JPS5991892A - 抗腫瘍活性を有するグルカンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ノムシタケ属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　）に属
するハナヤスリタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｏｐｈｉｏ
ｇｌｏｓｓｏｉｄｅｓＦｒ、　）を培養することによ郵
得られる培養液から抗腫瘍活性を有するグルカンを製造
する方法に関する。

近年、担子菌類を始めとする釉々の微生物を培養するこ
とにより主としてグルカンからなる多糖体を主要な活性
成分とする抗腫瘍性物質を製造する方法が提案されてお
り、一部には工業的に実施されているものもある。

本発明者は、さきに微生物が生産する多糖体の制癌性に
鑑み、更に制癌性の優れた多糖体を生産する微生物につ
いて検索した結果、ノムシタケ属（ＣｏｒｄＹｃｅｐｓ
　）に属するハナヤスリタケ（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｏ
ｐｈｉｏｇｌｏｓｓｏｉｄｅｓ　Ｆｒ、　）の培養によ
り生産される多糖体が腫瘍細胞に対して優れた制癌効果
を示すことを見出したが、その後上記ハナヤスリタケの
培養液に特定な精製処理を施すことにより、該培養液よ
り制癌性の著しく優れたグルカンを高収量で採取し得る
ことの知見を得て本発明をなすに至った。

したがって、本発明は、ハナヤヌリタケを利用してその
培養液から優れた抗腫瘍活性を有するグルカンを高収率
で採取し得る方法を提供することを目的とする。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明は、ハナヤスリタケと称せられるコルダイセブス
・オフイオグロソイデス（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｏｐｈｉ
ｏｇｌｏｓｓｏｉｄｅｓ　Ｆｒ、　）を寒天平板培地で
培養して得られる菌糸体を、液体培地中で培養し、得ら
れる培養液から菌糸体を分離除去し、次いで低分子物質
を除去した後、該培養液にエタールを添加し、生成する
沈殿物を採取して溶解し、得られる溶液からグルカンを
加温下に析出させることを特徴とする。

捷た、本発明は、上記低分子物質を除去して培養液を超
音波処理に付し、得られる培養液からグルカンを加温下
に析出させることも特徴として包含する。

本発明で利用するコルダイセプス・オフイオグロソイデ
スは肉厚菌目（Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ　）　＊　肉座
菌科（Ｈｙｐｏｃｒｅａｃｅａｅ　）　＋ノムシタケ属
（Ｃｏｒ取ｃｅｐｓ　）に屈し、その菌株は財団法人発
酵研究所より入手し得る（　Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ′ｏｐ
ｈｉｏｇｌｏｓｓｏｉｄｅｓ　Ｆｒ、　Ｉ　ＦＯ８９９
２）。

本発明では、まず、上記菌を寒天平板培地（例えばポテ
ト・デキストロース寒天培地に０．１〜０．３重量％の
酵母エキスを添加してｐＨを４〜７に調整した培地）に
接種し１通常２０〜３０Ｃ１好ましくは２５〜２７Ｃの
温度で１０〜１４日間程度培養して上記培地の表面に菌
糸体を生育させる。

次いで、本発明では、上述のごとく培養して得られる白
色乃至淡黄色の菌糸体を種母として液体培地中で培養す
る。この培養に当っては、培養初期（一般には３〜６日
間）には静置培養で行ない１次いで引続き振とり培養又
は通気攪拌培養で４〜６日間程度行なうことが好ましい
。

又、この培養時の温度は全期間を通して２０〜３０？Ｚ
’、好ましくは２５〜２７Ｃである。

上記液体培養に用いる培地は、一般に微生物の培養に適
用される公知の液体培地でよく１例えばグルコースを糖
源とし、これにペプトン。

酵母エキス等を添加したもの、更にこの培地に無機塩類
、アミノ酸、ビタミン等を添加したものを用い得る。又
液体培地のｐＨは４〜７の範囲が適当であり、特に滅菌
前のｐＴＴが５．５である培地の使用が好ましい。

本発明により、ハナヤスリタケの菌糸体を上述のように
して液体培養すると高粘性の培養物が得られるので、こ
れに２〜３倍容の蒸留水を添加して粘性を低下させ、よ
く攪拌混合した後、遠心分離、ろ過尋の手法により培養
物から菌糸体を分離除去する。次いで、得られる培養炉
液から低分子物質（分子量１，０００以下）を除去する
ために該培養ろ液を透析に付する。この透析は流水およ
び蒸留水を用いて行なうとよい。又、上記低分子物質の
除去には活性炭処理、イオン交換樹脂処理もしくは限外
濾過、更にはセパーグ法や酵素法等を組合わせて適用し
てもよい。

上述のようにして低分子物質を除去した培養ｐ液に、必
要に応じ濃縮した稜、エタノールを添加して該培養Ｆ液
中のグルカンを沈殿させる。

このエタノールによる沈殿生成は、培養Ｐ液に等量のエ
タノールを攪拌下に添加し、冷所Ｋ　−昼夜放置するこ
とによシ行なう。このようにして沈殿物として得られる
グルカンは粗製品であるため更に次のような精製を施す
。

上記沈殿物として得られる粗グルカンをｐＨ２〜６の酸
性水性液１例えば酢酸水溶液に溶解する。この溶解に肖
っては超音波装置又は高速ホモブレンダー等を用いると
効率的に溶解し得ると共に得られる溶液の粘性も低下し
得る。

本発明では、上述のようにして培養ろ液から低分子物質
を除去したものを、エタノールによる沈殿処理を行なう
ことなく、必要に応じ濃縮した後（約り程度に濃縮）、
超音波処理に付することも可能である。この場合超音波
処理は２００ｗで１時間程度行なうとよく、これＫよシ
培養ろ液の濃度が高くてもその粘度が低下するようにな
る。

次いで、上述のようにして得られる溶液並びに培養ろ液
を加温下に保持するとグルカンが析出するに至る。この
際の加温条件は３５乃至１００Ｃの範囲内で温度と時間
との関係で選定するとよい。例えば３５Ｃでは２４時間
、１００ｔＴでは１５分間、好ましくは５０〜７Ｃ１で
３０分間である。

末の精製されたグルカンが得られる。

次に、上述のようにして得られるグルカンの物１Ｋにつ
いて説明する。

（１）物質の性状 白色の不定形粉末で加熱すると分解して炭化する。なお
、明確な融点は示さない。

（２）分子量 １０．０００乃至１，０００，０００の広範囲な分布を
示し、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による平
均分子量は６３２，０００である。

（３）溶解性 水に難溶で、アルカリに可溶性であり、エタノール、ア
セトン、ｎ−へキサン、エーテル等の有機溶剤に不溶で
ある。

（４）　比旋光度 ０．５ＭＮａＣノ溶液（濃度Ｃ＝　０．０５％）中で〔
α〕■＝２．４ （５）呈色反応 フェノール硫酸反応　　　　　＋　（赤褐色）アンスロ
ン反応　　　　　＋　（緑色）モーリッシュ反応　　　
　　＋　（背紫色）エルソンモーガン反応　　　　　− カルバゾール硫酸反応　　　　− ビューレット反応　　　　　− トルイジン・ブルー〇染色　　　− ニンヒドリン反応　　　　　− （６）糖組成 フェノール硫酸法で中性糖を定析した結果その含量は９
４重惜チ以上である。

なお、グルカンを２〜４Ｎ（ｉｉｌｌ酸で加水分解後、
常法によりガスクロマトグラフィで分析した結果、中性
糖はグルコースのみから成り、捷た、４〜６Ｎ塩酸で加
水分解（１６〜２２時間）した試料についてアミノ酸分
析計により分析した結果、アミノ糖およびアミノ酸は検
出されない。また、完全にメチル化したグルカンを加水
分解後、アルディドールアセテート誘導体にしたものを
ガスクロマトグラフィで測定した結果第２図に示すとお
りであって、この測定結果とスミス分解、酵素分析等に
よる分析結果とＫｉみて１本発明によるグルカンは、β
−（１→３）グルカンを主鎖とし、β（１→６）グルコ
ピラノシド分枝を有するβ−（１→３）プルカンである
と同定される。

（７）　　赤外線吸収スペクトル 第１図に示すとおり。

（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）第３図
に示すとおり。

（９）”ＣＮＭＲスヘク）　ル 第４図に示すとおシ。

本発明により、ハナヤスリタケの菌糸体を液体培養して
得られる培養液より上述のようにしてグルカンを採取す
ると、高収量でβ（１→３）グルカンを得るととができ
、しかもこのグルカンは以下に述べるように優れた抗腫
瘍活性を示す。

本グルカンの薬理学特性 （１）急性宿性 試験動物としてマウスはＩＣＲ−ＪＣＬ系、６〜７週令
、体重２３〜２７ｇのものを、ラットはウィスター系、
４〜５週令、体重１１０〜１４０Ｉのものをそれぞれ用
いて、各試験群２５匹に対し本グルカンを経口並びに腹
腔内投与してその急性試験を下記によシ行なった。

グルカンを投与後、１週間にわたって各試験動物の一般
的症状、体重変化及び死亡例につき観察した後層殺剖検
した。結果は表１のとりシであって、　ＬＤｓｏ値が極
めて高いことがわかる。

表　　　１ （２）抗腫瘍活性 グルカン及び過ヨウ素酸、還元処理、ｔ？ｌＪアルコー
ルグルカンの抗腫瘍活性の検定は、　Ｓａｒｃｏｍａ１
８０Ｉｌ′Ｉｔ！瘍細胞を皮下接種したマウスにおける
ｉｎ　Ｖｉｖｎ試験法で行なった。

試験動物はＩＣＲ−ＪＣＬ、６週令雌マウス（体重２５
ｇ±３１りを採用し、１群にそれぞれ１０匹を用いた。

Ｓａｒｃｏｍａ　１８０腫瘍細胞は１マウスの腹腔内に
腹水型で１週間毎に継代しているものを用いた。試験に
当っては接種後−週間目の腹水中の細胞を取シ出し、約
４００万個を含有する生理食塩水０．１　ｍｌを試験マ
ウスの右脇腹下部皮下に移植した。移植して２４時間後
にグルカンを生理食塩水に５■／　１０　ｍｌの濃度に
なるように溶解し、１２０ＣＩ５分間滅菌した溶液を、
腹腔内投与群１尾静脈投与群、並びに筋肉内投与群の各
々に０．２５ｍ１宛投与し、以後１０日日間群に各に連
続１０日間投与した。

なお、対照群には滅菌生理食塩水を０．２５７１１ｊ腹
腔内に投与した。

腫瘍移植後３０日経過してマウスを解剖し、増殖した固
型腫瘍を摘出してその重量を測定することで上記各群と
対照群との比較を行なった。

結果は表２のとうりである。

表　　　　２ 表２におけるＳａｒｃｏｍａ　１８０固型肺瘍に対する
腫瘍増殖抑制率は下記式により算出した値である。

５−Ｔｓ 腫瘍増殖抑制率−Ｃ８×１００ Ｃ８：対照群の平均腫瘍重量 Ｔｓ　；試験群の　　１ 表２にみられるように、本発明によるグルカンの抗腫瘍
活性は極めて高く、更にポリアルコール化することによ
りその活性が増強される。

本発明によるグルカンのＳａｒｃｏｍａ　１８０固型腫
瘍に対する有効投与量は１日当シ１〜１０■／ｋｙ（体
重）であって、常法により製剤化して適用し得る。

以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。

実施例　１ 培地組成 ポリペプトン　　　１０．９ 酵母エキス　　　　　５ｇ グルコース　　　　　３０Ｉ！ 水　　　　　　　　　１ノ ｐＨ＝　　５．５ の組成から成る液体培地を２００　ｍｌずつ５００ｍ１
容の三角フラスコ５０本に分注し、綿栓を附した後に１
２０Ｃで１５分間滅菌し、別に０．３％酵母エキスを添
加したポテト−デキストロース寒天培地で斜面培養して
おいたＣｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓｏｉ
ｄｅｓＩＦｏ　８９９２を上記液体培地に接種し、２３
〜２７Ｃで５日間静置培養を行なった。ひきつづいてこ
九を２３〜２７Ｃで６日間、１８０ｒｒ）ｍにて回転式
の振とり培醇を行ない、高粘性の培ｃ物１０ノを得た。

これに１０ｊ！の蒸留水を加え、ミキサーで指押混合１
〜だＴＩ　７，５１１Ｏｒｐｍで遠心分離を行ない菌糸
体を除去し、粘１１．ｊｌな透明液をイ！＋　ｆ？：、
。この液の中に予め濃塩酸処理後充分水洗し次いでエタ
ノール、アセトンで洗って乾燥した活性炭を、重址比で
５％加え室温で１６時間攪拌した。濾過により活性炭を
除去して得られた液を蒸留水に対して５Ｃで４８時間透
析した後、等量のエタノールを加え、濾過により沈殿物
を回収し真空乾燥し白色の粉末を得た。この粉末を水に
再溶解後、４Ｃで出力２００ワツト、１時間超音波処理
を行なった後、不溶物を１５．００Ｏｒｐｍ　９０分間
の遠心分離によシ除去することにより透明な液を得た。

この液をミリポアフィルタ−（０，４５ｔＩｍ）で除菌
後３７ｃで１９時間加温すると白色の沈殿物を生じた。

この沈殿物を遠心分離により回収した後、２回水洗した
ものを凍結乾燥すると白色の粉末１２．５．９が得られ
た。このようにして得られた物質はグルコースのみから
なるグルカンでその抗腫瘍効果を検定した結果ＩＣＲ−
ＪＣＬ６週令マウスにおける、静脈内投与、腹腔内投与
並びに筋肉内投与（投与−Ｈｚ　５　ｙｍｙ／ｋｇ）で
Ｓａｒｃｏｍａ　１８０固型腫瘍に対する増殖抑制率は
各々９５．６．８７．６並びに８９．２％であ“つた。

実施例　２ 培地組成 ポリペプトン　　　　５ｇ 酵母エキス　　　　　３Ｉ グルコース　　　　　５ｇ リン酸１カリウム　　０．５．９ リン酸２カリウム　　０．５Ｉｉ 塩化マグネシウム　　０．３ｇ 水　　　　　　　　１ノ ｐＨ＝　　５．５ の組成から成る液体培地を１００ｄづつ５００ｍ１容三
角フラスコに分注し、綿栓を附した後に１２０Ｃで１５
分間滅菌したものに、別に寒天斜面培地で培養しておい
たＣｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｎｐｈｊｏｇｌｏｓｓｏｉｄｅ
ｓＩＦＯ８９９２を常法により接種し、２５Ｃで６日間
静置培養した。一方、２００ノ容ジャーファーメンタ−
に前記の組成の液体培地１２０ノを入れ、１２１Ｃで３
０分間滅菌、冷却し、これに上記の培養物を移植して、
２５Ｃにて３日間静置培養の後、引きつづいて通気量４
ｖｖｍ、攪拌数２５　Ｏｒｐｍの条件下で７日間通気攪
拌培養を行なった。得られた培養物をイオン交換水で２
倍に稀釈し、　２０．００Ｏｒｐｍで連続遠心分離を行
ない菌糸体を除去した。

このようにして得た透明な粘稠液を連続式超音波処理に
より低粘化を行ない、次いでこの液を２００ノ用タンク
を用い６０Ｃに攪拌しながら３０分間加温すると白色の
沈殿を生じた。この沈殿物を４Ｃに冷却後遠心分離器に
よシ回収した。回収された沈殿物は２回イオン交換水で
水洗した後凍結乾燥すると白色の粉末１５０．９が得ら
れた。

このようにして得られた物質はグルコースのみからなる
多糖体でその抗腫瘍効果を検定した結果ＩＣＲ−ＪＣＬ
６週令マウスにおける静脈内投与、腹腔内投与並びに筋
肉的投与（投与ｔ５＋ｌｖ／ｋｇ）でＳａｒｃｏｍａ　
１８０固型腫瘍に対するｍｍ抑制率は各々９４．３．８
６．７並びに８５．２％であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係るグルカンのＫＢｒ錠剤法によシ測
定した赤外吸収スペクトルを示したものであり、第２図
は該グルカンのメチル化分析におけるガスマドグラフィ
のチャートを示したものであシ、第３図は該グルカンを
ＤＭＳＯ−ｄａに溶解してプロトンＮＭＲで測定したス
ペクトルを示したものであシ、第４図は該グルカンをＤ
ＭＳＯ−ｄａに溶解して”ＣＮＭＲで測定したスペクト
ルを示したものである。 ポ願んｍｆ）雪印乳業株式会社 、９ＲＪ’！／、１Ｐ耐宮田広豆 第２図 時間（ｍｉｎ） 第３因 第４図 ＋（Ｊ（Ｊ　　　　　ａ　　　　　６０　　ｐｐｍ　（
（３）多摩市連光寺２２５９

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　コルダイセプス・オフィオグロソイデス（Ｃ
   ｏｒｄｙｃｅｐｓｏＴ）ｈｉｏｇｌｏｓｓｏｉｄｅｓ　
   Ｆｒ、　）を寒天平板培地で培養して得られる菌糸体を
   、液体培地中で培養し、得られる培養液から菌糸体を分
   離除去し、次いで低分子物質を除去した後、該培養液に
   エタノールを添加し、生成する沈殿物を採取して溶解し
   、得られる溶液からグルカンを加温下に析出させること
   を特徴とする抗腫瘍活性を有するグルカンの製造法。
2. （２）　　コルダイセプス・オフィオグロソイデス（Ｃ
   ｏｒｄｙｃｅｐｓｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓｏｉｄｅｓ　Ｆ
   ｒ、　）を寒天平板培地で培養して得られる菌糸体を、
   液体培地中で培養し、得られる培養液から菌糸体を分離
   除去し、次いで低分子物質を除去した後、該培養液を超
   音波処理に付し、得られる培養液からグルカンを加温下
   に析出させることを特徴とする抗腫瘍活性を有するグル
   カンの製造法。