CN104497160A - 一种蛹虫草多糖提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛹虫草多糖提取物及其制备方法与应用。所述的蛹虫草多糖提取物的制备方法，包含如下步骤：深层发酵培养蛹虫草菌丝体后，发酵产物通过离心分离除出菌丝体，获得发酵液；发酵液超滤去除小分子物质后，浓缩；浓缩后的发酵液通过去蛋白、乙醇沉淀、双氧水脱色，透析最后经真空冷冻干燥，制得蛹虫草多糖提取物。本发明制备过程简单、可高效高质大量生产，制备得到的蛹虫草多糖提取物对人体无毒害，具有良好降血脂的生理作用，可用于开发降血脂药物或保健食品。

Description

一种蛹虫草多糖提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛹虫草多糖提取物及其制备方法与应用。

背景技术

通过液体深层发酵食药用真菌菌丝体获得发酵产物，一般可以分别提取菌丝体中的胞内多糖和发酵液中的胞外多糖。

利用蛹虫草(Cordyceps militaris)菌丝培养产生的活性物质，与其子实体的活性成分、药理、毒理、临床及安全性方面具有相似性(曾宏彬等，2011)。现在普遍认为虫草多糖、虫草素、虫草酸等是蛹虫草重要的功效成分(张仁堂等，2014)。蛹虫草的液体发酵成为快速获得其菌丝体及其次生代谢产物的主要方法。房天琪等(2011)研究了蛹虫草菌丝体的摇瓶发酵工艺研究，得出最佳工艺参数为葡萄糖23.34g/L，玉米浆12.5mL/L，接种量9％，发酵温度25℃，KH₂PO₄1g/L和MgSO₄·7H₂O 1g/L，维生素Bl 2g/L、发酵转速150rpm，pH值7.0，菌丝生物量达到15.59g/L。杨杰等(2011)以蛹虫草菌丝生物量为指标，进行了60L发酵罐的培养条件研究，发现最佳装液量为35L/罐，通气量为0.9m³/h，最适的起始pH 6.4。以多糖等生理活性物质产量为指标的蛹虫草发酵条件的研究已有报道，李春丽等(2010)发现，蛹虫草的最佳培养基配方为：葡萄糖4％，豆浆30％，KH₂PO₄0.15％，MnCl₂0.1％，液体发酵胞外多糖产量为5.96g/L。Wang等(2011)将蛹虫草发酵液浓缩，乙醇沉淀多糖，用sevage法去蛋白，并透析冷冻干燥可得胞外粗多糖。一方面利用子实体获得多糖提取物，需耗费大量资源，目前蛹虫草子实体生长周期较长，且产量有限，自然环境生长采集的野生子实体数量稀少，用来提取多糖成本高；另一方面利用半合成培养基深层发酵对所得的多糖成分影响较大，不利于分离纯化和生理功效鉴定。研究发现，蛹虫草表现抗肿瘤，抗菌，降血糖，提高免疫机能和清除氧自由基抗疲劳等药理作用(叶晶晶等，2011；桂仲争等，2012)。从当前的研究可知，针对含蛹虫草胞外多糖提取物的生物活性或药效的研究大多体现在抗肿瘤和免疫调节等领域。有关蛹虫草液体深层发酵物降血脂作用的研究尚未见到有相关文献报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种蛹虫草多糖提取物的制备方法，该制备方法稳定可靠、成本低。

本发明的另一个目的在于提供上述制备方法制备得到的蛹虫草多糖提取物。

发明的另一个目的在于提供上述蛹虫草多糖提取物的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种蛹虫草多糖提取物的制备方法，包含如下步骤：

(1)将蛹虫草(Cordyceps militaris)发酵液超滤去除小分子物质后，得到蛹虫草超滤液；

(2)将蛹虫草超滤液浓缩，得到蛹虫草超滤浓缩液；

(3)蛹虫草超滤浓缩液采用胰蛋白酶和Sevage法去蛋白，得到去蛋白后的多糖提取液；

(4)用乙醇沉降去蛋白后的多糖提取液中的多糖，离心得到沉淀，沉淀脱色、透析、干燥后，制备得到蛹虫草多糖提取物；

步骤(1)中所述的蛹虫草发酵液的体积优选为150～250L；所述的蛹虫草超滤液的体积优选为10～30L；

步骤(1)中所述的超滤条件优选为进膜压力为10bar，通量3～5L/min，物料温度22℃；所述的超滤优选为用1万分子量PS超滤膜超滤；

步骤(2)中所述的浓缩温度优选为50～70℃；

步骤(2)中所述的蛹虫草超滤浓缩液的体积为蛹虫草超滤液的体积的1/5～1/10；

步骤(4)中所述的乙醇用量为去蛋白后的多糖提取液体积的3～5倍；

步骤(4)中所述的沉降的温度为0～25℃，沉降的时间为12～48h；

步骤(4)中所述的脱色、透析、干燥方法为：用水溶解沉淀并调节多糖溶液pH至8.0；然后滴加质量分数为30％的H₂O₂溶液，于50～55℃水浴保温2～3h，对其进行氧化脱色处理；然后将多糖溶液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中透析2～3d，每8～10h更换一次水；对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得蛹虫草多糖提取物；所述的质量分数为30％的H₂O₂溶液的用量为每100mL多糖液滴加2mL质量分数为30％的H₂O₂溶液；

步骤(3)中所述的采用胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步骤：

①将步骤(2)制备得到的蛹虫草超滤浓缩液调pH至8.0；然后将胰蛋白酶加入蛹虫草超滤浓缩液中充分混合并37℃振荡30～60min，再水浴灭酶10～15min，冷却至室温，得到去蛋白后的浓缩液；

②去蛋白后的浓缩液加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液，剧烈振荡30min～40min；然后离心，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液；

③重复步骤②1～3次，得到去蛋白后的多糖提取液；

步骤①所述的胰蛋白酶的初始浓度优选为2％(W/V)；所述的胰蛋白酶的用量为蛹虫草超滤浓缩液体积的(1:10)～(1:20)；

步骤①所述的灭酶温度优选为100℃；

步骤①所述的胰蛋白酶加入蛹虫草超滤浓缩液充分混合的具体操作优选为：配制2％(W/V)的胰蛋白酶溶液，将步骤(2)制备得到的蛹虫草超滤浓缩液调pH至8.0；然后将胰蛋白酶溶液和发酵浓缩液分别37℃水浴预热10～30min，将预热后的胰蛋白酶溶液和发酵浓缩液充分混合；

步骤②所述的氯仿正丁醇混合液中氯仿和正丁醇的体积比为5:1；

步骤②所述的离心转速为8000rpm，所述的离心时间为10min；

步骤(1)中所述的蛹虫草(C.militaris)发酵液是通过液体深层发酵培养，得到发酵产物，再通过离心除去菌丝体，获得蛹虫草发酵液；

所述的液体深层发酵培养的方法，包含如下步骤：

(Ⅰ)将蛹虫草斜面母种活化培养后转接至斜面固体培养基中，20～25℃培养8～15d，至菌丝铺满斜面为止，得到蛹虫草斜面菌种；

(Ⅱ)从步骤(Ⅰ)制得的蛹虫草斜面菌种上挑取4～6块菌块，接种至200mL液体发酵培养基中，室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在150rpm，24℃的条件下振荡培养6d，制得一级种子液；

(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)制得的一级种子液转入50L种子罐培养二级种子液，接种量为7％，培养温度为24℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量1.5m³/h(V:V为1:0.6)；培养3d后转入500L发酵罐进行发酵培养，初始培养温度、转速及罐压与种子罐相同，通气量为12m³/h，培养3～4d；

步骤(Ⅰ)所述的斜面固体培养基的配方为：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，蛋白胨1g，(NH₄)₂SO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1g，KH₂PO₄1g，琼脂20g，加水定容至1000mL，pH调至6.5；

步骤(Ⅱ)和(Ⅲ)中用于一级种子液和二级种子液培养以及发酵培养的培养基配方为：蔗糖50g、KNO₃4g、KH₂PO₄1g、MgSO₄·7H₂O 1g、维生素B10.05g、水1000mL、pH值为6.5；

一种蛹虫草多糖提取物，根据上述制备方法制备得到；

所述的蛹虫草多糖提取物可以应用于制备降血脂药物或保健食品，具有良好的降血脂作用；

所述的蛹虫草多糖提取物在降血脂药物与保健食品中的使用剂量为100mg/kg·d；

与现有的技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明的蛹虫草发酵液胞外多糖提取物，可采用发酵罐生产，从发酵液中获得胞外多糖提取物，不但制备过程简单，条件易控制，而且可大批量工厂化生产。

(2)本发明使用蔗糖和硝酸钾作为碳氮源的合成培养基进行发酵，不但培养基成分精确，重复性强，发酵效率高，而且多糖质量稳定、易于分离纯化，特别重要的是发酵的多糖测定不受培养基中糖含量的影响。

(3)使用不同蛹虫草菌株液体发酵，多糖产率和活性有所差异。本发明采用蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株，性状优良，适宜用于液体发酵产多糖，其产率高。

(4)本发明采用活化的斜面菌块接种于液体培养基，培养获得一级种子液，可以缩短液体种制备周期，简化生产工艺，而不需另外制备菌液。

(5)本发明先用乙醇沉淀浓缩液中的多糖，再少量水溶解多糖，进行脱色处理，针对性和目的性更强，不需要消耗较多双氧水，工艺简单易操作且效果好。

(6)本发明所得蛹虫草发酵液胞外多糖提取物，来源于蛹虫草液体深层发酵液，而且提取过程中安全可控，具有对人体无毒害的优点。本发明所得蛹虫草发酵液胞外多糖提取物溶解性好，具有良好的降血脂作用。

附图说明

图1为蛹虫草多糖提取物对小鼠血清TC的影响图。

图2为蛹虫草多糖提取物对小鼠血清TG的影响图。

图3为蛹虫草多糖提取物对小鼠血清LDL-C的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中涉及到的培养基配方：

斜面固体培养基配方：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，蛋白胨1g，(NH₄)₂SO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1g，KH₂PO₄1g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1000mL，pH调至6.5；

液体发酵培养基配方：蔗糖50g、KNO₃4g、KH₂PO₄1g、MgSO₄·7H₂O 1g、维生素B10.05g、水1000mL、pH值为6.5；

蛹虫草(C.militaris)菌株由华南师范大学生命科学学院提供(Ma L,ZhangS,et al.Hypouricemic Actions of Exopolysaccharide Produced by Cordycepsmilitaris in Potassium Oxonate-Induced Hyperuricemic Mice.CurrentMicrobiology,69(6):852-857，2014.)；

实施例1

(1)蛹虫草(C.militaris)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体深层发酵培养，获得发酵液，具体方法如下：

①斜面或平板菌种培养：将活化后的蛹虫草斜面母种菌丝块接入新的斜面固体培养基中，24℃培养10d，备用；

②一级液体菌种培养：取200mL液体发酵培养基装入500mL三角瓶，121℃灭菌20min，接入4～6个黄豆大小的的蛹虫草母种菌丝块；室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在24℃，转速150rpm条件下避光恒温振荡培养6天，得到一级种子液；

③二级液体菌种培养：50L种子罐装入液体发酵培养基35L，125℃灭菌20min；冷却后接入2.45L培养好的一级种子液，培养温度为24℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量1.5m³/h(V:V为1:0.6)培养3天，取样观察可发现到种子液清澈透亮，菌丝体丰富，大小均匀，得到二级种子液；

④液体深层发酵培养：将培养好的二级种子液转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m³/h，培养4d；

(2)将发酵产物通过高速离心获得发酵液，发酵液经1万分子量PS超滤膜超滤去除小分子物质后，浓缩至20L，得到蛹虫草超滤液；其中，超滤条件为：进膜压力约为10bar，通量3L/min，物料温度22℃；

(3)浓缩：用旋转蒸发仪将超滤液在60℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/5，得到蛹虫草超滤浓缩液；

(4)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、离心：称取2.0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中，再把1000mL的蛹虫草超滤浓缩液调pH至8.0，将酶液及蛹虫草超滤浓缩液同时放入37℃水浴锅中预热10min，然后把两者充分混合，并振荡保持30min后放入100℃水浴锅中灭酶10min，冷却至室温；加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液(氯仿:正丁醇(V:V)＝5:1)，剧烈震荡30min。然后8000rpm离心10min，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液，此过程重复2次，得到去蛋白后的多糖提取液；

(5)在去蛋白后的多糖提取液中加入4倍体积的乙醇，放于4℃冰箱冷藏2d，待析出粗多糖，离心得到沉淀；用少量蒸馏水溶解沉淀，调节多糖溶液pH至8.0，然后滴加质量分数为30％的H₂O₂(每100mL多糖液滴加2mL质量分数为30％的H₂O₂溶液)，在50℃下水浴保温2h，对其进行脱色素处理；之后，将多糖溶液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中以蒸馏水透析约3d，每8h更换一次蒸馏水。最后，对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得蛹虫草多糖提取物(EPCM)。

蛹虫草多糖提取物经苯酚硫酸法测定含总糖为58.26％，经DNS比色法测定含还原糖7.21％，经考马斯亮兰法测定含蛋白0.96％。

实施例2

(1)蛹虫草(C.militaris)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体深层发酵培养，获得发酵液，具体方法如下：

①斜面或平板菌种培养：将活化后蛹虫草斜面母种菌丝块接入新的斜面固体培养基中，20℃培养15d，备用；

②一级液体菌种培养：取200mL液体发酵培养基装入500mL三角瓶，121℃灭菌20min，接入4～6个黄豆大小的的蛹虫草母种菌丝块；室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在24℃，转速150rpm条件下避光恒温振荡培养6天，得到一级液体菌种；

③二级液体菌种培养：50L种子罐装入液体发酵培养基35L，125℃灭菌20min；冷却后接入2.45L培养好的一级种子液，培养温度为24℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量1.5m³/h(V:V为1:0.6)培养3天，取样观察可发现到种子液清澈透亮，菌丝体丰富，大小均匀，得到二级种子液；

④液体深层发酵培养：将培养好的二级种子液转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m³/h，培养3d；

(2)将发酵产物通过高速离心获得发酵液，发酵液经1万分子量PS超滤膜超滤去除小分子物质后，浓缩至20L，得到蛹虫草超滤液；其中，超滤条件为：进膜压力约为10bar，通量4L/min，物料温度22℃；

(3)浓缩：用旋转蒸发仪将超滤液在50℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/7，得到蛹虫草超滤浓缩液；

(4)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、离心：称取2.0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中，再把1000mL的蛹虫草超滤浓缩液调pH至8.0，将酶液及蛹虫草超滤浓缩液同时放入37℃水浴锅中预热10min，然后把两者充分混合，并振荡保持45min后放入100℃水浴锅中灭酶12min，冷却至室温；加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液(氯仿:正丁醇＝5:1)，剧烈震荡35min。然后6000rpm离心15min，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液，此过程重复3次，得到去蛋白后的多糖提取液；

(5)在去蛋白后的多糖提取液中加入3倍体积的乙醇，置于25℃沉降1d，待析出粗多糖，离心得到沉淀。用少量蒸馏水溶解沉淀，调节多糖溶液pH至8.0，然后滴加质量分数为30％的H₂O₂(每100mL多糖液滴加2mL质量分数为30％的H₂O₂溶液)，在55℃下水浴保温3h，对其进行脱色素处理。之后，将多糖溶液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中以蒸馏水透析约2d，每8h更换一次蒸馏水。最后，对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得蛹虫草多糖提取物(EPCM)。

蛹虫草多糖提取物经苯酚硫酸法测定含总糖为60.3％，经DNS比色法测定含还原糖8.21％，经考马斯亮兰法测定含蛋白0.93％。

实施例3

(1)蛹虫草(C.militaris)经斜面或平板菌种培养、液体振荡培养和液体深层发酵培养，获得发酵液，具体方法如下：

①斜面或平板菌种培养：将活化后蛹虫草斜面母种菌丝块接入新的斜面固体培养基中，25℃培养8d，备用；

②一级液体菌种培养：取200mL液体发酵培养基装入500mL三角瓶，121℃灭菌20min，接入4～6个黄豆大小的的蛹虫草母种菌丝块；室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在24℃，转速150rpm条件下避光恒温振荡培养6天，得到一级液体菌种；

③二级液体菌种培养：50L种子罐装入液体发酵培养基35L，125℃灭菌20min；冷却后接入2.45L培养好的一级种子液，培养温度为24℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量1.5m³/h(V:V为1:0.6)培养3天，取样观察可发现到种子液清澈透亮，菌丝体丰富，大小均匀，得到二级种子液；

④液体深层发酵培养：将培养好的二级种子液转入500L发酵罐培养，初始培养条件温度，转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m³/h，培养4d；

(2)将发酵产物通过高速离心获得发酵液，发酵液经1万分子量PS超滤膜超滤去除小分子物质后，浓缩至20L，得到蛹虫草超滤液；其中，超滤条件为：进膜压力约为10bar，通量5L/min，物料温度22℃；

(3)浓缩：用旋转蒸发仪将超滤液在70℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/10，得到蛹虫草超滤浓缩液；

(4)胰蛋白酶和sevage法去蛋白、离心：称取2.0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中，再把1000mL的蛹虫草超滤浓缩液调pH至8.0，将酶液及蛹虫草超滤浓缩液同时放入37℃水浴锅中预热10min，然后把两者充分混合，并振荡保持60min后放入100℃水浴锅中灭酶15min，冷却至室温；加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液(氯仿:正丁醇＝5:1)，剧烈震荡40min。然后7000rpm离心12min，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液，此过程重复1次，得到去蛋白后的多糖提取液；

(5)在去蛋白后的多糖提取液中加入5倍体积的乙醇，置于8℃沉降12h，待析出粗多糖，离心得到沉淀。用少量蒸馏水溶解沉淀，调节多糖溶液pH至8.0，然后滴加质量分数为30％的H₂O₂(每100mL多糖液滴加2mL质量分数为30％的H₂O₂溶液)，在52℃下水浴保温2.5h，对其进行脱色素处理。之后，将多糖溶液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中以蒸馏水透析约3d，每10h更换一次蒸馏水。最后，对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得蛹虫草多糖提取物(EPCM)。

蛹虫草多糖提取物经苯酚硫酸法测定含总糖为57.49％，经DNS比色法测定含还原糖7.03％，经考马斯亮兰法测定含蛋白0.95％。

实施例4蛹虫草多糖提取物(EPCM)(实施例1制备得到)降血脂实验

(1)蛹虫草多糖提取物(EPCM)降血脂作用的实验(高剂量)

①昆明种小鼠，SPF级别，雄性，体重18～22g，购自中山大学实验动物中心。许可证号：SCK(粤)2011-0029；高脂饲料(配方为：10％猪油、1.0％胆固醇、0.3％胆盐、88.7％普通饲料)，购自广东省医学实验动物中心。许可证号：SCK(粤)2008-0002。小鼠用普通饲料适应性喂养4d后，根据小鼠体重随机分为正常对照组，高脂模型组，阳性对照组(辛伐他汀，10mg/(kg·d))，200mg/(kg·d)多糖提取物高剂量组，每组小鼠数为10只。实验期间小鼠自由饮水，定量给食。所有小鼠饲养于温度为18～22℃，相对湿度为50％～60％，有自然光照的标准实验动物房。除正常对照组小鼠给予普通饲料外，其他各实验组给予高脂饲料，每只小鼠5g/d(后两周增至6g/d)。采取预防模式给药：即高脂饲料建模与给药同时进行。每天上午定时对实验处理组小鼠灌胃各药物一次，每只小鼠灌胃量均为0.5mL，正常对照组和高脂模型组灌胃等体积的蒸馏水。实验进行28d。实验期间每周称量一次体重，每日观察小鼠摄食，自主活动情况。

②最后一天灌胃后，小鼠禁食不禁水12h，断颈取血，分离得血清后分别检测血脂四项指标TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。取血后迅速解剖小鼠，取其心脏，肝脏、肾脏、脾脏，并计算心指数、肝指数、肾指数和脾指数(以脏器鲜重/体重表示)。

(2)蛹虫草多糖提取物(EPCM)降血脂作用的实验(中剂量)

①昆明种小鼠，SPF级别，雄性，体重18～22g，由中山大学实验动物中心提供。许可证号：SCK(粤)2011-0029；高脂饲料(配方为：10％猪油、1.0％胆固醇、0.3％胆盐、88.7％普通饲料)，由广东省医学实验动物中心提供。许可证号：SCK(粤)2008-0002。小鼠用普通饲料适应性喂养4d后，根据小鼠体重随机分为正常对照组，高脂模型组，阳性对照组(辛伐他汀，10mg/(kg·d))，100mg/(kg·d)多糖提取物中剂量组，每组小鼠数为10只。实验期间小鼠自由饮水，定量给食。所有小鼠饲养于温度为18～22℃，相对湿度为50％～60％，有自然光照的标准实验动物房。除正常对照组小鼠给予普通饲料外，其他各实验组给予高脂饲料，每只小鼠5g/d(后两周增至6g/d)。采取预防模式给药：即高脂饲料建模与给药同时进行。每天上午定时对实验处理组小鼠灌胃各药物一次，每只小鼠灌胃量均为0.5mL，正常对照组和高脂模型组灌胃等体积的蒸馏水。实验进行28d。实验期间每周称量一次体重，每日观察小鼠摄食，自主活动情况。

②最后一天灌胃后，小鼠禁食不禁水12h，断颈取血，分离得血清后分别检测血脂四项指标TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。取血后迅速解剖小鼠，取其心脏，肝脏、肾脏、脾脏，并计算心指数、肝指数、肾指数和脾指数(以脏器鲜重/体重表示)。

(3)蛹虫草多糖提取物(EPCM)降血脂作用的实验(低剂量)

①昆明种小鼠，SPF级别，雄性，体重18～22g，由中山大学实验动物中心提供。许可证号：SCK(粤)2011-0029；高脂饲料(配方为：10％猪油、1.0％胆固醇、0.3％胆盐、88.7％普通饲料)，由广东省医学实验动物中心提供。许可证号：SCK(粤)2008-0002。小鼠用普通饲料适应性喂养4d后，根据小鼠体重随机分为正常对照组，高脂模型组，阳性对照组(辛伐他汀，10mg/(kg·d))，50mg/(kg·d)多糖提取物低剂量组，每组小鼠数为10只。实验期间小鼠自由饮水，定量给食。所有小鼠饲养于温度为18～22℃，相对湿度为50％～60％，有自然光照的标准实验动物房。除正常对照组小鼠给予普通饲料外，其他各实验组给予高脂饲料，每只小鼠5g/d(后两周增至6g/d)。采取预防模式给药：即高脂饲料建模与给药同时进行。每天上午定时对实验处理组小鼠灌胃各药物一次，每只小鼠灌胃量均为0.5mL，正常对照组和高脂模型组灌胃等体积的蒸馏水。实验进行28d。实验期间每周称量一次体重，每日观察小鼠摄食，自主活动情况。

②最后一天灌胃后，小鼠禁食不禁水12h，断颈取血，分离得血清后分别检测血脂四项指标TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。取血后迅速解剖小鼠，取其心脏，肝脏、肾脏、脾脏，并计算心指数、肝指数、肾指数和脾指数(以脏器鲜重/体重表示)。

上述(1)、(2)、(3)的实验数据如表1，表2和表3所示。

表1 蛹虫草多糖提取物(EPCM)对小鼠血清TC及TG的影响

注：与正常对照组相比*P<0.05，**P<0.01；与高脂模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

由表1可知，小鼠摄食高脂饲料至最后一天，与正常对照组相比，高脂模型组小鼠血清中TC的含量极显著地升高了104.72％(P<0.01)；由表2可知，实验结束时，相对正常对照组，小鼠摄食高脂饲料使得其血清LDL-C、HDL-C和动脉粥样硬化指数AI极显著地升高285.14％，56.16％和44.20％(P<0.01)，以上说明摄入外源性高脂成分使得小鼠体内脂质水平极显著升高，是典型的脂质代谢紊乱症状，这提示本实验小鼠高脂血症模型已成功建立。

与高脂模型组相比，50mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)及200mg/(kg·d)EPCM分别使小鼠血清TC极显著下降19.82％、20.05％和16.36％(P<0.01)。从上述可知，100mg/(kg·d)的EPCM表现出最佳的降TC效果。阳性药物使小鼠血清TC极显著降低11.98％。与阳性药物相比，EPCM表现出比阳性药物辛伐他汀更佳的降低TC效果，但差异不显著(P>0.05)。

与此同时，各剂量组的蛹虫草胞外多糖提取物均发挥降低TG的作用。与高脂模型组相比，50mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)及200mg/(kg·d)的EPCM也可使TG极显著下降49.59％、45.45％和57.02％(P<0.01)。由上述可知，200mg/(kg·d)的EPCM表现出最佳的降TG效果，这种效果甚至极显著优于阳性药物辛伐他汀的降TG作用(P<0.01)。

综上所述，低中高剂量的EPCM也均表现出良好的降低高脂血症小鼠血清TC和TG的水平，其中以100mg/(kg·d)剂量下使TC降低20.05％(P<0.01)，200mg/(kg·d)剂量下使TG降低57.02(P<0.01)(图1～3)。

表2 蛹虫草多糖提取物(EPCM)对小鼠血清LDL-C，HDL-C和AI的影响

注：与正常对照组相比*P<0.05，**P<0.01；与高脂模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

实验至最后一天，相对正常对照组，高脂模型中小鼠血清LDL-C的水平极显著的升高(P<0.01)。与高脂模型组相比，阳性药物显著地降低了高脂血症小鼠血清LDL-C的水平(P<0.05)，而各剂量组的EPCM均极显著地降低了LDL-C的水平(P<0.01)。50mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)及200mg/(kg·d)的EPCM分别使LDL-C下降33.33％、52.63％和21.75％。其中EPCM在100mg/(kg·d)剂量下降LDL-C幅度最大。由以上可知，100mg/(kg·d)的EPCM有最佳降LDL-C效果，降幅分别达52.63％，这种效果优于阳性药物辛伐他汀的药效(P<0.01)。

辛伐他汀使HDL-C升高14.04％，但未达到显著水平(P>0.05)。与高脂模型组比较，各剂量的IPCM和EPCM均未能显著升高小鼠血清HDL-C的水平，这表明IPCM和EPCM不能通过HDL-C逆转运这一途径发挥降血脂的作用。

动脉粥样硬化指数是反应血脂异常升高导致动脉粥样硬化的有效指标。与正常对照组相比，高脂模型组小鼠的AI极显著升高(P<0.01)。各剂量的EPCM则未对AI产生明显影响(P>0.05)。

表3 蛹虫草多糖提取物(EPCM)对小鼠体重的影响

注：与正常对照组相比*P<0.05，**P<0.01；与高脂模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

从表3可以看出，在实验起始日，各实验组小鼠体重无明显差异。至第14d时，摄食高脂饲料后，高脂模型组小鼠体重相对正常组有显著增加(P<0.05)。这表明，高脂成分导致小鼠出现肥胖现象。在第28d，实验结束时，高脂模型组小鼠体重相对正常对照组的差异不显著(P>0.05)，其原因可能是实验后期小鼠对高脂饲料产生轻微的厌食现象，这使得摄食高脂饲料的小鼠体重增长减慢。与高脂模型组相比，200mg/(kg·d)的EPCM使小鼠体重显著降低(P<0.05)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种蛹虫草多糖提取物的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)将蛹虫草(Cordyceps militaris)发酵液超滤去除小分子物质后，得到蛹虫草超滤液；

(2)将蛹虫草超滤液浓缩，得到蛹虫草超滤浓缩液；

(3)蛹虫草超滤浓缩液采用胰蛋白酶和Sevage法去蛋白，得到去蛋白后的多糖提取液；

(4)用乙醇沉降去蛋白后的多糖提取液中的多糖，离心得到沉淀，沉淀脱色、透析、干燥后，制备得到蛹虫草多糖提取物；

步骤(3)中所述的采用胰蛋白酶和Sevage法，包含如下步骤：

①将步骤(2)制备得到的蛹虫草超滤浓缩液调pH至8.0；然后将胰蛋白酶加入蛹虫草超滤浓缩液充分混合并37℃振荡30～60min，再水浴灭酶10～15min，冷却至室温，得到去蛋白后的浓缩液；

②去蛋白后的浓缩液加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液，剧烈振荡30min～40min；然后离心，弃取蛋白层及有机溶液，回收上清液；

重复步骤②1～3次，去蛋白后的多糖提取液。

2.根据权利要求1所述的蛹虫草多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的超滤条件为进膜压力为10bar，通量3～5L/min，物料温度22℃。

3.根据权利要求1所述的蛹虫草多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的浓缩温度为50～70℃。

4.根据权利要求1所述的蛹虫草多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的沉降的温度为0～25℃，沉降的时间为12～48h。

5.根据权利要求1所述的蛹虫草多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的脱色、透析、干燥方法为：用水溶解沉淀并调节多糖溶液pH至8.0；然后滴加质量分数为30％的H₂O₂溶液，于50～55℃水浴保温2～3h，对其进行氧化脱色处理；然后将多糖溶液装入截留分子量为8000～15000Da的透析袋中透析2～3d，每8～10h更换一次水；对透析完成后的溶液进行浓缩，并真空冷冻干燥，获得蛹虫草多糖提取物。

6.根据权利要求1所述的蛹虫草多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的蛹虫草发酵液是通过液体深层发酵培养，得到发酵产物，再通过离心除去菌丝体，获得蛹虫草发酵液；

所述的液体深层发酵培养的方法，包含如下步骤：

(Ⅰ)将蛹虫草斜面母种活化培养后转接至斜面固体培养基中，20～25℃培养8～15d，至菌丝铺满斜面为止，得到蛹虫草斜面菌种；

(Ⅱ)从步骤(Ⅰ)制得的蛹虫草斜面菌种上挑取4～6块菌块，接种至200mL液体发酵培养基中，室温静置24h，待菌块伤口处愈合后在150rpm，24℃的条件下振荡培养6d，制得一级种子液；

(Ⅲ)将步骤(Ⅱ)制得的一级种子液转入50L种子罐培养二级种子液，接种量为7％，培养温度为24℃，转速为150rpm，罐压为0.05～0.07MPa，通气量1.5m³/h，培养3d后转入500L发酵罐进行发酵培养，初始培养温度、转速及罐压与种子罐相同，通气量约为12m³/h，培养3～4d。

7.根据权利要求6所述的蛹虫草多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(Ⅱ)和(Ⅲ)中用于一级种子液和二级种子液培养以及发酵培养的培养基配方为：蔗糖50g、KNO₃4g、KH₂PO₄1g、MgSO₄·7H₂O 1g、维生素B10.05g、水1000mL、pH值为6.5。

8.根据权利要求6所述的蛹虫草多糖提取物的制备方法，其特征在于：

步骤(Ⅰ)所述的斜面固体培养基的配方为：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，蛋白胨1g，(NH₄)₂SO₄2g，MgSO₄·7H₂O 1g，KH₂PO₄1g，琼脂20g，加水定容至1000mL，pH调至6.5。

9.一种蛹虫草多糖提取物，其特征在于根据权利要求1～9任一项所述的制备方法制备得到。

10.权利要求9所述的蛹虫草多糖提取物在制备降血脂药物或保健食品中的应用。