘干后与乙酸乙酯按质量体积比0.1~1克（g）：20毫升（mL）比例混合，搅拌2 h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3~5次，合并上清液，将合并后的上清液于40~45℃减压浓缩，获得乙酸乙酯提取物浸膏，将子实体粉末滤尽，烘干。

3.根据权利要求2所述的从色钉菇中提取抗氧化活性物质的方法，其特征在于：将乙酸乙酯提取后子实体粉末烘干后与无水乙醇按质量体积比0.1~1克（g）：20毫升（mL）比例混合，搅拌2 h，静置过夜，滤纸过滤收集上清液，重复操作3~5次，合并上清液，将合并后的上清液于40~45℃减压浓缩，获得乙醇提取膏状物。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法获得的提取物的应用，其特征在于：获得的色钉菇石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、乙醇提取物做为抗氧化保健产品及药物的原料。