JPH0341159B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ノムシタケ属（Cordyceps）に属す
るハナヤスリタケ（Cordyceps
ophioglossoidesFr.）を培養することにより得ら
れる培養液から抗腫瘍活性を有するグルカンを製
造する方法に関する。 近年、担子菌類を始めとする種々の微生物を培
養することにより主としてグルカンからなる多糖
体を主要な活性成分とする抗腫瘍性物質を製造す
る方法が提案されており、一部には工業的に実施
されているものもある。 本発明者は、さきに微生物が生産する多糖体の
制癌性に鑑み、更に制癌性の優れた多糖体を生産
する微生物について検索した結果、ノムシタケ属
（Cordyceps）に属するハナヤスリタケ
（Cordyceps ophioglossoidesFr.）の培養により
生産される多糖体が腫瘍細胞に対して優れた制癌
効果を示すことを見出したが、その後上記ハナヤ
スリタケの培養液に特定な精製処理を施すことに
より、該培養液より制癌性の著しく優れたグルカ
ンを高収量で採取し得ることの知見を得て本発明
をなすに至つた。 したがつて、本発明は、ハナヤスリタケを利用
してその培養液から優れた抗腫瘍活性を有するグ
ルカンを高収率で採取し得る方法を提供すること
を目的とする。 以下本発明を詳しく説明する。 本発明は、ハナヤスリタケを称せられるコルダ
イセプス・オフイオグロソイデス（Cordyceps
ophioglossoides Fr.）を寒天平板培地で培養し
て得られる菌糸体を、液体培地中で培養し、得ら
れる培養液から菌糸体を分離除去し、次いで低分
子物質を除去した後、該培養液にエタールを添加
し、生成する沈殿物を採取して溶解し、得られる
溶液からグルカンを加温下に析出させることを特
徴とする。 また、本発明は、上記低分子物質を除去して培
養液を超音波処理に付し、得られる培養液からグ
ルカンを加温下に析出させることも特徴とし包含
する。 本発明で利用するコルダイセプス・オフイオグ
ロソイデスは肉座菌目（Hypocreales）、肉座菌
科（Hypocreaceae）、ノムシタケ属
（Cordyceps）に属し、その菌株は財団法人発酵
研究所より入手し得る（Cordyceps・
ophioglossoides Fr.IFO8992）。 本発明では、まず、上記菌を寒天平板培地（例
えばポテト・デキストロース寒天培地に0.1〜0.3
重量％の酵母エキスを添加してPHを４〜７に調整
した培地）に接種し、通常20〜30℃、好ましくは
25〜27℃の温度で10〜14日間程度培養して上記培
地の表面に菌糸体を生育させる。 次いで、本発明では、上述のごとく培養して得
られる白色乃至淡黄色の菌糸体を種母として液体
培地中で培養する。この培養に当つては、培養初
期（一般には３〜６日間）には静置培養で行な
い、次いで引続き振とう培養又は通気撹拌培養で
４〜６日間程度行なうことが好ましい。又、この
培養時の温度は全期間を通して20〜30℃、好まし
くは25〜27℃である。 上記液体培養に用いる培地は、一般に微生物の
培養に適用される公知の液体培地でよく、例えば
グルコースを糖源とし、これにペプトン、酵母エ
キス等を添加したもの、更にこの培地に無機塩
類、アミノ酸、ビタミン等を添加したものを用い
得る。又液体培地のPHは４〜７の範囲が適当であ
り、特に滅菌前のPHが5.5である培地の使用が好
ましい。 本発明によりハナヤスリタケの菌糸体を上述の
ようにして液体培養すると高粘度の培養物が得ら
れるので、これに２〜３倍容の蒸留水を添加して
粘性を低下させ、よく撹拌混合した後、遠心分
離、ろ過等の手法により培養物から菌糸体を分離
除去する。次いで、得られる培養液から低分子
物質（分子量1000以下）を除去するために該培養
液を透析に付する。この透析は流水および蒸留
水を用いて行なうとよい。又、上記低分子物質の
除去には活性炭処理、イオン交換樹脂処理もしく
は限外過、更にはセバーグ法や酵素法等を組合
わせて適用してもよい。上述のようにして低分子
物質を除去した培養液に、必要に応じ濃縮した
後、エタノールを添加して該培養液中のグルカ
ンを沈殿させる。このエタノールによる沈殿生成
は、培養液に等量のエタノールを撹拌下に添加
し、冷所に一昼夜放置することにより行なう。こ
のようにして沈殿物として得られるグルカンは粗
製品であるため更に次のような精製を施す。 上記沈殿物として得られる粗グルカンをPH２〜
６の酸性水性液、例えば酢酸水溶液に溶解する。
この溶解に当つては超音波装置又は高速ホモブレ
ンダー等を用いると効率的に溶解し得ると共に得
られる溶液の粘性も低下し得る。 本発明では、上述のようにして培養液から低
分子物質を除去したものを、エタノールによる沈
殿処理を行なうことなく、必要に応じ濃縮した後
（約１／４程度に濃縮）、超音波処理に付すること
も可能である。この場合超音波処理は200wで１
時間程度行なうとよく、これにより培養液の濃
度が高くてもその粘度が低下するようになる。 次いで、上述のようにして得られる溶液並びに
培養液を加温下に保持するとグルカンが析出す
るに至る。この際の加温条件は35乃至100℃の範
囲内で温度と時間との関係で選定するとよい。例
えば35℃では24時間、100℃では15分間、好まし
くは50〜70℃で30分間である。 このようにして析出して得られるグルカンを冷
却後遠心分離により分離し、水洗後真空乾燥する
と白色粉末の精製されたグルカンが得られる。 次に、上述のようにして得られるグルカンの物
性について説明する。 (1) 物質の性状 白色の不定形粉末で加熱すると分解して炭化
する。なお、明確な融点は示さない。 (2) 分子量 10000乃至1000000の広範囲は分布を示し、高
速液体クロマトグラフイ（HPLC）による平均
分子量は632000である。 (3) 溶解性 水に難溶で、アルカリに可溶性であり、エタ
ノール、アセトン、ｎ―ヘキサン、エーテル等
の有機溶剤に不溶である。 (4) 比旋光度 0.5MNaCl溶液（濃度Ｃ＝0.05％）中で〔α〕
²⁰ _D＝2.4 (5) 呈色反応 フエノール硫酸反応 ＋ （赤褐色） アンスロン反応 ＋ （緑 色） モーリツシユ反応 ＋ （青紫色） エルソンモーガン反応 − カルバゾール硫酸反応 − ビユーレツト反応 − トルイジン・ブルーＯ染色 − ニンヒドリン反応 − (6) 糖組成 フエノール硫酸法で中性糖を定量した結果そ
の含量は94重量％以上である。 なお、グルカンを２〜4N硫酸で加水分解後、
常法によりガスクロマトグラフイで分析した結
果、中性糖はグルコースのみから成り、また、
４〜6N塩酸で加水分解（16〜22時間）した試
料についてアミノ酸分析計により分析した結
果、アミノ糖およびアミノ酸は検出されない。
また、完全にメチル化したグルカンを加水分解
後、アルデイトールアセテート誘導体にしたも
のをガスクロマトグラフイで測定した結果第２
図に示すとおりであつて、この測定結果とスミ
ス分解、酵素分析等による分析結果とに鑑み
て、本発明によるグルカンは、β―（１→３）
グルカンを主鎮とし、β（１→６）グルコピラ
ノシド分枝を有するβ―（１→３）ブルカンで
あると同定される。 (7) 赤外線吸収スペクトル 第１図に示すとおり。 (8) プロトン核磁気共鳴スペクトル（NMR） 第３図に示すとおり。 (9) ¹³CNMRスペクトル 第４図に示すとおり。 本発明により、ハナヤスリタケの菌糸体を液体
培養して得られる培養液より上述のようにしてグ
ルカンを採取すると、高収量でβ（１→３）グル
カンを得ることができ、しかもこのグルカンは以
下に述べるように優れた抗腫瘍活性を示す。 本グルカンの薬理学特性 (1) 急性毒性 試験動物としてマウスはICR―JCL系、６〜
７週令、体重23〜27ｇのものを、ラツトはウイ
スター系、４〜５週令、体重110〜140ｇのもの
をそれぞれ用いて、各試験群25匹に対し本グル
カンを経口並びに腹腔内投与してその急性試験
を下記により行なつた。 グルカンを投与後、１週間にわたつて各試験
動物の一般的症状、体重変化及び死亡例につき
観察した後屠殺剖検した。結果は表１のとうり
であつて、LD₅₀値が極めて高いことがわかる。

【表】 (2) 抗腫瘍活性 グルカン及び過ヨウ素酸、還元処理ポリアル
コールグルカンの抗腫瘍活性の検定は、
Sarcoma180腫瘍細胞を皮下接種したマウスに
おけるin vivo試験法で行なつた。 試験動物はICR―JCL、６週令雌マウス（体
重25ｇ±３ｇ）を採用し、１群にそれぞれ10匹
を用いた。Sarcoma180腫瘍細胞は、マウスの
腹腔内に腹水型で１週間毎に継代しているもの
を用いた。試験に当つては接種後一週間目の腹
水中の細胞を取り出し、約400万個を含有する
生理食塩水0.1mlを試験マウスの右脇腹下部皮
下に移植した。移植して24時間後にグルカンを
生理食塩水に５mg／10mlの濃度になるように溶
解し、120℃15分間滅菌した溶液を、腹腔内投
与群、尾静脈投与群、並びに筋肉投与群の各々
に0.25ml宛投与し、以後10日間各群に各各の投
与を連続して行つた。 ポリアルコールグルカン（CO―１）は同様
に溶解し腹腔内に連続10日間投与した。 なお、対照群には滅菌生理食塩水を0.25ml腹
腔中に投与した。 腫瘍移植後30日経過してマウスを解剖し、増
殖した固型腫瘍を摘出してその重量を測定する
ことで上記各群と対照群との比較を行なつた。 結果は表２のとおりである。

【表】 表２におけるSarcoma180固型腫瘍に対する
腫瘍増殖抑制率は下記式により算出した値であ
る。 腫瘍増殖抑制率＝Cs−Ts／Cs×100 Cs：対照群の平均腫瘍重量 Ts：試験群の 〃 表２にみられるように、本発明によるグルカ
ンの抗腫瘍活性は極めて高く、更にポリアルコ
ール化することによりその活性が増強される。 本発明によるグルカンのSarcoma180固型腫
瘍に対する有効投与量は１日当り１〜10mg／Kg
（体重）であつて、常法により製剤化して適用
し得る。 以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説
明する。 実施例 １ 培地組成 ポリペプトン 10ｇ 酵母エキス ５ｇ グルコース 30ｇ 水 １ PH＝5.5 の組成から成る液体培地を200mlずつ500ml容の三
角フラスコ50本に分注し、綿栓を附した後に120
℃で15分間滅菌し、別に0.3％酵母エキスを添加
したポテト−デキストロース寒天培地で斜面培養
しておいたCordyceps ophioglossoides IFO
8992を上記液体培地培地に接種し、23〜27℃で５
日間静置培養を行なつた。ひきつづいてこれを23
〜27℃で６日間、180rpmにて回転式の振とう培
養を行ない、高粘度の培養物10を得た。これに
10の蒸留水を加え、ミキサーで撹拌混合した後
7500rpmで遠心分離を行ない菌糸体を除去し、粘
稠な透明液を得た。この液の中に予め濃塩酸処理
後充分水洗し次いでエタノール、アセトンで洗つ
て乾燥した活性炭を、重量比で５％加え室温で16
時間撹拌した。過により活性炭を除去して得ら
れた液を蒸留水に対して５℃で48時間透析した
後、等量のエタノールを加え、過により沈殿物
を回収し真空乾燥し白色の粉末を得た。この粉末
を水に再溶解後、４℃で出力200ワツト、１時間
超音波処理を行なつた後、不溶物を15000rpm90
分間の遠心分離により除去することにより透明な
液を得た。この液をミリポアフイルター
（0.45μm）で除菌後37℃で19時間加温すると白色
の沈殿物を生じた。この沈殿物を遠心分離により
回収した後、２回水洗したものを凍結乾燥すると
白色の粉末12.5ｇが得られた。このようにして得
られた物質はグルコースのみからなるグルカンで
その抗腫瘍効果を検定した結果ICR−JCL6週令
マウスにおける、静脈内投与、腹腔内投与並びに
筋肉内投与（投与量５mg／Kg）でSarcoma180固
型腫瘍に対する増殖抑制率は各々95.6，87.6並び
に89.2％であつた。 実施例 ２ 培地組成 ポリペプトン ５ｇ 酵母エキス ３ｇ グルコース ５ｇ リン酸１カリウム 0.5ｇ リン酸２カリウム 0.5ｇ 塩化マグネシウム 0.3ｇ 水 １ PH＝5.5 の組成から成る液体培地を100mlづつ500ml容三角
フラスコに分注し、綿栓を附した後に120℃で15
分間滅菌したものに、別に寒天斜面培地で培養し
ておいたCordyceps ophioglossoides IFO 8992
を常法により接種し、25℃で６日間静置培養し
た。一方、200容ジヤーフアーメンターに前記
の組成の液体培地120を入れ、121℃で30分間滅
菌、冷却し、これに上記の培養物を移植して、25
℃にて３日間静置培養の後、引きつづいて通気量
4vvm、撹拌数250rpmの条件下で７日間通気撹拌
培養を行なつた。得られた培養物をイオン交換水
で２倍に稀釈し、20000rpmで連続遠心分離を行
ない菌糸体を除去した。このようにして得た透明
な粘稠液を連続式超音波処理により低粘化を行な
い、次いでこの液を200用タンクを用い60℃に
撹拌しながら30分間加温すると白色の沈殿を生じ
た。この沈殿物を４℃に冷却後遠心分離器により
回収した。回収された沈殿物は２回イオン交換水
で水洗した後凍結乾燥すると白色の粉末150ｇが
得られた。 このようにして得られた物質はグルコースのみ
からなる多糖体でその抗腫瘍効果を検定した結果
ICR―JCL6週令マウスにおける静脈内投与、腹
腔内投与並びに筋肉内投与（投与量５mg／Kg）で
Sarcoma180固型腫瘍に対する増殖抑制率は各々
94.3，86.7並びに85.2％であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係るグルカンのKBr錠剤法
により測定した赤外吸収スペクトルを示したもの
であり、第２図は該グルカンのメチル化分析にお
けるガスマトグラフイのチヤートを示したもので
あり、第３図は該グルカンをDMSO―d₆に溶解
してプロトンNMRで測定したスペクトルを示し
たものであり、第４図は該グルカンをDMSO―
d₆に溶解して ¹³CNMRで測定したスペクトルを
示したものである。

【特許請求の範囲】

１ 細菌細胞の残留物及びマイクロゲルを不純物
として含むキサンタンガムの酵素処理による浄化
法において、担子菌類の少なくとも１種のセルラ
ーゼによる前記ガムの水中分散処理を含み、前記
水性分散液が３〜７のPH、少なくとも10^-1当量／
の、アルカリ金属及び／又はアルカリ土金属の
塩の溶解濃度及び25〜65℃の処理温度を有するこ
とを特徴とする方法。 ２ 前記酵素による処理のPHが３〜６の間に含ま
れる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ キサンタンガムが、キサンタンガムを産生す
る細菌の発酵原液の形態において処理に付せら
れ、前記ガムが細菌細胞の残留物を含み、該ガム
を固体として単離することを目的とする処理を受
けていない、特許請求の範囲第１項または２項記
載の方法。 ４ 処理に付せられるキサンタンガムが細菌細胞
の残留物を含む固体のキサンタンガムである、特