CN111789257A - 一种羊肚菌多糖提取物、泡腾片及其制备方法与应用 - Google Patents

一种羊肚菌多糖提取物、泡腾片及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羊肚菌多糖提取物、泡腾片及其制备方法与应用，属于功能食品领域。所述的羊肚菌多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：将羊肚菌进行低温提取、醇沉、脱色、脱蛋白、纯化、分离，即可得到羊肚菌多糖提取物。将羊肚菌多糖提取物与片剂辅料，通过粉碎、制粒、干燥整粒、总混、压片步骤，得到羊肚菌多糖泡腾片。本发明获得的羊肚菌多糖提取物除纯度高、生物活性高外，提取得率、提取效率也比传统提取方法高，且相对传统提取方法更节能。本发明将羊肚菌通过分离纯化后制备成一种功能性泡腾片，进行了系统的补肾、壮阳等实验研究，探讨其药理作用，就羊肚菌多糖在补肾壮阳保健功能的应用上具有一定的参考价值。

Description

一种羊肚菌多糖提取物、泡腾片及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种功能食品领域，特别涉及一种羊肚菌多糖提取物、泡腾片及其制备方法与应用。
背景技术
羊肚菌属珍稀的食药两用真菌，早已被收录在李时珍的《本草纲目》中，由于它的菌盖表面凹凸不平，状如羊肚，故名羊肚菌。羊肚菌具有很高的营养和药用价值，据测定，羊肚菌含的多糖、蛋白质、粗脂肪、氨基酸等多种营养成分，羊肚菌多糖是羊肚菌主要的活性成分，国际上称它为健康食品之冠，常食有益肠胃、助消化、化痰理气、补肾壮阳、补脑提神等功效，还能强身健体、预防感冒、增强人体免疫力。因而在食品、医药、保健、和化妆品等领域，极具开发和应用前景。羊肚菌的提取相对与其他食用菌，研究不多，且都是传统高温单罐提取居多。
泡腾片在我国是一种较新型的片剂，利用有机酸和碱式碳酸(氢)盐反应做泡腾崩解剂，置入水中，即刻发生泡腾反应，生成并释放大量的二氧化碳气体，具备产量大、成本低、携带与使用方便、口感好等特点，一颗泡腾片置于水中即可相当于得到一杯可口的饮液，泡腾片虽深受大众喜爱，但目前国内具备功能性的泡腾片鲜少，以食用羊肚菌为主要原料制备成功能性的泡腾片更是没有。此外，泡腾片需要很强的抗吸湿性，否则会影响泡腾效果，强抗吸湿性、可压性好的辅料等还有很大的研究空间。
中医认为，肾为先天之本、性命之根，在人体生理上有着极其重要的地位和作用。这主要是由于肾中阴阳水火元气与精血的相互依赖又相互斗争，推动人体整个生命活动。《内经》里提到“肾者，主水，受五脏六腑之精而藏之；阴精所奉其人寿血者，以奉生身，莫贵于此。”羊肚菌在补肾壮阳功能上的实验研究暂无详细报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种羊肚菌多糖提取物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的羊肚菌多糖提取物及其应用。
本发明的再一目的在于提供一种口感好，携带方便，具有补肾壮阳保健功能的含有上述羊肚菌多糖提取物的泡腾片。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：
一种羊肚菌多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：对羊肚菌进行低温提取、醇沉、脱色、脱蛋白、纯化、分离，得到羊肚菌多糖提取物；具体包括如下步骤：
(1)将羊肚菌粉末进行超声波辅助低温连续提取，得到羊肚菌多糖水提物；
(2)将步骤(1)得到的羊肚菌多糖水提物进行浓缩、醇沉、收集沉淀，得到羊肚菌多糖粗提物；
(3)将步骤(2)得到的羊肚菌多糖粗提物溶解，得到羊肚菌粗多糖溶解液；将羊肚菌粗多糖溶解液进行脱色，固液分离，得到脱色的羊肚菌粗多糖溶液；
(4)将步骤(3)得到的脱色的羊肚菌粗多糖溶液使用蛋白酶进行酶解脱蛋白，过滤，得到脱色脱蛋白的粗多糖溶液；
(5)将步骤(4)得到的脱色脱蛋白的粗多糖溶液浓缩，干燥，得到羊肚菌多糖，即为羊肚菌多糖提取物。
步骤(1)中所述的羊肚菌粉末通过如下步骤制备得到：将羊肚菌子实体干燥、粉碎，制成粗粉，过筛即得羊肚菌粉末。
所述的干燥的温度为40～60℃；优选为50℃。
所述的过筛优选为过10～40目筛；更优选为过20目筛。
步骤(1)中所述的超声波辅助低温连续提取的方法包括：通过真空泵管相互连接三个提取罐，三个提取罐分别命名为提取罐A、提取罐B和提取罐C，提取罐中含超声设备；将羊肚菌粉末物料分别置于三个提取罐；往提取罐A加入水进行提取罐A的第一次提取，得到的提取液进入贮存罐；往提取罐A加入水进行提取罐A的第二次提取，得到的提取液作为提取溶剂进入提取罐B，进行提取罐B的第一次提取，得到的提取液进入贮存罐；往提取罐A加入水进行提取罐A的第三次提取，得到的提取液进入提取罐B进行提取罐B的第二次提取，再得到的提取液进入提取罐C进行提取罐C的第一次提取，终提取液进入贮存罐；A罐排渣，重新加入羊肚菌原料；往提取罐B加入水进行提取罐B的第三次提取，得到的提取液进入提取罐C进行提取罐C的第二次提取，得到的提取液进入提取罐A进行提取罐A的第一次提取(第二罐原料)，得到的提取液进入贮存罐；B罐排渣，重新加入羊肚菌原料；往提取罐C加入水进行提取罐C的第三次提取，得到的提取液进入提取罐A进行提取罐A的第二次提取(第二罐原料)，得到的提取液作为提取溶剂进入提取罐B，进行提取罐B的第一次提取，得到的提取液进入贮存罐；C罐排渣，重新加入羊肚菌原料；以此依次循环提取，加入每罐的羊肚菌原料均提取三次。
所述的提取的条件优选为：于50～75℃条件下提取罐水浴时间为0.5～3h，期间进行超声辅助提取；优选为65℃条件下水浴1h。
所述的超声设备的功率为200～600w。
所述的第一次提取的超声波功率优选为400～600w；更优选为500w。
所述的第二次提取的功率优选为300～400w；更优选为350w。
所述的第三次提取的功率优选为200～300w；更优选为250w。
所述的第一次提取、第二次提取、第三次提取指提取罐A、B、C中的第一次提取、第二次提取、第三次提取。
所述的超声辅助提取的时间为每次提取超声10～30min；优选为每次提取超声20min。
所述的A罐第一次提取料液比优选为1︰8～10。
所述的A罐第二次提取料液比优选为1︰10～12。
所述的A罐第三次提取料液比优选为1︰12～15。
所述的B罐第三次提取料液比优选为1︰10～15；更优选为12～15。
所述的C罐第三次提取料液比优选为1︰8～15；更优选为12～15。
步骤(1)中所述的羊肚菌多糖水提物中水的总用量按照羊肚菌粉末总用量︰水的总用量为3︰40～50(g︰mL)配比计算；优选为按照羊肚菌粉末︰水为3︰44(g︰mL)配比计算。
步骤(2)中所述的浓缩优选为真空浓缩。
所述的真空浓缩的条件优选为：真空度-0.06～0.10MPa、温度为50～70℃；更优选为-0.08MPa、65℃。
步骤(2)中所述的浓缩的程度优选为浓缩至密度为1.18～1.28g/mL的稠浸膏；更优选为浓缩至密度为1.20～1.23g/mL。
步骤(2)中所述的醇沉中的醇优选为乙醇；优选为95％(v/v)的乙醇溶液。
所述的乙醇的用量优选按照醇在醇沉体系中的体积占比70％～85％计算；优选按醇在醇沉体系中的体积占比75％计算。
步骤(2)中所述的醇沉的时间优选为8～14h；更优选为10h。
步骤(2)中所述的收集沉淀的方式优选离心；所述的离心的条件为：2000～5000rpm离心10～20min；更优选为4000rpm离心15min。
步骤(3)中所述的溶解的溶剂优选为水；更优选为纯化水。
步骤(3)中所述的羊肚菌粗多糖溶解液中，羊肚菌多糖粗提物与溶剂按体积比1︰4～6计算；优选按体积比1︰5计算。
步骤(3)中所述的脱色为通过大孔树脂进行脱色。
所述的大孔树脂优选为食品级D315大孔树脂。
所述的大孔树脂的用量按相当于羊肚菌粗多糖溶解液的1/3～1/2体积计算。
所述的脱色优选在搅拌状态下进行。
所述的脱色的条件优选为200～400rpm搅拌2～4h；更优选为300rpm搅拌3h。
步骤(4)中所述的蛋白酶优选包括胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的至少一种；更优选为木瓜蛋白酶。
当所述的蛋白酶为胰蛋白酶时，调整pH值至6～8；优选为调整pH值至7.0。
当所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶时，调整pH值至4～6；优选为调整pH值至5.5。
当所述的蛋白酶为菠萝蛋白酶时，调整pH值至6～8；优选为调整pH值至6.5。
所述的胰蛋白酶的用量为10～25U/mg；优选为15U/mg。
所述的木瓜蛋白酶的用量为10～25U/mg；优选为20U/mg。
所述的菠萝蛋白酶的用量为10～25U/mg；优选为20U/mg。
步骤(4)中所述的酶解脱蛋白的温度优选为50～65℃；更优选为55℃。
步骤(4)中所述的酶解脱蛋白的时间优选为1～3h；更优选为2h。
步骤(5)中所述的浓缩优选为真空浓缩。
所述的真空浓缩的条件优选为：真空度-0.06～-0.10MPa、温度为50～70℃；更优选为-0.08MPa、65℃。
步骤(5)中所述的干燥优选为冷冻干燥。
一种羊肚菌多糖提取物，通过上述制备方法制备得到。
所述的羊肚菌多糖提取物在制备补肾壮阳保健功能制剂中的应用。
一种补肾壮阳保健功能制剂，包括辅料和上述羊肚菌多糖提取物。
所述的辅料用于辅助将上述羊肚菌多糖提取物制成不同的剂量，优选包括但不限于片剂。
所述的片剂优选为泡腾片。
一种含羊肚菌多糖提取物的泡腾片，包括A组分、甜味剂和润滑剂；A组分由组下按质量份数计的成分组成：羊肚菌多糖提取物220～300份、柠檬酸260～320份、碳酸氢钠160～200份、蔗糖180～240份、异麦芽酮糖醇200～290份；甜味剂的含量为A组分质量的0～1.0％，润滑剂的含量为A组分质量的0～0.7％。
所述的甜味剂优选为三氯蔗糖。
所述的甜味剂的含量优选为A组分质量的0.5％～1.0％；更优选为A组分质量的0.7％。
所述的润滑剂优选为硬脂酸镁。
所述的润滑剂的含量优选为A组分质量的0.2％～0.7％；更优选为A组分质量的0.5％。
所述的含羊肚菌多糖提取物的泡腾片的制备方法，包括如下步骤：
(Ⅰ)将粉碎过筛后的甜味剂、柠檬酸、蔗糖和异麦芽酮糖醇混合，加入润湿剂制备成湿颗粒A；将羊肚菌多糖与碳酸氢钠混合，加入润湿剂制备成湿颗粒B；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)得到的湿颗粒A和湿颗粒B分别进行干燥、整粒处理，得到两种干颗粒；
(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)得到的两种干颗粒与润滑剂混合，得到总混合物；
(Ⅳ)将步骤(Ⅲ)得到的总混合物压片，得到含羊肚菌多糖提取物的泡腾片。
所述的润湿剂优选为50％(v/v)乙醇溶液。
所述的润湿剂用量优选按润湿剂︰所需润湿物料＝0.2～0.3mL︰1g计算；更优选按润湿剂︰所需润湿物料＝0.25mL︰1g计算。
步骤(Ⅰ)中所述的柠檬酸、蔗糖在粉碎过筛前还需要进行干燥处理。
所述的干燥的温度为55～60℃。
所述的干燥的程度为：柠檬酸、蔗糖的水分含量干燥至2％以下。
步骤(Ⅰ)中所述的过筛是指过60～100目筛；优选过80目筛。
步骤(Ⅰ)中所述的混合的设备优选为高速混合湿法制粒机。
所述的高速混合湿法制粒机的调节压力为0.4Mpa。
所述的高速混合湿法制粒机的搅拌桨转速为150～250rpm；优选为210rpm。
所述的高速混合湿法制粒机的切碎转速为1000～1600rpm；优选1400rpm。
步骤(Ⅱ)中所述的干燥的设备为柜式烘干箱。
步骤(Ⅱ)中所述的干燥的温度为50～65℃；优选为60℃。
步骤(Ⅱ)中所述的干燥的程度优选为：干燥至水分含量不高于3％。
步骤(Ⅱ)中所述的整粒的设备优选为摇摆式制粒机。
步骤(Ⅱ)中所述的整粒的目数优选为20目。
步骤(Ⅲ)中所述的混合的设备优选为三维混合机。
步骤(Ⅲ)中所述的混合的条件优选为：以24r/min的主轴转速混合15～25min；更优选为24r/min的主轴转速混合20min。
步骤(Ⅳ)中所述的压片的设备优选为全自动压片机。
步骤(Ⅳ)中所述的压片的片重优选为2.4g/片。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明将羊肚菌进行低温提取、醇沉、脱色、脱蛋白、纯化、分离，即可得到羊肚菌多糖提取物，获得的羊肚菌多糖提取物除纯度高、生物活性高外，提取得率、提取效率也比传统提取方法高，且相对传统提取方法更节能。
2.本发明将羊肚菌多糖提取物与片剂辅料，通过粉碎、制粒、整理、总混、压片步骤，即可得到羊肚菌多糖泡腾片。羊肚菌多糖泡腾片在剂型上新颖，市面上以羊肚菌为原料的产品暂无该剂型，制备技术简单，工艺稳定，适合于大规模生产。
3.在制备过程中，采用异麦芽酮糖醇作为主要成型剂，取代常用的较好的片剂辅料D-甘露醇、乳糖和部分的蔗糖等，针对具有高吸潮性的提取物原料，能有效防止压片过程中的吸潮结块，压出的片硬度适中、耐磨性好，压片无粘冲。且降低糖含量，产品更健康安全。
4.所制得的羊肚菌多糖提取物泡腾片口感好，携带方便，食用简单，原辅料安全性高，可长期服用。
5.本发明将羊肚菌通过分离纯化后制备成一种功能性泡腾片，进行了系统的补肾、壮阳等实验研究，探讨其药理作用，就羊肚菌多糖在补肾壮阳保健功能的应用上具有一定的参考价值。
附图说明
图1为不同脱蛋白酶对脱色的羊肚菌粗多糖溶液的脱蛋白效果结果图。
图2为不同提取方法制备的羊肚菌多糖提取物对羟基自由基消除能力结果图。
图3为不同提取方法制备的羊肚菌多糖提取物对DPPH自由基消除能力结果图。
图4为不同含羊肚菌多糖提取物的泡腾片的吸湿动力学曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1羊肚菌多糖提取物的制备
(1)选取云南省玉溪市的野生羊肚菌子实体，50℃烘干至恒重，粉碎成粗粉，过20目筛，得到大小均匀的羊肚菌颗粒。
(2)分别称取1质量份羊肚菌粉末置于A、B、C罐(A、B、C罐各批次的提取条件均为：65℃条件下水浴1h)中，A、B、C提取罐由真空泵管相互连接，其中，提取罐中含有超声设备(A、B、C罐中第一次提取、第二次提取和第三次提取的功率分别为500w，350w和250w，每次提取开始时超声，时间为20min)。加入每罐的羊肚菌原料均提取三次，每罐的羊肚菌原料在第一次提取得到的提取液就进入贮存罐，第二次提取和第三次提取得到的提取液作为下一罐的提取溶剂，以此为原则进行循环提取。具体的步骤如下：
1)本申请所述的超声辅助低温提取，其中羊肚菌多糖水提物中，羊肚菌粉末总用量︰水的总用量为3︰40配比组。
A、以1︰8的料液比(g︰mL，提取溶剂为纯化水；下同)经A罐第一轮第一次提取后，提取液进入贮存罐。
B、以1︰10的料液比(g︰mL，提取溶剂为纯化水)经A罐第一轮第二次提取后提取液进入B罐，经B罐进行第一轮第一次提取，提取液进入贮存罐。
C、以1︰12的料液比加水于A罐进行第一轮第三次提取后，提取液进入B罐，进行B罐的第一轮第二次提取，提取液再进入C罐，进行C罐的第一轮第一次提取，终提取液进入贮存罐。
D、A罐排渣，重新加入1质量份羊肚菌原料。
E、以1︰12的料液比加水入B罐进行第一轮第三次提取，提取液进入C罐，进行C罐的第一轮第二次提取，得到的提取液进入罐A第二轮的第一次提取(第二罐羊肚菌原料)，得到的提取液进入贮存罐。
F、B罐排渣，重新加入1质量份羊肚菌原料。
G、以1︰12的料液比加水入C罐进行C罐的第一轮第三次提取，得到的提取液进入A罐进行第二轮第二次提取，得到的提取液作为提取溶剂进入B罐，进行B罐第二轮的第一次提取，得到的提取液进入贮存罐。
H、C罐排渣，重新加入羊肚菌原料。
I、以1︰12的料液比往A罐加入水进行A罐第二轮的第三次提取，得到的提取液进入B罐，进行B罐第二轮的第二次提取，得到的提取液进入C罐，进行C罐第二轮的第一次提取，得到的提取液进入贮存罐。
J、A罐排渣，重新加入羊肚菌原料。
K、以1︰12的料液比加水入B罐进行第二轮第三次提取，提取液进入C罐，进行C罐的第二轮第二次提取，得到的提取液进入A罐第三轮的第一次提取(第三罐羊肚菌原料)，得到的提取液进入贮存罐。
L、B罐排渣，重新加入1质量份羊肚菌原料。
M、以1︰12的料液比加水入C罐进行第二轮的第三次提取，得到的提取液进入A罐进行第三轮的第二次提取，得到的提取液作为提取溶剂进入B罐，进行B罐第三轮的第一次提取，得到的提取液进入贮存罐。
N、C罐排渣，重新加入羊肚菌原料。
O、以1︰12的料液比往A罐加入水进行第三轮的第三次提取，得到的提取液进入B罐，进行B罐第三轮的第二次提取，得到的提取液进入C罐，进行C罐第三轮的第一次提取，得到的提取液进入贮存罐。
P、以1︰10的料液比加水入B罐进行第三轮第三次提取，提取液进入C罐，进行C罐的第三轮第二次提取，得到的提取液进入贮存罐。
Q、以1︰8的料液比加水入C罐进行第三轮的第三次提取，得到的提取液进入贮存罐。
本实施例是三轮循环，在步骤Q时即将结束循环，加入的水的量适当减少；若是继续循环，则按步骤C-O循环。
2)本申请所述的超声辅助低温提取，其中羊肚菌多糖水提物中，羊肚菌粉末总用量︰水的总用量为3︰44配比组。
步骤基本同1)组，区别仅在于水的加入量不同，水在不同步骤中的用量具体如下：
A(1︰9)、B(1︰11)、C(1︰13)、E(1︰13)、G(1︰13)、I(1︰13)、K(1︰13)、M(1︰13)、O(1︰13)、P(1︰11)、Q(1︰9)。
3)本申请所述的超声辅助低温提取，其中羊肚菌多糖水提物中，羊肚菌粉末总用量︰水的总用量为3︰50配比组。
步骤基本同1)组，区别仅在于水的加入量不同，水在不同步骤中的用量具体如下：
A(1︰10)、B(1︰12)、C(1︰15)、E(1︰15)、G(1︰15)、I(1︰15)、K(1︰15)、M(1︰15)、O(1︰15)、P(1︰12)、Q(1︰10)。
(3)向步骤(2)得到的羊肚菌水提物进行真空浓缩至密度为1.20～1.23g/mL，真空度为-0.08MPa、温度为65℃。向浓缩液中加入95％(v/v)的乙醇溶液，使乙醇浓度达到75％(v/v)，静置10h，4000rpm离心15min，收集沉淀，得到多糖粗提物。
(4)将步骤(3)得到的羊肚菌多糖粗提物采用相当于羊肚菌多糖粗提物5倍体积的纯化水溶解，得到羊肚菌粗多糖溶解液，然后加入1/3羊肚菌粗多糖溶解液体积的食品级D315大孔树脂，使用磁力搅拌器搅拌(300rpm、3h)过滤，固液分离，得到脱色的羊肚菌粗多糖溶液。
(5)将步骤(4)得到的脱色的羊肚菌粗多糖溶液，分成三组，分别加入胰蛋白酶(pH值7.0、酶用量15U/mg)、木瓜蛋白酶(pH值5.5、酶用量20U/mg)，菠萝蛋白酶(pH值6.5、酶用量20U/mg)，55℃条件下脱蛋白2h，然后通过苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝G-250法分别测定多糖损失率、蛋白质脱除率。分别采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶酶解之后，测定结果见图1。该结果表明：3种蛋白酶均具有较好的脱蛋白效果，其中，木瓜蛋白酶脱蛋白更高效、损失更小，即效果更优。
(6)将步骤(5)中得到的脱水脱蛋白的多糖溶液于-0.08MPa、65℃条件下进行真空浓缩成稠浸膏后进行冷冻干燥，制得羊肚菌多糖。测定多糖含量，多糖得率，计算溶剂使用量、耗时耗能，同时以传统高温提取方法制备得到的羊肚菌多糖的上述指标作对照；其中，传统高温提取羊肚菌多糖的方法为蒸煮法、三次间歇式提取，三次提取的料液比分别为1︰10、1︰8、1︰6。本实施例所述的传统高温提取羊肚菌多糖的方法为蒸煮法(即表1中的传统高温提取)，其中：蒸煮温度100℃，耗时23h，羊肚菌粉末与水的料液比为1︰24，结果如表1所示。
上述指标测定结果见表1。其中：
Figure BDA0002616899440000081
Figure BDA0002616899440000082
表1
Figure BDA0002616899440000083
结果表明：采用超声辅助低温提取(即低温连续提取)方法，较传统高温提取方法，得到的提取物得率高，多糖含量高，耗时少，降低能耗。
实施例2羊肚菌多糖抗氧化性测定
将实施例1分别经传统高温提取和超声辅助低温提取料液比3︰44条件下得到的羊肚菌多糖制备成0.2mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml一系列浓度的溶液(样品溶液)。
(1)羟基自由基清除能力
参考聂健等《7种不同来源灵芝热水提物体外抗氧化活性研究》中的测定方法并稍加改良。准确吸取不同浓度的样品溶液1mL，分别加入1mL 6mmol/L FeSO4溶液和1mL6mmol/L H2O2溶液摇匀，静置10min，再加入1mL 6mmol/L水杨酸溶液，摇匀，静置30min后，对照组以蒸馏水代替水杨酸，空白组用蒸馏水做参比代替样品，用紫外分光光度计于510nm处测吸光度。计算羟基自由基清除率计算公式：
Figure BDA0002616899440000091
其中：A空白为空白组吸光度(蒸馏水代替样品溶液)；
A样品为加入样品液的吸光度值；
A对照为对照组的吸光度值。
(2)DPPH自由基清除能力
参考Ma等《Optimization for the extraction of polysaccharides fromGanoderma lucidum and their antioxidant and antiproliferative activities》的方法并稍加以改良。吸取2mL多糖溶液，加入2mL浓度为0.2mmol的DPPH溶液，混匀，暗处反应30min，517nm测定吸光度。对照组用无水乙醇代替DPPH，空白组用蒸馏水代替多糖溶液。DPPH自由基清除率计算公式：
Figure BDA0002616899440000092
A空白为空白组吸光度(蒸馏水代替样品溶液)；
A样品为加入样品液的吸光度值；
A对照为对照组的吸光度值。
采用低温连续提取与传统高温提取的提取物在不同浓度下的羟基自由基消除率和DPPH自由基清除率分别如图2和图3所示。结果表明，实施例1中低温连续提取获得的提取物其抗氧化能力高于对照组传统高温提取获得的提取物。
实施例3含羊肚菌多糖提取物的泡腾片的制备
(1)各原料按照表2中的质量份数加入制备含羊肚菌多糖提取物的泡腾片。
表2(单位为质量份)
Figure BDA0002616899440000093
Figure BDA0002616899440000101
制备方法：将粉碎过筛(过80目筛)后的柠檬酸(水分含量低于2％)、蔗糖(水分含量低于2％)和异麦芽酮糖醇、三氯蔗糖置于高速湿法制粒机(调节压力0.4Mpa、搅拌桨转速210rpm、切碎速度1400rpm)混合，加湿润剂(50％(v/v)乙醇溶液)，润湿剂的用量按湿润剂(mL)∶柠檬酸+蔗糖+异麦芽酮糖醇和三氯蔗糖混合物(g)＝0.25:1计算，制成湿颗粒。将羊肚菌多糖与碳酸氢钠高速湿法制粒机混合(调节压力0.4Mpa、搅拌桨转速210rpm、切碎速度1400rpm)，加湿润剂(50％(v/v)乙醇溶液)，润湿剂的用量按湿润剂(mL)∶碳酸氢钠+羊肚菌多糖混合物(g)＝0.25:1计算，制成湿颗粒。将两组湿颗粒分别置于柜式烘干箱干燥(60℃干燥至水分含量不高于3％)，摇摆式制粒机进行整粒(目数为20目)。将两组干颗粒与润滑剂硬脂酸镁倒入三维混合机混合(主轴转速24r/min混合20min)，得到总混合物，全自动压片机压片，片重为2.4g/片，得到含羊肚菌多糖提取物的泡腾片，也可根据需要调整片重。
泡腾片1～3和对照1～3含羊肚菌多糖提取物的泡腾片性能测试：
1.吸湿性测定
参考朱裕林等《乳糖和甘露醇对骨疏灵颗粒吸湿性的影响》中的研究方法做参考。精密称取须考察的样品约2g平摊于干燥至恒质量的称量瓶中，开盖置于干燥器中12h以上达到脱湿平衡，备用。在25℃条件下，将过饱和NaCl溶液放置干燥器底部48小时，使其内部恒定相对湿度为75％。将装有样品的称量瓶精密称定质量后置于上述干燥器中(称量瓶盖打开)，于4h、8h、12h、24h、48h、72h后取出，将称量瓶盖严，精密称量称量瓶和样品的质量。每个样品平行做3份取平均值，计算吸湿百分率。以时间为横坐标，吸湿百分率为纵坐标，绘制吸湿动力学曲线见图4。
吸湿百分率按以下公式计算：吸湿百分率＝[(吸湿后样品的质量-吸湿前样品的质量)/吸湿前样品的质量]×100％。
2.脆碎度检查
按《中国药典》第四部，通则“片剂”脆碎度检测法。取泡腾片10片，用吹风机吹去片剂脱落的粉末，精密称重，置片剂四用测定仪(济南鑫贝西生物技术有限公司)圆筒中，转动4min。取出，同法除去粉末，精密称重，减失重量不得过1％，且不得检出断裂、龟裂及粉碎的片。本试验一般仅作1次。如减失重超过1％时，应复测2次，3次的平均减失重量不得过1％，并不得检出断裂、龟裂及粉碎的片。
3.硬度检查
按《中国药典》第四部，通则“片剂”硬度检测法。将药片径向固定在片剂四用测定仪(济南鑫贝西生物技术有限公司)硬度测定的两横杆之间，其中的活动柱杆借助弹簧沿水平方向对片剂径向加压，当片剂破碎时，活动杆的弹簧停止加压，仪器刻度盘所指示的压力即为片的硬度。测定3片，取平均值。对于泡腾片保存和运输有硬度要求：要求在泡腾性合格的情况下硬度越高越好。制备与测试结果见表3。
表3
样品 是否粘冲 脆碎度(％) 硬度(N)
泡腾片1 无粘冲 0.39 44.78
泡腾片2 无粘冲 0.41 42.65
泡腾片3 无粘冲 0.42 40.67
对照1 轻微粘冲 0.83 32.69
对照2 轻微粘冲 0.78 29.58
对照3 粘冲 1.04 20.57
从以上结果可知：添加了异麦芽酮糖醇的泡腾片1～3抗吸湿性好，其颗粒的抗吸湿性略优于单一辅料蔗糖与D-甘露醇或乳糖取代异麦芽酮糖醇的对照组合，更有利于贮存与产品的泡腾起泡性；泡腾片1～3的配方组合在制备过程中不粘冲，压出的片硬度更高，不易裂片，脆碎度低，不易掉粉，因此添加了异麦芽酮糖醇的泡腾片1～3可压性优于对照组合。
对泡腾片1～3的感官、泡腾状态与泡腾后饮液的口感等产品指标进行评价，结果见表4：
表4泡腾片产品指标评价
Figure BDA0002616899440000111
实施例4补肾壮阳功能实验
采用实施例3制备的含羊肚菌多糖提取物的泡腾片2开展补肾壮阳功能实验。
(一)给样剂量
成人正常每天服用量为2.4g(1片)，以60公斤计，给药剂量设计见表5。
表5：按体重等效换算小鼠的给样剂量
Figure BDA0002616899440000112
Figure BDA0002616899440000121
KM小鼠，雄性和雌性，购于中山大学实验动物中心。
SD大鼠，雄性，购于中山大学实验动物中心。
龟鹿补肾丸，广州市花城制药厂，国药准字Z44020148。
(二)受试样品对小鼠捕捉率影响实验
选取健康KM鼠40只雄性小鼠和40只雌性小鼠；将40只雄性小鼠随机分组，分别为空白对照组、样品低、中、高剂量组，每组10只小鼠，整个实验过程雄性小鼠处于独居状态。实验组给予受试样品，剂量见表5所示；空白对照组给予纯净水，每日一次，连续灌胃给药10d。末次给药45min后，在每只独居雄鼠笼中放入一只雌鼠(经过阴道涂片检定为发情期)，随即观察1h，记录其捕捉雌鼠的捕捉潜伏期、捕捉次数，计算各组的捕捉率，将以上结果进行统计学处理并比较组间差异。
Figure BDA0002616899440000122
Figure BDA0002616899440000123
(三)受试样品对小鼠受孕影响实验
选取健康KM鼠40只雄性小鼠和40只雌性小鼠；将40只雄性小鼠随机分组，分别为空白对照组、样品低、中、高剂量组，每组10只小鼠，整个实验过程雄性小鼠处于独居状态。实验组给予受试样品，剂量见表5所示；空白对照组给予纯净水，每日一次，连续灌胃给药10d。于末次给药后，将雄鼠1只与具有生殖能力的1只雌鼠(经阴道涂片为发情期)合笼，合笼后第2日检查雌性小鼠阴道是否有阴栓或者阴道涂片镜检，能检出精子者即为受孕鼠，记录受孕鼠；连续5天记录受孕鼠数量，将以上结果进行统计学处理并比较组间差异。
(四)受试样品对大鼠阴茎勃起实验
选取健康SD雄性大鼠54只，其中10只做假手术组(正常对照组)，不摘除双侧睾丸，仅打开皮肤后缝合，其余雄性大鼠均用10％水合氯醛生理盐水腹腔注射麻醉，用75％酒精消毒阴囊皮肤，摘除双侧睾丸，随机分为5组，样品低、中、高剂量组，模型对照组以及阳性药龟鹿补肾丸对照组，龟鹿补肾丸对照组4只大鼠，其余每组10只大鼠。大鼠于术后肌注射青霉素2万单位/kg，抗生素处理3天。
各组动物每天口服灌胃给予受试药物，假手术组、模型对照组给予等体积的纯净水，其余各组大鼠按表5的剂量进行给药。给药30天后，对各组大鼠进行阴茎电刺激实验，将JL-B型电刺激器的电极置于大鼠阴茎部位，刺激参数：电压50V，频率30Hz，波宽0.2ms，幅度1，给予局部电刺激，记录从刺激开始至阴茎勃起时间，即勃起潜伏期。实验结束后禁食12小时，摘眼取血，制备血清用于Zn含量的检测。处死立即取阴茎制备组织匀浆，用于阴茎组织总一氧化氮合酶的测定。分离前列腺腹叶、精囊腺、提肛肌，称重并计算相关指数。将阴茎勃起潜伏期及相关指数进行统计学处理并比较组间差异。
实施例结果：
(一)受试样品对小鼠捕捉率实验结果
样品中、高剂量小鼠的捕捉潜伏期明显缩短，与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P<0.05、P<0.001)；同时，样品的中、高剂量组能够增加小鼠1h内对雌鼠的捕捉次数，与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P<0.01、P<0.001)(见表6)。以上提示受试样品对壮阳具有一定的促进作用。
表6：受试样品对小鼠捕捉率实验结果(
Figure BDA0002616899440000131
n＝10)
Figure BDA0002616899440000132
注：与空白对照组相比**p<0.01，***p<0.001(t检验)。
(二)受试样品对小鼠受孕实验结果
每组独居小鼠每日放入一只动情期雌鼠过夜后，各给药组的受孕雌鼠数量明显增加(见表7)。样品中、高剂量雌鼠受孕总数与受孕率与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P<0.01、P<0.001)。提示受试样品对壮阳具有一定的促进作用。
表7：受试样品对小鼠捕捉率实验结果(
Figure BDA0002616899440000133
n＝10)
Figure BDA0002616899440000134
注：与空白对照组相比**p<0.01，***p<0.001(X2检验)。
(三)受试样品对大鼠阴茎勃起实验结果
除假手术组外，其余各组大鼠进行摘除睾丸手术，术后各组大鼠恢复良好，给药30d后测定阴茎勃起时间即阴茎勃起潜伏期的结果(见表8)、血清锌以及阴茎匀浆测定NOS的结果(见表9)及大鼠处死后性器官称重并计算内脏指数结果(见表10)；其中，血清锌采用火焰原子吸收分光光度法测定，波长为213.9nm；阴茎NOS采用阴茎组织匀浆测定总一氧化氮合酶NOS活性。
表8：受试样品对大鼠阴茎勃起潜伏期的实验结果(
Figure BDA0002616899440000141
n＝10)
Figure BDA0002616899440000142
注：与模型对照组相比*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(t检验)。
由表8可得，模型对照组大鼠的阴茎勃起潜伏期明显延长，与同期正常对照组相比，具有显著性差异(P<0.001)，提示大鼠摘除睾丸后，其性功能明显被抑制。样品中剂量和高剂量均能明显缩短大鼠的阴茎勃起潜伏期，与同期模型对照组相比，具有显著性差异(P<0.05、P<0.01、P<0.001)，提示两种样品对大鼠的性功能具有一定的调节作用。阳性药龟鹿补肾丸能够明显地缩短大鼠阴茎勃起潜伏期，与同期模型对照组相比，具有显著性差异(P<0.001)，提示其具有一定的壮阳作用，与其临床作用效果相符合。
表9：受试样品对大鼠血清锌和阴茎匀浆测定NOS的实验结果(
Figure BDA0002616899440000143
n＝10)
Figure BDA0002616899440000144
注：与模型对照组相比*p<0.05,**p<0.01(t检验)。
由表9可得，正常对照组与模型对照组大鼠的血清锌水平相近，两者间无显著性差异(P>0.05)，提示大鼠摘除睾丸后一个月内对血清锌离子水平影响有限。两种受试样品的血清锌水平或高或低，但与同期模型对照组相比，均无显著性差异(P>0.05)，此为动物的个体差异。从阴茎组织匀浆测定总一氧化氮合酶NOS活性结果可得，正常对照组大鼠的NOS水平升高，与同期模型对照组相比，具有显著性差异(P<0.05)，提示摘除睾丸导致大鼠肾阳虚后，影响了NOS的活力。样品高剂量均能明显提高NOS活力，与同期模型对照组相比，具有显著性差异(P<0.05、P<0.01)，提示样品对去势大鼠的性功能具有一定的调节作用。阳性药龟鹿补肾丸能够明显地升高阴茎NOS活力，与同期模型对照组相比，具有显著性差异(P<0.05)，提示其具有一定的壮阳作用，与其临床作用效果相符合。
表10：受试样品对摘除睾丸致肾阳虚大鼠的性器官脏器指数实验结果(
Figure BDA0002616899440000151
n＝10)
Figure BDA0002616899440000152
与模型对照组相比*p<0.05,**p<0.01(t检验)。
由表10实验结果可得，模型对照组大鼠前列腺腹叶、精囊腺、提肛肌以及包皮腺均出现不同程度的萎缩，与同期正常对照组相比，具有显著性差异(P<0.05、P<0.01)；提示摘除睾丸后大鼠的雄性激素水平明显降低，性器官出现了萎缩。给药30d后，样品的中剂量和高剂量均能够明显增加大鼠的性器官指数，与同期模型对照组相比，具有显著性差异(P<0.05、P<0.01)，提示样品均对去势大鼠具有一定的类激素样作用。阳性药龟鹿补肾丸前列腺腹叶、提肛肌与包皮腺指数均较高，与同期模型对照组相比，具有显著性差异(P<0.05)，提示其具有一定的类激素样作用，与其临床作用效果相符合。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种羊肚菌多糖提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：对羊肚菌进行低温提取、醇沉、脱色、脱蛋白、纯化、分离，得到羊肚菌多糖提取物；具体包括如下步骤：
(1)将羊肚菌粉末进行超声波辅助低温连续提取，得到羊肚菌多糖水提物；
(2)将步骤(1)得到的羊肚菌多糖水提物进行浓缩、醇沉、收集沉淀，得到羊肚菌多糖粗提物；
(3)将步骤(2)得到的羊肚菌多糖粗提物溶解，得到羊肚菌粗多糖溶解液；将羊肚菌粗多糖溶解液进行脱色，固液分离，得到脱色的羊肚菌粗多糖溶液；
(4)将步骤(3)得到的脱色的羊肚菌粗多糖溶液使用蛋白酶进行酶解脱蛋白，过滤，得到脱色脱蛋白的粗多糖溶液；
(5)将步骤(4)得到的脱色脱蛋白的粗多糖溶液浓缩，干燥，得到羊肚菌多糖，即为羊肚菌多糖提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的超声波辅助低温连续提取的方法包括：通过真空泵管相互连接三个提取罐，三个提取罐分别命名为提取罐A、提取罐B和提取罐C，提取罐中含超声设备；将羊肚菌粉末物料分别置于三个提取罐；往提取罐A加入水进行提取罐A的第一次提取，得到的提取液进入贮存罐；往提取罐A加入水进行提取罐A的第二次提取，得到的提取液作为提取溶剂进入提取罐B，进行提取罐B的第一次提取，得到的提取液进入贮存罐；往提取罐A加入水进行提取罐A的第三次提取，得到的提取液进入提取罐B进行提取罐B的第二次提取，再得到的提取液进入提取罐C进行提取罐C的第一次提取，终提取液进入贮存罐；A罐排渣，重新加入羊肚菌原料；往提取罐B加入水进行提取罐B的第三次提取，得到的提取液进入提取罐C进行提取罐C的第二次提取，得到的提取液进入提取罐A进行提取罐A第二罐原料的第一次提取，得到的提取液进入贮存罐；B罐排渣，重新加入羊肚菌原料，往提取罐C加入水进行提取罐C的第三次提取，得到的提取液进入提取罐A进行提取罐A第二罐原料的第二次提取，得到的提取液作为提取溶剂进入提取罐B，进行提取罐B的第一次提取，得到的提取液进入贮存罐；C罐排渣，重新加入羊肚菌原料；以此依次循环提取，加入每罐的羊肚菌原料均提取三次。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的提取的条件为：于50～75℃条件下提取罐水浴时间为0.5～3h，期间进行超声辅助提取；
所述的超声设备的功率为200～600w；
所述的第一次提取的超声波功率为400～600w；
所述的第二次提取的功率为300～400w；
所述的第三次提取的功率为200～300w；
所述的超声辅助提取的时间为每次提取超声10～30min；
步骤(1)中所述的羊肚菌多糖水提物中水的总用量按照羊肚菌粉末总用量g︰水的总用量mL为3︰40～50配比计算；
步骤(3)中所述的羊肚菌粗多糖溶解液中，羊肚菌多糖粗提物与溶剂按体积比1︰4～6计算；
步骤(4)中所述的蛋白酶包括胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶中的至少一种；
当所述的蛋白酶为胰蛋白酶时，调整pH值至6～8；
当所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶时，调整pH值至4～6；
当所述的蛋白酶为菠萝蛋白酶时，调整pH值至6～8；
所述的胰蛋白酶的用量为10～25U/mg；
所述的木瓜蛋白酶的用量为10～25U/mg；
所述的菠萝蛋白酶的用量为10～25U/mg；
步骤(4)中所述的酶解脱蛋白的温度为50～65℃；
步骤(4)中所述的酶解脱蛋白的时间为1～3h。
4.一种羊肚菌多糖提取物，其特征在于，通过权利要求1～3任一所述的制备方法制备得到。
5.权利要求4所述的羊肚菌多糖提取物在制备补肾壮阳保健功能制剂中的应用。
6.一种补肾壮阳保健功能制剂，其特征在于，包括辅料和权利要求4所述的羊肚菌多糖提取物。
7.一种含羊肚菌多糖提取物的泡腾片，其特征在于，包括A组分、甜味剂和润滑剂；A组分由组下按质量份数计的成分组成：羊肚菌多糖提取物220～300份、柠檬酸260～320份、碳酸氢钠160～200份、蔗糖180～240份、异麦芽酮糖醇200～290份；甜味剂的含量为A组分质量的0～1.0％，润滑剂的含量为A组分质量的0～0.7％。
8.根据权利要求7所述的含羊肚菌多糖提取物的泡腾片，其特征在于，所述的甜味剂为三氯蔗糖；
所述的润滑剂为硬脂酸镁。
9.根据权利要求7所述的含羊肚菌多糖提取物的泡腾片，其特征在于，所述的甜味剂的含量为A组分质量的0.5％～1.0％；
所述的润滑剂的含量为A组分质量的0.2％～0.7％。
10.权利要求7～9任一所述的含羊肚菌多糖提取物的泡腾片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(Ⅰ)将粉碎过筛后的甜味剂、柠檬酸、蔗糖和异麦芽酮糖醇混合，加入润湿剂制备成湿颗粒A；将羊肚菌多糖与碳酸氢钠混合，加入润湿剂制备成湿颗粒B；
(Ⅱ)将步骤(Ⅰ)得到的湿颗粒A和湿颗粒B分别进行干燥、整粒处理，得到两种干颗粒；
(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)得到的两种干颗粒与润滑剂混合，得到总混合物；
(Ⅳ)将步骤(Ⅲ)得到的总混合物压片，得到含羊肚菌多糖提取物的泡腾片；
其中，所述的润湿剂为50％(v/v)乙醇溶液；
所述的润湿剂用量按润湿剂︰所需润湿物料＝0.2～0.3mL︰1g计算。
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