CN101870740A - 一种尖顶羊肚菌胞外多糖提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种尖顶羊肚菌胞外多糖提取物及其制备方法和应用，该提取物是经过尖顶羊肚菌液体发酵培养，通过离心和真空抽滤分离菌丝体后而获得液体发酵液，并浓缩液体发酵液至原体积的1/3～1/6，得到浓缩液，浓缩温度为50～70℃；然后浓缩液去蛋白、离心，得到的活性提取液用1～5倍体积的95％乙醇在0～10℃透析沉降浓缩液中的多糖12～25小时，pH值为4～8，静置析出絮状白色物质，再离心分离得到白色沉淀，冷冻干燥，制得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物。本发明制备过程简单、可大量生产，提取物对人体无毒害，具有良好的抗氧化和延缓衰老作用，可用于制备抗氧化和延缓衰老药物或保健食品。

Description

一种尖顶羊肚菌胞外多糖提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及具有药用价值的真菌提取物，尤其涉及一种尖顶羊肚菌(Morchella conica)胞外多糖提取物的制备方法及其抗氧化和延缓衰老的应用。

背景技术

对于食用菌多糖的提取和生物活性研究，目前已有报道大多是从食用菌子实体中提取多糖，如方一泓等人用茶树菇(Agrocybe aegerita)子实体经热水提取，Sevage法脱蛋自质，乙醇沉淀得到的茶树菇多糖(食用菌学报，2006，13(4)：63-68)；又如贾建会等人用半合成培养基深层发酵产生的羊肚菌菌丝体和发酵液为主要原料提取羊肚菌多糖(食品科学，2002，23(4)：59-62)。一方面利用子实体获得的多糖，需耗费大量资源，目前尖顶羊肚菌子实体较难进行人工栽培，自然环境生长采集的野生子实体数量稀少，用来提取多糖成本高；另一方面利用半合成培养基深层发酵对所得的多糖成分及含量影响较大，不利于分离纯化和生理功效鉴定。研究发现，羊肚菌有抗肿瘤、免疫调节、抗疲劳、降血脂及抗菌等作用，具有重要的开发和利用价值(陈彦等，2008；张利平等，2009；明建等，2009)，但目前还未见有关尖顶羊肚菌胞外多糖抗氧化和延缓衰老作用的相关报道。

发明的内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种培养容易、提取方法简单可靠、成本低的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物。

本发明的另一个目的在于提供上述尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法。

本发明的再一个目的在于提供上述尖顶羊肚菌胞外多糖提取物在制备抗氧化和延缓衰老作用药物或保健食品中的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一种尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将尖顶羊肚菌液体发酵液浓缩至原体积的1/3～1/6，得到浓缩液，浓缩温度为50～70℃；

(2)浓缩液采用Sevage法去蛋白、离心，得到去蛋白后的活性提取液；

(3)去蛋白后的活性提取液用1～5倍体积的95％乙醇在0～10℃透析沉降浓缩液中的多糖12～25小时，pH值为4～8，静置析出絮状白色物质，再离心分离得到白色沉淀，冷冻干燥，制得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物。

所述步骤(2)servge法去蛋白、离心：在浓缩液中加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液(氯仿、正丁醇体积比为5∶1)，在恒温磁力搅拌器上剧烈搅拌30分钟，温度25℃，用Sigma台式冷冻离心机，温度4℃，以4000rpm的转速离心10分钟，回收上清液，弃去蛋白层及有机溶液。

所述步骤(3)离心条件为：转速4000-5000rpm、时间20-30min，其中优选：转速4000rpm、时间20min。

进行单因素实验以确定最佳条件：①取等量浓缩多糖提取液5份，每组30mL，分装于5个烧杯中，分别加入1～5倍体积的95％乙醇进行醇析，离心收集沉淀，然后测定胞外多糖提取率。②醇析时间选取5h、12h、15h、25h。③分别浓缩至原体积的1/3、1/4、1/5、1/6。④浓缩温度为50℃、60℃、70℃。⑤醇提pH值选取自然、4、5、6、7、8。按以上五方面进行单因素实验，获得最佳醇提条件：发酵液浓缩至原体积的1/5，浓缩温度为60℃，用4倍体积的95％乙醇进行醇析，醇析时间25小时，pH值为6。

所述尖顶羊肚菌液体发酵液是经过尖顶羊肚菌(Morchella conica)液体发酵培养，得到发酵物，再通过离心和真空抽滤分离菌丝体，获得的发酵液。所述离心条件优选：转速4000rpm、时间10min。

所述尖顶羊肚菌(Morchella conica)液体发酵培养是将尖顶羊肚菌(Morchella conica)接种到液体发酵培养基中发酵培养，其液体发酵培养基配方为：葡萄糖150g，硝酸铵6g，KH₂PO₄3.0g，MgSO₄·7H₂O 3.0g，维生素B10.3g，加蒸馏水定容至3000ml。

所述发酵培养的步骤是：(1)取100ml所述液体发酵培养基，经灭菌后，在其中接入3个直径约为4mm的尖顶羊肚菌菌丝块，在25～28℃，转速130～160rpm，避光恒温振荡培养6～8天，得到液体菌种；(2)将上述液体菌种接入3L灭菌后的所述液体发酵培养基中，培养温度为25～28℃，转速为130～160rpm，培养5～9天，得到发酵物，备用。

由上述方法制备得到的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖84.0％左右，经DNS比色法测定含还原糖25.7％左右，经考马斯亮兰法测定含蛋白5.07％左右。

本发明对上述制备所得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物进行体外抗氧化测试，以Vc为阳性对照，并对其清除ABTS自由基、羟基自由基以及超氧阴离子的作用进行实验，根据实验数据评价其抗氧化活性。结果表明：1mg/mL的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对超氧阴离子的抑制率为20.81％；对羟基自由基的抑制率为72.4％；0.1mg/mL尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对ABTS自由基的抑制率可达77.43％。此尖顶羊肚菌胞外多糖提取物具有良好的抗氧化能力。

本发明对上述制备所得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物进行果蝇寿命测试。首先配制果蝇基本培养基，在基础培养基中加入尖顶羊肚菌胞外多糖提取物然后观察果蝇的平均寿命延长率、半数死亡时间和最高寿命。结果表明：尖顶羊肚菌胞外多糖提取物可明显延长果蝇的寿命。浓度为0.2g/L的尖顶羊肚菌多糖提取物可使雌雄果蝇的平均寿命分别延长22.18％和30.27％；使雌雄果蝇的半数死亡时间分别延长20.55％和32.35％；使雌雄果蝇的最高寿命分别延长20.39％和31.52％。它对果蝇寿命的影响存在着性别差异，对雄性果蝇的延寿效果优于对雌性果蝇。

本发明对上述制备所得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物进行小鼠延缓衰老功效测试。用该提取物对D-半乳糖所致衰老模型小鼠进行灌胃，观察其对小鼠大脑超氧化物歧化酶(SOD)活性、脂褐素(LF)和丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明，50mg/kg·d的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物能使雄性、雌性小鼠脑SOD活性分别提高20.70％(p＜0.05)、21.13％(p＜0.05)，LF含量分别降低35.14％(p＜0.01)、44.79％(p＜0.01)，MDA含量分别减少15.10％、15.61％，表明尖顶羊肚菌胞外多糖提取物具有良好的延缓衰老作用，且具有性别的差异，对雌性小鼠延缓衰老效果略优于对雄性小鼠。

由此可见，本发明所得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物具有良好的抗氧化，延寿和延缓衰老作用，可作为生产尖顶羊肚菌胞外多糖提取物单体、抗氧化和延缓衰老药物与保健食品开发的原料，该提取物在抗氧化和延缓衰老药物与保健食品应用中的使用剂量为50mg/kg·d。

与现有的技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物，可采用发酵罐生产，从发酵液中提取，不但制备过程简单，条件易控制，而且可大批量工厂化生产。

(2)本发明使用合成培养基进行发酵，不但培养基成分精确，重复性强，而且多糖易于分离纯化。

(3)本发明所得胞外多糖提取物，来源于尖顶羊肚菌液体发酵液，而且提取过程中没有加入任何有害成分，具有对人体无毒害的优点。

(4)本发明所得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物溶解性好，具有良好的抗氧化、延寿和延缓衰老作用。

附图说明

图1为尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对超氧阴离子自由基的抑制作用图；

图2为尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对羟基自由基的抑制率图；

图3为尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对ABTS+自由基的抑制作用图；

图4为尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对小鼠SOD、LF、MDA生化指标的影响图(注：Y轴表示各组与模型组比较，SOD增加的百分比以及LF、MDA减少的百分比)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

一种尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，步骤如下：

(1)尖顶羊肚菌GIM5.70(Morchella conica)(从广东省微生物菌种保藏中心购买。)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体发酵培养，得到发酵液。

具体的培养基配方和培养条件如下：

①斜面或平板菌种培养：培养基配方为，马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨1g，(NH₄)₂SO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1g，KH₂PO₄1g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000ml，pH调至6.5；然后接入1个直径约为4mm的尖顶羊肚菌菌丝块，26℃培养14天，置于4℃保存备用。

②液体振荡培养：以NH₄NO₃作为氮源，葡萄糖或可溶性淀粉作为碳源，以及初始pH和接种量作为考察因素最终确定合成培养基配方为：葡萄糖50g，硝酸铵2g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O 1.0g，维生素B10.1g，加蒸馏水定容至1000mL，自然pH值；培养条件为：取100mL上述合成培养基装入250mL三角瓶，在121℃灭菌30分钟，并接入3个直径约为4mm的尖顶羊肚菌菌丝块在25℃，转速160rpm，避光恒温振荡培养7天，得到液体菌种。

③液体发酵培养：将液体培养基3L(葡萄糖150g，硝酸铵6g，KH₂PO₄3.0g，MgSO₄·7H₂O 3.0g，维生素B10.3g，加蒸馏水定容至3000ml)转入5L发酵罐培养，再接入100mL上述液体菌种，培养温度为25℃，转速为130rpm，培养7天，即可得到菌丝体丰富，菌球丰富、均匀，颜色微黄的发酵物，备用。

(2)将发酵物通过离心和真空抽滤分离菌丝体，获得澄清的发酵液。

①离心：Sigma台式冷冻离心机，以4000rpm的转速离心10分钟。

②真空抽滤：真空抽滤，使菌丝体与发酵液分离，得发酵液，备用。

(3)浓缩发酵液：用旋转蒸发仪将发酵液在60℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/5。

(4)去蛋白、离心：Sevage法去蛋白，加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液(氯仿、正丁醇体积比为5∶1)，在恒温磁力搅拌器上剧烈搅拌30分钟，温度25℃；用Sigma台式冷冻离心机，温度4℃，以4000rpm的转速离心10分钟，回收上清液，弃去蛋白层及有机溶液，重复多次。

(5)将去蛋白后的活性提取液加入其4倍体积的95％乙醇在4℃透析沉降25h，调pH值为6，静置过夜，析出絮状白色物质，以4000rpm、20分钟离心分离得到白色沉淀，冷冻干燥，即制得目标产物尖顶羊肚菌胞外多糖提取物。

尖顶羊肚菌GIM5.70胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖84.0％，经DNS比色法测定含还原糖25.7％，经考马斯亮兰法测定含蛋白5.07％。

实施例2

一种尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，步骤如下：

(1)将尖顶羊肚菌经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体发酵培养。具体的培养基配方和培养条件同实施例1。

(2)将发酵物通过离心和真空抽滤分离菌丝体，获得澄清的发酵液。具体方法同实施例1。

(3)浓缩发酵液：用旋转蒸发仪在50℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/3。

(4)去蛋白、离心：同实施例1。

(5)将去蛋白后的活性提取液加入其1倍体积的95％乙醇在0℃透析沉降15h，pH值为4，静置过夜，析出絮状白色物质，以5000rpm、30分钟离心分离得到白色沉淀，冷冻干燥，即制得目标产物尖顶羊肚菌胞外多糖提取物。

尖顶羊肚菌GIM5.70胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖84.0％，经DNS比色法测定含还原糖25.7％，经考马斯亮兰法测定含蛋白5.07％。

实施例3

一种尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，步骤如下：

(1)将尖顶羊肚菌经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体发酵培养。具体的培养基配方和培养条件同实施例1。

(2)将发酵物通过离心和真空抽滤分离菌丝体，获得澄清的发酵液。具体方法同实施例1。

(3)浓缩发酵液：用旋转蒸发仪在70℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/6。

(4)去蛋白、离心：同实施例1。

(5)将去蛋白后的活性提取液加入其5倍体积的95％乙醇在10℃透析沉降25h，pH值为8，静置过夜，析出絮状白色物质，以4500rpm、25分钟离心分离得到白色沉淀，冷冻干燥，即制得目标产物尖顶羊肚菌胞外多糖提取物。

尖顶羊肚菌GIM5.70胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖84.0％，经DNS比色法测定含还原糖25.7％，经考马斯亮兰法测定含蛋白5.07％。

实施例4

一种尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，步骤如下：

(1)将尖顶羊肚菌经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体发酵培养。具体的培养基配方和培养条件同实施例1。

(2)将发酵物通过离心和真空抽滤分离菌丝体，获得澄清的发酵液。具体方法同实施例1。

(3)浓缩发酵液：用旋转蒸发仪在60℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/4。

(4)去蛋白、离心：同实施例1。

(5)将去蛋白后的活性提取液加入其3倍体积的95％乙醇在5℃透析沉降12h，pH值为自然，静置过夜，析出絮状白色物质，以4000rpm、20分钟离心分离得到白色沉淀，冷冻干燥，即制得目标产物尖顶羊肚菌胞外多糖提取物。

尖顶羊肚菌GIM5.70胞外多糖提取物，经苯酚硫酸法测定含总糖84.0％，经DNS比色法测定含还原糖25.7％，经考马斯亮兰法测定含蛋白5.07％。

实施例5

尖顶羊肚菌胞外多糖提取物(实施例1制备的)体外抗氧化试验

尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对超氧阴离子自由基、羟基自由基和ABTS+自由基的清除作用

A、胞外多糖对超氧阴离子自由基的清除作用：按抗超氧阴离子自由基试剂盒(购买于南京建成生物工程研究所)配制试剂，设对照组、标准管和测定管。各按顺序加入试剂一：1.0mL，三管分别加蒸馏水、0.5mg/mL的Vc标准品和样品：0.05mL，试剂二(ml)、试剂三(ml)、试剂四(ml)各0.1mL，用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟后加显色剂2.0mL，混匀，10分钟后于550nm比色。计算公式：

样品中抗超氧阴离子活力单位(U/g)＝(A对-A测)/(A对-A标)×标准浓度(0.15mg/ml)×1000ml×样品测试前稀释倍数

B、胞外多糖对羟基自由基的清除作用

空白管：取pH7.4，0.2mol/L的磷酸缓冲液1.0mL和4.0mL蒸馏水于试管中，混匀；未损伤管(A未损伤)：取1.0mL的磷酸缓冲液，0.75mL邻二氮菲、0.5mLFeSO₄和2.75mL蒸馏水于试管中，混匀；损伤管(A损伤)：同上，把未损伤管的蒸馏水改为2.25mL蒸馏水和0.5mL H₂O₂(0.1％)的混合液；样品管(A样品)：把未损伤管的蒸馏水改为0.5mL H₂O₂和1.25mL蒸馏水的混合液。37℃保温60min，于波长510nm处，测吸光度(A)值。计算公式：

抑制率I(％)＝[A(样)-A(损)]/[A(未)-A(损)]×100％

C、胞外多糖对ABTS+自由基清除作用

将5mL的7mmolPL ABTS和88μL的140mmol/L高硫酸钾混合，在室温、避光的条件下静置过夜，形成ABTS+自由基储备液，用无水乙醇稀释成工作液，要求当在200μL工作液中加入无水乙醇时其在30℃、734nm波长下的吸光度为0.51±0.02，取不同浓度的各样品20μL，加入300μL的ABTS+工作液，以无水乙醇为空白，混合10s，30℃静置7min，在734nm下测吸光度记为A，同法20μL无水乙醇中加入300μl ABTS+工作液混匀，测吸光度记为A1；不加ABTS+工作液的不同浓度的各样品吸光度记为B。以Vc为阳性对照组。计算公式：

抑制率％＝[A1-(A-B)]/A1×100％

试验数据如图1、图2和图3所示。

从图1可见，多糖对O_2-·自由基的清除能力以抑制率表示，抑制率越高，说明多糖抗氧化作用越强。2mg/mL的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物和Vc对O_2-·自由基抑制率分别为43.06％、50.02％，两者的抑制率接近。对O_2-·自由基的清除效率与多糖浓度呈一定的量效关系，抑制作用随着反应体系中多糖浓度的增大而增强。

由图2可见，1mg/mL的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对羟基自由基的抑制率为72.4％，抑制率为50％对应的浓度Vc为0.58mgg/mL，此多糖的浓度为：0.81mg/mL。低浓度时，Vc对清除羟基自由基作用的效果较佳，但随着浓度的增加，多糖的作用也不断加强，说明尖顶羊肚菌胞外多糖在一定浓度范围内对羟基自由基具有一定的清除活性。

从图3可知，0.1mg/mL的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对ABTS自由基的抑制率为77.43％。抑制率为50％对应的浓度Vc为0.027mg g/mL，多糖浓度为：0.026mg/mL。在一定的浓度范围内，多糖对ABTS+自由基的清除效率和多糖浓度呈一定的量效关系，随着多糖浓度的增加，多糖对自由基的抑制率也逐步增加。

实施例6

尖顶羊肚菌胞外多糖提取物(实施例1制备的)对果蝇生存寿命影响试验

(1)将成熟野生型黑腹果蝇(北京万域美澜科技有限公司购买)装入有基础培养基的50mL三角瓶内交配产卵，形成蛹时除去亲本蝇，收取10h内羽化的果蝇，用乙醚将其麻醉后，即分雌雄，挑取体型大小相近的果蝇随机分组。多糖组的培养基采用基础培养基按0.2g/L、1g/L、5g/L、25g/L的浓度加入尖顶羊肚菌胞外多糖提取物。空白对照组用基础培养基培养。

(2)每个浓度组共用160只果蝇，雌雄各半，各4支管，雌雄分养，每管20只果蝇。多糖组的果蝇在基础培养基中培养到第14天后，转到含不同浓度多糖提取物的培养基中培养直至其全部死亡。实验在温度25±1℃、相对湿度50％～70％的培养箱内进行，每4天更换新鲜的培养基。每天定时统计果蝇死亡数直至果蝇全部死亡。实验结束后计算每组的平均寿命、半数死亡时间和最高寿命(每组最后死亡的5只果蝇的平均存活天数为该组的最高寿命)。本实施例的试验数据如下表1所示。

表1尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对果蝇寿命的影响

备注：与同性别空白对照组比较，＊：P＜0.05；＊＊：P＜0.01(P是指几组数据之间的差异性)。

从表1可知，0.2g/L、1g/L、5g/L和25g/L四个浓度组的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物都能延长雄性果蝇的平均寿命(P＜0.01)和最高寿命(P＜0.01)，平均寿命延长率分别为30.27％、12.90％、12.42％和15.84％；最高寿命延长率为31.52％、28.39％、15.20％和37.60％；浓度为0.2g/L、1g/L的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物使雄性果蝇的半数死亡时间分别延长了32.35％和32.09％(P＜0.01)。

0.2g/L、1g/L、5g/L的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物能提高雌性果蝇的平均寿命，其平均寿命延长率分别为22.18％(P＜0.01)、11.37％(P＜0.01)和9.04％(P＜0.05)；0.2g/L的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物使雌性果蝇的半数死亡时间延长了20.55％(P＜0.01)，但随多糖浓度的升高，雌性果蝇的平均寿命延长率和半数死亡时间延长率都呈下降趋势，0.2g/L和25g/L的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物可延长雌性果蝇的最高寿命，其最高寿命延长率分别为20.39％(P＜0.05)和25.19％(P＜0.01)。

尖顶羊肚菌胞外多糖提取物能显著延长果蝇的寿命，不同浓度对果蝇的延寿效果不一样，0.2g/L尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对果蝇平均寿命、半数死亡时间和最高寿命效果更为明显；25g/L的此多糖提取物对果蝇最高寿命的影响明显(P＜0.01)。尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对果蝇寿命的影响存在性别差异，对雄性果蝇的延寿效果要比对雌性果蝇好。

实施例7

尖顶羊肚菌胞外多糖提取物延缓衰老作用的实验，所用的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物是由实施例1制备的。

(1)尖顶羊肚菌胞外多糖提取物延缓衰老作用的实验(高剂量)

①昆明种小鼠，SPF级，体重20±2克，由中山医科大学动物实验中心购买，合格证号：SCXK(粤)2004-0011；粤监证字2008A059。将小鼠随机分为空白对照组、造模组、阳性对照组、尖顶羊肚菌多糖提取物高剂量组，每组10只，雌雄各半，自由进食和饮水，造模组、阳性对照组、高剂量组每天腹腔注射剂量为120mg/kg·d的D-半乳糖溶液0.2mL，空白对照组注射等量的生理盐水，连续注射42天。高剂量组分别灌胃尖顶羊肚菌多糖提取物浓度为800mg/kg·d，阳性对照组灌胃浓度为800mg/kg·d的维生素E，空白对照组和造模组分别灌胃生理盐水，各组小鼠的灌胃量均为0.2mL。

②实验周期42天，实验结束后，用黄嘌呤氧化酶法测定小鼠脑的SOD活性，硫代巴比妥酸法测定小鼠脑MDA含量，荧光比色法测定小鼠脑LF含量。

(2)尖顶羊肚菌胞外多糖提取物延缓衰老作用的实验(中剂量)

①昆明种小鼠，SPF级，体重20±2克，由中山医科大学动物实验中心购买，合格证号：SCXK(粤)2004-0011；粤监证字2008A059。将小鼠随机分为空白对照组、造模组、阳性对照组、尖顶羊肚菌多糖提取物中剂量组，每组10只，雌雄各半，自由进食和饮水，造模组、阳性对照组、中剂量组每天腹腔注射剂量为120mg/kg·d的D-半乳糖溶液0.2mL，空白对照组注射等量的生理盐水，连续注射42天。中剂量组分别灌胃尖顶羊肚菌多糖提取物浓度为200mg/kg·d，阳性对照组灌胃浓度为800mg/kg·d的维生素E，空白对照组和造模组分别灌胃生理盐水，各组小鼠的灌胃量均为0.2mL。

②实验周期42天，实验结束后，用黄嘌呤氧化酶法测定小鼠脑的SOD活性，硫代巴比妥酸法测定小鼠脑MDA含量，荧光比色法测定小鼠脑LF含量。

(3)尖顶羊肚菌胞外多糖提取物延缓衰老作用的实验(低剂量)

①昆明种小鼠，SPF级，体重20±2克，由中山医科大学动物实验中心购买，合格证号：SCXK(粤)2004-0011；粤监证字2008A059。将小鼠随机分为空白对照组、造模组、阳性对照组、尖顶羊肚菌多糖提取物低剂量组，每组10只，雌雄各半，自由进食和饮水，造模组、阳性对照组、低剂量组每天腹腔注射剂量为120mg/kg·d的D-半乳糖溶液0.2mL，空白对照组注射等量的生理盐水，连续注射42天。低剂量组分别灌胃尖顶羊肚菌多糖提取物浓度为50mg/kg·d，阳性对照组灌胃浓度为800mg/kg·d的维生素E，空白对照组和造模组分别灌胃生理盐水，各组小鼠的灌胃量均为0.2mL。

②实验周期42天，实验结束后，用黄嘌呤氧化酶法测定小鼠脑的SOD活性，硫代巴比妥酸法测定小鼠脑MDA含量，荧光比色法测定小鼠脑LF含量。

上述(1)、(2)、(3)的实验数据如表2和图4所示。

表2尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对小鼠脑SOD、LF、MDA影响(x±s)

注：与造模组比较，*：P＜0.05；**：P＜0.01(P是指几组数据之间的差异性)。

从表2可知，尖顶羊肚菌胞外多糖提取物在50mg/kg·d的剂量下使雄性小鼠脑SOD活性提高20.70％(P＜0.05)，脑LF含量降低35.14％(P＜0.01)，脑MDA含量降低15.10％；其对雌性小鼠脑SOD活性提高21.13％(P＜0.05)，脑LF含量降低44.79％(P＜0.01)，脑MDA含量降低15.61％，小鼠SOD活性比阳性对照组高，LF含量比阳性对照组低。

200mg/kg·d尖顶羊肚菌胞外多糖提取物能使雄性小鼠脑LF含量降低24.32％(P＜0.05)，MDA含量降低18.68％；其使雌性小鼠脑LF含量、MDA含量分别降低41.67％(P＜0.01)、19.41％，但是对雄性和雌性小鼠脑SOD活性均与模型组没有显著差异。

800mg/kg·d的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物能使雄性小鼠脑LF含量降低29.73％(P＜0.01)，MDA含量降低19.13％，脑SOD活性则比模型组降低13.20％，但没有显著差异(P＞0.05)；其能使雌性小鼠脑LF含量、MDA含量分别降低31.25％(P＜0.01)、23.07％(P＜0.05)，使脑SOD活性提高了18.02％，但无显著差异(P＞0.05)。

从图4可见，尖顶羊肚菌胞外多糖提取物对小鼠的LF影响最大，本实验所设置的3个剂量组中，50mg/kg·d(低剂量组)的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物具有良好的延缓衰老效果，总体优于阳性对照组，且具有性别的差异，对雌性小鼠的延缓衰老作用略优于对雄性小鼠的。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将尖顶羊肚菌液体发酵液浓缩至原体积的1/3～1/6，得到浓缩液，浓缩温度为50～70℃；

(2)浓缩液采用Sevage法去蛋白、离心，得到去蛋白后的活性提取液；

(3)去蛋白后的活性提取液用1～5倍体积的95％乙醇在0～10℃透析沉降浓缩液中的多糖12～25小时，pH值为4～8，静置析出絮状白色物质，再离心分离得到白色沉淀，冷冻干燥，制得尖顶羊肚菌胞外多糖提取物。

2.根据权利要求1所述尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)Sevage法去蛋白、离心是在浓缩液中加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液，在恒温磁力搅拌器上搅拌30分钟，用Sigma台式冷冻离心机，温度4℃，以4000rpm的转速离心10分钟，回收上清液即去蛋白后的活性提取液。

3.根据权利要求1所述尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述尖顶羊肚菌液体发酵液浓缩至原体积的1/5，所述浓缩温度为60℃；步骤(3)中所述活性提取液用4倍体积的95％乙醇在4℃透析沉降浓缩液中的多糖25小时，pH值为6。

4.根据权利要求1所述尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述尖顶羊肚菌液体发酵液是经过尖顶羊肚菌(Morchella conica)液体发酵培养，得到发酵物，再通过离心和真空抽滤分离菌丝体，获得的发酵液。

5.根据权利要求4所述尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述尖顶羊肚菌液体发酵培养是将尖顶羊肚菌接种到液体发酵培养基中发酵培养，其液体发酵培养基配方为：葡萄糖150g，硝酸铵6g，KH₂PO₄3.0g，MgSO₄·7H₂O 3.0g，维生素B10.3g，加蒸馏水定容至3000ml。

6.根据权利要求5所述尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述发酵培养的步骤是：(1)取100ml所述液体发酵培养基，在其中接入3个直径为4mm的尖顶羊肚菌菌丝块，经灭菌后，在25～28℃，转速130～160rpm，避光恒温振荡培养6～8天，得到液体菌种；(2)将上述液体菌种接入3L灭菌后的所述液体发酵培养基中，培养温度为25～28℃，转速为130～160rpm，培养5～9天，得到发酵物。

7.根据权利要求1所述尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述离心条件为：转速4000-5000rpm、时间20-30min。

8.一种顶羊肚菌胞外多糖提取物，是由权利要求1～7任一顶所述的方法制备得到。

9.权利要求8所述的尖顶羊肚菌胞外多糖提取物在制备抗氧化和延缓衰老药物或保健食品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述尖顶羊肚菌胞外多糖提取物的使用剂量为50mg/kg·d。

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