CN111040044A - 一种蛹虫草胞内多糖及制备方法及其在调节肠道菌群中的应用 - Google Patents

一种蛹虫草胞内多糖及制备方法及其在调节肠道菌群中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蛹虫草胞内多糖及制备方法及其在调节肠道菌群中的应用。该方法包含如下步骤：将蛹虫草菌种进行发酵培养后分离得到蛹虫草菌丝体；然后将蛹虫草菌丝体脱脂处理后进行热水浸提，得到蛹虫草浸提液；再采用胰蛋白酶和Sevage法除蛋白，乙醇沉淀，DEAE‑Sepharose Fast Flow柱层析纯化，得到蛹虫草胞内多糖。本发明中制备的蛹虫草胞内多糖能调节高脂饮食小鼠肠道细菌菌群结构，促生高脂饮食小鼠肠道益生菌，改善厚壁菌门/拟杆菌比例，同时可调节真菌菌群结构，促进肠道丁酸盐的合成途径并诱导激活短链脂肪酸受体，促进脂肪的代谢和抑制脂肪的累积，从而起到降血脂和保肝作用。

Description

一种蛹虫草胞内多糖及制备方法及其在调节肠道菌群中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种蛹虫草胞内多糖及制备方法及其在调节肠道菌群中的应用。
背景技术
肠道菌群，人体肠道寄宿着的正常微生物，其数量是人体细胞的10倍以上。在正常情况下，肠道菌群与宿主之间，肠道菌群、肠道环境与宿主之间，处于动态平衡状态。肠道菌群间相互依存，相互制约，共同形成了一个相对稳定的肠道微生态环境。肠道菌群是人体最大的免疫器官，对人体免疫调节、内分泌系统、神经系统有种重要的调节作用，介导了多种内分泌疾病的代谢途径。
大量研究表明，肠道微生态结构的失衡是引起机体高血糖、高血脂、高血压等代谢性疾病以及人体肥胖的重要内在因素，如双歧杆菌和乳酸杆菌等乙酸产生菌，可通过胆固醇同化、结合胆盐共沉淀胆固醇和催化胆固醇转化为不溶性粪甾醇等方式以降低血清胆固醇水平。嗜黏蛋白艾克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)是人体肠道中一种可降解黏蛋白的细菌，文献研究报道其数量与肥胖、糖尿病、炎症和代谢紊乱呈负相关；它发挥益生作用的机制可能是调节肠道内黏液厚度和维持肠道屏障完整性，以及对内分泌尤其是高血糖、肥胖有良好的调节作用。此外，研究证实人体的肠道菌群结构直接影响了人体的内分泌系统。拟杆菌门和厚壁菌门二者间适合的比例有助于促进内分泌系统功能和肠道的消化吸收，通过改善拟杆菌/厚壁菌门比例能有效地调节机体血糖、血脂与体重。肠道真菌虽在肠道菌群中所占比例较少，却是人体重要的组成部分，对肠道内稳态平衡的维持作用显著，一旦平衡失调会导致部分人群的功能紊乱，引起多种疾病发生。已有研究证实了肥胖、炎症性肠病(溃疡性肠病，克罗恩病)、强直性脊柱炎、结肠癌、肝硬化、过敏性免疫等疾病与机体肠道真菌紊乱相关，其中与疾病相关的真菌报道最多是念珠菌属和酵母菌属。因此，调整肠道细菌、真菌微生态结构，能有效的预防和治疗内分泌-代谢疾病。
蛹虫草(Cordyceps militaris)作为一种极具药用价值的食药用真菌，有着多年的使用历史，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎、促进免疫调节、抑菌以及抗肿瘤等多种生理功效。研究发现从蛹虫草菌丝体中提取的活性物质，与从其子实体中提取的活性成分在药理、毒理、安全性方面具有相似性，因此可采用液体深层培养可以快速高效地获得蛹虫草菌丝体，可代替野生蛹虫草，能保证药用物质的来源并缓解野生蛹虫草资源紧张的现状。已有研究表明多糖是蛹虫草的重要生理活性成分，能调节机体碳水化合物、脂质代谢相关酶的转录和表达，进而改善代谢综合征及其并发症。但尚未见国内外报道蛹虫草多糖能否通过调节肠道菌群结构来发挥调节血脂异常的作用，尤其是对调节肠道真菌组成和结构与健康的报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种蛹虫草胞内多糖的制备方法。该制备方法稳点可靠、成本低。
本发明的另一目的在于提供所述方法制备得到的蛹虫草胞内多糖。
本发明的再一目的在于提供所述的蛹虫草胞内多糖在调节肠道菌群中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种蛹虫草胞内多糖的制备方法，包含如下步骤：
(1)将蛹虫草菌种接种于液体培养基中进行发酵培养，固液分离，得到蛹虫草菌丝体；
(2)将步骤(1)中得到的蛹虫草菌丝体烘干、粉碎过筛，得到菌丝体粉末；然后加入石油醚进行脱脂处理，烘干，得到蛹虫草菌丝体干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛹虫草菌丝体干粉加入到水中，于65～95℃条件下进行热水浸提，得到蛹虫草浸提液；然后将其浓缩，得到浓缩后的蛹虫草浸提液；
(4)将步骤(3)中得到的浓缩后的蛹虫草浸提液采用胰蛋白酶和Sevage法除蛋白，得到除蛋白后的蛹虫草浸提液；
(5)将步骤(4)中得到的除蛋白后的蛹虫草浸提液加入到乙醇溶液中，静置，离心收集沉淀，得到多糖沉淀；然后将多糖沉淀加水复溶，得到多糖溶液；再将其脱色、透析、浓缩、干燥，得到蛹虫草胞内粗多糖；
(6)将步骤(5)中得到的蛹虫草胞内粗多糖进行DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析纯化，然后透析，冷冻干燥，得到蛹虫草胞内多糖(IPCM)。
步骤(1)中所述的液体发酵培养基的配方为：蔗糖50g，KNO3 4g，KH2PO4 1g，MgSO4.7 H2O 1g，维生素B1 0.1g，补纯水定容至1000mL，调pH为6.5。
步骤(1)中所述的发酵培养优选为通过如下步骤实现：
①将蛹虫草斜面母种活化培养后转接至斜面固体培养基中，于20～25℃(优选24℃)培养8～15d，直至菌丝铺满斜面为止，得到蛹虫草斜面菌种；
②将步骤①得到的蛹虫草斜面菌种上挑取4～6块菌块，接种于150～200mL液体发酵培养基中，在26℃、转速160rpm条件下避光恒温振荡培养7d，得到蛹虫草液体发酵产物。
步骤①所述的斜面固体培养基的配方为：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，蛋白胨1g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 1g，(NH4)2SO4 2g，维生素B1 0.1g，补纯水定容至1000mL，加琼脂20g融化，调pH为6.5。
步骤②所述的液体发酵培养基的配方为：蔗糖50g，KNO3 4g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O1g，维生素B1 0.1g，补纯水定容至1000mL，调pH为6.5。
步骤(1)中所述的固液分离为采用离心和/或真空抽滤的方式进行分离。
步骤(2)中所述的烘干的温度均为50～70℃；优选为60℃。
步骤(2)中所述的过筛为过60～100目筛；优选为过80目筛。
步骤(2)中所述的菌丝体粉末与石油醚的固液比为1：1～2(g/mL)；优选为1：1(g/mL)。
步骤(2)中所述的脱脂处理的时间优选为2～4天。
步骤(2)中所述的脱脂处理的次数为1～3次；优选为2次。
步骤(3)中所述的蛹虫草菌丝体干粉与水的料液比1:20～40(g/mL)；优选为1:40(g/mL)。
步骤(3)中所述的提取的温度优选为70℃。
步骤(3)中所述的提取的时间为1～3h；优选为2.5h。
步骤(3)中所述的提取的次数为1～3次；优选为2次。
步骤(3)中所述的浓缩为采用旋转蒸发的方式进行浓缩。
步骤(3)中所述的浓缩的温度为50～70℃；优选为55～60℃；更优选为60℃。
步骤(3)中所述的浓缩的为浓缩至蛹虫草浸提液体积的1/3～1/5；优选为浓缩至蛹虫草浸提液体积的1/5。
步骤(4)中所述的采用胰蛋白酶和Sevage法除蛋白优选为通过如下步骤实现：
(I)将步骤(3)中得到的浓缩后的蛹虫草浸提液调pH至8.0，然后加入胰蛋白酶溶液，混合均匀，于37℃、120rpm振荡30～60min(优选为30min)，再水浴灭酶，冷却至室温，得到酶解后的蛹虫草浸提液；
(II)将步骤(I)中得到的酶解后的蛹虫草浸提液加入氯仿正丁醇混合液，于25℃、速180rpm振荡30～40min(优选为30min)，然后离心，弃去蛋白层及有机溶液，收集上清液；
(III)重复步骤(II)3～5次，直至不再出现蛋白层，得到除蛋白后的蛹虫草浸提液。
步骤(I)中所述的灭酶的条件为：100℃灭酶10～15min；优选为：100℃灭酶10min。
步骤(I)中所述的胰蛋白酶溶液的浓度为质量体积比2％～5％；优选为2％。
步骤(I)中所述的胰蛋白酶溶液与浓缩后的蛹虫草浸提液的体积比为1：20～30；优选为1：20。
步骤(II)中所述的氯仿正丁醇混合液中氯仿和正丁醇的体积比为4：1。
步骤(II)中所述的氯仿正丁醇混合液与酶解后的蛹虫草浸提液的体积比为1：0.2～0.25；优选为1：0.2。
步骤(II)中所述的离心的条件为：5000rpm离心10～15min；优选为：5000rpm离心10min。
步骤(5)中所述的乙醇溶液为质量分数95％的乙醇溶液。
步骤(5)中所述的乙醇溶液与除蛋白后的蛹虫草浸提液的体积比为2～5：1；优选为4～5：1。
步骤(5)中所述的静置的条件为：4℃静置12～18h；优选为：4℃静置12h。
步骤(5)中所述的脱色为采用H2O2溶液进行脱色；优选为采用质量分数为30％H2O2溶液进行脱色。
所述的H2O2溶液的用量为多糖溶液体积的1/30～1/50；优选为多糖溶液体积的1/50。
步骤(5)中所述的多糖溶液的浓度15～30mg/mL；优选为20mg/mL。
步骤(5)中所述的脱色的条件为：50℃水浴保温1～2h。
步骤(5)中所述的透析为采用截留分子量为6000～8000Da的透析袋进行透析；优选为采用截留分子量为6000～8000Da的透析袋透析3d，每8h更换一次去离子水。
步骤(5)中所述的浓缩为浓缩至蛹虫草多糖提取液体积的1/3～1/5；优选为浓缩至蛹虫草多糖提取液体积的1/3。
步骤(6)中所述的DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析优选为通过如下步骤实现：
(i)往层析柱中加入1/3柱体积的去离子水，打开下端出液口，再将DEAE-SepharoseFast Flow填料倒入层析柱中，使之在层析柱中自然沉降，填料的体积为柱体积的2/3；
(ii)利用恒流泵将Tris-HCl缓冲液泵入到层析柱内，打开下端出液口，直至流出液的pH值与Tris-HCl缓冲液的pH值相同；
(iii)将蛹虫草胞内粗多糖加入Tris-HCl缓冲液中，混合均匀后过滤，得到蛹虫草胞内粗多糖溶液；然后将其加入层析柱中，再用NaCl-Tris缓冲液洗脱多糖，收集蛹虫草胞内多糖；
(iv)以苯酚硫酸法测定步骤(iii)中收集的蛹虫草胞内多糖，合并单一吸收峰样品，透析，浓缩，冷冻干燥，得到蛹虫草胞内多糖。
步骤(i)中所述的层析柱的规格为：1.5cm×20cm。
步骤(ii)中所述的Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0～7.6；优选为7.0。
步骤(ii)中所述的流出液的流速为1mL/min。
步骤(ii)中所述的蛹虫草胞内粗多糖溶液的浓度为10mg/mL。
步骤(iii)中中所述的过滤为采用0.22μm的微孔滤膜进行过滤。
步骤(iii)中所述的NaCl-Tris缓冲液为将氯化钠溶于Tris-HCl缓冲液获得的NaCl-Tris缓冲液。
步骤(iii)中所述的NaCl-Tris缓冲液中NaCl的摩尔浓度为0.1～0.4mol/L。
步骤(iii)中所述的NaCl-Tris缓冲液的pH值优选为8.0～8.2。
步骤(iii)中所述的洗脱的流速为1mL/min。
步骤(6)中所述的透析为采用截留分子量为6000～8000Da的透析袋进行透析；优选为采用截留分子量为6000～8000Da的透析袋透析3d。
一种蛹虫草胞内多糖，通过上述任一项所述的方法制备得到。
所述的蛹虫草胞内多糖在制备对肠道益生菌具有促增殖作用，促进肠道短链脂肪酸产量，调节肠道菌群结构，和/或降血脂的产品中的应用，该蛹虫草胞内多糖具有良好的改善高脂饮食机体的肠道微生态和降血脂作用。
所述的产品为药品、保健品和功能性食品中的至少一种。
所述的蛹虫草胞内多糖的使用剂量为50～200mg/kg/d；优选为100～200mg/kg/d；更优选为200mg/kg/d。
所述的肠道益生菌包括拟杆菌、艾克曼菌、瘤胃菌和丁酸盐合成菌中的至少一种。
所述的丁酸盐合成菌包括肠道真杆菌(Eubacterium)和梭菌属(Clostridium)的至少一种；蛹虫草胞内多糖可以提高肠道真杆菌和梭菌属的相对丰度。
所述的短链脂肪酸为乙酸、丙酸、丁酸和戊酸中的至少一种；蛹虫草胞内多糖诱导激活短链脂肪酸受体GPR41和GPR43的表达。
所述的肠道菌群为肠道细菌群和/或肠道真菌群；优选为肠道真菌群。
所述的肠道细菌包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、Epsilonbacteraeota、放线菌门(Actinobacteria)、Patescibacteria、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和柔膜菌门(Tenericutes)；优选为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、艾克曼菌科(Akkermansiaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)；蛹虫草胞内多糖可以提高肠道拟杆菌门的相对丰度，降低厚壁菌门的相对丰度，从而实现调节厚壁菌门/拟杆菌比例的作用。
所述的肠道真菌包括曲霉科(Aspergillaceae)、节担菌科(Wallemiaceae)、根霉科(Rhizopodaceae)、葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)、假球壳科(Pleosporaceae)、假毛球壳科(Trichosporonaceae)和德巴列酵母科(Debaryomycetaceae)；蛹虫草胞内多糖可以提高肠道青霉属和念珠菌的相对丰度，降低曲霉菌、链格孢属和毛霉属真菌的相对丰度。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明使用的液体发酵培养基为合成培养基，成分明确，重复性高，发酵效率高，产物稳定，避免了天然培养基或半合成培养基带来的组分干扰，易于多糖分离纯化。
(2)本发明的蛹虫草菌丝体胞内多糖，可以通过液体深层发酵培养快速获得多糖提取原料蛹虫草菌丝体，提取过程安全可控，所得多糖组分含量高，溶解性好；制备过程简单，条件易于控制，周期短，产率高，可实现大批量生产。
(3)本发明使用采用胰蛋白酶联合Sevage法除蛋白，能充分彻底地水解并除去蛹虫草浸提液中的蛋白质组分，该方法目的性强，效果好。
(4)本发明使用DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析纯化蛹虫草胞内多糖，通过实验优选纯化条件，可以同时发挥离子交换及分子筛作用，快速高效得到多糖组分，工艺简单易操作，效果好，避免多次纯化工艺造成的多糖组分的损失。
(5)本发明的蛹虫草胞内多糖可作为益生元，不仅能调节高脂饮食小鼠肠道细菌菌群结构，显著促生高脂饮食小鼠肠道拟杆菌门拟杆菌科(Bacteroidaceae)、艾克曼菌科(Akkermansiaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)以及丁酸盐合成菌等益生菌，并抑制厚壁菌门葡萄球菌属(Staphylococcus)，改善厚壁菌门/拟杆菌比例，同时可调节真菌菌群结构，降低曲霉科(Aspergillaceae)、热带念珠菌(Candida tropicalis)等促炎症和肥胖的真菌的相对丰度，调节担子菌门/子囊菌门比例，共同起到辅助降血脂的作用。本发明对通过膳食补充蛹虫草以及其他药食两用真菌多糖调节肠道细菌、真菌菌群结构以治疗高脂血症的应用提供新的思路。
(6)本发明的蛹虫草胞内多糖可以促进肠道丁酸盐的合成途径并诱导激活短链脂肪酸受体，促进脂肪的代谢和抑制脂肪的累积，从而起到降血脂和保肝作用。
(7)本发明蛹虫草胞内多糖制备过程简单，产物稳定，可高效大批量生产，具有良好的调节高脂血性肠道菌群紊乱及降血脂作用，可应用于调节肠道菌群结构及降血脂药物或保健食品领域。
附图说明
图1是蛹虫草胞内多糖对小鼠肠道细菌物种分布的影响图；其中，A为门水平肠道细菌物种分布的影响图；B为属水平肠道细菌物种分布的影响图。
图2是蛹虫草胞内多糖对小鼠肠道厚壁菌门与拟杆菌门细菌数量的比值的影响图(组别：正常对照组，小鼠喂食普通饲料，每天灌胃1％(mL/g)BW无菌水；高脂模型组，小鼠喂食高脂饲料，每天灌胃1％(mL/g)BW无菌水；IPCM处理组，小鼠喂食高脂饲料，每天灌胃200mg/kg IPCM；与正常对照组相比，##p＜0.01；与高脂模型组相比，**p＜0.01)。
图3是蛹虫草胞内多糖对高脂饮食小鼠肠道细菌群落多样性和分布的影响图(组别：NC,正常对照组；HC，高脂模型组；IPCM，IPCM处理组；与正常对照组相比，##P<0.01；与高脂模型组相比，**P<0.01)；其中，A为Shannon指数；B为Chao1指数；C为主成分分析(PCA)；D为主坐标分析(PCoA)。
图4是蛹虫草胞内多糖对小鼠肠道真菌物种分布的影响图；其中，A为门水平肠道真菌物种分布的影响图；B为属水平肠道真菌物种分布的影响图。
图5是各组小鼠肠道担子菌门与子囊菌门真菌数量的比值(组别：正常对照组，小鼠喂食普通饲料，每天灌胃1％(mL/g)BW无菌水；高脂模型组，小鼠喂食高脂饲料，每天灌胃1％(mL/g)BW无菌水；IPCM处理组，小鼠喂食高脂饲料，每天灌胃200mg/kgIPCM；与正常对照组相比，##p＜0.01；与高脂模型组相比，**p＜0.01)。
图6是蛹虫草胞内多糖对高脂饮食小鼠肠道真菌群落多样性和分布的影响图(组别：NC,正常对照组；HC，高脂模型组；IPCM，IPCM处理组；与正常对照组相比，##P<0.01；与高脂模型组相比，**P<0.01)；其中，A为Shannon指数；B为Chao1指数；C为主成分分析(PCA)；D为主坐标分析(PCoA)。
图7是蛹虫草胞内多糖对小鼠肠道丁酸盐合成菌相对丰度的影响图；其中，A为介导丁酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(But)功能菌Faecalibacterium的相对丰度；B为介导But功能菌Roseburia的相对丰度的影响图；C为介导But功能菌Eubacterium的相对丰度的影响图；D为介导But功能菌总相对丰度的影响图；E为介导丁酸激酶(Buk)功能菌Clostridium的相对丰度的影响图。
图8是蛹虫草胞内多糖对小鼠血脂水平的影响图(与正常对照组相比#P<0.05，##P<0.01；与高脂模型组相比，*P<0.05，**P<0.01)；其中，A为蛹虫草多糖对小鼠血清总胆固醇的影响图；B为蛹虫草多糖对小鼠血清甘油三酯的影响图；C为蛹虫草多糖对小鼠血清低密度脂蛋白-胆固醇的影响图；D为蛹虫草胞内多糖对小鼠血清高密度脂蛋白-胆固醇的影响图。
图9是蛹虫草胞内多糖对小鼠肝脂水平的影响图(与正常对照组相比#P<0.05，##P<0.01；与高脂模型组相比，*P<0.05，**P<0.01)；其中，A为蛹虫草多糖对小鼠肝脏总胆固醇的影响图；B为蛹虫草多糖对小鼠肝脏甘油三酯的影响图。
图10是蛹虫草胞内多糖对高脂饮食小鼠肝脂组织形态的影响图(黄色箭头代表大泡性脂肪病变)。
图11为蛹虫草胞内多糖对小鼠肠道短链脂肪酸受体表达的影响(与正常对照组相比，#P<0.05，##P<0.01；与高脂模型组相比，*P<0.05，**P<0.01)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例中蛹虫草(Cordyceps militaris)菌株由华南师范大学生命科学学院提供(黄振峰,尹导群,陈丽,张松*,兰瑛.蛹虫草菌丝体胞内多糖提取方法的研究.华南师范大学学报(自然科学版),2018,50(6),69-74.)。
实施例中涉及到的培养基配方：
斜面固体培养基的配方为：马铃薯(去皮)200g(煮出滤汁)，葡萄糖20g，蛋白胨1g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 1g，(NH4)2SO4 2g，维生素B1 0.1g，补纯水定容至1000mL，再加入琼脂20g融化，pH为6.5；
液体发酵培养基的配方为：蔗糖50g，KNO3 4g，KH2PO4 1g，MgSO4.7 H2O 1g，维生素B1 0.1g，补纯水定容至1000mL，pH为6.5。
实施例1：蛹虫草胞内多糖的制备
蛹虫草经菌种活化，斜面菌种培养和液体深层发酵培养，获得蛹虫草菌丝体，具体方法如下：
①斜面菌种培养：将蛹虫草斜面母种活化培养后接种于灭菌的斜面固体培养基中，于24℃培养8d，备用；
②液体深层发酵培养：从蛹虫草斜面菌种上挑取4～6块黄豆大小的菌块，接种于150mL无菌的液体发酵培养基中，于26℃、转速160rpm条件下避光恒温振荡培养7d，制得蛹虫草液体发酵产物，经离心和真空抽滤分离，得到蛹虫草菌丝体；
(2)脱脂：将分离得到蛹虫草菌丝体于60℃烘干至恒重，用粉碎机粉碎，过孔径为80目筛，得到菌丝体粉末；然后按m(菌丝体粉末):v(石油醚)＝1:1(g/mL)加入石油醚，于摇床上振荡2天，离心后取沉淀，再按照上述方法重复脱脂1次；所得沉淀于60℃条件下烘干，得到蛹虫草菌丝体干粉；
(3)热水浸提多糖：将蛹虫草菌丝体干粉与水混合浸提多糖，提取条件为：料液比(m/v)1:40(g/mL)，提取温度75℃，提取时间2.5h，提取2次，得到蛹虫草浸提液；
(4)浓缩：所得蛹虫草浸提液于60℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/5，得到浓缩后的蛹虫草浸提液；
(5)胰蛋白酶和Sevage法除蛋白：将2.0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中，得到胰蛋白酶溶液；将1000mL的浓缩后的蛹虫草浸提液调pH至8.0；然后将胰蛋白酶溶液及蛹虫草浸提液同时放入37℃水浴锅中预热10min后将两者充分混合，并于37℃、转速120rpm振荡30min后，再于100℃水浴10min使酶失活，冷却至室温；加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝4：1，v/v)，于25℃、转速180rpm振荡30min，然后于5000rpm离心10min，弃去蛋白层及有机溶液，收集上清液，重复3次，得到除蛋白后的蛹虫草浸提液。
(6)乙醇沉淀多糖：将除蛋白后的蛹虫草浸提液加入4倍体积的质量分数为95％的乙醇，混合均匀，于4℃静置12h，待析出蛹虫草多糖，离心收集沉淀；
(7)多糖沉淀脱色、透析、干燥，具体方法如下：
①用纯水溶解多糖沉淀，得到质量浓度为20mg/mL多糖溶液，滴加质量分数为30％的H2O2溶液(用量为多糖溶液体积的1/50)，混匀后于50℃水浴保温1h，进行氧化脱色；
②脱色后的蛹虫草多糖提取液装入截留分子量为6000～8000Da的透析袋中透析3d，每8h更换一次去离子水；
③透析后的蛹虫草多糖提取液进行减压浓缩至蛹虫草多糖提取液体积的1/3，并进行真空冷冻干燥，得到蛹虫草胞内粗多糖；
DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析，包含如下步骤：
①往层析柱(1.5cm×20cm，购于广州市芊荟化玻仪器有限公司)中加入约1/3柱体积的去离子水，打开下端出液口，再将DEAE-SepharoseFast Flow填料缓慢的倒入层析柱中，使之在层析柱中自然沉降，填料的体积约为柱体积的2/3；
②利用恒流泵将Tris-HCl缓冲液(pH为7.0)泵入到层析柱内，打开下端出液口，流速保持在1mL/min，直至流出液的pH值与Tris-HCl缓冲液的pH值相同时，层析柱达到了平衡。
③将氯化钠溶解于Tris-HCl缓冲液，制得NaCl-Tris缓冲液(pH 8.2，NaCl摩尔浓度为0.1M)。将上述获得的蛹虫草胞内粗多糖加入Tris-HCl缓冲液(pH为7.0)充分溶解，使蛹虫草胞内粗多糖终浓度为10mg/mL，过0.22μm微孔滤膜，得到蛹虫草胞内粗多糖溶液缓缓加入层析柱中，再用NaCl-Tris缓冲液(NaCl摩尔浓度为0.1M)洗脱多糖，流速控制在1mL/min，部分收集器收集多糖；
④以苯酚硫酸法测定步骤③所得到的多糖溶液，合并单一吸收峰样品，然后装入截留分子量为6000～8000Da的透析袋中，在去离子水中透析3d，浓缩，冷冻干燥，得到蛹虫草胞内多糖(简称IPCM)。
所得蛹虫草胞内多糖易溶于纯水，不溶于无水乙醇、二甲基亚砜、、无水乙醚和乙酸乙酯等有机溶剂。经菲林试剂反应、I2-KI反应、茚三酮反应和三氯化铁反应(Yu,C.H.,Dai,X.Y.,Chen,Q.,Zang,J.N.,Deng,L.L.,Liu,Y.H.,et al.(2013).Hypolipidemic andantioxidant activities of polysaccharides from Rosae Laevigatae Fructus inrats.Carbohydrate Polymers,94,56-62)的比色结果表明：蛹虫草多糖不含还原糖、淀粉性多糖、氨基酸及酚类物质。蛹虫草胞内多糖经苯酚硫酸法测定总糖的质量分数为85.38％。
实施例2：蛹虫草胞内多糖的制备
(1)蛹虫草经菌种活化，斜面菌种培养和液体深层发酵培养，获得蛹虫草菌丝体，具体方法如下：
①斜面菌种培养：将蛹虫草斜面母种活化培养后接种于灭菌的斜面固体培养基中，于24℃培养8d，备用；
②液体深层发酵培养：从蛹虫草斜面菌种上挑取4～6块黄豆大小的菌块，接种于150mL无菌的液体发酵培养基中，于26℃、转速160rpm条件下避光恒温振荡培养7d，制得蛹虫草液体发酵产物，经离心和真空抽滤分离，得到蛹虫草菌丝体；
(2)脱脂：将分离得到蛹虫草菌丝体于60℃烘干至恒重，用粉碎机粉碎，过孔径为80目筛，得到菌丝体粉末；然后按m(菌丝体粉末):v(石油醚)＝1:1(g/mL)加入石油醚，于摇床上振荡2天。离心后取沉淀，再按照上述方法重复脱脂2次。所得沉淀于60℃条件下烘干，得到蛹虫草菌丝体干粉；
(3)热水浸提多糖：将蛹虫草菌丝体干粉与水混合浸提多糖，提取条件为：料液比(m/v)1:40(g/mL)，提取温度75℃，提取时间2.5h，提取2次，得到蛹虫草浸提液；
(4)浓缩：所得蛹虫草浸提液于60℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/5，得到浓缩后的蛹虫草浸提液；
(5)胰蛋白酶和Sevage法除蛋白：将2.0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中，得到胰蛋白酶溶液；把1000mL的浓缩后的蛹虫草浸提液调pH至8.0；然后将胰蛋白酶溶液及蛹虫草浸提液同时放入37℃水浴锅中预热10min，把两者充分混合，并于37℃、转速120rpm振荡30min后，再于100℃水浴10min使酶失活，冷却至室温；加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝4：1，v/v)，于25℃、转速180rpm振荡30min，然后于5000rpm离心10min，弃去蛋白层及有机溶液，收集上清液，重复5次，得到除蛋白后的蛹虫草浸提液。
(6)乙醇沉淀多糖：将除蛋白后的蛹虫草浸提液加入4倍体积的质量分数为95％乙醇，混合均匀，于4℃静置12h，待析出多糖，离心收集沉淀；
(7)多糖沉淀脱色、透析、干燥，具体方法如下：
①用纯水溶解多糖沉淀，得到质量浓度为20mg/mL多糖溶液，滴加质量分数为30％H2O2溶液(用量为多糖溶液体积的1/50)，混匀后于50℃水浴保温2h，进行氧化脱色；
②脱色后多糖提取液装入截留分子量为6000～8000Da的透析袋中透析3d，每8h更换一次去离子水；
③透析后的多糖提取液进行减压浓缩至蛹虫草多糖提取液体积的1/3，并进行真空冷冻干燥，得到蛹虫草胞内粗多糖；
(8)DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析，包含如下步骤：
①往层析柱(1.5cm×20cm)中加入约1/3柱体积的去离子水，打开下端出液口，再将DEAE-SepharoseFast Flow填料缓慢的倒入层析柱中，使之在层析柱中自然沉降，填料的体积约为柱体积的2/3；
②利用恒流泵将Tris-HCl缓冲液(pH为7.0)泵入到层析柱内，打开下端出液口，流速保持在1mL/min，直至流出液的pH值与Tris-HCl缓冲液的pH值相同时，层析柱达到了平衡。
③将氯化钠溶解于Tris-HCl缓冲液，制得NaCl-Tris缓冲液(pH 8.2，NaCl摩尔浓度为0.2M)。将蛹虫草胞内粗多糖加入Tris-HCl缓冲液(pH为7.0)充分溶解，使蛹虫草胞内粗多糖终浓度为10mg/mL，过0.22μm微孔滤膜，得到蛹虫草胞内粗多糖溶液缓缓加入层析柱中，再用NaCl-Tris缓冲液洗脱多糖，流速控制在1mL/min，部分收集器收集多糖；
④以苯酚硫酸法测定步骤③所得到的多糖溶液中，合并单一吸收峰样品，然后装入截留分子量为6000～8000Da的透析袋中，在去离子水中透析3d，浓缩，冷冻干燥后得到蛹虫草胞内多糖(IPCM)。
所得蛹虫草胞内多糖多糖易溶于纯水，不溶于无水乙醇、二甲基亚砜、、无水乙醚和乙酸乙酯等有机溶剂。经菲林试剂反应、I2-KI反应、茚三酮反应和三氯化铁反应比色结果表明蛹虫草多糖不含还原糖、淀粉性多糖、氨基酸及酚类物质。蛹虫草胞内多糖经苯酚硫酸法测定含总糖质量分数为84.80％。
实施例3：蛹虫草胞内多糖的制备
(1)蛹虫草经菌种活化，斜面菌种培养和液体深层发酵培养，获得蛹虫草菌丝体，具体方法如下：
①斜面菌种培养：将蛹虫草斜面母种活化培养后接种于灭菌的斜面固体培养基中，于24℃培养8d，备用；
②液体深层发酵培养：从蛹虫草斜面菌种上挑取4～6块黄豆大小的菌块，接种于200mL无菌的液体发酵培养基中，于26℃、转速160rpm条件下避光恒温振荡培养7d，制得蛹虫草液体发酵产物，经离心和真空抽滤分离得到蛹虫草菌丝体；
(2)脱脂：将分离得到蛹虫草菌丝体于60℃烘干至恒重，用粉碎机粉碎，过孔径为80目筛，得到菌丝体粉末；然后按m(菌丝体粉末):v(石油醚)＝1:1(g/mL)加入石油醚，于摇床上振荡2天。离心后取沉淀，再按照上述方法重复脱脂2次。所得沉淀于60℃条件下烘干，得到蛹虫草菌丝体干粉；
(3)热水浸提多糖：将蛹虫草菌丝体干粉与水混合浸提多糖，提取条件为：料液比(m/v)1:40(g/mL)，提取温度75℃，提取时间2.5h，提取2次，得到蛹虫草浸提液；
(4)浓缩：所得蛹虫草浸提液于60℃的恒温水浴锅中减压浓缩至原体积的1/5，得到浓缩后的蛹虫草浸提液；
(5)胰蛋白酶和Sevage法除蛋白：将2.0g胰蛋白酶溶于100mL蒸馏水中，得到胰蛋白酶溶液；把1000mL的浓缩后的蛹虫草浸提液调pH至8.0；然后将胰蛋白酶溶液及蛹虫草浸提液同时放入37℃水浴锅中预热10min，把两者充分混合，并于37℃、转速120rpm振荡30min后，再于100℃水浴10min使酶失活，冷却至室温；加入0.2倍体积的氯仿正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝4：1，v/v)，于25℃、转速180rpm振荡30min，然后于5000rpm离心10min，弃去蛋白层及有机溶液，收集上清液，重复5次，得到除蛋白后的蛹虫草浸提液。
(6)乙醇沉淀多糖：将除蛋白后的蛹虫草浸提液加入4倍体积的质量分数为95％乙醇，混合均匀，于4℃静置12h，待析出多糖，离心收集沉淀；
(7)多糖沉淀脱色、透析、干燥，具体方法如下：
①用纯水溶解多糖沉淀，得到质量浓度为20mg/mL多糖溶液，滴加质量分数为30％H2O2溶液(用量为多糖溶液体积的1/50)，混匀后于50℃水浴保温1h，进行氧化脱色；
②脱色后多糖提取液装入截留分子量为6000～8000Da的透析袋中透析3d，每8h更换一次去离子水；
③透析后的多糖提取液进行减压浓缩至蛹虫草多糖提取液体积的1/3，并进行真空冷冻干燥，得到蛹虫草胞内粗多糖；
(8)DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析，包含如下步骤：
①往层析柱(1.5cm×20cm)中加入约1/3柱体积的去离子水，打开下端出液口，再将DEAE-SepharoseFast Flow填料缓慢的倒入层析柱中，使之在层析柱中自然沉降，填料的体积约为柱体积的2/3；
②利用恒流泵将Tris-HCl缓冲液(pH为7.0)泵入到层析柱内，打开下端出液口，流速保持在1mL/min，直至流出液的pH值与Tris-HCl缓冲液的pH值相同时，层析柱达到了平衡。
③将氯化钠溶解于Tris-HCl缓冲液，制得NaCl-Tris缓冲液(pH为8.0，NaCl摩尔浓度为0.4M)，将蛹虫草胞内粗多糖加入Tris-HCl缓冲液(pH为7.0)充分溶解，使蛹虫草胞内粗多糖终浓度为10mg/mL，过0.22μm微孔滤膜，得到蛹虫草胞内粗多糖溶液缓缓加入层析柱中，再用NaCl-Tris缓冲液洗脱多糖，流速控制在1mL/min，部分收集器收集多糖；
④以苯酚硫酸法测定步骤③所得到的多糖溶液中，合并单一吸收峰样品，然后装入截留分子量为6000～8000Da的透析袋中，在去离子水中透析3d，浓缩，冷冻干燥后得到蛹虫草胞内多糖(IPCM)。
所得蛹虫草胞内多糖易溶于纯水，不溶于无水乙醇、二甲基亚砜、、无水乙醚和乙酸乙酯等有机溶剂。经菲林试剂反应、I2-KI反应、茚三酮反应和三氯化铁反应比色结果表明蛹虫草多糖不含还原糖、淀粉性多糖、氨基酸及酚类物质。蛹虫草胞内多糖经苯酚硫酸法测定含总糖质量分数为82.37％。
实施例4：蛹虫草胞内多糖(IPCM，实施例1制备得到)调节肠道菌群作用评价实验
(1)昆明小鼠：SPF级别，雄性，体重16～20g，日龄28～30天，购于广东省医学实验动物中心(许可证号：SCXK(粤)2018-0002)。普通饲料，高脂饲料(配方为：10％猪油、1.0％胆固醇、0.3％胆酸钠、88.7％普通饲料；wt％)，购于广东省医学实验动物中心(许可证号：SCXK(粤)2013-0002)。
(2)小鼠饲养于室温20～22℃，相对湿度50～60％RH，自然光照的SPF级动物房，实验期间小鼠自由进食和饮水(饮用水经高压蒸汽灭菌，饲料经紫外照射灭菌)。用普通饲料适应性喂养4d后，随机分为正常对照组，高脂模型组和蛹虫草胞内多糖处理组(即IPCM处理组，剂量为200mg/kg/d)，每组小鼠数为10只。于第5天起，正常对照组小鼠喂食普通饲料，其他处理组喂食高脂饲料。采用预防模式给药(即蛹虫草胞内多糖处理组为高脂饲料喂养+蛹虫草胞内多糖)，每日定时经口灌胃给予受试物一次，正常对照组和高脂模型组灌胃等体积的无菌水，灌胃容积为1％(mL/g/d)。灌胃量根据每周体重增减调整，连续灌胃四周，每天记录小鼠的进食量，体重变化，自主活动情况。
(3)最后一天灌胃后，小鼠禁食不禁水12h，采用逼迫法无菌采集小鼠新鲜粪便样，装于灭菌的1.5mL离心管中，迅速用液氮冷冻，进行肠道微生物16S rDNA和ITS2序列高通量测序，并分析蛹虫草胞内多糖对肠道丁酸盐合成菌相对丰度的影响。
(4)实验结果：
1)对蛹虫草胞内多糖对肠道菌群的影响
①对蛹虫草胞内多糖对肠道细菌的影响
结合16S rDNA序列结果，在门和科水平分析绘制物种分布柱状图研究IPCM对高脂饮食小鼠肠道细菌物种分布的影响，并根据物种注释结果，选取丰度水平前十的物种，并将其他物种合并为Others，结果如图1所示；肠道拟杆菌门与厚壁菌门细菌数量的比值结果如图2所示。
在门水平，在小鼠肠道菌群中，拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、Epsilonbacteraeota、放线菌门(Actinobacteria)、Patescibacteria、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和柔膜菌门(Tenericutes)占据着前10纲的位置(图1A)。与正常对照组相比，高脂模型组的厚壁菌门、放线菌门和Epsilonbacteraeota分别显著地提高了1倍、2.8倍和6.9倍；而拟杆菌门、蓝细菌门、脱铁杆菌门、Patescibacteria、变形菌门、柔膜菌门和疣微菌门微生物分别降低了38.38％、70.54％、85.09％、64.83％、62.61％、32.94％和93.51％，使厚壁菌门/拟杆菌门值较正常对照组显著提高。经过28天的IPCM灌胃处理，与高脂模型组相比，肠道拟杆菌门微生物提高了88.63％；厚壁菌门微生物降低了37.21％，使厚壁菌门/拟杆菌门(Firm/Bact)值恢复至正常水平(图2)。此外，IPCM能逆转高脂饮食引起小鼠的拟杆菌门、蓝细菌门、脱铁杆菌门、Patescibacteria、变形菌门、柔膜菌门和疣微菌门微生物的相对丰度的降低。
在科水平，在小鼠肠道菌群中，Muribaculaceae、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、艾克曼菌科(Akkermansiaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和韦荣球菌科(Erysipelotrichaceae)为相对丰度最高的10科(图1B)。经过28天的灌胃处理，与正常对照组相比，高脂饲料使小鼠肠道拟杆菌科、瘤胃菌科和艾克曼菌科微生物相对丰度分别下降31.23％、74.55％和93.51％，而毛螺菌科相对丰度提高了94.38％，乳杆菌科以及葡萄球菌科微生物相对丰度分别提高了4.3倍和32倍。灌胃IPCM后，高脂饮食小鼠肠道拟杆菌科、瘤胃菌科和艾克曼菌科微生物相对丰度分别提高了157.46％、56.5％和492.51％，同时使乳杆菌科和葡萄球菌科微生物恢复至正常水平。
α-多样性分析用于分析样品内的微生物群落多样性，可以反映样品内的微生物群落的丰富度和多样性。α-多样性分析的计算结果如图3A和3B所示。衡量菌群多样性的Shannon指数分析中，与正常对照组相比，高脂模型组指数均显著降低(p＜0.01)。经过IPCM给药处理后，高脂饮食处理组指数均显著提高(p＜0.01)。菌群丰度指数Chao1分析中，与正常对照组相比，高脂模型组指数显著降低(p＜0.01)；而经过IPCM灌胃处理后，Chao1指数均显著地提高(p＜0.01)。β-多样性分析可以反映样品间物种多样性差异，坐标图上距离越近的样品，相似性越大。β-多样性分析的结果如附图3C和3D所示。由微生物主成分分析(PCA)和主坐标分析(PCoA)结果可以看出，高脂饲料喂养的小鼠肠道微生物菌群与正常饲料喂养的小鼠菌群有明显的分离度。通过灌胃IPCM干预，高脂饮食小鼠肠道菌群由相对分散朝一种菌型聚拢，并有趋于正常的变化趋势。这表明蛹虫草多糖具有调节肠道菌群恢复至正常组成的作用。
综上所述，高脂饮食处理导致机体肠道稳态失衡，而IPCM饮食干预均能有效地提高高脂饮食小鼠肠道益生菌如拟杆菌、艾克曼菌和瘤胃菌等的相对丰度，降低有害菌如葡萄球菌和芽孢杆菌等的相对丰度，逆转了高脂饮食引起乳杆菌的丰度异常升高，改善肠道菌群构成，维持肠道微生物的稳定。
②对蛹虫草胞内多糖对肠道真菌的影响
结合ITS2序列结果，在门和科水平分析绘制物种分布柱状图研究IPCM对高脂饮食小鼠肠道真菌物种分布的影响，并根据物种注释结果，选取丰度水平前十的物种，并将其他物种合并为Others，结果如图4所示；肠道担子菌门与子囊菌门真菌数量的比值结果如图5所示。
在门水平，在小鼠肠道菌群中，子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、毛霉亚门(Mucoromycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)占据着前4纲的位置(图4A)。与正常对照组相比，高脂模型组担子菌门真菌相对丰度提高了48.28％，毛霉亚门真菌相对丰度提高至5.6倍。经过28天的IPCM灌胃处理，与高脂模型组相比，肠道担子菌门真菌相对丰度降低了18.60％，但毛霉亚门真菌相对丰度提高至16.37倍。此外，被孢霉门真菌相对丰度降低了85.71％。担子菌门真菌与子囊菌门真菌数量上的比值可评价肠道真菌的稳态。与正常对照组相比，高脂模型组担子菌门与子囊菌门真菌数量比值明显提高(图5，p＜0.01)，而经过IPCM灌胃处理使高脂饮食小鼠该比值显著下降
(p＜0.01)，恢复至正常水平。
在科水平，在小鼠肠道菌群中，曲霉科(Aspergillaceae)、节担菌科(Wallemiaceae)、根霉科(Rhizopodaceae)、葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)、假球壳科(Pleosporaceae)、假毛球壳科(Trichosporonaceae)和德巴列酵母科(Debaryomycetaceae)为相对丰度最高的10科(图4B)。经过28天的灌胃处理，与正常对照组相比，高脂饲料使小鼠肠道曲霉科、节担菌科、根霉科和假毛球壳科真菌相对丰度分别提高55.44％、50.77％、1248.39％和15510.23％，而葡萄座腔菌科、丛赤壳科、枝孢霉科、假球壳科以及德巴列酵母科真菌相对丰度分别降低了88.48％、50.31％、45.21％、76.40％和46.82％。灌胃IPCM后，高脂饮食小鼠肠道根霉科和德巴列酵母科真菌相对丰度分别提高了45倍和1倍，使葡萄座腔菌科、丛赤壳科、枝孢霉科、假球壳科和假毛球壳科真菌相对丰度分别下降了29.34％、49.28％、53.60％、64.02％和86.92％。
已有临床研究报道肠道曲霉科真菌含量与机体肥胖症的发生呈正相关，而念珠菌与肥胖症的发生呈负相关。热带念珠菌为促炎症真菌，节担菌的含量与呼吸道过敏疾病呈正相关，马色拉菌与儿童过敏性哮喘相关呈负相关。在本发明中，对与疾病相关的肠道真菌相对丰度进行分析发现，高脂饮食处理导致机体肠道稳态失衡，包括曲霉属、毛霉菌属、热带念珠菌和节担菌相对丰度提高，以及链格孢属、念珠菌和马色拉菌相对丰度下降。而经过IPCM灌胃处理后，与高脂模型组相比，青霉属和念珠菌相对丰度提高，曲霉菌、链格孢属和毛霉属真菌相对丰度下降。上述结果表明，IPCM干预均能在门和科水平有效地影响高脂饮食小鼠肠道真菌菌群的相对丰度，恢复肠道真菌菌群结构稳态。
对小鼠肠道真菌进行α-多样性和β-多样性分析结果如图6所示。衡量菌群多样性的Shannon指数分析中，与正常对照组相比，高脂模型组指数均显著降低(图6A)，p＜0.05)，而经过IPCM灌胃处理后，高脂饮食处理组指数并未能提高至正常水平。此外，经过IPCM灌胃处理后，菌群丰度指数Chao1显著地下降(图6B，p＜0.05)。这提示，高脂饮食降低小鼠肠道菌群的多样性，而IPCM干预4周后使小鼠肠道真菌菌群多样性显著提高，但未能提高其丰度。由微生物主成分分析结果可以看出，高脂饲料喂养的小鼠肠道微生物菌群与正常饲料喂养的小鼠真菌菌群有明显的分离度。通过灌胃IPCM干预，高脂饮食小鼠肠道菌群由相对分散朝一种菌型聚拢，并有趋于正常的变化趋势(图6C和6D)。这表明IPCM具有调节肠道真菌菌群组成的作用。
综上，高脂饮食引起了小鼠肠道真菌微生态的紊乱，而IPCM能在一定程度上调节高脂饮食诱导的肥胖和炎症相关的肠道真菌的相对丰度，进而对机体脂质代谢具有积极的作用。
2)蛹虫草胞内多糖对肠道丁酸盐合成菌相对丰度的影响
研究报道了肠道普拉梭菌(Faecalibacterium)、罗斯氏菌(Roseburia)、真杆菌(Eubacterium)和梭菌属(Clostridium)微生物为丁酸盐合成的主要菌群；其中普拉梭菌、罗斯氏菌和真杆菌主要含有丁酰辅酶A：乙酸辅酶A转移酶(But)，参与丁酰辅酶A合成丁酸盐的过程。而梭菌属微生物主要含有丁酸盐合成途径的丁酸激酶(Buk)。
蛹虫草胞内多糖对小鼠肠道丁酸盐合成菌相对丰度的影响如图7所示。由图7可知，与正常对照组相比，高脂模型组小鼠肠道中普拉梭菌和罗斯氏菌相对丰度显著提高(P＜0.05,图7A和B)，而真杆菌和梭菌属微生物的相对丰度显著下降(P＜0.01,图7C和7D)，推测其小鼠肠道But酶的含量显著高于正常对照组(P＜0.05,图7D)，但Buk酶的含量极度显著低于正常对照组(P＜0.01,图7E)。经过IPCM灌胃处理后，相对于高脂模型组，小鼠肠道的真杆菌相对丰度显著提高11.3倍(P＜0.01)，而对普拉梭菌和罗斯氏菌的相对丰度无显著性差异。此外，肠道梭菌属微生物的相对丰度均显著高于高脂模型组(P＜0.01，图7D)。
综合四种微生物的相对丰度，IPCM能显著地提高高脂饮食小鼠肠道But和Buk基因相关菌的相对丰度，进而促进丁酸盐的合成途径。
实施例5：蛹虫草胞内多糖(IPCM，实施例1制备得到)降血脂实验
(1)昆明小鼠：SPF级别，雄性，体重16～20g，日龄28～30天，购于广东省医学实验动物中心(许可证号：SCXK(粤)2018-0002)。普通饲料，高脂饲料(配方为：10％猪油、1.0％胆固醇、0.3％胆酸钠、88.7％普通饲料；wt％)，购于广东省医学实验动物中心(许可证号：SCXK(粤)2013-0002)。辛伐他丁片，批准文号：国药准字号J20180007，购至杭州默沙东制药有限公司。
(2)小鼠饲养于室温20～22℃，相对湿度50～60％RH，自然光照的SPF级动物房，实验期间小鼠自由进食和饮水(饮用水经高压蒸汽灭菌，饲料经紫外照射灭菌)。用普通饲料适应性喂养4d后，随机分为正常对照组，高脂模型组，阳性药物组(辛伐他丁，剂量为10mg/kg/d)，蛹虫草胞内多糖低剂量处理组(剂量为50mg/kg/d)，蛹虫草胞内多糖中剂量处理组(剂量为100mg/kg/d)和蛹虫草胞内多糖高剂量处理组(剂量为200mg/kg/d)，每组小鼠数为10只，于第5天起，正常对照组小鼠喂食普通饲料，其他处理组喂食高脂饲料(高脂模型组、阳性药物组和蛹虫草胞内多糖处理组喂食高脂饲料，采用预防模式给药，即阳性药物组为高脂饲料喂养+阳性药物；蛹虫草胞内多糖处理组为高脂饲料喂养+蛹虫草胞内多糖)。采用预防模式给药，每日定时经口灌胃给予受试物一次，正常对照组和高脂模型组灌胃等体积的无菌水，灌胃容积为1％(mL/g/d)。灌胃量根据每周体重增减调整，连续灌胃四周，每天记录小鼠的进食量，体重变化，自主活动情况。
(3)最后一天灌胃后，小鼠禁食不禁水12h，经硫喷妥钠麻醉小鼠后，摘眼球取血，分离得到血清后分别检测血脂指标，包括总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)，计算动脉粥样硬化指数AI(LDL-C/HDL-C)。取血后迅速解剖小鼠，取其肝脏，测定肝脂水平以及观察肝脏组织形态；取其结肠，采用ELISA法测定短链脂肪酸受体GPR41和GPR43表达量。
(4)实验结果：
1)蛹虫草胞内多糖的降血脂作用分析
对蛹虫草胞内多糖进行降血脂作用分析见图8。由图8可知：经过28天的高脂饲料喂食，与正常对照组相比，高脂模型组小鼠的体内脂肪组织含量增加，血清中TC的含量极显著地升高了126.29％(P<0.01)，TG的含量极显著地升高了114.63％(P<0.01)，LDL-C的含量极显著地升高了88.13％(P<0.01)，HDL-C的含量极显著地升高了50.00％(P<0.01)。结果表明，摄入外源性高脂成分使得小鼠体内脂质水平极显著升高，导致体内脂质谢紊乱，引起高脂血症。经过10mg/kg/d的辛伐他丁灌胃处理后，高脂饮食小鼠血清TC、TG和LDL-C分别下降了30.07％(P<0.05)、3.41％(P＞0.05)和57.48％(P<0.01)。
与高脂模型组相比，50、100和200mg/kg/d的IPCM分别使高脂血症小鼠血清TC含量显著地下降了28.47％(P<0.05)、38.50％(P<0.01)和41.69％(P<0.01)，呈现剂量-效应关系，200mg/kg/d的IPCM表现出最佳的降TC作用且优于辛伐他丁。对于TG水平，与高脂模型组相比，50、100和200mg/kg/d的IPCM均可使高脂血症小鼠血清TG含量极显著下降了29.55％、39.77％和29.55％(P<0.01)；其中100mg/kg/d为最佳剂量且该剂量下的降血脂效果优于辛伐他丁。对于LDL-C水平，50、100和200mg/kg/d的IPCM分别使LDL-C显著地下降了18.60％、20.60％和49.17％(P<0.01)，呈现剂量-效应关系，200mg/kg/d的IPCM表现出最佳的降LDL-C作用。各剂量组IPCM均不能显著提高HDL-C水平，这表明IPCM未能通过胆固醇逆转运途径发挥降血脂作用。
动脉粥样硬化指数是反映血脂异常升高导致动脉粥样硬化的有效指标。小鼠摄食高脂饲料使得其动脉粥样硬化指数AI较正常小鼠显著地提高20.00％(P<0.05)，而10mg/(kg·d)的辛伐他丁处理极显著地使AI降低51.85％(P<0.01)。100mg/(kg·d)的IPCM灌胃处理使高脂饮食小鼠AI显著地降低34.57％(P<0.01)。
综上所述，低、中、高剂量的IPCM均表现出良好的降血脂作用，其中200mg/kg/d剂量的IPCM使高脂饮食小鼠血清TC、TG和LDL-C分别显著地降低29.55％，29.55％和49.17％(P<0.01)。
2)蛹虫草胞内多糖的降肝脂作用分析
对蛹虫草胞内多糖降肝脂作用分析见图9。与正常对照组相比，高脂饲料喂养28天后，小鼠肝脏TC极显著地提高了85.24％(P<0.01)，肝脏TG极显著地提高了246.34％(P<0.01)。与高脂模型组比较，10mg/kg/d辛伐他丁使高脂饮食小鼠肝脏TC和TG含量分别显著地降低49.34％(P<0.01)和18.87％(P<0.05)。
50、100及200mg/kg/d的IPCM分别使高脂饮食小鼠肝脏TC含量极显著降低28.99％、31.48％和30.23％(P<0.01)。在肝脏TG累积方面，50、100及200mg/kg/d的IPCM分别使高脂饮食小鼠肝脏TG含量降低3.66％、10.99％和13.52％，但差异均无统计学意义(P＞0.05)。
由以上可知，IPCM能有效地逆转喂食高脂饲料引起肝脏脂肪的累积，缓解高脂饮食引起的肝脏大泡性脂肪病变，使肝脏组织形态恢复正常(图10)，保护肝脏。其中200mg/kg/d剂量的IPCM使高脂饮食小鼠肝脏TC和TG分别降低30.23％和13.52％。
3)蛹虫草胞内多糖对短链脂肪酸受体GPR41和GPR43表达作用分析
短链脂肪酸主要由肠道中的细菌发酵而产生的，不仅能在肠道内作为营养物质为其他器官吸收和利用，同时还能调节胃肠道对脂肪的代谢。短链脂肪酸受体GPR41和GPR43均可以通过介导短链脂肪酸而对机体发挥重要的生理作用。GPR43是结肠中细胞表面高蛋白受体，由乙酸和丙酸等短链脂肪酸诱导激活，能促进脂质和葡萄糖代谢的胰岛素的分泌，起到调节动物食欲、体液分泌和电解质平衡及炎症抑制等生理作用。GPR41由丙酸、丁酸和戊酸等短链脂肪酸激活，参与调控脂肪酸的吸收，并调节机体的能量平衡状态。
对蛹虫草胞内多糖调节短链脂肪酸受体GPR41和GPR43表达作用分析见图11。与高脂模型组比较，阳性药物辛伐他丁极显著地使结肠GPR43的表达量上调了41.42％(P＜0.01)，而对GPR41的作用无统计学意义(P＞0.05)；50、100和200mg/kg/d的IPCM使得结肠GPR43的表达量分别极显著上调了92.43％％、108.64％和95.82％(P<0.01)。此外，IPCM表现出提高小鼠结肠GPR41的表达量的作用，呈剂量-效应关系，且当剂量达到200mg/kg/d时，IPCM使结肠GPR41表达量极显著地上调62.36％(P<0.01)。
结合实施例4和实施例5结果可知，IPCM可发挥着“类益生元”的作用，通过调节的微生物与宿主之间存在着动态的互惠作用，即益生元或“类益生元”提高了机体有益菌群的比例，降低有害菌群的相对丰度，尤其是降低促炎症和肥胖真菌的相对丰度；有益的优势菌群借助其代谢产物如短链脂肪酸等，进而诱导激活短链脂肪酸受体GPR41和GPR43的表达，促进脂肪的代谢和抑制脂肪的累积，从而起到降血脂和保肝作用。本发明首次从肠道菌群的角度验证了蛹虫草多糖降血脂活性，为蛹虫草降血脂机制研究提供新的思路，也为蛹虫草及其他药食两用真菌多糖制备调节高脂血性肠道紊乱的药物以及临床治疗高脂血症开辟新的领域。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种蛹虫草胞内多糖的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
(1)将蛹虫草菌种接种于液体培养基中进行发酵培养，固液分离，得到蛹虫草菌丝体；
(2)将步骤(1)中得到的蛹虫草菌丝体烘干、粉碎过筛，得到菌丝体粉末；然后加入石油醚进行脱脂处理，烘干，得到蛹虫草菌丝体干粉；
(3)将步骤(2)中得到的蛹虫草菌丝体干粉加入到水中，于65～95℃条件下进行热水浸提，得到蛹虫草浸提液；然后将其浓缩，得到浓缩后的蛹虫草浸提液；
(4)将步骤(3)中得到的浓缩后的蛹虫草浸提液采用胰蛋白酶和Sevage法除蛋白，得到除蛋白后的蛹虫草浸提液；
(5)将步骤(4)中得到的除蛋白后的蛹虫草浸提液加入到乙醇溶液中，静置，离心收集沉淀，得到多糖沉淀；然后将多糖沉淀加水复溶，得到多糖溶液；再将其脱色、透析、浓缩、干燥，得到蛹虫草胞内粗多糖；
(6)将步骤(5)中得到的蛹虫草胞内粗多糖进行DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析纯化，然后透析，冷冻干燥，得到蛹虫草胞内多糖。
2.根据权利要1所述的蛹虫草胞内多糖的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述的DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析通过如下步骤实现：
(i)往层析柱中加入1/3柱体积的去离子水，打开下端出液口，再将DEAE-SepharoseFast Flow填料倒入层析柱中，使之在层析柱中自然沉降，填料的体积为柱体积的2/3；
(ii)利用恒流泵将Tris-HCl缓冲液泵入到层析柱内，打开下端出液口，直至流出液的pH值与Tris-HCl缓冲液的pH值相同；
(iii)将蛹虫草胞内粗多糖加入Tris-HCl缓冲液中，混合均匀后过滤，得到蛹虫草胞内粗多糖溶液；然后将其加入层析柱中，再用NaCl-Tris缓冲液洗脱多糖，收集蛹虫草胞内多糖；
(iv)以苯酚硫酸法测定步骤(iii)中收集的蛹虫草胞内多糖，合并单一吸收峰样品，透析，浓缩，冷冻干燥，得到蛹虫草胞内多糖；
步骤(ii)中所述的Tris-HCl缓冲液的pH值为7.0～7.6；
步骤(ii)中所述的流出液的流速为1mL/min；
步骤(ii)中所述的蛹虫草胞内粗多糖溶液的浓度为10mg/mL；
步骤(iii)中所述的过滤为采用0.22μm的微孔滤膜进行过滤；
步骤(iii)中所述的NaCl-Tris缓冲液为将氯化钠溶于Tris-HCl缓冲液获得的NaCl-Tris缓冲液；所述的NaCl-Tris缓冲液的pH值为8.0～8.2；
步骤(iii)中所述的NaCl-Tris缓冲液中NaCl的摩尔浓度为0.1～0.4mol/L；
步骤(iii)中所述的洗脱的流速为1mL/min。
3.根据权利要1所述的蛹虫草胞内多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的采用胰蛋白酶和Sevage法除蛋白通过如下步骤实现：
(I)将步骤(3)中得到的浓缩后的蛹虫草浸提液调pH至8.0，然后加入胰蛋白酶溶液，混合均匀，于37℃、120rpm振荡30～60min，再水浴灭酶，冷却至室温，得到酶解后的蛹虫草浸提液；
(II)将步骤(I)中得到的酶解后的蛹虫草浸提液加入氯仿正丁醇混合液，于25℃、速180rpm振荡30～40min，然后离心，弃去蛋白层及有机溶液，收集上清液；
(III)重复步骤(II)3～5次，直至不再出现蛋白层，得到除蛋白后的蛹虫草浸提液；
步骤(I)中所述的灭酶的条件为：100℃灭酶10～15min；
步骤(I)中所述的胰蛋白酶溶液的浓度为质量体积比2％～5％；
步骤(I)中所述的胰蛋白酶溶液与浓缩后的蛹虫草浸提液的体积比为1：20～30；
步骤(II)中所述的氯仿正丁醇混合液中氯仿和正丁醇的体积比为4：1；
步骤(II)中所述的氯仿正丁醇混合液与酶解后的蛹虫草浸提液的体积比为1：0.2～0.25；
步骤(II)中所述的离心的条件为：5000rpm离心10～15min。
4.根据权利要1所述的蛹虫草胞内多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的发酵培养通过如下步骤实现：
①将蛹虫草斜面母种活化培养后转接至斜面固体培养基中，于20～25℃培养8～15d，直至菌丝铺满斜面为止，得到蛹虫草斜面菌种；
②将步骤①得到的蛹虫草斜面菌种上挑取4～6块菌块，接种于150～200mL液体发酵培养基中，在26℃、转速160rpm条件下避光恒温振荡培养7d，得到蛹虫草液体发酵产物；
步骤①所述的斜面固体培养基的配方为：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨1g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 1g，(NH4)2SO4 2g，维生素B1 0.1g，补纯水定容至1000mL，加琼脂20g融化，调pH为6.5；
步骤②所述的液体发酵培养基的配方为：蔗糖50g，KNO3 4g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 1g，维生素B1 0.1g，补纯水定容至1000mL，调pH为6.5。
5.根据权利要1所述的蛹虫草胞内多糖的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的固液分离为采用离心和/或真空抽滤的方式进行分离；
步骤(2)中所述的烘干的温度均为50～70℃；
步骤(2)中所述的过筛为过60～100目筛；
步骤(2)中所述的菌丝体粉末与石油醚的固液比为1：1～2，g/mL；
步骤(2)中所述的脱脂处理的时间为2～4天；
步骤(2)中所述的脱脂处理的次数为1～3次；
步骤(3)中所述的蛹虫草菌丝体干粉与水的料液比1:20～40，g/mL；
步骤(3)中所述的提取的时间为1～3h；
步骤(3)中所述的提取的次数为1～3次；
步骤(3)中所述的浓缩为采用旋转蒸发的方式进行浓缩；
步骤(3)中所述的浓缩的温度为50～70℃；
步骤(3)中所述的浓缩的为浓缩至蛹虫草浸提液体积的1/3～1/5；
步骤(5)中所述的乙醇溶液与除蛋白后的蛹虫草浸提液的体积比为2～5：1；
步骤(5)中所述的乙醇溶液为质量分数95％的乙醇溶液；
步骤(5)中所述的静置的条件为：4℃静置12～18h；
步骤(5)中所述的多糖溶液的浓度15～30mg/mL；
步骤(5)中所述的脱色为采用H2O2溶液进行脱色；
步骤(5)中所述的脱色的条件为：50℃水浴保温1～2h；
步骤(5)中所述的透析为采用截留分子量为6000～8000Da的透析袋进行透析；
步骤(5)中所述的浓缩为浓缩至蛹虫草多糖提取液体积的1/3～1/5；
步骤(6)中所述的透析为采用截留分子量为6000～8000Da的透析袋进行透析。
6.一种蛹虫草胞内多糖，其特征在于：通过权利要求1～5任一项所述的方法制备得到。
7.权利要求6所述的蛹虫草胞内多糖在制备对肠道益生菌具有促增殖作用，促进肠道短链脂肪酸产量，调节肠道菌群结构，和/或降血脂的产品中的应用，其特征在于：
所述的产品为药品、保健品和功能性食品中的至少一种；
所述的肠道益生菌为拟杆菌、艾克曼菌、瘤胃菌和丁酸盐合成菌中的至少一种；
所述的丁酸盐合成菌为肠道真杆菌(Eubacterium)和梭菌属(Clostridium)中的至少一种；
所述的短链脂肪酸为乙酸、丙酸、丁酸和戊酸中的至少一种；
所述的肠道菌群为肠道细菌群和/或肠道真菌群。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的蛹虫草胞内多糖的使用剂量为50～200mg/kg/d。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的蛹虫草胞内多糖的使用剂量为100～200mg/kg/d。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述的肠道细菌包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、Epsilonbacteraeota、放线菌门(Actinobacteria)、Patescibacteria、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、蓝细菌门(Cyanobacteria)和柔膜菌门(Tenericutes)；
所述的肠道真菌包括曲霉科(Aspergillaceae)、节担菌科(Wallemiaceae)、根霉科(Rhizopodaceae)、葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)、假球壳科(Pleosporaceae)、假毛球壳科(Trichosporonaceae)和德巴列酵母科(Debaryomycetaceae)。
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