DK151640B - Fremgangsmaade til fremstilling af forbindelser med carcinostatisk og immunostimulerende virkning - Google Patents

Description

DK 151640 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte forbindelser, der udviser carcinostatiske og immunostimulerende virkninger og betegnes TF-210 og TF-310.

5 I de senere år har man i udstrakt grad anvendt lægemidler til patienter med forskellige typer cancer, der bevirker en forøgelse af værtsorganismens immunologiske aktivitet, hvorved der opnås en carcinostatisk virkning ved hjælp fra den immunologiske funktion. Som antitumormidler i et 10 sådant lægemiddel kendes forbindelser, der opnås fra forskellige bakterieorganismer eller forskellige bakteriekulturer eller polysacchari der, der er opnået fra frugtlegemerne af Basidiomycetes eller dyrkede svampelegemer heraf. Indtil nu er der imidlertid ikke blevet foretaget 15 undersøgelse af de farmakologiske virkninger af kulturer fremstillet ved dyrkning af bakterier tilhørende slægten Fusobacterium.

Man har nu undersøgt den farmakologiske virkning af den supernatante væske, der er opnået ved at dyrke Fusobac-20 terium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) og fjerne organismerne fra kulturen, og man har overraskende fundet, at en særlig komponent, der findes i den supernatante væske, udviser carcinostatisk virkning. Man har fundet, at komponenten har en indirekte carcinostatisk 25 virkning ved at forøge den værtsformi diede antitumor- virkning eller værtens immunitet og at udnytte denne. Komponenten udviser særdeles lav toxicitet, og den kan også opnås ved at behandle selve kulturen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse 30 hermed ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Fra beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 3616/80 må det endvidere anses for kendt at fremstille en stof- 2

DK 15164QB

blanding betegnet TF-1Q0 eller fraktioner heraf med car-cinostatiske og immunostimulerende virkninger ved en fremgangsmåde som er ejendommelig ved at Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) dyrkes i et 5 passende næringssubstrat, hvorefter et hydrofilt organisk opløsningsmiddel sættes til kulturen eller dennes supernatante del. Herefter isoleres det dannede bundfald, og den vandopløslige fraktion af bundfaldet isoleres og underkastes eventuelt efterfølgende dialyse, 10 ultrafiltrering, behandling med ionbytter, udfældning med bariumioner og efterfølgende fjernelse af barium, dialyse og ultrafiltrering eller den vandopløslige fraktion tilsættes et kvaternært ammoniumsalt, bundfaldet isoleres, og der dissocieres, idet de ønskede fraktioner isoleres 15 på det enkelte behandlingstrin.

Opfindelsen beskrives nærmere i det følgende.

Som den anvendte bakterie ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes således Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) og spontane mutanter eller kunstigt 20 modificerede mutanter heraf med væsentlig samme egenskaber som denne.

De bakteriologiske egenskaber af Fusobacterium nucleatum TF-031 er følgende: (I) form (1) celleform: tenformede (fig. 1) (2) cellernes polymorphisme: ingen (3) bevægelighed: ingen (4) sporer: ingen (5) Gramfarvning: Gram-negativ (6) syreresistens: negativ (II) Vækstbetingelser i et dyrkningssubstrat:

DK 151640 B

3 (1) TF-a agarplade og skråagardyrkningssubstrat Ydre form: rund Størrelse: ca. 1 mm Udvækst: halvkugleformet 5 Struktur: dugdråbeagtig

Overflade: glat Kanter: glat

Farve: mælkeagtig gullighvid Gennemskinnelighed: uigennemsigtig 10 (2) TF-a flydende dyrkningssubstrat Vækstgrad: kraftig Turbiditet: koagulering Bundfald: intet

Overfladevækst: ingen, ingen vækst til en dybde på 15 på ca. 5 mm

Gasudvikling: ingen (III) Fysiologiske egenskaber (1) Produktion af hydrogensulfid: + (2) Reduktion af nitrater: - 20 (3) Produktion af smørsyre: + (4) Produktion af indol: + (5) Urease: - (6) Katalase: - (7) Stivelseshydrolyse: - 25 (8) Oxygenkrav: anaerob (9) Produktion af ammoniak: + (10) Produktion af carbondioxid: +

(11) Væskstområde: pH 5,0 - 8,5, temperatur 30 - 45 °C

(12) Produktion af gas fra sukkerarter: L-arabinose (-)* 30 D-xylose (-), D-glucose (-), D-mannose (-), D-fruc- tose (-), D-galactose (-), maltsukker (-), sucrose (-), trehalose (-), sorbitol (-), mannitol (-), inositol (-), glycerol (-), stivelse (-).

De omhandlede forbindelser kaldet TF-210 og TF-310 frem-35 stilles f.eks. på følgende måde:

DK 151640 B

4 o o H >—1

CM fA

1 1 U_ Lp J— I- 'l·

U_ tA

CD <t P <f

CD I I

SZ lA CL

i—I Λ to, cd ja (ί α zc ®

I CD IC

Li_ 8J CD Q- C ->-1

1— > CD CD (D

i—1 .TJ TJ 4->

E 0 0 TJ '0 0 O

3 -p «Η >H > -C P

-PC ι-H CU P CL

ø ro -p D- ø ffi (D----p -- --D--* ø -C- D— h ro ra c ό ro o c tj ή 3 p «cm i« ø

c 0 ^ DJ CD

Q, Ή I—i E O E i—I 0

3 CD O 0 C

•p -H CD CD P

p C 0 0 -0 0 0 Ό *“ Ή ''"j -p "O TJ -P Q. ϋ_

CJ -P O

ro p Ξ ro 3

_Q 0 CD P TJ

o i—i cn ·ρ c cd —i c cd ro 3 0 ·Η -X 3> u- c lj

P CD C

Cp 3 S O

ro -p ή ·Η .—I D- y -p cn 3 o c co ro

-P J* C I P

C CD O lA Cp .Μ ·Η ·Ρ ρ c -P c >n ro zi ø o cn ro i P P CL cp o ci_ ro +J Dl "O D>

i—I *P C C

•p i—i ro *p Q_ CD 3= i—t

0 CD E

ps ro

"O rP CD

CL CL

1 O C3

DK 151640B

5

Ovennævnte produktionsmetode beskrives nedenfor: (1) Dyrkning af bakterier

Dyrkningen af Fusobacterium nucleatum TF-031 udføres på almindelig måde til dyrkning af anaerobe bak-5 terier. Dvs., et dyrkningssubstrat indeholdende en nitrogen-kilde som f. eks. oksehjerne-hjerteekstrakter, forskellige peptoner eller lignende; en vitaminkilde som f. eks. gærekstrakt eller lignende; et uorganisk salt som f. eks. natriumchlorid eller lignende; en carbonkilde som f. eks.

10 glucose, lactose eller lignende; et reducerende middel som f. eks. L-cystin, natriumsulfit, thioglycolat eller lignende, indstilles til en pH-værdi på 6 - 8,5, fortrinsvis 6,5 - 7,5, og bakterierne udsåes på dyrkningssubstratet, hvorefter steady-state-dyrkning udføres under anae-15 robe betingelser ved 30 - 42 °C, fortrinsvis 32 - 37 °C i 1 - 5 dage, fortrinsvis 24 - 96 timer. Specielt er det ønskeligt at anvende dyrkningssubstratet beskrevet i tabel 1 (i det efterfølgende omtalt som TF-dyrkningssubstrat). Imidlertid er hjerne-hjerte-infusionssubstratet, der er et 20 oksehjerne-hjerte-ekstrat, ikke altid nødvendigt som nitro genkilde, og det kan erstattes med et hjerteinfusionssubstrat, der er et oksehjerteekstrakt, kødekstrakt, fiske-ekstrakt, majsstøbevæske eller lignende. Bland.t de forskellige peptoner, er proteosepepton og phytonpepton ikke 25 altid nødvendige, og trypticasepeptonen kan erstattes med polypepton.

Dersom agar ikke anvendes, er det en fordel at omrøre kulturen.

DK 151640B

6 TABEL 1

Bestanddele af TF-a TF-b TF-c TF-d TF-e TF-f dyrkningssubstrat (g/X)

Trypticase pepton 17 17 17 17 17 17

Phytonpepton 3 3 1,5 -

Proteosepepton 10 5 5

Hj erne-hjerte- infusion 35 17,5 -

Hjerteinfusion - - 25 20 10 15 Gærekstrakt 333333

Natriumchlorid 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5

Glucose 6 6 6 12 12 12

Lactose 5 5 5 10 10 10 L-cystin 0,25 0,5 0,5 -

Natriumsulfit 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Thioglycolat 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Agar 0 eller 0 eller 0 eller 0 eller 0 eller 0 eller 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

DK 151640 B

7 (2) Indsamling af den supernatante væske fra kulturen (fjernelse af organismerne)

Organismerne fjernes fra den ovennævnte opnåede kultur for at opnå en supernatant væske. For at fjerne organismer-5 ne kan en almindelig metode som centrifugering og filtre ring anvendes, idet der bruges en filterhjælp som f. eks.

Hyflo-Super-Cel, og specielt foretrækkes en centrifugerings-metode af driftsmæssige hensyn på grund af mængden af fjernede organismer og udbyttet af den supernatante væske.

10 (3) Opsamling af carcinostatisk forbindelse TF-210 og TF-310.

(i)(a) Et hydrofilt organisk opløsningsmiddel sættes til den ovennævnte supernatante væske eller kultur, og det dannede bundfald opsamles. På dette tidspunkt indstilles fortrinsvis den supernatante væske eller kulturen til pH 15 1,5 - 7, fortrinsvis i nærheden af pH 2 (pH 1,5 - 2,5).

Hydrofile organiske opløsningsmidler omfatter f. eks. alkoholer som ethanol eller methanol, ketoner som f.eks. acetone, idet alkoholerne, specielt ethanol, giver det bedste resultat. Det hydrofile organiske opløsningsmid -20 del sættes fortrinsvis til på en sådan måde, at koncentrationen af dette bliver 30 - 80 rumfang-?o, specielt 50 - 80 rumfang-/o. Efter tilsætningen af det hydrofile organiske opløsningsmiddel, henstår den fremkomne blanding ved lav temperatur, fortrinsvis ved ca. 5 °C, i 25 flere timer til adskillige dage, for at fuldende dan nelsen af bundfaldet.

Det således dannede bundfald fraskilles ved almindelige metoder som f.eks. dekantering, centrifugering eller filtrering, 30 (b) Til det ovenfor fraskilte bundflad sættes vand sædvan ligvis i en mængde på 5 - 20 gange bundfaldets, og pH-

DK 151640B

8 værdien indstilles til 7,5 - 8. Efter eventuel fjernelse af den uopløselige del, indstilles blandingen til nær pH 4 (3,5 - 4,5). De fremkomne vand-uopløselige og vandopløselige dele skilles fra hinanden under anvendelse af 5 en almindelig metode som f.eks. centrifugering eller filtrering. Den således opnåede vanduopløselige del (TF — 210) har de i tabel 2 angivne egenskaber.

Den således opnåede carcinostatiske forbindelse TF-210, kan flere gange underkastes samme fraktionering afhæn-10 gig af pH for at renses. De således opnåede carcinostatiske forbindelser kan omdannes ved almindelige metoder til farmaceutisk acceptable salte som f. eks. alkalimetalsalte som natriumsalte eller kaliumsalte og jordalka-limetalsalte, som f. eks. magnesiumsalte eller calcium-15 salte.

(ii) De fraktioner, der er i besiddelse af ovennævnte car-cinostatisk aktivitet under (i), TF-210 underkastes proteinfjernelsesbehandling ved almindelige metoder, hvorved der opnås TF-310. For at fjerne protein kan der an-20 vendes fremgangsmåder, der er velkendte inden for fagområdet, og særligt foretrukken er en metode, der nedbryder med proteolytiske enzymer. Dersom det ønskes, at fjernelsen af protein udføres ved en behandling med et prote-olytisk enzym, er det tilstrækkeligt, at den under •25 (i) ovennævnte opnåede fraktion med carcinostatisk virk ning opløses eller opslæmmes i vand eller en pufferopløsning, at den fremkomne opløsning eller suspension tilsættes et proteinnedbrydende enzym, og at enzymbehandlingen udføres på sædvanlig måde.

DK 151640 B

9

Som proteolytiske enzymer kan nævnes pronase, papain, trypsin, chymotrypsin og lignende. Pronase og trypsin foretrækkes. Det foretrækkes inden eller under enzymbehandlingen, at den vandige opløsning indstilles til og holdes 5 ved pH 7 - 8. Til dette formål kan anvendes natriumhydroxid, kaliumhydroxid, natriumcarbonat, natriumhydrogen-carbonat og lignende. For at forhindre nedbrydning af reaktionsblandingen under enzymbehandlingen er det en fordel at tilsætte en lille mængde af et organisk opløsningsmid-10 del som f. eks. chloroform, toluen eller lignende. Enzymet anvendes sædvanligvis i en mængde på ca. 1-2 vægt-% baseret på vægten af pulveret (tørstof), der skal underkastes enzymbehandlingen.

Den ovennævnte enzymbehandling udføres sædvanligvis ved 15 30 - 40 °C i 1 - 72 timer, fortrinsvis 24 - 48 timer.

Den kan også udføres ved f. eks. først at tilsætte ca.

1 vægt-?o af et enzym til pulveret (tørstof), og underkaste pulveret (tørstoffet) for enzymbehandling i 1 - 24 timer og herefter yderligere tilsætte ca. 1 vægt-?£ af en-20 zymet igen for yderligere at enzymbehandle.

Efter ovennævnte enzymbehandling fjernes uopløselige dele eventuelt ved en behandling som f.eks. centrifugering eller filtrering, hvorefter der fra den således opnåede vandopløselige del opsamles den pågældende fraktion 25 af den carcinostatiske forbindelse TF-310.

DK 151640B

10

Isoleringen af fraktionen af TF-310, kan udføres ved en fraktioneringsmetode afhængig af pH, ved at fraskille bundfaldet med et hydrofilt organisk opløsningsmiddel, ved fraktionering med en ionbytter eller ved ultrafiltre-5 ring. Eventuelt kan en eller flere af disse behandlinger gentages flere gange. Den omhandlede carcinostatiske forbindelse TF-310 fås ved at indstille den ovennævnte vandopløselige dels pH til fortrinsvis en pH-værdi på ikke over 2,5 (eventuelt kan trichloreddikesyre tilsættes), 10 fjerne det fremkomne bundfald, tilsætte den opløselige del et hydrofilt organisk opløsningsmiddel som f. eks. en alkohol, således at koncentrationen af denne bliver 30 - 80 rumfang-%, fortrinsvis 60 - 80 rumfang-%, opsamle det fremkomne bundfald, der er en fraktion af den omhand-15 lede forbindelse, og herefter eventuelt behandle dette bundfald med en stærk anionbytterharpiks som f. eks. "Do-wex" 1 (handelsnavn) "Amberlite" IRA-400 (handelsnavn) eller lignende (denne behandling kan udføres flere gange) for at opsamle de uadsorberede fraktioner, eventuelt underkas-20 te fraktionerne ultrafiltrering (f. eks. Toyo Ultrafilter UK-50 (molekylvægtsafskæring: 200 000), og herefter underkaste dem f. eks. koncentrering, afsaltning, tørring eller udfældning fra et hydrofilt organisk opløsningsmiddel eller lignende. Den således opnåede carcinostatiske 25 forbindelse TF-310 har de i tabel 2 angivne egenskaber.

Den carcinostatiske forbindelse TF-310 kan omdannes til farmaceutisk acceptable salte ved almindelige metoder.

Specielt skal f. eks. nævnes alkalimetalsalte som f. eks. natriumsalte eller kaliumsalte og jordalkalimetalsalte 30 som f. eks. magnesiumsalte eller calciumslate som eksem pler på farmaceutisk acceptable salte.

-1- 11

DK 151640B

i

- I iH P

iH C >. X O (D -C (D C X X X CO 0 CD

X ·* >—I

4-10 ·>

0 C E X

E O P X

X O 0

•H 0 tt- -H O O X

CT 0 P •H O CT>

I—1 λ rH O

S ø .π x: o, ø o o x • H S C 0 i—l i—I 0 ·* 44 £ o. x c 0

" O X 0 U

X 0 N 0 Q.

o

1 PØI

•Η P O E Ή

Η O E O X

O E ø C 0

p D X 0 O

Q- 4-) -H C

0 0 3 p x x s Ξ ø o ra Ξ E Ή 0 VO ·Η CM E *—I t*- i—I CJl σι æ p icc _i c x x x ω ø -h UJ *p lj ø c en g c -H ct p

et ·£ OP-rHOØP

I— ·Η ·Η 0 P X ·Η > X X C3 > j* c u oo cn 0 0 iH O 0 °J pc»· Ό "q, ti- O 0 0 ø c o -H 0 E 3 0

rH 0 4_> X O E P

g C 0 -H O 0

-± C P O P 0 M

c 0 0 0 0 0 3

Ω tt_ 0 cn X E

0 L·- 1 4-»

X C

X 3

•Η P P

> X 0 “ X 0 >

^ oø 0 iH

53 P >, 3 Q1 C3 rH Q.

0

"O

X

p / O

x /c Ti 0 /o ΓΊ

^ / -Η I

0 / X Ll.

C / -¾ ·- 0 / 0

cn/ P

uy u.

.. DK 151640B

-· I 12

P

cn ω •h i ·> jz o ® S +i S O p ro s co o —i i—1 U— >-*

0- ^ Q -C

Ξ >H P -P

O O 03 cn C -Η -H

o co jr o _ -C O ^ jj cn ίδ ω - o > c

•'(DJ-1 ‘Η I N CO

cn o c jj •H C <D 0 1- J CO XI □

(D -C CO

CO J-> »- Ή

S CD CD >» i—1 £ C SZ

Q. O 4-> o -h jj ro jj co ro i ^ co i

JJ -rj f-t P £ -H

p pH O O O JJ

O O E E C CO

o- ρ ro ro co o

CL JJ 4-> 1—I C

cd ro

Cn] f-l JZ J-> s: E

cd o co E

_1 E -H co MD -H

LJ E i—I ‘C- "H1 Q>

CD EB fJ ICC

< C £ £ CO 0 -H

H— LJ Cl C

C -H cn p ZL

0 C|_ ,H O CO fj

•H CO P J£ -H

JJ JZ CD > ZL C LjJ oo cn ro cd ι-ιοαι P C Ό C|_ O CO CO CO c η ω Ξ ro ro ro jj jj o £ p c co -η o ω C P O P CO i—! ω ω ω co o ro

q o- ro co jr E

1 jj j-> c ti ro

•P P P

> jd ro jz ro >

oCO CO i—I

p >n ro cro —i o.

o

i—J

ΡΛ

Ll.

l·—

DK 151640B

13 p ss o 0 ^ I—i

•H 2 I

XJ On

P

8___ 3> tu CO r"'

OA

rH ^ to X i-~

C I

CO LA

P__- 8

-P

C &? (D w ΓΑ E o ο- α; i rH o LU <(· to c o o

(D -H □ I

p -P CM O O

-P CL CA LA CM

Z£ Cl I LA CM

tu o o <—t '—i

CL CO O I

CO XI VO ·· O

CO CO ΓΑ O <t

C rH CM CM

O I L ti- LO ri ·

• H = CO CO Ή rH

-P = -C I - I

^ Q. ° C O O E

-p Eturacoo m o ό u m; pa fn CO '—' P 0) ·—I i—I o

,: XI (U -P -C I CM

CO "O UC P - O O

f-ι o tu 8 O <* ή

O Ό 4J CL C CM <f I

Ct_ S <D CO ON rH O

„ P E -H CM CM

CO 0 I ·> i—I

p p -P “O O O <—I

CM Ci_ CQ -P C tA rH

C IX 0 oco ON LA CO

_j H ^ QXICMrHO

LU--- m -p < P T* t- +j ødt; zc ro 0- ø C -H J3 >

D > S

α ø p ø c b ø Q1 O to p .

C -H 0 CJ

•H 4J *P C O

P P- o

0 CO fj CL LA

C P CO E IA

O II ^ O N

CL CD _N£ E 0 0 1 O C 0 T3

Zi. C Z£ O

ø ø zi cn vo

Q o -H O rH

3 / g/c 0 o cn ή o

LU X> rH

, Z£ CM

/ ro i / P Ll.

/ ^ _ 14

DK 151640B

i t-1 i

IA

I'- ao ΓΛ

CD

C O I I

O O O ~ O

•H IA CD O CM

4-> ΙΑ IA VO CD

n 1 H (D ^

0 O i—I CD

CD O ·, I O

JO lA O O

CD IA CM CD CD

VO IA [> P ,-H iH Os

CD CD I

'TI -C CD Λ ·*

ti C VO CD O

CO E 0 VO CD CM

CD D T3 i—1 CD

-I-1 p 0 r-H r-t

£ 4-> -C ·» I I

p OC P o O CD

C·- CD a ΙΛ m3 CD

^ α c ου <t oh

. . CD CM Ή ή I

<M -HE

Q) r» *s Q

H -P Ό o o o

y -P C CM <f CM CD

0 0 °CD ON cA ι-H CD

< O JD CM r-H r-H CD

m

1 I -H

C (DO

CA Ό C

cn ø æ ø ih cn +j

X! 0 O CD

C Ό

C O O rH

O CL o O

-rH E l·*

-P O O CJ

DC CO p o CD 0 -H 0

IH "O P tA

Ct_ · 0 OV

-P CD C i-H

0 0 O O

C Q. p C P TJ E 0 0 0 0 O >

Q TD > O

α 1 -1

fA

I—_ u_

DK 151640 B

15

E XI

O (D

CO > ^ o\ •P -P ^ PC Ή

>. oco <D

P E T3

-P O

X) C -P

3 -H (U

E E O

XJ 3 ΙΛ

i—I XI CO

O Ή — jr co c co „ XJ E Ή o o C 3 Ή Ή •η ρ ο ι C ffl L · •H CO I O Cd

(O c >. CM CJ

-Ρ -Η P

C-l O O CO

η. XI _l O

E

O

03 p

-P I CD

C uc m C

>» o o

10 p c ,H

CO -P <D Π P -o -c £ c-i 3 Q- Λ r*

O ^ CO

° XI Ό S? _ P

**— I—I 0J O q_

'— o il ιΛ MJ

_C C CM

CM X -P <D * m ^ c i-π XJ · co cn

•H »CO O CO O .H

-I X) E -P o .

UJ -H 0) 1 CQ p <D E I “ rf CO CO I co

ΓΓ -C O <f ΙΛ ' I S

·“ ϋ O O i—i ϋ 3 tn · · n CO r-1 (N CO CO “ lo cn x o o o

"D

___c ι ·Η * ·Η ? co cn ^ c c cn E cn e

O -H O C O C CD

•H C ^ _ _ XI

-p co E c m co

ase cd mj a> co 0[D

Ρ ,H ^ -P CM -P CM “

o a c c CL

CO O X CO I CO I

jr et J pc co CO CT E COCOCOLOfn •H C <t C “ (D XJ A O CM O CM "7

-p C V -Η -Ρ P

-p CO - -P Cp -p C|— Q

cd > o a co a co c*- rH ·> P p X) o Γ" o c o c j;

H CD CO S CO S J

> Ρ X J3 X J3 XJ

CO-PO- CO CU CO CD (— p pc -C Jr jr -p (D XJ XJ Ρ XI Ρ ω rp a cd cd æ cd æ cn r co > >c>cc

•H

________pH

roca si * ..

cn c c

_ <=> PC

O ι-Ι P

hP ΝΛ OJ

CM 2 1 1 «

Ll Lu ® ι— η- ar

DK 151640 B

16

C

•rH

<—i

0 C Lu O

1 *H

"P i f-ι + +

3 CD CD (D _l P

i—l O c ΠΤ o

I -P •-I -P

0 Pi T3 CD . +

C CD T

PC P

<t

O

cn

CM

nr 1 c c o

O -H

•M -p . + Λ rrc +

-P CD -P C CD

CD C P

CO

-P____ n ** O o ci- cn

^ CM

nr c O -P + + _j c r* uj <d cd S £2 i—____ c jr o O *H 4_

CO -P + T

•h nc <—I CO O CD ST P

c •H C P o m -η >,+j jr pc 1

C CD H CD 2 P

P / CD / X3 /

PC /- S O

c / ° «Μ ΓΛ g/-3 7 li? -¾ t Lu 7 (0 I i_

/ P

/

DK 151640B

η

De farmakologiske virkninger af de omhandlede carcino-statiske forbindelser TF-210 og TF-310 er som beskrevet nedenfor. I de følgende farmakologiske forsøg opnåedes forsøgsforbindelsen TF-210 som beskrevet i ek-5 sempel 1, TF-310-1 som beskrevet i eksempel 3 (1) og TF-310-2 som beskrevet i eksempel 8.

(1) Immunostimulerende virkning

Tre ICR stamme mus (hunmus 6 uger gamle) anvendtes for hver gruppe. Hver af forsøgsforbindelserne opløstes i en 10 fysiologisk saltopløsning, og 0,2 ml af hver af de fremstillede opløsninger administreredes intraperitonealt til musene. 24 timer efter administreringen injiceredes 0,2 ml af carbonsuspension fremstillet ved at blande 1 ml Pelikan blæk 17 sort (fremstillet af GOnther-Wagner Co., 15 Ltd.) med 2 ml af en fysiologisk saltopløsning indeholdende 3 vægt-?i gelatine intravenøst i musens hale, og 1, 5, 10 og 15 minutter efter injektionen opsamledes 0,02 ml af blodet fra øjenhulen under anvendelse af et hematocrit-capillær beklædt med heparin og umiddelbart fortyndet og 20 hæmolyseret med 1,6 ml af en 0,1 vægt-% vandig natrium-carbonatopløsning. Denne opløsning underkastes colorime-triske bestemmelse ved 675 nm, og det phagocytotiske indeks (K-værdi) bestemmes ud fra ligningen beskrevet af Halpern et al.

25 Til musene i kontrolgruppen administreres 0,2 ml af en fysiologisk saltopløsning.

DK 151640B

18

log Cn - log C

κ= —Γπ- u L0 hvori Cg = carbonpulverindhold i blodet til tiden tg, og C = carbonpulverindholdet i blodet til tiden t.

Resultaterne er vist i tabel 3 og 4.

TABEL 3

Forbindelse Dosis Gennemsnits K- __(mq/kq)____værdi____ TF-210 3 0,1153 - 0,0273 __6_ 0,1198 - 0,0231

Kontrol - 0,0348 - 0,0037 TABEL 4

Forbindelse Dosis Gennemsnits K- (mg/kg) værdi ^TF-310-1 0,1 0,0580 - 0,0088 __1___0,0776 - 0,0168

Kontrol - 0,0295 - 0,0007

Bemærkning: * Forsøget udførtes på en gruppe bestående af 4 mus.

DK 151640 B

19 (2) Carcinostatisk virkning (i) Antitumorvirkning over for Ehrlich tumorascites.

Ehrlich tumorascitesceller indsprøjtedes intraperitonealt i ICR stamme mus (hunmus, 6 uger gamle) i en mængde på 5 1 x lCr celler pr. mus. Herefter opløstes hver af forsøgs- forbindelserne i fysiologisk saltopløsning, og 2 ml af hver af de fremstillede opløsninger administreredes intraperitonealt til musene en gang om dagen i 7 på hinanden følgende dage fra den første dag efter indsprøjtning af 10 tumorcellerne. Til kontrolgruppen administreredes 0,2 ml fysiologisk saltopløsning på samme måde som beskrevet ovenfor.

Resultaterne er angivet i tabel 5 og 6.

Overlevelsesdage for musene i en gruppe til hvilken forsøgsforbindelsen T/c = blev administreret__,QQ (af)

Overlevelsesdage for mus i kontrolgruppen “ K'0j

DK 151640B

20 i Γ“Τ ε tu

CD JO

t—l .Η cn

CD -Η Ξ TJ

c tu α o "o 83 cn ,_i , i oo ή -p m r1 \ \ O CO CD \ ^ Z>

JZ ~0 ~O r-~ vfl CO

c-i .—r cd 0 D P U. C|-

P

ω > 0 o ro C|- C0 -ri

Ό 1) O O

M -D ^ CO

£0 0) \ \ ^ μ > σι co r·» co

O CD CO Li_ —1 TO

CJ ^ —1 '—1 σ •vT 'O VO VO o t—c *—c -4 ^ /\ Λ _]----

LU CD

m CTi <r co r·' ov vo Z: Ό ~ -

CD ω ΙΛ <r CM

π® +i+i +'

C CD

Βω “ “ c Ti "ct r>- vo vo

C CD CO CV| N ’—C

m > ό α Λ CD O —

CD

P

X -P

cn CD-H ^ _ 1 c r-» r-

\ -H

CD B XX

ε ·ο i v p ^ Λ

CO i-H CD

•h co cn o ro

cn 4-) c o c -H

Q CO P

ø cn »—i o '"j c o o

•H i—1 P

-Q CM -P

O 1 =

L_ ϋ_ O

M

21

DK 15164 O B

—--i--- i—1 01

E -C

01 ι-H CTl

rP C

CD -H £ Ό C dl

5 & CO CO CO CD

r-t 4J i—l C~ o « <u jr „ „

£ η Ό ^0 O

P iH (U

0 3 P

Li_ <P .O

P

01 > o o ΙΛ C|_ C0 Ή _ CO 00 00 TI 01 C~ Η Ό \ \ \ o c <f \o α jo ω ω ρ > α> 0 αι co

Li_ 1—1 TI

M3 O O

. , CJ M3 I"· O

VG P rP rP rH

_| Η- A λ LU ______ CD 03 < Dl

1- CO

T3 1 CD Lf\ ίΛ ΓΛ 01 0 - -

® <t CM CM

•H i—I

C 0 0) > +1 +! +1 E dl Ϊ 71 C; ΟΝ Ml 00 C £ O! „ S > -a t-. CO mo d Q w CM CM <—l Λ Λ -1--- Q1 ρ ^ x +i ^ _ CO Γ"

Dl -Η X I

-X C X

\ -P ^ σι ε „ .

ε ό ·*

—' CO CO

f-i

»HH

•h co σι co -t-> c

O C -P

a co ρ σ co ΉI _i ai 7 .

tj 1 1-1 c o o P <-i p

-P 1Λ -P

O ' C

li U. O

__Η—_M

DK 151640B

22 (ii) Antitumorvirkninq overfor Sarcoma-180-celler (a) Sarcoma-180-celler transplanteredes intraperitonealt i ICR stamme mus (hunmus, 6 uger gamle) i en mængde på 1 x 10^ celler pr. dag. Derefter opløstes hver af forsøgs-5 forbindelserne i fysiologisk saltopløsning og 0,2 ml af hver af de fremstillede opløsninger administreredes intraperitonealt til musene en gang om dagen i 7 på hinanden følgende dage fra den første dag efter transplanteringen af carcinomacellerne. Til kontrolgruppen administre-10 redes 0,2 ml af en fysiologisk saltopløsning på samme måde.

'Resultaterne er vist i tabel 7.

DK 151640 B

23

E

<D

H

H Dl B

0 ·Η CO

E TJ Η c ω Ό 83 Ό Η -Ρ 0 ο co ρ ί 3 3 ; " « ί ; ί ϋ ο υ ι σι ρ ro cd -σ ο □ ΓΛ lire ·Η

ΤΙ 0 .Η ΤΙ Ο C

-Ρ ϊ ΙΛ ιΛ ιΑ gø \ \ \

Lt_ ,—C <t ΙΑ Ο η 5 ΓΛ ΙΛ Ο _| \ W CO ο ο

LlI I— Η CM Η CD Λ Λ < 1

. —I-Μ--« er-FT

CO CD »

-P tO LA O CM

•r| i—I CJ> ' ^ c ω ro co > tj +i+i +i Ξ CD "

<L> 7< ΛΝ CM O CXJ

» C 0 σι r ø > ro c·' ° ^

u O TI cm CA rH

A ^ --1---- 0

P

X -P

CO

CD H

PC c

\ H

CD E - ET) ^ _ ^ ro ^

P X I

CO rH 0 X

h ro en ^ CO -P C ^ .

O C H - Q ro P ΙΆ 0

CD

0 H

TI o o

C HP

•Η CM H-> P 1 c

o Lp O

U. Η ^

DK 151640B

24 (b) Sarcoma 180-celler transplanteredes subcutant i armhulen på ICR stamme mus (hunmus, 6 uger gamle) i en mængde på 1 x 10^ celler pr. mus. Herefter opløstes forsøgsforbindelserne i fysiologisk saltopløsning eller 5 i en 5% vandig glucoseopløsning, og 0,2 ml af hver af de fremstillede opløsninger administreredes intravenøst eller intramuskulært i musene en gang om dagen i 7 på hinanden følgende dage fra første dag efter indtransplan-teringen af carcinomacellerne. Til kontrolgrupperne 10 administreredes 0,2 ml af en 5% vandig glucoseopløsning eller en fysiologisk saltopløsning på samme måde som omtalt ovenfor. Resultaterne er vist i tabel 7_(2),

DK 151640 B

25 w c w O OO r—IvO <ίΟιΛΟ O NO O J- CM VOO m<f vfNNN O ΓΛ O ” CJ Μ ^ ^ α

I CO

______________C

CO

ΙΛ O H O VO NO '—I NO i—i ON or- P om f-H ΝιΛ NNNN <f ^ Λ -P ^ ·* *,*,«.#. *.#ι·\·,·ι ·> ri ^ O OOOOOOOOO O O P ω

+1 +H-I + 1+1 + I + I LI -1 +1 +1+1 -P F

C*— M

-*£, ον νοιλγ-'Ονιλιλγηιλ-ϊ)· co m ø

oT CM m<rvOl^il^Or^OCM ΝΟΝΟ C

p O O i—I CMCM CM<—I Η H ΙΛ <—f <+ CO.

0 XI Zl

1 . S

" - S · c u ω ® æ -1 Λ " « ί ω 9- ίο 5 ϋ c ° α ' ,5 *Η CM ^ 3 Cd CD , 00 £ ® c ό ^ Ο W |—| ^ “--g æ “ γλ ® —' ® σι ro ^ ο ι □ ο. Ο σ -ρ £ α ^ ο-Η ^ ^ Ρ £ 5 Γ 3 C0

—1 mm CO CO CD h W

LU S “ >, S 0 O

CQ ø c Li_ ^ p C|_ P-

< φ 0 CO

I— Ξ= CD p CO

______________ø -ρ σ . cd co c

ø -Η O -H

P > (Ί x -p · ω

CO ι—I U -P

cn-H r~ r^· r^- r~- i— r-- r^- i" , c XXXXX lO^ffl

X Xlr-ίΙΛ XI X ' Ξ g rH

^ gg SSSr-, H -? s g- “ a §, o ° o|°1 °1o1o|o1 o| l± ό o

CD -P C CO P

O C ·Η p iH 4-1

Ct CO P Q

tp co p ---- ε ø

> E > E co CD -P

'!T? -Ρ -Η I -Η -H -P U +- tø ro p ø

-3 TJ CO

---- —.---cn cn ø ø ro CD ,Η CM CM -P C|_ Ό 7} ι ι—ι ι ή i c ro -n O O O OOr-iOs £ i—I pi—1 P i“H O 83 CH <t

•Η ΙΛ-Ρ ΙΛ -pr^PCC'-H

O IC I C I -P c -H

p Lu O Ih OLuCOPC

,7 p- p- i£i-o>øø

^ O 4J X

26

DK 151640B

(iii) Antitumorvirkninq over for Ehrlich faste tumor

Ehrlich tumorceller transplanteredes subcutant i armhulen på ICR stamme mus (hunmus, 6 uger gamle) i en mængde på 4 x 10^ celler pr. mus. Herefter opløstes huer af forsøgs-5 forbindelserne i en fysiologisk saltopløsning eller 5% van dig glucoseopløsning, og 0,2 ml af hver af de fremstillede opløsninger administreredes intraperitonealt til musene en gang om dagen i 7 på hinanden følgende dage fra den første dag for indtransplanteringen af tumorcellerne eller 10 en gang hver anden dag i 10 dage fra den ottende dag efter indtransplanteringen af tumorcellerne. Til kontrolgrupperne administreredes 0,2 ml af en fysiologisk saltopløsning efter en 5% vandig glucoseopløsning på samme måde som ovenfor.

Vægten af hver tumor bestemtes. Vægtbestemmelsen af tumoren 15 udførtes ved at måle hoveddiameteren (a mm) og den mindre diameter (b mm) ved hjælp af en skydelære og erstatte værdierne for a og b med følgende ligning: ,2 a x b

Tumorens vægt = 2 (mg)

Resultaterne er angivet i tabel 8 - (1)' og 8-(2).

λ

DK 151640B

27

✓—N

SO

O ON 00 O

\ CM CA O

I- i—I

* νΞ' r- os 2 2 +J * ~ O' CO < i 1 1 σ > +i +i Ή

Q S2 M3 CM CM

ø ON NO CO

f-l

O rH CM NO

ε 3 i— cn ca o c •-1 .,-j ~

w U CN VO

I CD

æ £ -

o M LA

—1 -H

U-l C O' *· CQ Ή CO -vt"

^ -i O

l·- §

<—i CO +J

c CO f-l ω x cn c cn ή .x u r^· \ tu ? ^ v i E -P x 1 ^ co x

•H lA

CO C ». r-v Ή Ή -λ CO a ^

O “O Ω CO

CD

CO -(

Ή O O

-g Ή £

C CN 4-J

•Η I C

_Q l_i_ O

g >- *

Ll.

DK 151640 B

28

/^N

S?

CJ

\ ΙΛ O

*- LT\ □

H

sk x-N r—4 ΪΛ · % 31 ° ° ^

ιΛ jj - - C

1-1 CD CM CM I -H

æ ® + +' o I

Q o CO o S " tu r— r - co °- f-i ~ CO o

O <J- CO (D

E _* ω ,Ξ to o ·η o __Dl 3 O '-f r-, cn o

Dl Dl ·

CO CD Ή CO

ffl >> γ ® ^ σι ft- c -p

cm c ro <H

'w' *H ^ vo > °C0 1 cu ° ^ 5

CD f. <H CJI

-P - c ΙΛ C

_i CD ~ -Η ω I i I Ή 00 Ή £ *H P-l CD .5 CD °

<. 2 CD Q CD E

I— -Q CO CM ,-,0 3

<C Q Ή q. -P -P

Ο Ό C ft-

___^ 0 CO

0 > -p C c 0_ CO 0 •2 0 -p ro -i d C ^ CD 1 ® CO ^ 0 CD > x ffl -P £ x Dl D l°l □i = c ' g1 X u 0 t ® \ 0 => *“ 73

S’ P ^ C

.= -P CO * C

CO X I D> 0

CD '2 O C Q

H 3 I—I 1—1 ·Η CD 2 CM C * ffl Ό I CD * ° (0 b_ q _ I—* i—I ·* *

0 i—I

CD I rH Ql rj o o c -8 ^ p ·*

C ΙΛ -P C

•H 1C X.

XI Li_ Ο P

£ h- Sd EB

i° ε ^ ro ___ co

DK 151640B

29 (iv) Antitumorvirkninq over for B-16 melanomceller (a) B-16 melanomceller transplateredes subcutant i armhulen på BDF, stamme mus (hanmus, 7 uger gamle) i en 0^6 mængde på 1 x 10 celler pr. mus. Herefter opløstes 5 hver af forsøgsforbindelserne i en fysiologisk saltop- opløsning, og 0,2 ml af hver af de fremstillede opløsninger administreredes intraperitonealt til musene en gang om dagen i 7 på hinanden følgende dage fra den 1. dag efter indtransplanteringen af tumorcellerne. Til kontrol-10 gruppen administreredes 0,2 ml af en fysiologisk salt opløsning på samme måde. Vægten af tumorerne bestemtes på den 17. eller 23. dag efter indtransplantering af tumorcellerne. Bestemmelsesmetoden var som ovenfor (iii). Resultaterne er vist i tabel 9-(l).

i

DK 151640B

30 ·η ρ

03 -P C CD i—i Cl CD C CD

CJ1 P

CD -P

"O "O

C

• Ή h-

.__________ _ r-i H

ω

c jJJ

0 *t- S° _ Ό 03

w <j- O ΙΛ O

\0 O VO CD m CT

LJ ^ 1-1 ø CD

\ 4J Ό 1- £ 0) -P ^

--- to CM

03

-O C

. 03

cn ^ coiHia ocdO

HD1 I^VOVOCD i—1 ø

rH ^ ··'*·' CM p CD

•p o ° '“I ° I 0 03

•H -P Lu. rH -P

C D3 +| +1 +1 +1 I— iH £ cd aj „ ^ _ 03 ω

ES> p ø -P

03 P O p CD

co » _r 7 Τ' o-oo

C£ ΙΛ ·ί N <1 £ _Q

OD “ D

U -U c 4-> Ή ω , ____L__ti 4- o CT (5 ^ I 5 ΓΛ c i ^ ' c i CD --i P m 03 U.

C 03 40 Dl H-

X -H CD r~- · i'' C

EC C -H C

Dl D Ή Xl XI « p 0 ·

CO -X CD P £ø+j(D

•h\ 03 r~- i^> tu+jcnc

CO Dl rH P c C ffi P

O E CD -P c ® > » O w -p CD 03 ,—[ r-l 0-3 q_ o 1—* --CD E 03 ** C D 03

ø P CD -P P

CD ® P CD O

1 1 .—i cn +j 4J ε

V 0 Ή C -o ,H D

rp. Ό 1 i i 1 i >r^ C C Ή ^ c oOOO C.Hø •Η rH P Ή ί·< E 0-

rH JD -p ΓΛ -P t4 p CD CD

0 p I C I C 8j ø c

o O L. O L·. O = -p C C

CD Li_ I— ^ 1— la: <Uci_øø 1_ CQ ø cj øl

DK 151640B

31 (b) B-16 melanom celler transplanteredes subcutant ved armhulen i BDF stamme mus (hanmus, 6 uger gamle) i en 1 £ mængde på 1 x 10 celler pr, mus. Herefter opløstes forsøgsforbindelserne i en 5% vandig glucose-opløsning, 5 og 0,2 ml af den fremstillede opløsning administreredes samtidig intratumoralt og intraperitonealt en gang hver anden dag i 12 dage fra den 13. dag efter indtransplan-teringen af tumorcellerne. Til kontrolgruppen administreredes 0,2 ml af en 5?0 vandig opløsning således som 10 beskrevet ovenfor. Resultaterne er angivet i tabel 9 - (2).

DK 151640 B

32

□ O M3 <ί ΙΛ O

lt\ r-~ tA r~ kn o

o M

f-

Ci n n \o ra o

^ N r' N N ΙΛ CO

« * i at · _P o o o o o o a +1 +1 +1 +1 +1 +1 f" CM 00 M3 i—I CM ΙΛ

£ ON O CM ΓΛ 0\ CO

= ... ...

Ej CM <f ΧΊ vf >H tn I— -P -P O.

_ ·Η ·Η Ή ° +

<D

C ' ^ ro -Η p c ω x.Hcn M3 M3 M3 M3 M3

CT "O *H XXX XX

m ^ CO P ' •h\ ω o o o cno rn rti r-H P-l * * * * * S = CO -P ΓΗΙΛΟ om

___, -P CD '-I

^ ω

CM CD

7 æ 7 o -° o -1 JO ^ ω p ^ JO O rt ca Li.

i— ____

DK 151640 B

33 (3) Akut toxicitet LD^o - værdierne for mus (ICR stamme, hunmus, 6 uger gamle, intravenøs administrering) er vist i tabel 10.

Tabel 10

Forbindelse LD,-g(mg/kg) TF-210 >100

Som det fremgår af de ovennævnte farmakologiske forsøg, 5 er de omhandlede TF-210 og TF-310 værdifulde som carci- nostatiske midler, hvorfor de kan forventes at have virkning over for forskellige cancer-sygdomme og at udvise specielle virkninger over for specielle faste cancere. De omhandlede TF-210 og TF-310 forbindelser havde udmærkede 10 virkninger.

Dosis af de omhandlede TF-210 og TF-310 forbindelser udvælges afhængigt af patientens tilstand, skønt det sædvanligvis er fordelagtigt at administrere disse i en voksen-dosis på 0,005 til 50 mg/kg én gang om dagen eller 15 flere gange om dagen afhængig af administreringsmåden, i- det de fortrinsvis administreres subcutant, intramusku-lært eller intravenøst eller som injektion i den angrebne del.

De omhandlede forbindelser kan anvendes i forskellige far-20 maceutiske doserings former som perorale, injektions- el ler suppositoriepræparater, der fremstilles på normal måde .

Opfindelsen forklares nærmere i detaljer nedenfor, idet der henvises til eksemplerne og de medfølgende tegninger, 25 hvor fig. 1 viser et mikroskop-fotografi, der angiver formen af Fusobacterium nucleatum TF-031, der anvendes ved frem-

DK 151640B

34 gangsmåden ifølge opfindelsen; fig. 2 viser et infrarødt absorptions-spektrum af den car-cinostatiske forbindelse TF-210 fremstillet i eksempel 1, der er angivet nedenfor; 5 fig. 3 viser et ultraviolet absorptions-spektrum af forbindelsen ; fig. 4 viser et infrarødt absorptions-spektrum af den carcinostatiske forbindelse TF-310 fremstillet i eksempel 3, der omtales nærmere nedenfor; 10 fig. 5 viser et ultraviolet absorptions-spektrum af forbindelsen; fig. 6 viser et væskechromatografi med høj ydeevne af forbindelsen; fig. 7 viser et infrarødt absorptions-spektrum af den 15 carcinostatiske forbindelse TF-310 (renset) fremstillet i eksempel 8, der omtales nærmere nedenfor; fig. 8 viser et ultraviolet absorptions-spektrum af forbindelsen; fig. 9 viser et væskechromatografi med høj ydeevne af 20 forbindelsen.

Eksempel 1 (1) I en 10 liters forgæringsbeholder (fremstillet af Marubishi Rika Kenkyusho) anbragtes 8 liter af TF-e dyrkningssubstrat indeholdende 17 g trypticase pepton, 25 10 g hjerteinfusion, 3 g gærekstrakt, 7,5 g natriumchlo- rid, 12 g glucose, 10 g lactose, 0,1 g natriumsulfit og 0,5 g natrium-thioglycolat, pr. liter destilleret vand. Dyrkningssubstratet steriliseredes i 30 minutter

DK 151640B

35 ved 120 QC. Efter afkøling af dyrkningssubstratet, ledtes nitrogengas gennem denne med en hastighed på 100 ml/min. i en time. I dyrkningssubstratet udsåedes 1 liter af en fordyrket kultur af Fusobacterium nucleatum TF-031 5 (FERM-5077, ATCC-31647) fremstillet forud ved at dyrke kulturen i et TF-e dyrkningssubstrat, der havde ovennævnte sammensætning. Cellerne dyrkedes 3 dage ved 37 °C under omrøring (30 omrøringer pr. minut), medens der til førtes nitrogengas med en hastighed på 65 ml/min. Efter 10 dyrkningen sattes til kulturen 160 g Celit og 80 g cellulose-pulver, og blandingen omrørtes og filtreredes under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 7,8 liter af en bakteriefri supernatant' væske af kulturen.

(2) Til 7,8 liter af ovennævnte supernatante væske sattes 13 117 ml koncentreret saltsyre for at indstille væskens pH til 2,0, hvorefter 11,7 liter ethanol tilsattes for at danne en 60% vandig ethanol-opløsning, der herefter henstod 24 timer ved 4 °C. Herefter fjernedes den supernatante væske ved dekantering, og den tilbageblevne 20 del underkastedes centrifugering ( 6 x 10^ omdrejninger, pr. minut) ved 4 °C for at opsamle bundfaldet. Dette bundfald vaskedes med 400 ml af en 60% vandig ethanol-opløsning, der havde en pH-værdi på 2,0, 400 ml ethanol, 200 ml acetone og 200 ml diethylether i nævnte 25 rækkefølge, og der tørredes ved reduceret tryk, hvor ved opnåedes 3,9 g af et pulver.

(3) Det under (2) ovenfor fremstillede pulver opslsmme-des i 25 ml vand. pH af den fremstillede suspension indstilledes til 7,5 til 8,0 ved at tilsætte 1 N vandig 30 natriumhydroxidopløsning, og efter omrøring i 30 min.

ved stuetemperatur, tilsattes 1 N saltsyre for at indstille pH af opløsningen til 4,0. Efter omrøring i 2 timer under isafkøling underkastedes blandingen herefter centrifugering (1 x 10^ omdrejninger pr. minut, 35 10 min.) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Dette bundfald vaskedes med 10 ml vand, der hav-

DK 151640B

36 de en pH-værdi på 4,0, og bundfaldet skiltes fra vaskevandet ved centrifugering (1 x 10^ omdrejninger pr. minut, 10 min.). Bundfaldet vaskedes med 10 ml ethanol ag tørredes under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 5 1,5 g af den carcinostatiske forbindelse TF-210.

Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-210 havde de i tabel 2 viste egenskaber. Det infrarøde absorptions-spektrum og det ultraviolette absorptions-spek-! trum af forbindelsen er vist i henholdsvis fig. 2 og 10 3.

Eksempel 2 (1) I en 10 liters forgæringsbeholder anbragtes 8 liter TF-d dyrkningssubstrat indeholdende 17 g tryptica-sepepton, 20 g hjerteinfusion, 3 g gærekstrakt, 7,5 g 15 natriumchlorid, 12 g glucose, 10 g .lactose, 0,1 g na triumsulfit og 0,5 g natriumthioglycolat pr. liter destilleret vand. Dyrkningssubstratet steriliseredes i 30 min. ved 120 °C. Efter afkøling af dyrkningssubstratet ledtes ni'trogengas gennem dette i 1 time med en has-20 tighed på 100 ml/min. I dette dyrkningssubstrat udsåedes 1 liter af en fordyrket kultur af Fusobacterium nucle- atum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) fremstillet forud · ved dyrkning i et TF-d dyrkningssubstrat, der havde ovennævnte sammensætning. Cellerne dyrkedes 3 dage ved 37 °C 25 under omrøring (30 omdrejninger pr. minut), medens der tilførtes nitrogengas med en hastighed på 65 ml/min. Efter dyrkningen sattes dyrkningsopløsningen til 160 g Ce-lit og 80 g cellulose-pulver, og den fremstillede blanding omrørtes og filtreredes under reduceret tryk, hvor-30 ved der opnåedes 7,8 liter af en bakteriefri supernatant væske af kulturen.

(2) Til 7,8 liter af den supernatante væske fremstillet ovenfor under (1) sattes 117 ml koncentreret saltsyre for at indstille pH af den supernatante væske til 2,0.

35 Derefter sattes 11,7 liter ethanol til den supernatante

DK 151640B

37 væske til dannelse af 60¾ vandig ethanolopløsning, hvorefter den henstod i 24 timer ved 4 °C. Den superna-tante væske fjernedes herefter ved dekantering, og den tilbageblevne del centrifugeredes (6 x ΙΟ"5 omdrejnin-5 ger pr. minut, 5 min.) ved 4 °C for at opsamle bundfal det. Dette bundfald vaskedes med 400 ml 60¾ vandig et-tianolopløsning med en pH-værdi på 2,0, 400 ml ethanol, 200 ml acetone og 200 ml diethylether i nævnte rækkefølge, og der tørredes under reduceret tryk, hvorved 10 der opnåedes 4,5 g pulver.

(3) Dette pulver underkastedes samme behandling som i eksempel 1 (3), hvorved der opnåedes 1,6 g af den car-cinostatiske forbindelse TF-210.

Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-210 hav-15 de de i tabel 2 angivne egenskaber. Det infrarøde absorptions-spektrum og det ultraviolette absorptions-spektrum af forbindelsen var i det væsentlige identisk med spektrene opnået i eksempel 1.

EKSEMPEL 3? 20 (1) I 15 ml vand opslæmmedes 1,5 g af den carcinosta tiske forbindelse TF-210 fremstillet i eksempel 1. Til suspensionen sattes IN vandig natriumhydroxidopløsning under omrøring for at indstille suspensionens pH til 7,8. Suspensionen opvarmedes til 37 °C, og der til-25 sattes 15 mg "Pronase" E handelsnavn Kaken Kagaku; 1 000 000 tyrosinenheder/g) og flere dråber toluen. Under omrystning enzymbehandledes blandingen ved en pH-værdi på 7,8 til 8,0 ved 37 - 40 °C i 24 timer. Efter behandlingen centrifugeredes blandingen (4 000 omdr. pr.

30 minut, 10 minutter) for at skille bundfladet fra den su- pernatante væske. Bundfaldet tilsattes 3 ml vand med en pH-værdi på 8,0 , og blandingen centrifugeredes (4 000 omdr. pr. minut, 10 minutter) for skille bundfaldet fra 38

DK 15164QB

vaskevandet. Vaskevandet og ovennævnte supernatante væske sloges sammen, og blandingen tilsattes 1 N saltsyre for at indstille pH til 2,0, hvorved der dannedes et bundfald. Denne blanding henstod ved 5 “C i 12 timer, hvor-5 efter den centrifugeredes (1 x 20^ omdr. pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Til bundfaldet sattes 3 ml vand med pH på 2,0, og blandingen centrifugeredes (1 x 10^ omdr. pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra vaskevandet.

10 Dette vaskevand og den ovennævnte supernatante væske sloges sammen, ethanol sattes til opløsningen til opnåelse af en 80% vandig ethanolopløsning. Den vandige ethanol-opløsning omrørtes 2 timer under isafkøling, hvorefter den centrifugeredes (4 000 omdr. pr. minut, 10 minutter) for 15 at skille bundfaldet fra den supernatante væske. Bundfaldet vaskedes med 3 ml 80% vandig ethanolopløsning og 5 ml ethanol i nævnte rækkefølge, og der tørredes under reduceret tryk, hvorved der opnåedes 327 mg af den carcino-statiske forbindelse TF-310 fraktion.

20 I 5 ml vand opløstes 327 mg af ovennævnte pulver, og den fremstillede opløsnings pH indstilledes til 7,0 ved tilsætning af 1 N vandig natriumhydroxidopløsning. Den fremstillede opløsning hældtes på en søjle pakket med 45 ml "Amberlite" IRA 400 (handelsnavn for Rohm og Hass), 25 der var forud indstillet til 0H-typen med IN vandig natriumhydroxidopløsning. Herefter ledtes 200 ml vand gennem søjlen. Alle eluaterne sloges sammen, og pH af disse indstilledes til 7,0 ved tilsætning af 1 N saltsyre. Opløsningen koncentreredes under reduceret tryk, og heref-30 ter filtreredes gennem et "Millipore" filter, der havde en porediameter på 0,3 ^urn ("Millipore": Handelsnavn fra Japan Millipore Limited) og til slut frysetørredes, hvorved der opnåedes 210 mg af den frysetørrede carcinostatiske forbindelse TF-310.

35 Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-310 havde de i tabel 2 viste egenskaber, og saccharidind- 39

DK 15164 OB

holdet heraf var sædvanligvis ca. 20 - 60¾ udtrykt som glucose. Det infrarøde absorptionsspektrum, ultravio-lette absorptionsspektrum og high performance væske-chromatogrammet af en typisk forbindelse er vist i hen-5 holdsvis fig. 4, 5 og 6.

(2) I 50 ml vand opløstes 140 mg af den oven for frem- j stillede carcinostatiske forbindelse TF-310, og den fremstillede opløsning koncentreredes til en koncentration på 100 gange den oprindelige under anvendelse af 10 "Ultrafilter" UK-50 (handelsnavn for en ultrafiltermembran fra Toyo Roshi Kabushiki Kaisha, nominel molekylvægtafskæring: 50 000). Dette koncentrat filtreredes gennem et "Millipore" filter med en porediameter på 0,2 ^um, og herefter frysetørredes til fremstilling af 88 mg 15 af den rensede, frysetørrede carcinostatiske forbindelse TF-310. Den således fremstillede, rensede carcinostatiske forbindelse TF-310 havde de i tabel 2 angivne egenskaber, og saccharidindholdet heraf var sædvanligvis ca.

16 - 30¾ udtrykt som glucose.

20 EKSEMPEL 4 (1) På samme måde som i eksempel 2 —(3) behandledes 4,5 g af forbindelsen fremstillet som beskrevet i eksempel 2-(l) og (2), hvorved den carcinostatiske forbindelse TF-210 opnåedes.

25 (2) Den carcinostatiske forbindelse TF-210 fremstillet i (1) behandledes på samme måde som beskrevet i eksempel 3-(1) hvorved fremstilledes den frysetørrede carcinostatiske forbindelse TF-310 i en mængde på 220 mg.

Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-310, havde 30 de i tabel 2 angivne egenskaber, og det infrarøde spekter, det ultraviolette absorptionsspekter og high performance væskechromatogrammet af forbindelserne var i det væsentli-

DK 151640 B

40 ge identiske med de, der var opnået i eksempel 3.

EKSEMPEL 5 På samme måde som i eksempel 3, behandledes 1,5 g af den carcinostatiske forbindelse TF-210 fremstillet i eksempel 5 1, bortset fra at (a) 15 mg trypsin (fremstillet af Difco) anvendtes i stedet for "Pronase" E ved enzymbehandling og (b) en 60% vandig ethanolopløsning fremstilledes i stedet for en 80¾ vandig ethanolopløsning, når bundfaldet opsamledes fra den vandopløselige del, der havde en 10 pH-værdi på 2,0 efter enzymbehandlingen. På denne måde opnåedes 200 mg af den frysetørrede carcinostatiske forbindelse TF-310.

Den ovenfor nævnte carcinostatiske forbindelse TF-310, havde de i tabel 2 angivne egenskaber, og det infrarøde 15 absorptionsspekter, ultraviolette absorptionsspekter og high performance væskechromatogrammet var i det væsentlige identiske med de, der var opnået i eksempel 3.

EKSEMPEL 6

Den carcinostatiske forbindelse TF-210 fremstillet i 20 eksempel 1, behandledes på samme måde som beskrevet i eksempel 3 (1), bortset fra at ved enzymbehandlingen anvendtes en 60¾ vandig ethanolopløsning i stedet for den 80¾ vandige ethanolopløsning, når bundfaldet opsamledes fra den vandopløselige del med en pH på 2,0. Herved frem-25 stilledes den frysetørrede carcinostatiske forbindelse TF-310 i en mængde på 190 mg.

Den således fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-310 havde de i tabel 2 angivne egenskaber, og det infrarøde absorptionsspekter, det ultraviolette absorptions-30 spekter og high performance væskechromatogrammet var i det væsentlige identiske med de, der var opnået i eksem-

DK 151640B

41 pel 3.

EKSEMPEL 7

Den carcinostatiske forbindelse TF-210 fremstillet i eksempel 1 behandledes på samme måde som beskrevet i 5 eksempel 3 (1), bortset fra, at efter enzymbehandlingen, i stedet for at indsamle bundfaldet fra den vandopløselige del med en pH på 2,0, dannedes en 60% ethanolopløsning i stedet for en 80% vandig ethanolopløsning, hvorefter den samme behandling udførtes som beskrevet i de respek-10 tive eksempler. Herved opnåedes 192 mg af den frysetørrede carcinostatiske forbindelse TF-310.

Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-310 havde de i tabel 2 angivne egenskaber, og det infrarøde absorptionsspekter, de ultraviolette absorptionsspektre og 15 high performance væskechromatogrammet var i det væsentlige identiske med de, der er opnået i eksempel 3.

EKSEMPEL .8 I en 90 liters forgæringsbeholder (type MSJ-l^» fremstillet af Marubishi Rika Kenkyusho) anbragtes et TF-f 20 dyrkningssubstrat fremstillet ved til 70 liter destilleret vand at sætte 1190 g trypticasepepton, 1050 g hjerteinfusion, 210 g gærekstrakt, 525 g natriumchlo-rid, 840 g glucose, 700 g lactose, 7 g natriumsulfit, 35 g natriumthioglycolat og 175 g kalium sekundært phos-25 phat. Dyrkningssubstratet steriliseredes i 15 minutter ved 118 °C. Efter afkøling ledtes nitrogengas gennem substratet med en hastighed på 250 ml/minut i en time.

I dette dyrkningssubstrat udsåedes ca. 900 ml af en fordyrket kultur af Fusobacterium nucleatum TF-031 30 (FERM-5077, ATCC-31647), der var fremstillet forud ved at dyrke i et TF-f dyrkningssubstrat med samme sam-

DK 151640B

42 mensætning som ovenfor. Cellerne dyrkedes 4 dage ved ca. 33 °C under omrøring (90 omrøringer pr. minut), medens der tilledtes nitrogengas med en hastighed på 250 ml/minut. Efter dyrkningen sattes dyrkningsopløsningen 5 til 10 g/liter "Celite" og 5 g/cellulosepulver, og blandingen omrørtes og filtreredes under reduceret tryk, hvorved der opnåedes ca. 65 liter af en bakteriefri supernatant væske af kulturen.

(2) Til 7,5 liter af ovennævnte supernatante væske sat-10 tes 113 ml koncentreret saltsyre for at indstille væskens pH til 2,0. Herefter tilsattes væsken 11,4 liter ethanol for at få en 60% vandig ethanolopløsning, der herefter henstod i 24 timer ved 4 °C. Herefter fjernedes væskedelen ved dekantering, og den tilbageblevne del cen-15 trifugeredes (4 x 10^ omdr. pr. minut, 10 minutter) ved 4 °C for at få et bundfald. Bundfaldet vaskedes med to 100 ml portioner 60% vandig ethanolopløsning med en pH på 2,0 med 150 ml ethanol, med 150 ml methanol og endelig med 150 ml acetone i nævnte rækkefølge, og der lufttørredes 20 til opnåelse af 3,0 g pulver.

(3) Det under (2) oven for fremstillede pulver opslæm-medes i 30 ml vand. Den fremstillede suspensions pH indstilledes til 7,5 til 8,0 ved tilsætning af 4 N vandig natriumhydroxidopløsning, og efter at der var omrørt ved 25 stuetemperatur i 15 minutter, indstilledes atter til 4,0 ved tilsætning af 4 N saltsyre. Herefter henstod suspensionen under isafkøling i 2 timer, blandingen centrifugeredes (1 x 10^ omdr. pr. minut, 10 minutter) for at skille bundfaldet fra den supernatante væske.

30 Det fraskilte bundfald tilsattes 6 ml vand for at vaske bundfaldet, hvorved der dannedes en suspension, og hertil sattes 4 N vandig natriumhydroxidopløsning for at indstille pH til 7,5 til 8,0. Suspensionen omrørtes ved stuetemperatur i 15 minutter, hvorefter 4 N saltsyre 35 sattes til suspensionen for at indstille til pH 4,0, og suspensionen henstod 2 timer under isafkøling. Her-

DK 151640 B

43 efter centrifugeredes suspensionen (1 x 10^ omdr. pr. minut, 10 minutter) for at opsamle bundfaldet. Bundfaldet vaskedes med 4 ml vand, der havde en pH-værdi på 4,0 og centrifugeredes (1 x 10^ omdr. pr. minut, 10 minutter), 5 hvorved der opnåedes 6,2 g (våd vægt) af et bundfald (TF — 210).

Den fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-210 havde de i tabel 2 angivne egenskaber, og det infrarøde absorption sspektrum og ultraviolette absorptionsspektrum 10 var i det væsentlige identisk med spektrene opnået i eksempel 1.

(4) Bundfaldet 6,2 g (våd vægt) fremstillet oven for (3) opslæmmedes i 6 ml vand. Til suspensionen sattes under omrøring en mættet vandig ammoniumcarbonatopløsning 15 for at indstille suspensionens pH til 7,8. Suspensionen opvarmedes til 37 °C, og der tilsattes 21 mg "Pronase" E og herefter flere dråber toluen. Den fremstillede blanding enzymbehandledes under omrystning ved en pH-værdi på 7,8 til 8,0 ved 37 - 40 “C i 24 timer. Den behandlede 20 blandings pH indstilledes til 1,0 ved tilsætning med 4 N saltsyre, hvorved der dannedes et bundfald. Denne suspension henstod 2 timer under isafkøling, hvorefter . 4 der centrifugeredes (1 x 10 omdr. pr. minut, 10 minutter) for at opnå en supernatant væske. Til den superna-25 tante væske sattes 29 ml ethanol for at få en 60% vandig ethanolopløsning, hvorved der dannedes et bundfald. Opslæmningen henstod 2 timer under isafkøling, hvorefter der centrifugeredes (6 x ΙΟ"5 omdr. pr. minut, 10 minutter) for at få et bundfald. Bundfaldet vaskedes med 30 5 ml 60% vandig ethanolopløsning, 10 ml ethanol og 10 ml acetone i nævnte rækkefølge, og der lufttørredes til opnåelse af 315 mg rå krystaller af den carcinostatiske forbindelse TF-310.

De rå krystaller (315 mg) opløstes i 30 ml vand, og der til-35 sattes 4 N vandig natriumhydroxidopløsning for at indstille til pH 8,0. Den fremstillede opløsning hældtes på en

DK 151640B

44 søjle pakket med 30 ml "Dowex" 1x4 (handelsnavn fra Dow Chemical) Cl-type. Herefter ledtes 100 ml vand gennem søjlen, og alle eluaterne sloges sammen, indstilledes til en pH-værdi på 6,5 til 7,0 og filtreredes gennem ultrafilter 5 UK-50, hvorefter filtratet koncentreredes 100 gange.

Koncentratet filtreredes gennem et "Millipore" filter, der havde en porediameter på 0,3 ^um, og herefter fryse-tørredes til opnåelse af 230 mg frysetørret, renset carci-nostatisk forbindelse TF-310.

10 Den således fremstillede carcinostatiske forbindelse TF-310 havde de i tabel 2 angivne egenskaber, og saccharid-indholdet var ca. 16 - 30¾ udtrykt som glucose. Det infrarøde absorptionsspektrum, ultraviolette absorptionsspektrum og high performance væskechromatogrammet af en ty-15 pisk forbindelse er vist i henholdsvis fig. 7, 8 og 9.

Præparationseksempel 1

En fortyndet vandig natriumhydroxid-opløsning sattes til 3 til 4 mg af den carcinostatiske forbindelse TF-210 i pulverform til opnåelse af en opløsning, der havde en pH 20 værdi på 7,0 til 7,5. Den vandopløselige del af denne opløsning anbragtes i ampuller og frysetørret. Pulveret opløstes, når det skulle anvendes, i en steriliseret fysiologisk saltopløsning, en 0,5 % lidocain-opløsning, en 5% vandig glucoseopløsning eller lignende, og den derved 25 opnåede opløsning* anvendtes til injektionsformål.

Præparationseksempel 2

En vandig opløsning med pH 7,0 til 7,5 indeholdende den carcinostatiske forbindelse TF-310-1 anbragtes i en ampul, hvor der frysetørredes til opnåelse af et frysetør-30 ret carcinostatisk forbindelse TF-310, der indeholdt 0,5 eller 1 mg enhed. Pulveret opløstes, når det skulle anvendes, i en steriliseret fysiologisk saltopløsning, en 0,5¾

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en carcinostatisk og immunostimulerende forbindelse betegnet TF-210 eller den tilsvarende proteinfri forbindelse betegnet TF-310 kendetegnet ved, at man dyrker bakterien Fuso-bacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647) eller 20 en mutant heraf med i det væsentlige samme egenskaber i et dyrkningssubstrat indeholdende nitrogenkilder, carbon-kilder, vitaminkilder, reducerende midler og uorganiske salte med eller uden agar, under anaerobe betingelser, at man eventuelt efter fraskillelse af bakteriecellerne 25 sætter et hydrofilt organisk opløsningsmiddel til substratet eller den supernatante væske heraf, at man isolerer det fremkomne bundfald og ekstraherer det med vand ved en pH-værdi på 7,5 til 8, og at man behandler ekstrakten ved indstilling af pH til 3,5 til 4,5, at man fraskiller og 30 yderligere renser det dannede bundfald, og at man, om ønsket, underkaster den isolerede fraktion på et vilkårligt trin for en behandling til fjernelse af protein. DK 151640B

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at fjernelsen af protein udføres med et proteolytisk enzym.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet 5 ved, at enzymbehandlingen er en behandling med pronase eller trypsin.

4. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det hydrofile organiske opløsningsmiddel, der sættes til den supernatante væske, 10 er en alkohol.

5. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, kendetegnet ved, at dyrkningen udføres ved 32 °C til 37 °C i 1 til 4 dage i dyrkningssubstrat med en pH-vær- di på 6,5 til 7,5.

5 En vandig opløsning med pH 7,0 til 7,5 indeholdende den carcinostatiske forbindelse TF-310-2 anbragtes i en ampul og frysetørredes til opnåelse af et frysetørret car-cinostatisk præparat indeholdende TF-310 med 0,5 eller 1 mg enhed. Pulveret opløstes, når det skulle anvendes i en 10 steriliseret fysiologisk saltopløsning, en 0,5% lidocainopløsning,. en 5% vandig glucoseopløsning eller lignende, og den fremstillede opløsning anvendtes til injektions-formål.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at pH-værdien af den supernatante væske indstilles til 1,5 til 2,5, og at en alkohol tilsættes, således at koncentrationen i den fremstillede opløsning er 50 - 70 rumfang-?i.