CN113332317B - 一种羊肚菌提取物的提取方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羊肚菌提取物的提取方法，具体包括如下步骤：步骤1，制备羊肚菌粉末；步骤2，将步骤1所得产物与生理盐水混合均匀，制备羊肚菌混合物；步骤3，向步骤2得到的羊肚菌混合物中加入酸性溶液，然后向溶液中加入胃蛋白酶溶液，得到羊肚菌体外模拟胃消化物；步骤4，向步骤3所得羊肚菌体外模拟胃消化物中加入碳酸氢钠溶液，然后向溶液中加入胰蛋白酶溶液，得到羊肚菌体外模拟肠消化物；步骤5，将步骤4所得产物进行抽滤，减压浓缩，得到羊肚菌体外模拟消化液；步骤6，将羊肚菌体外模拟消化液与石油醚混合均匀，合并石油醚提取物，得到羊肚菌甾醇。本发明提取出的羊肚菌提取物能够缓解由葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎症状。

Description

一种羊肚菌提取物的提取方法及其应用

技术领域

本发明属于炎症性肠病研究技术领域，涉及一种羊肚菌提取物的提取方法。

背景技术

羊肚菌(Morchella spp.)属于子囊菌门(Ascomycota)盘菌纲(Pezizomycetes)盘菌目(Pezizales)羊肚菌科(Morchellaceae)羊肚菌属(Morchella)，我国对羊肚菌的记载最早见于《本草纲目》，其菜部蘑菰蕈纲目记载：一种状如羊肚，有蜂巢眼者，名羊肚菜，民间亦称羊肚蘑、狼肚菜、蜂窝菌、草笠竹，是羊肚菌属真菌的统称。羊肚菌味道鲜美、风味独特，不仅含有多种维生素、蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、矿质元素及人体必须的硒、有机锗，具有极高的营养价值；还富含多糖、多酚、甾醇、萜类等化合物，具有积极的药用价值。现代本草专著《中华本草》和《新华本草纲要》对羊肚菌药理作用描述为味甘、性平，和胃消食，化痰理气，可用于消化不良、痰多气短。近年的研究表明，羊肚菌表现出显著的抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳、抑菌、降血脂、护肝、促进胃肠蠕动、提高免疫力等功效。因其极高的营养保健价值和药用价值，羊肚菌与松茸菌、黑松露、牛肝菌并称世界四大名菌。

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)是一系列肠道疾病的总称，主要包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)和克罗恩病(Crohn.s Disease，CD)，二者发病机制不同但临床表现相似。溃疡性结肠炎是一类以直肠和结肠黏膜下层的非特异性炎症病变为主的肠道疾病，主要累及直肠和乙状结肠，也可侵及全部结肠和末端回肠，临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便等。该病反复发作、迁延不愈，并发症包括中毒性巨结肠、肠穿孔、下消化道大出血等，可伴发贫血、口角炎、肠道穿孔、肠道阻塞，具有癌变风险的同时为患者带来极大精神焦虑并可能诱发抑郁。流行病学调查显示，UC发病无性别差异，但存在地域性差异，居住地区纬度越高，发病率越高；其发病原因可能与遗传、饮食、免疫等因素有关，过去认为UC在西方发达国家发病率较高，亚洲国家发病率很低，但随着经济的发展，膳食结构和生活方式发生了巨大变化，我国UC的发病率逐年上升，1999～2003年的患病数是1989～1993年的8倍。因UC发病机制不明，缺乏特效药，目前临床治疗多采用水杨酸抑制剂、皮质类固醇和免疫抑制剂治疗，虽起效快但激素依赖、激素抵抗、毒副作用、耐药性等难题仍亟待解决。我国的专家学者尝试采用中药内服、针灸、敷贴、灌肠可一定程度缓解患者的临床症状。因此，中药又为治疗UC这一上榜世界卫生组织列出的“现代难治病”带来了一线曙光。

真菌是甾体化合物发现的重要源泉，从化学结构推演，甾体可被认为是三萜类化合物的一个重要亚群，它广泛存在于生物组织内，具有增强细胞膜结构稳定性的作用。受限于羊肚菌样品难求，有关羊肚菌甾醇的研究资料较少，目前仅有日本学者于1990年比较了德国、法国、日本羊肚菌样品中甾醇含量，结果表明德国和法国样品中5,7-二烯麦角甾醇和麦角甾醇的含量分别为36％和35％，日本样品中麦角甾醇的含量为15％。另有国内学者于1998年报道了从尖顶羊肚菌中分离得到两种同分异构的扶桑甾醇。2006年吉林农业大学的研究团队从购自山西的羊肚菌子实体乙醇提取物石油醚萃取部位中分离出了豆甾醇和β-谷甾醇。2018年沈阳农业大学的科研人员从羊肚菌发酵菌丝体中提取得到白桦脂酸等系列三萜化合物。已有的研究表明甾醇能够抑制人体对胆固醇的吸收，促进胆固醇的降解代谢，并且具有较强的抗炎和消炎作用，可直接作为抗炎药物，是重要的医药中间体，已被日本批准作为功能性添加剂。有关羊肚菌甾醇生理活性的研究目前还留有很大空白，截至目前，仅有羊肚菌甾醇能够不同程度抑制体外培养的肿瘤细胞增殖活性的研究，但尚未见到有关羊肚菌治疗溃疡性结肠炎的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种羊肚菌提取物的提取方法，该方法提取出的羊肚菌提取物能够缓解由葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎症状。

本发明所采用的技术方案是，一种羊肚菌提取物的提取方法，具体包括如下步骤：

步骤1，将羊肚菌子实体烘干、粉碎、过筛，得到羊肚菌粉末；

步骤2，将步骤1所得产物与生理盐水混合均匀，得到混合物；将混合物置于恒温磁力搅拌器，得到羊肚菌混合物；

步骤3，向步骤2得到的羊肚菌混合物中加入酸性溶液，调节羊肚菌混合物的PH为酸性，然后向溶液中加入胃蛋白酶溶液，避光，充入氮气，置于37℃恒温水浴摇床，得到羊肚菌体外模拟胃消化物；

步骤4，向步骤3所得羊肚菌体外模拟胃消化物中加入1mol/L的碳酸氢钠溶液调节pH为7.0，然后向溶液中加入胰蛋白酶溶液，避光，充入氮气，置于37℃恒温水浴摇床，得到羊肚菌体外模拟肠消化物；

步骤5，将步骤4所得产物进行抽滤，合并上清液，减压浓缩至原体积的1/10，得到羊肚菌体外模拟消化液；

步骤6，将步骤5所得羊肚菌体外模拟消化液与石油醚混合均匀，萃取2～5次，至石油醚层接近无色，合并石油醚提取物，减压蒸干，得到羊肚菌甾醇。

本发明的特点还在于：

步骤2中，步骤1所得产物与生理盐水的料液比按照1g：10～25mL的比例；混合物置于磁力搅拌器中，在60～80℃下搅拌30～60分钟。

步骤3中，摇床的转速为50～150rpm/min，消化时间为1～4h。

步骤4中，转速为50～150rpm/min消化1～4h。

步骤6中羊肚菌体外模拟消化液与石油醚按照体积比1：1～3的比例混合均匀。

本发明的有益效果是，本发明通过灌胃MsPF(羊肚菌甾醇)治疗DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型，发现羊肚菌甾醇可明显改善小鼠的精神状态，缓解便血及体重的下降，逐步恢复UC小鼠的结肠长度和隐窝结构，对UC具有确切疗效。进一步的实验结果提示，其作用机制可能与激活免疫调节、下调血清中炎性因子IL-6、IL-1β的表达密切相关。药物作用后，UC小鼠血清中谷草、谷丙转氨酶的含量趋向于正常对照组，表明羊肚菌甾醇可缓解UC导致的肝损伤，且无毒。

附图说明

图1是本发明一种羊肚菌提取物的实验过程中药物干预14天期间体重变化图；

图2是本发明一种羊肚菌提取物的OB试剂盒测试大便潜血情况；

图3是本发明一种羊肚菌提取物的实验过程中结肠组织病理学变化图；

图4是本发明一种羊肚菌提取物的不同组实验得到的小鼠结肠长度；

图5(a)～(c)是本发明一种羊肚菌提取物的实验过程中小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量柱状图；

图6(a)、(b)是本发明一种羊肚菌提取物的实验过程中小鼠血清中谷草、谷丙转氨酶含量的柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明一种羊肚菌提取物的提取方法，具体包括如下步骤：

步骤1，将羊肚菌子实体烘干、粉碎，过40目筛，得到羊肚菌粉末；

步骤2，将步骤1所得产物与生理盐水按照1g：10～25mL的比例混合均匀，得到混合物；将混合物置于恒温磁力搅拌器于60～80℃下搅拌30～60分钟，得到羊肚菌混合物；

步骤3，往步骤2得到的羊肚菌混合物中加入1mol/L的盐酸调节pH为2.0，然后向溶液中加入浓度为50mg/mL的胃蛋白酶溶液2～5mL，避光，充入氮气，置于37℃恒温水浴摇床，转速为50～150rpm/min消化1～4h，得到羊肚菌体外模拟胃消化物；

步骤4，向步骤3所得羊肚菌体外模拟胃消化物中加入1mol/L的碳酸氢钠溶液调节pH为7.0，然后向溶液中加入浓度为5mg/mL的胰蛋白酶溶液2～5mL，避光，充入氮气，置于37℃恒温水浴摇床，转速为50～150rpm/min消化1～4h，得到羊肚菌体外模拟肠消化物；

步骤5，将步骤4所得产物进行抽滤，合并上清液，减压浓缩至原体积的1/10，得到羊肚菌体外模拟消化液；

步骤6，将步骤5所得羊肚菌体外模拟消化液与石油醚按照体积比1：1～3的比例混合均匀，萃取2～5次，至石油醚层接近无色，合并石油醚提取物，减压蒸干，得到羊肚菌甾醇。

实施例1

一种羊肚菌提取物的提取方法，具体包括如下步骤：

步骤1，将羊肚菌子实体烘干、粉碎，过40目筛，得到羊肚菌粉末；

步骤2，将步骤1所得产物与生理盐水按照1g：15mL的比例混合均匀，得到混合物；将混合物置于恒温磁力搅拌器于65℃下搅拌60分钟，得到羊肚菌混合物；

步骤3，往步骤2得到的羊肚菌混合物中加入1mol/L的盐酸调节pH为2.0，然后向溶液中加入浓度为50mg/mL的胃蛋白酶溶液3mL，避光，充入氮气，置于37℃恒温水浴摇床，转速为100rpm/min消化2h，得到羊肚菌体外模拟胃消化物；

步骤4，向步骤3所得羊肚菌体外模拟胃消化物中加入1mol/L的碳酸氢钠溶液调节pH为7.0，然后向溶液中加入浓度为5mg/mL的胰蛋白酶溶液5mL，避光，充入氮气，置于37℃恒温水浴摇床，转速为100rpm/min消化1h，得到羊肚菌体外模拟肠消化物；

步骤5，将步骤4所得产物进行抽滤，合并上清液，减压浓缩至原体积的1/10，得到羊肚菌体外模拟消化液；

步骤6，将步骤5所得羊肚菌体外模拟消化液与石油醚按照体积比1：1的比例混合均匀，萃取4次，至石油醚层接近无色，合并石油醚提取物，减压蒸干，得到羊肚菌甾醇。

采用本实施例方案得到的羊肚菌甾醇的得率为203.167mg/g；

实施例2

一种羊肚菌提取物的提取方法，具体包括如下步骤：

步骤1，将羊肚菌子实体烘干、粉碎，过40目筛，得到羊肚菌粉末；

步骤2，将步骤1所得产物与生理盐水按照1g：10mL的比例混合均匀，得到混合物；将混合物置于恒温磁力搅拌器于60℃下搅拌30分钟，得到羊肚菌混合物；

步骤3，往步骤2得到的羊肚菌混合物中加入1mol/L的盐酸调节pH为2.0，然后向溶液中加入浓度为50mg/mL的胃蛋白酶溶液2mL，避光，充入氮气，置于37℃恒温水浴摇床，转速为150rpm/min消化1h，得到羊肚菌体外模拟胃消化物；

步骤4，向步骤3所得羊肚菌体外模拟胃消化物中加入1mol/L的碳酸氢钠溶液调节pH为7.0，然后向溶液中加入浓度为5mg/mL的胰蛋白酶溶液2mL，避光，充入氮气，置于37℃恒温水浴摇床，转速为50rpm/min消化3h，得到羊肚菌体外模拟肠消化物；

步骤5，将步骤4所得产物进行抽滤，合并上清液，减压浓缩至原体积的1/10，得到羊肚菌体外模拟消化液；

步骤6，将步骤5所得羊肚菌体外模拟消化液与石油醚按照体积比1：2的比例混合均匀，萃取2次，至石油醚层接近无色，合并石油醚提取物，减压蒸干，得到羊肚菌甾醇。

实施例3

一种羊肚菌提取物的提取方法，具体包括如下步骤：

步骤1，将羊肚菌子实体烘干、粉碎，过40目筛，得到羊肚菌粉末；

步骤2，将步骤1所得产物与生理盐水按照1g：25mL的比例混合均匀，得到混合物；将混合物置于恒温磁力搅拌器于80℃下搅拌45分钟，得到羊肚菌混合物；

步骤3，往步骤2得到的羊肚菌混合物中加入1mol/L的盐酸调节pH为2.0，然后向溶液中加入浓度为50mg/mL的胃蛋白酶溶液5mL，避光，充入氮气，置于37℃恒温水浴摇床，转速为50rpm/min消化4h，得到羊肚菌体外模拟胃消化物；

步骤4，向步骤3所得羊肚菌体外模拟胃消化物中加入1mol/L的碳酸氢钠溶液调节pH为7.0，然后向溶液中加入浓度为5mg/mL的胰蛋白酶溶液4mL，避光，充入氮气，置于37℃恒温水浴摇床，转速为150rpm/min消化3h，得到羊肚菌体外模拟肠消化物；

步骤5，将步骤4所得产物进行抽滤，合并上清液，减压浓缩至原体积的1/10，得到羊肚菌体外模拟消化液；

步骤6，将步骤5所得羊肚菌体外模拟消化液与石油醚按照体积比1：3的比例混合均匀，萃取5次，至石油醚层接近无色，合并石油醚提取物，减压蒸干，得到羊肚菌甾醇。

实验验证

一、方法与步骤

1.小鼠实验分组

50只健康昆明小鼠，雌雄各半，体重18～22g，购自空军军医大学实验动物中心[许可证号：SCXK(陕)2019-001]。随机分为5组：正常对照组、模型组1、模型组2、MsPF(羊肚菌石油醚)组、SASP(柳氮磺胺吡啶)组。如表1所示。

表1 小鼠分组情况

注：“+”表示小鼠摄入该物质，“-”表示小鼠未摄入该物质。DSS为葡聚糖硫酸钠。

2.小鼠溃疡性结肠炎模型建立及药物干预

(1)小鼠溃疡性结肠炎模型建立

小鼠适应性喂养1周后，除正常对照组外，其余4组给予4％DSS水溶液(DSS为葡聚糖硫酸钠)自由饮用7天，建立小鼠急性溃疡性结肠炎模型。

记录以下指标：①小鼠的进食量，即喂食前后对鼠粮称重，计算得到小鼠每日进食量；②饮水量，即每日更换新鲜饮用水，对照组为蒸馏水，其余各组均为4％DSS溶液；③体重变化，即每日定时称量小鼠体重，并计算体重下降分数[体重下降分数(％)＝(当日体重/g)/(起始体重/g)×100％]；④大便性状每日定时观察稀便程度，自第三日起用便隐血(OB)试剂盒检测血便情况。若小鼠出现活动量降低、精神不振、排便次数增加，且出现稀便、甚至血便等现象，提示小鼠急性溃疡性结肠炎模型建立成功，各组小鼠可恢复正常饮水。

(2)药物干预

小鼠自由饮用纯净水，每日按照表1定时灌胃1次，持续14天。环境保持37℃恒温，空气湿度60～70％，自由饮食，12小时周期光照，保持动物室清洁、安静。

3.指标检测

药物干预第14天进行样本采集，采集前禁食不禁水24小时。采集血清后室温静置20min，然后3000r/min离心10min，取上层血清，-20℃保存待测；解剖小鼠，收集胸腺、脾脏及结肠组织。

(1)羊肚菌甾醇对溃疡性结肠炎治疗效果评价；

1)疾病活动指数(DAI)评分；

每日在固定时间称重并记录小鼠体重变化，观察并记录小鼠进食量、摄水量、精神状态、毛发光泽度、粪便性状等情况，用便隐血(OB)试剂盒检测并记录血便情况，按照公式DAI＝(体重分数+大便性状评分+大便潜血评分)/3对小鼠进行疾病活动指数(DiseaseActivity Index，DAI)评分，DAI评分标准见表2。

表2 DAI评分标准

便隐血(OB)试剂盒检测方法：①取样并打开测试卡正面的盖子，利用取样木棒挖取粪便检体10～15mg涂抹在测试卡A窗或者B窗的方格内，然后合上盖子。②将测试卡背面朝上，并打开印有“Development Window”的封盖。③在方格内左右两侧各滴一滴显色剂A，待试剂完全渗透之后，再各滴一滴显色剂B。④当加入显色剂B后，于2min之内判读完毕。

检测结果的解释：①当加入显色剂B后，立即产生紫色，报告为(4+)；②当加入显色剂B后，10s内产生紫色，报告为(3+)；③当加入显色剂B后1min内产生紫色，报告为(2+)；④当加入显色剂B后，1～2min内才逐渐产生紫色，报告为(1+)；⑤当加入显色剂B后，于判读时间内无任何紫色的颜色反应，报告为阴性(-)。

2)结肠粘膜损伤指数(Colonic mucosa damage index，CMDI)评分

摘除结肠外壁脂肪组织及肠系膜等杂质，沿肠系膜缘纵轴剖开结肠后用的生理盐水清洗肠壁及内容物，观察结肠损伤情况，根据表3进行结肠粘膜损伤指数(Colonicmucosa damage index，CMDI)评分。

表3 CMDI评分标准

3)结肠组织病理学观察

取小鼠结肠组织制作石蜡切片并进行苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin，H&E)染色，显微镜下观察组织病理学(隐窝破坏)情况。

4)结肠长度

取小鼠结肠组织，测量并记录其长度。

(2)羊肚菌甾醇治疗溃疡性结肠炎机制研究

1)羊肚菌甾醇对小鼠免疫系统的调节

解剖小鼠分别取出胸腺和脾脏，观察并记录脏器颜色、大小及形态，称重，按照脏器指数(％)＝脏器湿重(g)/小鼠体重(g)×100％的公式，分别计算胸腺指数和脾脏指数，将以上结果分别与正常组和模型对照组比较，判断羊肚菌甾醇是否通过激活免疫调节治疗溃疡性结肠炎。

2)羊肚菌甾醇对小鼠炎性因子的影响

检测小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，将以上结果分别与正常组和模型对照组比较，判断羊肚菌甾醇是否通过抑制炎性因子的表达缓解溃疡性结肠炎。

3)羊肚菌甾醇对小鼠肝功能的影响

检测小鼠血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的含量，将结果分别与正常组和模型对照组比较，判断羊肚菌甾醇是否影响肝脏的代谢功能。

二、统计学处理

采用SPSS 25.0软件对数据进行分析，结果以X±S表示，组间显著性差异分析采用Duncan法，多重比较结果采用字母法标记，A～Z表示P<0.01，a～z表示P<0.05。

三、结果与分析

1.疾病活动指数(DAI)评分；

药物干预14天期间体重变化如图1所示。与正常对照组相比，模型组1、模型组2体重明显下降，说明小鼠溃疡性结肠炎模型建立成功。与模型组1相比，MsPF组体重升高，可见体重升高和药物干预有关而非葵花籽油作用。与模型组2相比，SASP组体重也呈升高趋势，提示SASP确可缓解体重下降趋势。以上结果共同说明，已建成的UC模型稳定，可有效评价药物对溃疡性结肠炎的疗效，羊肚菌甾醇可有效缓解UC导致的体重下降，其效果优于临床常用药物SASP。

OB试剂盒测试大便潜血情况如图2所示。因正常组小鼠无血便情况，不提供图片。由图2可以看出，模型组1、模型组2便血程度已呈现较为严重程度；与模型组1相比，MsPF组大便潜血程度显著下降，与模型组2相比，SASP组大便潜血情况有所缓解；MsPF组大便潜血程度低于SASP组。综上可见羊肚菌甾醇对便血情况的缓解效果优于临床常用药物SASP。

2.结肠粘膜损伤指数(CMDI)评分

摘除结肠外壁脂肪组织及肠系膜等杂质，沿肠系膜缘纵轴剖开结肠后用生理盐水清洗肠壁后观察显示，正常小鼠结肠组织紧实光滑；模型组1、模型组2小鼠结肠严重充血水肿，黏膜表面出现大面积溃疡；MsPF组和SASP组表现为结肠水肿、充血、黏膜溃疡程度减轻。MsPF组较SASP组表现为轻度充血水肿，肠壁上皮粘连不重。各组炎症损伤评分结果如表4所示：模型组1、模型组2较正常对照组评分明显升高，具有极显著差异(P<0.01)，可见小鼠溃疡性结肠炎模型建立成功。与模型组1相比，MsPF组小鼠结肠损伤指数骤降(P<0.01)，说明MsPF对恢复结肠损伤有极显著效果。与模型组2相比，SASP组的炎症损伤评分显著下降(P<0.01)，验证了SASP对UC的治疗效果。综上可见羊肚菌甾醇对结肠粘膜损伤的缓解效果优于临床常用药物SASP。

表4 结肠炎小鼠结肠损伤指数(X±S，n＝10)

注：不同字母代表组间差异显著，A～Z表示P<0.01。

3.结肠组织病理学观察

将小鼠结肠组织的石蜡切片进行HE染色后可在图3中观察到，正常组小鼠结肠组织的隐窝结构清晰可见；模型组1、模型组2小鼠结肠隐窝结构完全破坏，呈筛漏状，成为溃疡的病灶；MsPF组小鼠结肠组织内隐窝结构已恢复，炎症程度较模型组1明显减轻；SASP组小鼠结肠组织中也可观察到恢复的隐窝结构，隐窝数量较模型组2多。综上可见羊肚菌甾醇和SASP均可缓解小鼠结肠部位溃疡，逐步恢复其正常生理结构。

4.羊肚菌甾醇对溃疡性结肠炎小鼠结肠长度的影响

摘除结肠外壁脂肪组织及肠系膜等杂质，沿肠系膜缘纵轴剖开结肠后用生理盐水清洗肠壁后对结肠的长度进行测量，结果见图4(左)，对各组小鼠结肠长度进行统计学分析结果如图4(右)所示，正常对照组小鼠的结肠为12.05±0.76cm，模型组小鼠的结肠显著缩短(P<0.05)至9.46±0.98cm和10.18±0.57cm；MsPF组的结肠长度为11.54±0.68cm，较模型组1显著增加，与正常组小鼠结肠长度无差异；SASP组小鼠结肠长度为10.79±0.91cm，较模型2组略有增加，但还低于正常组，以上差异均有统计学意义(P<0.05)。综上可见羊肚菌甾醇和SASP均可缓解结肠炎症，逐步恢复结肠长度，但羊肚菌甾醇的效果优于临床常用药物SASP。

5.羊肚菌甾醇对溃疡性结肠炎小鼠免疫器官的影响

灌服药物结束后，摘取小鼠的免疫器官进行脏器指数测定结果见表5，与正常对照组相比，模型组1小鼠脾脏指数明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，模型组2小鼠免疫器官脏器指数无明显差异。与模型组1相比，MsPF组小鼠脾脏指数明显下降，趋于正常水平，差异有统计学意义(P<0.05)，但SASP组小鼠脾脏指数、胸腺指数与模型组2相比无统计学差异(P>0.05)。综上可见羊肚菌甾醇对炎症的缓解效果优于临床常用药物SASP。

表5 各组小鼠脏器指数

n＝10

注：不同字母代表组间差异显著，a～z表示P＜0.05

6.羊肚菌甾醇对溃疡性结肠炎小鼠炎性细胞因子的影响

药物灌胃14天后，测定小鼠血清中炎性因子的含量，结果见图5(a)。正常组小鼠血清中IL-6的含量为63.21±1.49pg/mL，模型组1与正常组接近，推测葵花籽油也能一定程度影响血清中IL-6的表达，但灌服MsPF后血清中IL-6含量下降至51.94±1.23pg/mL，具有显著性差异(P<0.05)，说明羊肚菌甾醇能够显著下调UC小鼠血清中IL-6的表达，有效缓解炎症反应。模型组2小鼠血清中IL-6含量显著升高至73.20±1.21pg/mL，灌服SASP后血清中IL-6含量显著下降至49.68±2.11pg/mL，组间差异具有统计学意义(P<0.05)，该结果验证了临床药物的有效性。

药物对血清中炎性细胞因子IL-1β的影响结果见图5(b)。正常组小鼠血清中IL-1β的含量为63.52±2.04pg/mL，模型组1与模型组2的含量分别上升至75.34±2.04pg/mL和77.66±1.03pg/mL，显著高于正常组(P<0.05)，说明UC模型建立成功；灌服MsPF后，小鼠血清中IL-1β的含量下降至67.09±0.69pg/mL，逐步趋于正常水平；服用SASP对小鼠血清中IL-1β的含量影响不显著(P<0.05)。

药物对血清中炎性细胞因子TNF-α的影响结果见图5(c)。正常组小鼠血清中TNF-α的含量为82.08±2.87pg/mL，模型组1与模型组2的含量分别上升至101.78±1.72pg/mL和101.68±1.28pg/mL，显著高于正常组(P<0.05)，说明UC模型建立成功；灌服MsPF和SASP后，血清中TNF-α的含量变化并不明显，但数值均略有上升，分别为105.05±1.68pg/mL和107.43±1.77pg/mL，这提示羊肚菌甾醇和SASP有可能会促进TNF-α的生成，从而具有潜在的抗肿瘤活性。

综上可知，羊肚菌甾醇对UC小鼠血清中炎性因子的下调功效优于临床常用药物SASP。

7.羊肚菌甾醇对溃疡性结肠炎小鼠肝脏代谢功能的影响

正常情况下，ALT(谷丙转氨酶)主要存在于肝细胞浆中，当肝细胞轻度病变，细胞膜通透性增加时会从细胞溢出，AST(谷草转氨酶)主要存在于细胞浆的线粒体中，当肝细胞严重破坏坏死时，AST便被释放出来，当机体受到外来侵害导致肝脏代谢功能受损时，血清中的AST、ALT含量大幅升高时则表明肝功能受损。由图6(a)可知，与正常对照组相比，模型组小鼠血清中ALT含量均呈显著增加，说明溃疡性结肠炎会导致肝损伤，灌服MsPF后，小鼠血清中的ALT含量骤降，甚至在短时间内低于正常水平，提示羊肚菌甾醇对肝损伤的修复效果显著；服用SASP也可促使小鼠血清中ALT含量下降至正常水平。说明羊肚菌甾醇缓解溃疡性结肠炎导致的肝损伤效果优于临床常用药SASP。由图6(b)可知，与正常对照组相比，模型组小鼠血清中AST含量均呈显著增加，说明溃疡性结肠炎会导致肝损伤，灌服MsPF和SASP后，小鼠血清中的ALT含量均呈现下降趋势，但还略高于正常组，提示羊肚菌甾醇和临床常用药SASP均可不同程度缓解溃疡性结肠炎导致的肝损伤。

综上所述，羊肚菌甾醇可通过激活免疫调节，下调血清中炎性因子IL-6、IL-1β的含量，修复肝损伤，逐步改善溃疡性结肠炎的临床症状，如缓解便血及体重的下降，恢复结肠的正常生理结构，使其长度趋向正常。

Claims (1)

1.一种用于治疗溃疡性结肠炎的羊肚菌提取物的提取方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

步骤1，将羊肚菌子实体烘干、粉碎、过筛，得到羊肚菌粉末；

步骤2，将步骤1所得产物与生理盐水混合均匀，得到混合物；将混合物置于恒温磁力搅拌器，得到羊肚菌混合物；

步骤2中，步骤1所得产物与生理盐水的料液比按照1g：10～25mL的比例；混合物置于磁力搅拌器中，在60~80℃下搅拌30~60分钟；

步骤3，向步骤2得到的羊肚菌混合物中加入酸性溶液，调节羊肚菌混合物的pH 为酸性，然后向溶液中加入胃蛋白酶溶液，避光，充入氮气，置于37℃恒温水浴摇床，得到羊肚菌体外模拟胃消化物；

所述步骤3中，摇床的转速为50～150rpm/min，消化时间为1～4h；

步骤4，向步骤3所得羊肚菌体外模拟胃消化物中加入1mol/L的碳酸氢钠溶液调节pH为7.0，然后向溶液中加入胰蛋白酶溶液，避光，充入氮气，置于37℃恒温水浴摇床，得到羊肚菌体外模拟肠消化物；

步骤4中，转速为50～150rpm/min消化1～4h；

步骤5，将步骤4所得产物进行抽滤，合并上清液，减压浓缩至原体积的1/10，得到羊肚菌体外模拟消化液；

步骤6，将步骤5所得羊肚菌体外模拟消化液与石油醚混合均匀，萃取2～5次，合并石油醚提取物，减压蒸干，得到羊肚菌甾醇；

步骤6中羊肚菌体外模拟消化液与石油醚按照体积比1：1～3的比例混合均匀。

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