CN105012382B - 核桃粕提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及核桃粕提取物及其制备方法和用途，具体涉及核桃粕提取物在制备治疗胆结石药物和抗胆结石保健品中的应用。其制备方法为核桃粕经石油醚或超临界提取后过滤得滤渣，滤渣再用水或醇溶液提取，减压浓缩得浸膏，浸膏总有机酸含量在30%以上，总有机酸药理实验证明核桃粕提取物具有抗胆结石、利胆的作用。本发明的制备方法使用了人们常弃掉的核桃粕为原料，工艺简单，有机酸含量高。

Description

核桃粕提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于中药制药技术领域，涉及核桃粕提取物及其制备方法和应用，具体涉及核桃粕提取物、其制备方法以及该提取物在制备治疗胆结石、利胆药物及保健品方面的应用。

背景技术

胆结石是一种严重威胁人类健康的常见病、多发病，受多种因素影响而反复发作，近年来由于我国人民生活水平提高，饮食习惯的改变，环境因素变化，胆结石的发病率呈现逐年上升，在西方国家其发病率为10％-20％，在我国为2.4％-7％，部分地区高达16.8％。临床上患者常出现中上腹或右上腹闷胀不舒服，嗳气和厌食油腻食物等消化不良症状，易被当作“肝炎”、“胃炎”而拖延治疗。每年大约20％的“无症状”胆囊结石患者出现胆绞痛。当夜餐后或在夜间，胆囊结石易卡在胆囊颈部或胆管内，使用胆囊内压力升高，胆囊膨胀产生剧烈的绞痛。这种绞痛常常是持续性阵发性加重，严重者出现休克甚至生命危险。除此之外，一些小的结石落入胆总管、排入十二指肠，不仅损伤总胆管末端肝胰壶腹括约肌，反复如此，还会造成胆总管末端狭窄，继发总胆管结石及胆源性胰腺炎。近年来，胆管癌的发生率显著提高，有资料表明约0.5％-1％的胆囊结石并发胆囊癌。这种情况时常误诊，有统计误诊率可达79.5％。往往在胆结石手术时才发现胆囊癌，多为晚期，疗效极差，绝大多数患者在一年内死亡。

目前，治疗仍以手术为主，但术后残石率及复发率高(可达30％-50％)，再次手术难度和风险将成培加大。西药治疗胆结石的疗程较长，通常要服用半年至两年才能达到效果，且副作用，价格也相对较贵。因此，寻找治疗胆结石的高效低毒的药物刻不容缓。

胡桃仁(juglans regia L.)是胡桃科植物的成熟种子，其性温味苦，归肾、肺、大肠经，具有补肾，温肺，润肠的功效，多用于肾阳不足，腰膝酸软，阳痿遗精，虚寒咳嗽，肠燥便秘。主要含有脂肪、蛋白质、酚酸类成分，现代研究发现，核桃仁具有抗氧化、抗癌、抗衰老、提高免疫力、改善记忆力和治疗急性肝损伤等药理作用。核桃粕为核桃仁榨油后的剩余物，保留了核桃仁中的主要化学成分，但长期以来，经过榨油后的核桃粕除部分用来提取蛋白质品外，常常成为工业生产的副产品，被当做饲料低价处理或废弃。

发明内容

为了充分利用资源，本发明提供了核桃粕提取物的制备方法，以及在制备治疗胆结石等消化系统药物、保健品等方面的应用。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

1.核桃粕提取物的制备：

(1)将核桃粕粉碎，核桃粕粉末用石油醚提取或超临界萃取，石油醚提取后弃去石油醚液，过滤得滤渣，或超临界萃取后得滤渣。

(2)滤渣用水或体积浓度为30％-80％醇溶液提取，减压蒸干，得到核桃粕提取物。

步骤(1)中药材粉碎目数为10-40目，优选20目。

所述的石油醚为沸程在60-90℃的石油醚，石油醚用量为核桃粕的质量的3-5倍，优选5倍。

所述步骤(1)的超临界萃取压力为25-35MPa，优选30MPa，萃取温度为30-60℃，优选45℃，萃取时间1-5h，优选3h。

所述步骤(1)中的石油醚提取的提取方法为回流、冷浸或闪式提取，每次1min～4小时，提取次数1-3次，优选冷浸提取。

步骤(2)中所述的醇溶液为甲醇、乙醇或正丁醇的含水溶液，体积浓度为30％-80％，优选40％-70％，更优选70％。所述醇溶液优选乙醇溶液。

所述的水或醇溶液的用量为核桃粕质量的的8-20倍量，优选10倍。

步骤(2)中所述的提取所用方法为回流、冷浸或闪式提取，每次1min～3h，优选回流提取。

所述的回流提取中，提取时间为1～3小时，回流温度为70～90℃，优选0.5小时。

冷浸时间为1～3小时，优选3小时。

闪式提取时间为20秒-3分钟，优选1分钟。

核桃粕提取物以总有机酸含量为指标，以核桃仁中特有的成分glansreginins A为对照品，分光光度法测得总有机酸含量大于30％，为30.8％-37.1％。此提取方法总有机酸收率高，方法简单重现性好。

2.核桃粕提取物的预防胆结石的研究

采用健康雄性C57BL/6J小鼠，给予高脂饲料制胆结石模型，给一定浓度提取物，检测血液高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、胆汁流量和胆汁胆固醇(CHO)、总胆红素(TBIL)。实验数据采用SPSS16.0软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齐性时用LSDt-test分析方法进行组间比较，方差不齐时用Dunnett’sT3分析，实验结果以平均值±标准误差(Mean±SEM)表示。核桃粕提取物组血清中的CHO含量与模型组含量比较显著降低，HDL-C的含量显著高于模型组，LDL-C含量较模型组含量有显著下降，核桃粕提取物组与模型组比较，核桃粕提取物组小鼠胆汁中CHO含量有显著降低。各组胆汁中TBIL含量以核桃粕提取物组降低的较多，但无统计学意义。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进行进一步阐述。应理解为这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

具体实施方式：

提取工艺优化

选用提取时间、溶剂倍量、提取次数、乙醇浓度4个因素，每个因素3个水平，以核桃粕粉末中glansreginins A的含量(mg/g)为考察指标，按照(L₉3⁴)正交表(见表1)设计方案进行实验，优化提取工艺。

精密称取核桃粕粉末20.0g，9份，按正交试验设计表进行提取，过滤，浓缩，稀释至适当浓度后，作为待测液，用于总有机酸的含量测定，正交实验设计结果见表2，方差分析见表3。

表.1L₉(3⁴)提取工艺正交设计

表2.正交试验结果(％)

实验结果表明，以glansreginins A含量为指标进行直观分析时，各因素对结果的影响大小依次为C>D>B>A，以浸膏为指标得到的结果与以glansreginins A为指标的结果一致，最佳工艺条件为A1B2C3D2，进一步方差分析结果表明提取次数和醇浓度对指标成分提取的影响较显著。提取次数优选3次，提取溶剂优选乙醇，浓度优选70％，提取时间对提取率影响不大。

实施例1

将核桃粕粉碎，取50g核桃粕粉以3倍量的石油醚(60-90)冷浸2次，每次4h，弃去石油醚液，得滤渣，将滤渣以10倍量浓度为70％的乙醇溶液回流提取2次，每次1h，减压回收溶剂，减压浓缩至干，得核桃粕提取物，以glansreginins A为对照品，分光光度法测得总有机酸含量为35.1％。

实施例2

将核桃粕粉碎，取50g核桃粕粉用超临界萃取压力30MPa，萃取温度为40℃，萃取时间3h，得滤渣，将滤渣以12倍量浓度为40％的甲醇溶液超声提取2次，每次0.5h，减压回收溶剂，减压浓缩至干，得核桃粕提取物，以glansreginins A为对照品，分光光度法测得总有机酸含量为31.1％。

实施例3

将核桃粕粉碎，取50g核桃粕粉以5倍量的石油醚(60-90)冷浸3次，每次4h，弃去石油醚液，得滤渣，将滤渣以20倍量浓度为60％的正丁醇溶液冷浸提取3次，每次4h，减压回收溶剂，减压浓缩至干，得核桃粕提取物，以glansreginins A为对照品，分光光度法测得总有机酸含量为32.1％。

实施例4

将核桃粕粉碎，取50g核桃粕粉以5倍量的石油醚(60-90)回流提取3次，每次1h，弃去石油醚液，得滤渣，将滤渣以10倍量浓度为60％的乙醇溶液回流提取3次，每次1.5h，减压回收溶剂，减压浓缩至干，得核桃粕提取物，以glansreginins A为对照品，分光光度法测得总有机酸含量为33.8％。

实施例5

将核桃粕粉碎，取50g核桃粕粉以5倍量的石油醚(60-90)回流提取3次，每次1h，弃去石油醚液，得滤渣，将滤渣以10倍量浓度为70％的乙醇溶液回流提取3次，每次1.5h，减压回收溶剂，减压浓缩至干，得核桃粕提取物，以glansreginins A为对照品，分光光度法测得总有机酸含量为37.1％。

实施例6

将核桃粕粉碎，取50g核桃粕粉以5倍量的石油醚(60-90)回流提取3次，每次1h，弃去石油醚液，得滤渣，将滤渣以10倍量浓度为50％的乙醇溶液回流提取3次，每次1.5h，减压回收溶剂，减压浓缩至干，得核桃粕提取物，以glansreginins A为对照品，分光光度法测得总有机酸含量为26.1％。

实施例7

将核桃粕粉碎，取50g核桃粕粉以5倍量的石油醚(60-90)回流提取3次，每次1h，弃去石油醚液，得滤渣，将滤渣以10倍量浓度为80％的乙醇溶液回流提取3次，每次1.5h，减压回收溶剂，减压浓缩至干，得核桃粕提取物，以glansreginins A为对照品，分光光度法测得总有机酸含量为36.3％。

实施例8

健康雄性C57BL/6J小鼠32只(20±2g)，随机分组：空白对照组、模型对照组、阳性对照组和给药组。模型对照、阳性对照组和给药组小鼠给予致石饲料，饮水不限，空白对照组予正常饲料。给药组和阳性对照组小鼠每日上午固定时间称重灌胃，灌给核桃粕提取物(实施例1)和熊去氧胆酸片(UDCA)，剂量分别为0.01mg/g和0.02mg/g，每日1次；模型对照组和空白对照组给予等体积的蒸馏水。喂养8周。实验最后1d，禁食24h，眼眶取血，静置30min后3000rpm离心10min，取血清，在沈阳疾控中心用全自动生化仪检测血清中的CHO、TG、LDL-C和HDL-C；模型组小鼠血清的CHO、和LDL-C含量与空白对照组含量比较显著升高(P<0.01，P<0.01)，血清HDL-C含量较空白对照组含量也有降低，表明造模成功。阳性对照组血清中的CHO含量较模型组含量显著降低(P<0.01)，HDL-C含量与模型组含量比较升高较显著(P<0.05)，LDL-C含量降低较显著(P<0.01)。核桃粕提取物组血清中的CHO含量与模型组含量比较显著降低(P<0.05)，HDL-C的含量显著高于模型组(P<0.01)，LDL-C含量较模型组含量有显著下降(P<0.05)。结果见表4。

表4各组血浆中CHO、TG、HDL-C、LDH-C的含量

(mmoL/L)

与空白组比较，“#”表示P<0.05，“##”表示P<0.01；与模型组比较，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。

结论：核桃粕提取物能够明显降低小鼠血浆中CHO、LDL-C水平，升高HDL-C水平。从而可以确定核桃粕提取物具有一定抗胆结石作用。

实施例9

核桃粕提取物对小鼠胆汁成分的影响

健康雄性C57BL/6J小鼠32只(20±2g)，随机分组：空白对照组、模型对照组、阳性对照组和给药组。模型对照、阳性对照组和给药组小鼠给予致石饲料，饮水不限，空白对照组予正常饲料。给药组和阳性对照组小鼠每日上午固定时间称重灌胃，灌给核桃粕提取物(实施例1)和熊去氧胆酸片(UDCA)，剂量分别为0.01mg/g和0.02mg/g，每日1次；模型对照组和空白对照组给予等体积的蒸馏水。喂养8周。实验最后1d，禁食24h，迅速打开腹腔，分离胆囊，注射器吸出全部胆汁，在沈阳疾控中心用全自动生化仪检测胆汁中胆固醇(CHO)、总胆红素(TBIL)。模型组与空白组比较，模型组小鼠胆汁中CHO含量显著升高(P<0.05)；熊去氧胆酸组与模型组含量比较可显著降低胆汁中的CHO含量(P<0.05)；核桃粕提取物组与模型组比较，核桃粕提取物组小鼠胆汁中CHO含量有显著降低(P<0.05)。各组胆汁中TBIL含量以核桃粕提取物组降低的较多，但无统计学意义。结果见表5。

结论：核桃粕粗提取物能显著降低胆汁中胆固醇的含量，对胆结石的形成有一定的预防作用。

表5各组小鼠胆汁成分

(mmoL/L)

注：与空白组比较，“#”表示P<0.05；与模型组比较，“*”表示P<0.05。

实施例10

核桃粕提取物对大鼠胆汁流量的影响

取大鼠32只(体重220±10g)，随机分为3组，即空白对照组、阳性药组和核桃粕提取物组，分别称重、编号，灌胃给药7天，空白组给予蒸馏水，核桃粕提取物组2mL/100g(实施例2)。最后一天给药1h后以3.5％水合氯醛1mL/100g(体重)腹腔注射麻醉，仰位固定于小动物手术板，腹部剪毛后沿腹白线(腹正中)用粗剪刀(或手术刀切口)剖开腹腔2～3cm，可见胃幽门部，沿十二指肠降部肠系膜看到白色透明具有韧性的胆总管，在接近十二指肠开口处，向肝脏方向剪“V”形，将胆汁引流管插入胆总管，引出腹壁，结扎固定可见淡黄色液体顺管流出即是胆汁，稳定10min后，先收集30min胆汁，然后给药组经十二指肠分别注射核桃粕提取物，阳性药，空白组注射生理盐水，以30min为一时限，用小试管收集大鼠1.5h内的胆汁(mL)，记录各时间段胆汁流量，并将收集的胆汁在沈阳疾控中心用全自动生化仪检测胆固醇(CHO)、胆红素(TBIL)。与空白对照组比较，十二指肠给药后，核桃粕提取物组和阳性药能显著提高大鼠胆汁分泌物量(P<0.05)。结果见表6。

结论：核桃粕粗提取物能有效提高大鼠胆汁分泌量，有利于胆结石的排除。

表6各组大鼠胆汁流量

注：与空白组比较，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。

实施例11

核桃粕提取物对大鼠胆汁成分的影响

对实施例7中接的胆汁进行成分分析，结果表明与空白组比较，给药组对胆汁中CHO含量的影响不明显；阳性药与空白组比较，胆汁中CHO含量有升高趋势。各组胆汁中TBIL含量均无明显差异(P﹥0.05)。结果见表7。

结论：核桃粕粗提取物不影响正常大鼠胆固醇和胆红素的分泌，不破坏正常大鼠胆固醇和胆红素的分泌的平衡。

表7各组大鼠胆汁成分

(mmoL/L)

实施例12含核桃粕提取物的颗粒剂及其制备

处方：成分 ％(重量)

核桃粕提取物 15

蔗糖 65

糊精 20

制法：将核桃粕提取物(实施例4)、蔗糖和糊精混合均匀，加入适量75％乙醇制成软材，18目筛制湿颗粒，50℃烘箱干燥30min，取出后过18目筛整粒，分装，即得核桃粕提取物颗粒剂。

实施例13含核桃粕提取物的片剂及其制备

处方：成分 ％(重量)

核桃粕提取物 15

微晶纤维素 77

羧甲基淀粉钠 7

甜菊糖苷 0.5

硬脂酸镁 0.5

制法：将核桃粕提取物(实施例2)、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠混合均匀，加入适量75％乙醇制成软材，软材过18目筛制湿粒，湿粒于50℃烘箱中干燥30min，取出后过18目筛整粒，加入硬脂酸镁和甜菊糖苷，混匀，压片，即得核桃粕提取物片剂。

实施例14含核桃粕提取物的胶囊剂及其制备

处方：成分 ％(重量)

核桃粕提取物 15

糊精 45

淀粉 40

制法：取处方量的核桃粕取物(实施例2)粉碎过80目筛，加入淀粉、糊精、混合均匀，

装入胶囊，即得核桃粕提取物胶囊。

实施例15含核桃粕提取物的软胶囊剂及其制备

处方：成分 ％(重量)

核桃粕提取物 15

明胶 30

甘油 20

水 35

制法：取处方量的甘油和水加热至70-80℃，加入明胶，搅拌，保温1-2h，除去上浮的泡沫过滤后制成胶板，再将处方量的核桃粕提取物(实施例4)粉碎过80目筛，置于二块胶板之间，用钢模压制成胶囊。

实施例16核桃粕提取物的口服液及其制备

处方：成分 ％(重量)

核桃粕提取物 15

蔗糖 25

水 60

制法：去处方量的核桃粕提取物加入适量的水，调节pH值至7.0，搅匀，冷藏72小时，过滤，滤液加入蔗糖，搅拌使溶解，加入适量香精并调节pH值至7.0，加入适量的水，搅拌，静置12小时，过滤，灌装，灭菌，即得核桃粕提取物口服液。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有治疗胆结石作用的核桃粕提取物，其特征在于，通过如下步骤制备：

（1）将核桃粕粉碎，核桃粕粉末用石油醚提取或超临界萃取，石油醚提取液弃去石油醚液，过滤得滤渣或超临界提取后得滤渣；

（2）将（1）中的滤渣用水或体积浓度为60%-80%乙醇溶液提取，减压蒸干，得到核桃粕提取物；所述的核桃粕提取物中，有机酸含量在30%以上。

2.根据权利要求1所述的具有治疗胆结石作用的核桃粕提取物，其特征在于：步骤（1）中的石油醚沸程为60-90℃，提取方法为回流、冷浸或闪式提取。

3.根据权利要求1-2任何一项所述的核桃粕提取物，其特征在于：步骤（2）中的所述的醇溶液为甲醇、乙醇或正丁醇的含水溶液，所述的水或醇溶液的用量为核桃粕的8-20倍量。

4.一种药物组合物，包含作为唯一活性成分的权利要求1-3任何一项所述的具有治疗胆结石作用的核桃粕提取物。

5.一种药物制剂，其特征在于，包含作为唯一活性成分的权利要求1-3任何一项所述的具有治疗胆结石作用的核桃粕提取物或权利要求4所述的药物组合物与药学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂为固体制剂或液体制剂，所述的固体制剂为片剂、胶囊或颗粒剂；所述的液体制剂为口服液。

7.权利要求1或2所述的核桃粕提取物在制备防治胆结石病药物中的应用。

8.权利要求3所述的核桃粕提取物在制备防治胆结石病药物中的应用。

9.权利要求4所述的药物组合物在制备防治胆结石病药物中的应用。

10.权利要求5所述的药物制剂在制备防治胆结石病药物中的应用。