FI69096B - Foerfarande foer framstaellning av en karcinostatisk och immunostimulerande tf-2-substans - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av en karcinostatisk och immunostimulerande tf-2-substans Download PDFInfo
- Publication number
- FI69096B FI69096B FI820527A FI820527A FI69096B FI 69096 B FI69096 B FI 69096B FI 820527 A FI820527 A FI 820527A FI 820527 A FI820527 A FI 820527A FI 69096 B FI69096 B FI 69096B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- precipitate
- water
- adjusted
- added
- medium containing
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 101000651310 Desulfitobacterium hafniense (strain Y51) Trigger factor 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 title 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 46
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 21
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 15
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 338
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 229
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 143
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 claims description 105
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 99
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N hydrochloric acid Substances Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 65
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 64
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 37
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 36
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 35
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 33
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 33
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 33
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 claims description 33
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 32
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 32
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 32
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 30
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 29
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 28
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 27
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 27
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 26
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 26
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 25
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 24
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 23
- 239000004158 L-cystine Substances 0.000 claims description 23
- 235000019393 L-cystine Nutrition 0.000 claims description 23
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 23
- 241000605986 Fusobacterium nucleatum Species 0.000 claims description 21
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 claims description 19
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 16
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 16
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 16
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 16
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 15
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 claims description 15
- GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M sodium thioglycolate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CS GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 229940046307 sodium thioglycolate Drugs 0.000 claims description 13
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 claims description 13
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 12
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 10
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 10
- 108010009004 proteose-peptone Proteins 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 9
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 claims description 8
- 208000006268 Sarcoma 180 Diseases 0.000 claims description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 8
- -1 phytonipeptone Substances 0.000 claims description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 3
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 claims description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 claims description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000001050 lubricating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims 45
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims 33
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 24
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 claims 23
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 21
- 239000010200 folin Substances 0.000 claims 13
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 12
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims 10
- MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 10h-anthracen-9-one;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims 8
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 claims 8
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims 8
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims 8
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims 6
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 claims 5
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- RJTZUHVCZIGJMB-UHFFFAOYSA-N hydron;1h-indole;chloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2NC=CC2=C1 RJTZUHVCZIGJMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 claims 3
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- JXUKAWQLFQEMRO-UHFFFAOYSA-N ClCl.N1C=CC2=CC=CC=C12 Chemical compound ClCl.N1C=CC2=CC=CC=C12 JXUKAWQLFQEMRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 206010048612 Hydrothorax Diseases 0.000 claims 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims 1
- YSVZGWAJIHWNQK-UHFFFAOYSA-N [3-(hydroxymethyl)-2-bicyclo[2.2.1]heptanyl]methanol Chemical compound C1CC2C(CO)C(CO)C1C2 YSVZGWAJIHWNQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims 1
- HRYZWHHZPQKTII-UHFFFAOYSA-N chloroethane Chemical compound CCCl HRYZWHHZPQKTII-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 208000003906 hydrocephalus Diseases 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 claims 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 30
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract description 4
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract 1
- 230000003327 cancerostatic effect Effects 0.000 description 109
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 101
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 97
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 75
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 43
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 41
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 40
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 23
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 18
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 15
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 13
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 8
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 6
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 6
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 229940126701 oral medication Drugs 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N D-Maltose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RSPISYXLHRIGJD-UHFFFAOYSA-N OOOO Chemical compound OOOO RSPISYXLHRIGJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 2
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 0 CCC**(*CCC*CC*CC*)N Chemical compound CCC**(*CCC*CC*CC*)N 0.000 description 1
- DEDZSLCZHWTGOR-UHFFFAOYSA-N CCCC1CCCCC1 Chemical compound CCCC1CCCCC1 DEDZSLCZHWTGOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Diphosphoinositol tetrakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101100252165 Mus musculus Rnd2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N hexahydrofarnesyl acetone Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)=O WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007236 host immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005554 pickling Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/05—Immunological preparations stimulating the reticulo-endothelial system, e.g. against cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
1 69096
Menetelmä karsinostaattisen ja immunostimuloivan TF-2-aineen valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää TF-2-aineen valmista-5 miseksi, joka aine on TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-300 (TF-310, TF-320 tai TF-330), TF-340 tai TF-350 ja jolla on karsinostaattinen ja immunostimuloiva vaikutus, jossa menetelmässä viljellään anaerobisissa olosuhteissa TF-2-ainetta tuottavia bakteereita, jotka kuuluvat Fuscobac-10 terium-sukuun, ja TF-2-aineita saadaan viljelmästä tai sen pintanesteestä.
Viime vuosina laajalle levinneenä erilaisia syöpätyyppejä sairastavien potilaiden parannuskeinona käyttöön on tullut hoito, johon sisältyy isännän immunologisen toimin-15 nan lisääminen ja karsinostaattisen vaikutuksen aiheuttaminen immunologisen toiminnan myötävaikutuksella. Kasvaimen vastaisina aineina, joita sellaiseen hoitoon on käytetty, on tunnettuja aineosia, joita saadaan erilaisista bakteeri-organismeista tai erilaisten bakteerien viljelmästä tai 20 polysakkarideista, joita saadaan Basidiomycetes-suvun le-viämiselimistä tai niiden viljellyistä sienirungoista.
Näillä kasvainten vastaisilla aineilla ei ole kuitenkaan tyydyttävää vaikutusta, ja sitä paitsi niillä on ei-toivottavia sivuvaikutuksia, eikä niiden valmistamiseksi 25 ole keksitty tyydyttävää menetelmää.
Toisaalta on kuvattu organismi ja supernatantti, jotka on saatu viljelemällä Fusobacterium-sukuun kuuluvia bakteereita, esim. lajeja Fusobacterium K031-3B, Fusobacte-rium fusifomis W-12, Fusobacterium girans 1012 ja Fusobacte-30 rium nucleatum 1010 (Dental Surgery 23 (1974) 322-333 ja Dental Surgery 23 (1974) 534-539). Silloin komponentteja, jotka saatiin Fusobacterium-sukuun kuuluvien bakteereiden viljelmistä tai viljelmien supernatanteista, ei kuitenkaan tarkemmin tutkittu. Näiden komponenttien farmakologista 35 aktiivisuutta ei myöskään kuvattu.
Tämän keksinnön keksijät ovat tutkineet pintanesteen ______ — ΤΓ 69096 farmakologista aktiivisuutta, jota nestettä on saatu viljelemällä Fusobacterium-sukuun kuuluvia bakteereita ja poistamalla organismit viljelmästä, todeten, että tietyllä pintanesteestä saadulla aineosalla on karsinostaattista 5 vaikutusta; että mainitulla aineosalla on epäsuoraa karsinostaattista vaikutusta lisäämällä isäntävälitteistä kasvaimen vastaista vaikutusta tai isännän immuniteettia ja käyttämällä hyväksi immuniteetin myötävaikutusta; ja että mainitun aineosan toksisuus on hyvin vähäinen ja sitä voi-10 daan saada myös viljelmää käsittelemällä.
Tämän keksinnön kohteena on menetelmä TF-2-aineen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että viljellään anaerobisissa olosuhteissa pH:ssa 5-8,5 ja lämpötilassa 30-45°C 1-5 vuorokautta TF-2-ainetta tuottavia bakteerei-15 ta, jotka kuuluvat Fusobacterium-sukuun, kasvualustassa, joka sisältää typpilähteen, hiililähteen, vitamiinilähteen, pelkistimiä ja epäorgaanisia suoloja yhdessä agarin kanssa tai sitä ilman, lisätään saostavaa ainetta näin muodostuneeseen viljelmään tai sen emäliuokseen, mainitun saosta-20 van aineen ollessa hydrofiilinen orgaaninen liuotin, pitoisuuteen 30-80 tilavuusprosenttia ja pH:ssa 1,5-7, annetaan sakan muodostua, otetaan sakka talteen, fraktioidaan sakka pH:sta riippuen ja otetaan talteen TF-2-aine, joka on TF-210, TF-220, TF-230, TF-240 tai TF-250 tai fraktioidaan sakka 25 pH:sta riipuen ja saatetaan saatu fraktio deproteinisointi-käsittelyyn ja otetaan talteen TF-2-aine, joka on TF-300 (TF-310, TF-320 tai TF-330), TF-340 tai TF-350, ja haluttaessa muodostetaan tavanomaisella tavalla fysiologisesti hyväksyttävä suola.
30 Tässä keksinnössä käytettävinä bakteereina voidaan käyttää mitä tahansa TF-2-ainetta tuottavia Fusobacterium-sukuun kuuluvia bakteereita, ja esimerkiksi käytetään edullisesti bakteeria Fusobacterium nucleatum. Täsmällisesti sanoen käytetään bakteeria Fusobacterium nucleatum TF-031 35 (FERM 5077; ATCC 31647).
69096
Fusobacterium nucleatum TF-031:n bakteriologiset ominaisuudet ovat seuraavat: (I) Muoto (1) Solujen muoto: sukkulamainen (kuva 1) 5 (2) Solujen polymorfismi: puuttuu (3) Liikkuvuus: puuttuu (4) Itiöt: puuttuvat (5) Gram-värjäytyminen: gram-negatiivinen (6) Haponkestävyys: negatiivinen 10 (II) Kasvuolosuhteet viljelmäväliaineessa (1) TF-a agar-levy- ja viistopintaviljelyväliaine Ulkonainen muoto: pyöreä muoto Koko: noin 1 mm
Protuberanssi: puolipallon muotoinen 15 Struktuuri: kastepisaramainen
Pinta: sileä Reunat: sileät Väri: maitomaisen kellertävän valkea Läpinäkyvyys: läpinäkymätön 20 (2) TF-a neste-viljelyväliaine
Kasvuaste: voimakas Sakeus: koaguloitunut Saostuma: ei sakkaa
Pintakasvu: ei kasvua, ei kasvua noin 5 mm:n 25 syvyyteen saakka
Kaasu: ei kaasua (III) Fysiologiset ominaisuudet (1) Rikkivedyn muodostuminen: + (2) Nitraattien pelkistyminen: - 30 (3) Voihapon muodostuminen: + (4) Indolin muodostuminen: + (5) Ureaasi: - (6) Katalaasi: - (7) Tärkkelyksen hydrolyysi: - 35 (8) Suhtautuminen happeen: anaerobinen 69096 (9) Ammoniakin muodostuminen; + (10) Hiilidioksidin muodostuminen: +
(11) Kasvurajat: pH 5,0-8,5, lämpötila 30-45°C
(12) Kaasun muodostuminen sakkarideista: 5 L-arabinoosi (-), D-ksyloosi (-), D-glu- koosi (-), D-mannoosi (-), D-fruktoosi (-), D-galaktoosi (-), mallassokeri (-), sakkaroosi (-), trehaloosi (-), sorbitoli (-), mannitoli (-), inositoli (-), glysero-10 li (-), tärkkelys (-).
Tämän keksinnön uusia TF-2-aineita valmistetaan, esimerkiksi, seuraavalla tavalla.
5 69096 I -' 0 O o o o o o i (M ro in m * tn
(M (N CN M (N (N CO
1 I I II I -- I
Pk Pk Pk Pk Pk (k Pk
En E-ι E-· E-ι E-< 9-t Eh f f ♦ f !
G .H CD CD
r-i -n > r—I
3 -H CD O O
H > -P -H rP * 3 tfl 4-1 <N m 3 c o c i-1
Ai CD G ·Ή Pk Pk •H (0 O En En G Ph -P Ή ij β
IIP CD G 4-1 i—I rH
IÖ CD -H A rH rH (Ö fÖ (fl
44 44 Ρϋ) fÖ *γ4 Ή ι—I 1—I r—I
G A m G O O rH rH r-l in id p; 3 (0 Ή c c ·Η ·Η ·Η a .q <d 4J ϋ <u<DO o o
1 —m-o-a — m -h -h c c G
EC *,>H(Öa>4J44<D <D <D
3 <D -H H ΙΛ 3 -H -H -rH
44-ΗΠ3 O.GG4J 44 44 (0 > 44 Oi ·· ·· ω ΠJ H ia C G G ^
rH 44 !(0 -rH ·· ·· ·· O 1 O
O 44 e PH PC PC CO O' CN n * ro 3 O rH Oi Oi <N-- ro
c 3 <D 3 PC PC X I I
44 to 4J G G Pii Oi di (k Pk E M en (D <D Eh ; En
3 Id H ·· (D <D G G G
•H44> K44 44<D3<D3<D I
Ph 44 GitDPDOrHfDrHO) \
CD (D P> > 44 1—I 44 rH 44 I
44 G <D -H (D -H (D
o -h a> cd > o > o > 3 3 G G G G 1
jQ I CD<D(D(D<D<D(D
O <N Ai Ai (D Ή (D -H (D ;
tn I G 3 G G 44 G 44 G
3 Ek -H -H -H (D (D CD 1
Pk Eh -P 1—I rH Ai G A G Ai O
O 3 ·· 3 ·· 3 44 3 -r4 -H -H rp -H CN -H U)
H CD CD «“I 1—I 1—I -H
rH PC PC O O O o id id id a id ft id <n o Jim Oi e Ai A A A A rsl * ro/ ro
CD O O O G O G O I-----1 I G
G -ro -n -n CD -n (D -n Pk Ck Pk CD
rl ID CD Eh tr< Eh Ή
G --- 44 - 44 - G
ϋ V G G G CD G CD G -H
m CD CD CD > CD P> CD Ή
O' O G G G G G CD
(H -H -H -H -H CD -H CD -H 44
O 44 E E E G E G E O
A 3 3 3 ai 3 <D 3 (h
Geo ΟΟΟΛίΟΛίΟ Λ
CD Ph AAA 3 A 3 A
G'w ΟΟΟ-ΗΟ-ΉΟ 4*
•H -H AAAi-HA-HA
•H G cn
•H CD Φ G G G --H G -H G
•H C > O O O CD O CD O
l+H -Η ·ιΗ -H -H -H -H O O
OO 44 4J -P 3 -P 3 -P ι-H rH
>h A A A! A -P A 4J A CN·* ro
Ό 3 ίο Π3 fO 4J (3 -Μ Π3 I—— I
Ρ>ι·Η p Ph Ph 3 Ph 3 Sh Pk Pk PC PI ^ Pk Pk Pk E Pk g Ρκ/ Eh \Εη 6 69096
Edellä mainittua valmistusmenetelmää on kuvattu alla seuraavasti: (1) Bakteerien viljely
Fusobacterium-sukuun kuuluvien bakteerien vilje-5 ly suoritetaan tavanomaisella anaerobisten bakteerien viljelymenetelmällä. Tämä tarkoittaa, että viljelyväli-aineen, joka sisältää typpilähdettä kuten naudan aivo-sydän-uutteita, erilaisia peptoneja, tai näiden kaltaisia aineita; vitamiinilähdettä, kuten hiivauutetta tai 10 tämän kaltaista ainetta; epäorgaanista suolaa kuten nat-riumkloridia tai tämän kaltaista suolaa; hiililähdettä kuten glukoosia, laktoosia tai näiden kaltaista ainetta; pelkistävää ainetta kuten L-kystiiniä, natriumsulfiittia, tioglykolaattia tai näiden kaltaista ainetta, pH sääde-15 tään arvoon 6-8,5, edullisesti välille 6,5-7,5, ja vil-jelyväliaineeseen siirretään bakteereita, minkä jälkeen niitä viljellään vakiotilassa anaerobisissa olosuhteissa 30° - 42°C:ssa, edullisesti 32° - 37°C:ssa, 1-5 päivää, edullisesti 24 - 96 tuntia. Erityisen toivottavaa on, 20 että käytetään viljelyväliainetta, jota on selostettu taulukossa 1 (josta seuraavassa käytetään nimitystä TF-viljelyväliaine). Aivo-sydän-infuusio, joka on naudan aivo-sydänuutetta, ei kuitenkaan ole aina välttämätön hiililähteenä ja voidaan korvata sydän-infuusiolla, joka 25 on naudan sydän-uutetta, naudanlihauutetta, kalauutetta, maissiliotetta, tai tämän kaltaista ainetta. Erilaisten peptonien joukosta proteoosipeptoni ja fytonipeptoni eivät aina ole välttämättömiä, ja tryptikaasipeptoni voidaan korvata polypeptonilla.
30 Kun agaria ei käytetä, on toivottavaa, että vil jelmää sekoitetaan.
Il 69096
Taulukko 1
Vil je Lyväliaineen aineosat TF-a TF-b TF-c TF-d TF-e TF-f
(g/D
Tryptikaasi- 17 17 17 17 17 17 peptoni 5 Fytoni- 3 3 1,5 - - peptoni
Proteoosi- 10 5 5 peptoni
Aivo-sydän- 35 17,5 - infuusio 10 Sydän- - - 25 20 10 15 infuusio
Hiivauute 3 3 3333
Natriumkloridi 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5
Glukoosi 6 6 6 12 12 12
Laktoosi 5 5 5 10 10 10 L-kystiini 0,25 0,5 0,5
Natriumsulfiitti 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Tioglykolaatti 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Agar 0 tai 0 tai 0 tai 0 tai 0 tai 0 tai 20 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 8 69096 (2) Pintanesteen kokoaminen viljelmästä (organismien poistaminen)
Pintanesteen saamiseksi talteen organismit poistetaan edellä saadusta viljelmästä. Organismien poista-5 miseksi voidaan käyttää tavanomaista menetelmää, esim. sentrifugointia ja suodatusmenetelmää käyttämällä suo-datusapuainetta, kuten tuotetta Hyflo-Super-Cel, ja erityisesti suoritettavien työvaiheiden, organismien poistamisasteen, ja pintanesteen saannon kannalta sent-10 rifugointimenetelmä on ensisijainen.
(3) Karsinostaattisen aineen TF-2:n kokoaminen.
(i) (a) Edellä saatuun pintanesteeseen tai vil jelmään lisätään hydrofiilistä orgaanista liuotinta, ja muodostunut sakka kootaan talteen. Tällöin pintanes-15 teen tai viljelmän pH säädetään lähinnä välille 1,5-7, ensisijaisesti pH 2:n tienoille (pH 1,5-2,5). Hydro-fiilinen orgaaninen liuotin on, esimerkiksi, alkoholi kuten etanoli, metanoli ja näiden kaltainen alkoholi, ja ketoni kuten asetoni ja tämän kaltainen aine, jos-20 kin alkoholeilla, erityisesti etanolilla saadaan täl löin paras tulos. Hydrofiilistä orgaanista liuotinta lisätään sopivasti siten, että sen konsentraatio voi olla 30-80 %, erityisesti 50-80 tilavuus-%. Hydrofiili-sen orgaanisen liuottimen lisäämisen jälkeen, muodostu-25 neen seoksen annetaan olla paikoillaan alhaisessa lämpötilassa, edullisesti noin 5°C: ssa, useista tunneista useisiin päiviin jotta sakka saadaan muodostumaan täydellisesti.
Näin muodostettu sakka erotetaan tavanomaisin 30 menetelmin kuten dekantoimalla, sentrifugoimalla, suo dattamalla ja näiden kaltaisilla tavoilla.
(b) Edellä erotettuun sakkaan lisätään vettä, tavallisesti 5-20-kertainen määrä sakkaan nähden, ja sakka fraktioidaan pH:sta riippuen. Tämä menetelmä suo-35 ritetaan spesifisesti seuraavasti: (b-1) Edellä mainitun sakan ja veden seoksen pH säädetään välille 7,5-8. Sen jälkeen kun liukenematon 11 9 69096 osa on poistettu, mikäli se on välttämätöntä, seoksen pH säädetään 4:n tienoille (3,5-4,5). Muodostuneet veteen liukenematon ja veteen liukeneva osa erotetaan toisistaan käyttämällä tavallista menetelmää kuten sentrifu-5 goimalla, suodattamalla, tai näiden kaltaisella menetelmällä. Näin saadun veteen liukenemattoman osan (TF-210) ominaisuudet on esitetty taulukossa 2.
(b-2) Edellä kohdassa (a) saatuun sakkaan lisätään erikseen vettä tavallisesti 5-20 kertaa sakan määrä. 10 Seoksen pH säädetään välille 7,5-8. Sen jälkeen kun liukenematon osa on, tarvittaessa, poistettu, seoksen pH säädetään 6:n tienoille (5,5-6,5). Muodostuneet veteen liukenematon ja veteen liukeneva osa erotetaan toisistaan tavallisella menetelmällä kuten sentrifugoimalla, 15 suodattamalla, tai näiden kaltaisella menetelmällä. Näin saadun veteen liukenemattoman osan (TF-220) ominaisuudet on esitetty taulukossa 2.
(b-3) Edellä erotetun veteen liukenevan osan (b-2) pH säädetään 4:n tienoille (3,5-4,5). Saadut sakka 20 ja vesiliukoinen osa erotetaan toisistaan tavallisella menetelmällä kuten sentrifugoimalla, suodattamalla, tai näiden kaltaisella menetelmällä. Näin saadun sakan (TF-230) ominaisuudet on esitetty taulukossa 2.
(b—4) Edellä erotetun vesiliukoisen osan (b-1) 25 tai (b-3) pH säädetään 2:n tienoille (1,5-2,5), jolloin muodostuu sakkaa. Tämä sakka erotetaan vesiliukoisesta osastaan tavallisella menetelmällä kuten sentrifugoimalla, suodattamalla tai näiden kaltaisella menetelmällä. Näin saadun sakan (TF-240) ominaisuudet on esitet-30 ty taulukossa 2.
(b-5) Edellä kohdassa (a) saatuun sakkaan lisätään vettä tavallisesti 5-20 kertaa sakan määrä ja seoksen pH säädetään, esimerkiksi, välille 7,5-8. Sitten pH säädetään edelleen 2:n tienoille (1,5-2,5). Näin saa-35 tuun vesiliukoiseen osaan tai edellä eristettyyn vesi- 10 69096 liukoiseen osaan (b-4) lisätään, tarvittaessa, sen jälkeen kun vesiliukoisen osan määrä on konsentroitu kolmanteen - seitsemänteen osaansa, nydrofiilistä orgaanista liuotinta, lähinnä alkoholia, siten, että sen 5 konsentraatioksi tulee 20-80 %, lähinnä 20-60 tilavuus-%. Keräämällä talteen muodostunut sakka saadaan tuotetta TF-250. Näin saadun karsinostaattisen aineen TF-250 ominaisuudet on esitetty taulukossa 2.
Näin saadut karsinostaattiset aineet TF-210, 10 TF-220, TF-230, TF-240 ja TF-250 voidaan kukin frak tioida useaan kertaan samaa fraktiointimenetelmää käyttäen riippuen puhdistamiseen käytetystä pH:sta. Näin saadut karsinostaattiset aineet voidaan kukin muuttaa tavanomaisella menetelmällä farmaseuttisesti hyväksyt-15 täviksi suoloiksi, kuten alkalimetallisuoloiksi, esimerkiksi natriumsuoloiksi, kaliumsuoloiksi ja näiden kaltaisiksi suoloiksi ja maa-alkalimetallisuoloiksi, esimerkiksi magnesiumsuoloiksi, kalsiumsuoloiksi ja näiden kaltaisiksi suoloiksi.
20 (ii) Edellä kohdassa (i) mainitulla tavalla saa duista karsinostaattista aktiivisuutta omaavista fraktioista TF-210, TF-220, TF-230, TF-240 ja TF-250 poistetaan kustakin proteiinit tavanomaisen menetelmän mukaisesti, jolloin saadaan tuotteita TF-300 (TF-310, 25 TF-320 ja TF-330), TF-340 ja TF-350. Proteiinien pois- tokäsittelyssä voidaan käyttää alalla tunnettuja menetelmiä, ja erityisen ensisijainen sellainen menetelmä on hajoittaminen proteolyyttisillä entsyymeillä. Kun proteiinien poistaminen halutaan suorittaa käsittele-30 mällä proteolyyttisellä entsyymillä, riittää kun kukin edellä kohdassa (i) saaduista karsinostaattista aktiivisuutta omaavista fraktioista liuotetaan tai suspen-doidaan veteen tai puskuriliuokseen, lisätään proteiinin hajoittavaa entsyymiä saatuun liuokseen tai sus-35 pensioon, ja entsyymikäsittely suoritetaan tavanomaiseen tapaan.
Il n 69096
Proteolyyttisinä entsyymeinä voidaan mainita pronaasi, papaiini, trypsiini, kymotrypsiini, ja näiden kaltaiset entsyymit. Ensisijaisia ovat pronaasi ja trypsiini. Suositeltavaa on, että ennen entsyymikäsit-5 telyä tai sen aikana vesiliuoksen pH säädetään välille 7-8 ja pidetään siinä. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää natriumhydroksidia, kaliumhydroksidia, natrium-karbonaattia, natriumvetykarbonaattia ja näiden kaltaisia aineita. Jotta saadaan estetyksi reaktioseoksen mätä-10 neminen entsyymikäsittelyn aikana, toivottavaa on lisätä pieni määrä orgaanista liuotinta kuten kloroformia, tolueenia tai näiden kaltaista liuotinta. Entsyymiä käytetään tavallisesti noin 1-2 paino-% entsyymikäsittelyn kohteena olevan jauheen (kiinteän aineen) painosta las-15 kien.
Edellä mainittu entsyymikäsittely suoritetaan tavallisesti 30-40°C:ssa 1-72 tunnin kuluessa, lähinnä 24-48 tunnin aikana. Se voidaan suorittaa myös lisäämällä ensin, esimerkiksi, noin 1 paino-% entsyymiä jauheen 20 (kiinteän aineen) joukkoon ja käsittelemällä jauhetta (kiinteätä ainetta) entsyymin kanssa 1-24 tuntia ja lisäämällä sen jälkeen taas noin 1 paino-% entsyymiä entsyymikäsittelyn jatkamiseksi.
Edellä mainitun entsyymikäsittelyn jälkeen liu-25 kenematon aines poistetaan, tarvittaessa, esimerkiksi sentrifugoimalla, suodattamalla tai näiden kaltaisella menetelmällä, minkä jälkeen näin saadusta vesiliukoisesta osasta kootaan talteen vastaavat karsinostaatti-set ainefraktiot TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), 30 TF-340 ja TF-350. Tällä tavalla tuotetta TF-310 voidaan saada tuotteesta TF-210, tuotetta TF-320 tuotteesta TF-220, tuotetta TF-330 tuotteesta TF-230, tuotetta TF-340 tuotteesta TF-240 ja tuotetta TF-350 tuotteesta TF-250. Näiden TF-300-fraktioiden (TF-310, TF-320, 35 TF-330), TF-340 ja TF-350 erottaminen voidaan suorittaa
[I
12 69096 fraktiomalla ainakin kerran pH:sta riipuen, saosta-malla erilleen hydrofiilisestä orgaanisesta liuottimes-ta, fraktioimalla ioninvaihtajalla, suorittamalla ultra-suodatus ja näiden kaltaisilla menetelmillä. Vaihtoeh-5 toisesti yksi tai useampia näistä työvaiheista voidaan uusia useaan kertaan. Spesifisesti tämän keksinnön tar-sinostaattisia aineita TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 ja TF-350) saadaan säätämällä edellä saadun vesiliukoisen osan pH siten, että se ei ensisijaisesti ole 10 suurempi kuin 2,5 (tarvittaessa voidaan lisätä trikloo-rietikkahappoa), poistamalla muodostunut sakka, lisäämällä liukoiseen osaan hydrofiilistä orgaanista liuotinta kuten alkoholia siten, että sen konsentraatioksi tulee 30-80 %, edullisesti 60-80 tilavuus-%, kokoamalla 15 talteen muodostunut sakka, joka on kohteena oleva aine-fraktio, käsittelemällä sen jälkeen, tarvittaessa, tätä sakkaa vahvasti anionisella ioninvaihtajahartsilla kuten tuotteella Dowex 1 type (kauppanimi), Amberlite IRA-400 (kauppanimi), tai näiden kaltaisella valmis-20 teella (tämä käsittely voidaan suorittaa useaan kertaan) absorboitumattomien fraktioiden kokoamiseksi, suorittamalla, tarvittaessa, fraktioiden ultrasuodatus /esimerkkinä Toyo Ultrafilter UK-50 (suodattaa molekyylejä, joiden molekyylipaino on alle 50 000) tai Toyo 25 Ultrafilter UK-200 (suodattaa molekyylejä, joiden molekyylipaino on alle 200 000)/, ja käsittelemällä niitä sitten esimerkiksi konsentroimalla, ulosuolaamalla, kuivaamalla tai saostamalla hydrofiilisestä orgaanisesta liuottimesta, tai näiden kaltaisella menetel-30 mällä. Näin saatujen karsinostaattisten aineiden TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 ja TF-350 ominaisuudet on esitetty taulukossa 2.
Karsinostaattiset aineet TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 ja TF-350 voidaan muuttaa farmaseutti- 13 69096 sesti hyväksyttäviksi suoloiksi tavanomaisen menetelmän mukaisesti. Mainittuina farmaseuttisesti hyväksyttävinä suoloina voidaan mainita spesifisesti, esimerkiksi, alkalimetallisuolat kuten natriumsuolat, kalium-5 suolat ja näiden kaltaiset suolat ja maa-alkalimetalli-suolat kuten magnesiumsuolat, kalsiumsuolat, ja näiden kaltaiset suolat.
14 69096 I - 85£ .
3 *i!4 4 3 - w w p e <n q +j « S »o * fi H -H e -H 43 x C n «3 Q -H g rH +J 3 .·3ΐ0·η ,2 h J5 a ως-ho 3 g .:3 g g .g .g lip iiHss ä ä ' ' Ui 1 3!|A lii ll| z! | S tilth W Ή .2 -P ^ΓΐϊϋίΌ •5 -S:S , co i h&Sk 3 υ m ϋ£φ§ S S c 3 S3?§ 5 1 öä| S5i| - * lsaif i^ig 0 C H£ S 5 V φ »H U g &1 (Q H Μ ·ί—v *frt q O) -¾ n m > ω·3 5 1 I »lii a«3 p '* § S S 5SSc3 S 3-alls 31 §11 fci 2 fl ·η n 3 ns8| ®s^|i •S 8 s f 3 * Sgl3 .asls° > +5 I =nj 5 3 m -h q oq r-ι :<a -h s 1 1 e co -rl i—j E fflfc hq ggjjgg^
=9 S
g I gl g 5rn D £j (g <0
4i ® > S
I r S o -h /-ho oooo o oji-PH n ci ^ in o • /K 7777 ? <§/££ li li & & li lt 15 69096
;S
I .-sl-a
δ ο δ ä ‘il TJ
<U C tO -P <L> +3 (3 id - <d -P r r sr
« s 5 5 S -S
dl O) -H φ (ί H
G C rH 0) -h >i llgrsl •H T-t 4J (1) Xj Ή hjH (D i5 Φ ^ _ :3^ g -g 5 i ύ =15 3 (0 Vj -H 3 n 12 χ X (0 —· W -H <. ·γ—i
{N aö -5 rd ·η ί> :<d § C ad S
i—I “ '1 l rH H p rH g
Q rH x: CrtJ rH -H > flj rH -H
2 α> υ c 3 > φ « » > a> ra to 2 U -H ·· > -H PJ > (0 -H Pj > p p -H rH o to o -h tn χ o -H tn -h +j
rH H M OD fö H ·Η Id W rH Ή *“1 P
1 sf °a
En -H <3 -h -h h Id a -H -h (d ae (d I» C ΕΌ 3 UI UI a -P UI U)H >
H | O 3 li -H JJ tfl H PH
:rö S O P 9 W Λ C Q :« (d H
-¾ '3 •f* S lä > ·· S 2>;Wfd SPHPa Ξ -h o 3 Ξ ·η > i) > «i 8 s aJcnooS <d to <a -h to to g E »HE O) ·η Ο s r
S JS - 8 5 3%s s’s I
Si SS-h £.S§.* . 35 il
fO tO S rH H ΙΌ- O rH tO ltd- 10 JJ
H+J-Htuo U Xl x o 3 PÄ id (0 g £ f :id ^ S S ad 3 ^ -¾ 3 g ttÖ "H CO ti? rH aÖ rH tO rH ttd rH -H 9 S tO fd i—I rH E Pj <H -P g Pj 'P &
:ίο Φ > I H ao .G td *H fd WP a E
E-ι > P* CQ CO EHW-nt0> hw 3·Η ill > ro <d § s s = 31 s 0 o o o o
rH (N ΓΟ «r LO
ro ro ro ro ro
1 I III
£ & & £ £ 16 69096 <#> o p—i o' -p ~ V T V 7 7 0 2 en ["- o cn ro
G rH »H
Γ
•H
U) ^ >i dp r* r* r- m lo >i ;r i 1 i i i r-j K in to ID Tj» Γ0 ru § (0 ro (N lo 00 ro p dp ·5Ρ O' »a· ro ro
M —’ I l T I I
H o o cn m o < U o* o· o> ro ro S -y M 0 h' -Sj ·Η 5 -ro r·^
(0 -P 2 I O (0 -¾ I ·. Q IvrO
•1“10 O (N H Λί O O e I O O ·(—> '-'φ C m CN rH I -ΙΛΗ δ O ΊΛΗ
Cu O in *-η ή · o iti in o -no in cn o
tj? -I—> ·—I I Q tnOrHrH-P UOHHO
<NQ H o e jo <N I -H cn I en -H -rl «·>» φ T3 ro * OrH v ro -o O -P j* o cn -h ioooi i o o· * I CN H +1 βΟΝΝ E CONINO · -s HC * ' VO OOVOrHÖ O O VO rH CN (rt
P Q -P III O H Ή vO i—I VO rH O r-H
H m £ Λ o l oi »on l *o »dn I »hh 2 -S 'rl to cn o oo E m o © cn wool -h m TO <D ^ ro (30 ro U (0 C GO VO 00 (Λ C 00 00 O o
E-ι I -PrH e I VO rH -H dl vo ro -h φ vo co oo C
(0 CD 1 O ep i—1 O V-J -H rH rH (0 Vh Ή rH rH O flj
5 G £ _ o »(N s = +3 -P l-ro+J+J I H H
P Φ U :cö vo * o o X £ ·* o v Λ · o +J
6 S — lönovfH I OOHO ΙΌΟΗ »
(Cl ω CN O' I Q. .V (N O' VO Qj JS (N rr OrH
,P Sh -h e o rH o (0 ^ en -h σν **Hf9 U Φ (N (N -P CN -P (N rH g C K ί H I «.H :nl (0 I ·. «. :rrt to | », | q H^' Λ! -P O o H m jo o o o i)ir o o o JÄinH in g in (n vo tn 3 m h m o ft O σκη m :to rC en in o :id (fl ovin h h
CO^CNrH-ro B CINHH Eh C (N H H CD
. · Il II II II
ιφ me mc n e me
H I £ m Ή E (0 H E 8 -rl *E (§ -H E cO
φ(0 ·· φ (8 ·η · Φ TO το · 0)(0 ·γο · <D (0 ·η · s 9¾3¾ 9Ϊ·3S άi3S .ai·3I .ai·3! a aa"? .9a *„u 9a ®0U 9115%0 9a*0u m -P > :(0 o -p > TO o -p > to m +j> (0 τη +j > ido
•d M :<0 P vo vafl-n^i· 4<:π)·ηΜ ,ώ:(0·ηΗ m :TO -rorH
E TO P -P rH (OP CN (0 M (N 1 U (N TOP CN
S iiSSA äiMSA isSISA äSSA
e m p -p vo -poo P o -pid
m :TO P -H -p 90+J(i)H a0+)ll)H adJJOXN »0 -P φ <H
(0 h 3 & g H 3 +J H 3+J H 3 ί H 3 P
•ro H H 10 3 rHHm-H H H m H rj rl ffl H rl rl dl H
(0 3TO rH -H TO 3(0 i—I Ή 3 !(0 rH *H C ϊ(0 Ή ·Η p 3C0 rH Ή p
K O ε-n EhODj-PEhOCU-PEhOCU-P EhO&i+J
s jo
•H /-H
(0 / -P o 000 o e / M <-h cn ro -s· in i / S 7 7 7 7 7
0/ G g & & & |J
II
17 69096
Hi ^ LT) CM
I til I I
r—t I—I rH rH CO rH
Γ~ ! Γ— Γ— ip φ
I tit T T
in m m m in r~ I— t— r~^ h· Γ" h· rr τ h· co co
I III I I
00 00 00 CO CM ^
ΓΟ 00 CO CO CO CO
"ns O ~
jä +1 4-1 O
Π3 rrt ro oo τη g -5 cm fO · (0 » * o -
COO COO CM O
cm o -· o r^· o ' 'S' co σ no H* σι -no <j o I cm co Q |-| ΙΟ rH J-ilOr-Hr-H Vd r—I CÖ 5 -rl oo I * -rl 00 I I rl k I ·η 2 2 cm o o · XNoo · Λί o o
73 I ID CM Π5 I ID (N fO T O ID O
I—j · *" tj» o t—I · *· r—I '—I · co hj· r 3 l/IOHHH IIIOHHH Cl) 00 rH σ · (T5 jh CM I ·Η £) CM -ΗΛΙ <0
Eh ns σι - o q nS σ - - o ns o «· * ι—ι
CM O 00 £ CM O O £ OOOrH
β *3· Ο <D C CM CM δ β U0 CM CM -H
0-LCIrH-H 0-U">CN-r| O Cl m O Q
O rH 4-> O rl rl 4) r-Η rH £ JUO I ' MO I I :cQ C I 1 <1>
tn CO O OrH Cl) CO O OH C/5 ® O O H
ci) co oo cm ι = = = co co oo m I _ ci) -h oo oo 4-) •h I m h E -HiincMg h +)ino
COrHrHO ΜΟΗΗ Ö UCH rHH
flO 4-1 O 4-» O
v m s -.o 2in*--in 2 2 £
Cpcoooo oicoooco 7p o o o
ft (N ID OO ft ΗΉΌ0 ft4-l CO O
Cl) β ID 00 I ID β ID CO CO A CD H O
φΗΗΟ (DrHrHnS £HHO
:«J-H I In :n3 -H I I TO MO 3 I I op
D) 4IOOCO CO 4-1 O O M rJOO I
in C ID CO in C IO H O 10 c ID H* 0 TO O ID co (0 TO o id M1 C- TO o ID H Cl
Eh AC 1—I 1—l ί 1 Eh 2 1—I —I σ Eh η 1 rH 1—I 00 I II·
C (d CTO
•H CO r-4 ·Η Co r-H *H TO rH
OfO’HrH Q CO Ή r-Η Q ίυ *H rH
2 τη 4-) <1) 2 ’Ή 4-> Cl) 2 'Ή -P Φ
n TO II) ι—I rHCCSCOrHrHnJWrH
10 -S ^ S 9 * -5 ^ ·> 8 o Q TO TO ft o Q TO TO ft OQiflrrtQd
•H £ to 4-1 :nS -Η £ ·γο 4-) :ns -h £ to -P :nS
4-) 4-) rH 4-) 4-) rH 4-) 4-) 2 •rossi* rossi* rossg* ,WiJ « o c = = = hi>nsc » 0 fi 4H β ·· 3 ·· «44 β ·· 3 ·· «44 β ·· 3 ·· _ § u 2 o ,¾ u 2 u _ tou2u
M TOO O :TO TOO O ^ TOO O
E -no H in E'DOHO 6 too -HO
TO TO oo 3 σι :ns nj ί1 3 o cnsnSrHpoo E< ji H 44 H B PH 4KN El TOH Ph o OOOO o ο ι—ι cm co Hj· in co co co co co co
I I I I I I
£ |j & & £ 18 69096 h h j^1 + + + + + + + + + + +
»H
H
Λ -3
i—I -P
$ ^ + + + + + + + + + + + G Q> M p "<5
0 I
1 sf
2? .9 aT
•P I
ja S si 3 ή -2 g + + + + + + + + + + + •H :3 <35 p 2 > s .
o
CO
CM
K
•H -S
f—j 4-i §|+++++++++++ tl p ij T-lfO + + + + + + + + + + + fi S /
H NSS\V
•5 X
H >X
u x\
rg S | I I I I I
z P ,Χ -p 1/ ω/Q ooooooooooo •h / -h rHCMcoTrinoiHcMco^m
Π3/-Ρ CMCMCMCNCMCOnnrOMCO
q x i i i i i i i i i i i ι/g ββββββ&β&βέ
II
19 69096 (0 •S -3 ε >—f οι 3 n
3 E, O O O
pH I oi vo n o
® ns >10*> CN
-5 -5 -a s S laa a s s -g £8«3 . a . i a s s s s
C 01 C E I
h c+j oi ° -S ° S m -S s = -3 -5 -5 li S S -s 8 .s .s .5 8 888 Λ fi c 1 8 VI1 8 8 8 v" VM VI1 vn I 3 5 -9
-P
™ §Λ 1 g »S3 -¾ -i_> o> lo o o o o ln (0 -Spojc in o m ro oo vo vo in σν .u R tn -p 5J cn cn cn tn g q t r c c c -5 -5 -5 -S -5 -S m
H U«8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 S
•H f* CN-~ III 1113
Ό ·Η ϊ # I II = s -H
•h tn i movo vo o o *—i ροή in intnrHvorH «ηγμοο-η (0 0 iH :(0 en 3 3 8 3 -S -S -S -S .5 .3 -3 -3 -3 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 cj
•H
4-»
^ * 4J
O fd fd fd <d <d rd fO Λ flS 0) I *» rH pH pH pH pH pH pH pH pH 4-)
Q-ι Γ*** f0 iH (0 pH (d rH (¾ rH (d rH fQ H fd *H fd rH id Ή *H
U τνΗ -ΓΗ Ή ·ΓΗ ·Η TVH ·Γ-Ϊ·Η *ΓΗ·Η *ΓΊ ·Η *ΙΗ *Η ΤΗ ·Η u 8·η§ *8 <ο8 «ο8 «8 <ΰ8 «8 ιβ8ό8(ο8 9
C0 ρΗ<1)ρΗ(1)γΗ53ρΗ(1)ρΗ(1)ρΗ(1) pH m «Η 0) Η δ W
fd O CC «Η ·Η ιΗ *Η pH *Η pH ·Η pH ·Η γΗ ·Η pH ·Η rH ·Η pH ·Η ^^>θι g-<J3-|Jg,4J34Jf^+Jg4J ra +j d h d 4J w 4-> fd —» 3c9c3c3c§cSc § e 3 c 3 c id
H H ^ g O) - φ .. φ .. φ ·· φ « 0) .. = s 0) .. 0) ·· 0).. 4J
Φ *H 15 Ξ UBuBUBUBuäuä U £ U B U £ -P
3 iJÄw aB as aδ as ag as a8 a8 a8 ä -h id · -pm ojvo 4JVO -pm .o cr> ij o .y o -P m .p *j< > j) - tn CL·vo avo avo avo avo aoo aoo avo avo * (Oatn^d ST cg ST <N ST cn ST (N ST rs ST cn ST cn ST cn £T cn
M 01 Ql QIQIQIQIQIQl QIQIQI
+1 O 3 E tn oo en 00 tn o tn o tn oo en vo tn vo eno en m tn rH -h ή-ή Λ θ' ,ό-ττ η-rt b in Tj ή irf nm 3 D H H'' SJfN i?N al(N 2|n <! ΓΜ «J (N < ΓΝ -p 4J ^ 1 S I □ s / * tn |o
•H -H O O O O O O OOO O O
(ΰ /-P <H (N Γ0 tJ· LT) o rH CN ro >5Γ U0
C/id CN CN CN CN CN CO COfOrO ΓΟ CO
H 1 I I I I I I III I I
g/£ $%%&%%%%$%% 20 69096 Tämän keksinnön karsinostaattisten aineiden TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 ja TF-350 farmakologisia vaikutuksia on selostettu alla. Seuraavissa farmakologisis-5 sa kokeissa käytettyä koeainetta TF-210 saatiin esimerkissä 1, ainetta TF-220 esimerkissä 3, ainetta TF-230 esimerkissä 5, ainetta TF-240 esimerkissä 7, ainetta TF-250 esimerkissä 9, ainetta TF-310-1 esimerkissä 11 (1), ainetta TF-310-2 esimerkissä 18, ainetta TF-320 10 esimerkissä 12, ainetta TF-330 esimerkissä 13, ainetta TF-340 esimerkissä 19, ainetta TF-350 esimerkissä 24, ja ainetta TF-300 esimerkeissä 11 - 18.
(1) irnmunöstimuloiva aktiivisuus
Kussakin ryhmässä käytettiin kolmea ICR-kannan 15 hiirtä (naarashiiriä, 6 viikon ikäisiä). Kukin koeaine liuotettiin fysiologiseen suolaliuokseen ja 0,2 ml kutakin saaduista liuoksista annettiin hiirille vatsaontelon-sisäisesti. Kahdenkymmenenneljän tunnin kuluttua annosta hiiren häntään ruiskutettiin laskimonsisäisesti 0,2 20 ml hiilisuspensiota, jota oli valmistettu sekoittamalla 1 ml tuotetta Perikan Drawing Ink 17 Black (valmistaja Giinther-Wagner Co., Ltd.) 2 ml:n kanssa fysiologista suolaliuosta, jossa oli 3 paino-% gelatiinia, ja 1, 5, 10 ja 15 minuutin kuluttua ruiskeen annosta, 25 silmäkuopasta kerättiin 0,02 ml verta käyttämällä hepa-riinilla pinnoitettua hematocrit-kapillaaria, ja laimennettiin heti, ja punasolut liuotettiin 1,6 ml:11a 0,1-painoprosenttista natriumkarbonaatin vesiliuosta.
Tämä liuos mitattiin kolorimetrisesti aallonpituudella 30 675 nm, ja Halpern'in ym:n yhtälöä käyttäen määritettiin fagosytoottinen indeksi (K-arvo).
Kontrolliryhmän hiirille annettiin 0,2 ml fysiologista suolaliuosta.
II
21 69096
log Cn - log C
K = -t“="t- r r0 jossa Cq = veren hiilijauhepitoisuus ajankohtana tg, ja C = veren hiilijauhepitoisuus ajankohta-5 na t.
Tulokset on esitetty taulukoissa 3-5.
22 6 9 0 9 6
Taulukko 3
Aine Annostus Keskimääräinen K-arvo
Aine (mg/kg) mn ?Ίη 3 0,1155 ± 0,0273 iF"21D 6 0,1198 ± 0,0231
Tp P?n 1,5 0,1087 ± 0,0346 3 0,1292 ± 0,0289 mp ppn 5 0,1028 ± 0,0175 3 10 0,1194 ± 0,0334 TF_2i,0 ' 5 0,1109 ± 0,0250 U 10 0,1127 ± 0,0496
Tp ρςη 5 0,0865 ± 0,0131 5 10 0,1120 ± 0,0329
Kontrolli - 0,0348 ± 0,0037
Taulukko 4 m, . Annostus Äin© (mg/kg) Keskimääräinen K-arvo ,Tp pin i 0,1 0.0580 ± 0,0088 1F-31U-1 ! 0.0776 ± 0,0168 mp ppn 0,1 0.0468 ± 0,0123 ii?“3 U 1 0.0715 ± 0,0040 mp 0,1 0.0601 ± 0,0098 TF“330 1 0.0965 ± 0,0102
Kontrolli - 0.0295 ± 0,0007
Huomautus: * Koe suoritettiin ryhmällä, jossa oli 4 hiirtä.
Il 23 69096
Taulukko 5
Ainp Annostus „
Aine (mg/kg) Keskimääräinen K-arvo 5 0,-1292 ± 0,0229 TF-340* 10 0,1001 ± 0,0295 5 0.0817 ± 0,0002 TF-350 10 0,1453 ± 0,0229
Kontrolli - 0f0408 ± 0,0016 -1-:--1
Huomautus: * Koe suoritettiin ryhmällä, jossa oli 4 hiirtä.
24 69096 (2) Karsinostaattinen aktiivisuus (i) Kasvaimen vastainen aktiivisuus Ehrlich'in vesivatsakasvainta vastaan.
Ehrlich*in vesivatsakasvainsoluja istutettiin 5 vatsanontelonsäisäisesti ICR-kannan hiiriin (naaras- hiiriä, 6 viikon ikäisiä) määrin 1 x 10^ solua hiirtä kohden. Sen jälkeen kutakin koeainetta liuotettiin fysiologiseen suolaliuokseen ja 0,2 ml kutakin saatua liuosta annettiin vatsaontelonsisäisesti hiirille ker- 10 ran päivässä seitsemänä perättäisenä päivänä kasvainsolu- jen istuttamisen jälkeisestä ensimmäisestä päivästä alkaen. Kontrolliryhmille annettiin samalla tavalla kuin edellä 0,2 ml fysiologista suolaliuosta.
Tulokset on esitetty taulukoissa 6 ja 7.
15 Päivien lukumäärä, joiden ajan koeainetta T/c = saaneen ryhmän hiiret säilyivät hengissä χ ^qq Päivien lukumäärä, joiden ajan kontrolliryhmän hiiret säilyivät hengissä li 25 69096
I I
•H I H
§ $ ° °
(Η .Ο I—I H CO CO CO OO OO CO COCO CO
^x w w w \ “ .g r—vo h in t~- c-- cm un cm un o 51¾ tn to
>ι·Η C
gg s , s S ojs
•n c rH flj 5i rH
ft φ :3 a+J ° ° „
> _ -C H H COOO COCO QOOO CO CO OO
•H (I) p \ \ V v \ v \ v v v v ® :S 00 ™ ^ t>. o- mtn C\?ir; o o S :(0
on Φ Ό B
p ^ -H on inm t-—co oo vo hoo o \vo un cor— c—vo ooc\j un o
^ ^ >HrH HH H H HH H H rH
ΛΛ Λ Λ ΛΑ Λ A ΛΛ VO---------
O
3 C
•5
2 > t(0 0- ON H OO OOVO NO UN UN VO
·*- ·- a,
c:Q,-H 0-=r UN CM
g -g CU +l +l +l +l +l +l +l +1 +1 +1 +1
"vjw'IO ^ 00 CD H ONOO CNJ UN OOVO CO
:m &:rä f—vo CM on Onoo 0O-=r O vo ' vo
E (0 :nj CMCVl Ovi CNJ CM CNJ CMCU CMCM rH
'3 $ 5 ΛΛ ΛΛ ΛΛ ΛΛ ΛΛ ω ο Μ Φ γ~3 ^3
« 0) rH
s •m 3 g f E 0~-O~ 0- 0-- 0— C— o·- (r-
wx? * * * x ** XX XX I
2 O>!(0 C—UN OO UN rH UN rH UN rHUN
Q O O OO OH
o O O O o .
Ή CM OO -=r UN 2
<M CNJ CM CM CM i-H
dj · I I I I p
g (¾ Cl. fc fc, H
| ^ Eh EH £ £ I
_69096 26
I I
3¾ § Jj :j0 äw:ra coco coco oooo oooo coco oo ε w w w \ \ w -*.
•SSc t"- c*- r~- c— ir\ in oco o 01 TD δ >,·Η S :SF α> ·η Ε-ι C! Ή S 5) ·Η ίο &Ιη \\ \\ \\ ^ ^ " -^·Μ3 C t C— C— C-- in O CO o H (o O m a «
o 5 S S
ro 0) Ό C
cm c^- c^-md oo m r—σ\ o
\ON C--MD f-C»- MD r-H C— O
HH HH H H rH rH HH i—1 ΛΛΛΛΛΛΛΛ Λ
JL
H LPiOO VO tJ\ VO in.=l- rHO m
g fc ^ w ° ° ^·”σΓ ^o“ cvT
S ä —· +l +l +l +l +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 00 >1 ^ -¾ £ "2 camd oh 00 md eno mdo oo 9 % Si ^70° σ7σ7 coV o^o” md”
•5 H M g ™ CM CM CM CM CM CMCM rHOO rH
3 ^§1 ΛΛΛΛΛΛΛΛ Λ rH qh3 3 « Φ Ή (0 __
Eh--------
S
o 2 C'-·η* o— e r- o- e— e— [v_ nj~ x x xx xx χ χ * * , wx’h £^ή in rH h in ,-h in |£| 6
)—I I
O O O o O
H cm on lp\ 3 en on on on on n
i S & £ & £ . I
27 6 9 0 9 6 (ii) Kasvaimen vastainen aktiivisuus sarkooma-180-soluja vastaan (a) Sarkooma-180-soluja istutettiin vatsaonte-lonsisäisesti ICR-kannan hiiriin (naarashiiriä, 6 vii-5 kon ikäisiä) määrin 1 x 10^ solua hiirtä kohden. Sen jälkeen kutakin koeainetta liuotettiin fysiologiseen suolaliuokseen ja 0,2 ml kutakin saatua liuosta annettiin vatsaontelonsisäisesti hiirille kerran päivässä seitsemänä perättäisenä päivänä syöpäsolujen istuttamisen 10 jälkeisestä ensimmäisestä päivästä alkaen. Kontrolliryhmälle annettiin samalla tavalla kuin edellä 0,2 ml fysiologista suolaliuosta. Tulokset on esitetty taulukossa 8.
28 69096
h ·—I
-m g> f8 -P :tö äwira if' if* ά in tn in in m in in m E n W \\ \ \ \\ v S S c ^ ^ ^ 1—1I IA -=T OJ o tn m 0>1 -H c 12 § i-i
§ 5j -H
•π C H fÖ ^ Ή G >i $ :rö if' if* if' if* iPif* Ain min in « S+j M \\ W \\ \x \ > £ :ra -=rin ojin -=r m rj in -=r jy o •H (Q 3 Ira & to O 3 S 8
CO Q) Ό G
P CT f? f? ^0° c—oo tn m vo oj o 22?, -a-ο σν σ\ o E-· ^ OJ 1—1 OI H H i—I CM i—li—| r-1 ΛΛ ΛΛ ΛΛ ΑΛ ΛΑ οο Ji —.
n :S ° ° ^ °ο o o oj m 'o -S ä +l +l +l +l +l +l +1 +1 +1 +i +i
Eh ’Sm1»! ojo m o ojoo -=r o o-=r co f a*S iTrS, ^°° ή o noo jt" •h«‘1 ™ °° oj m ojoj oj en «nj oj m M M 3 ΛΛ ΛΛ aa aa aa' las
K 0) H
S
•o o g 1 e e t—o— e—O- t—f— wxS * * * * * * * * * * i 2 tjiis a e·- min —iin r-iin r-iin tn M e ~ - * 1^1 on oh O O O O o ^ ή oj my m d °J oj c\j nj oj n „'11110 S ^ fc fcj -p
B ^ E-ι Eh eh S
-..< 11 I « li 29 69096 (b) Sarkooma-180-soluja istutettiin nahan alaisesti ICR-kannan hiirien (naarashiiriä, 6 viikon ikäi- 7 siä) kainalokuoppaan määrin 1 x 10 solua hiirtä kohden. Sen jälkeen kutakin koeainetta liuotettiin fysiologiseen 5 suolaliuokseen tai 5 %:iseen glukoosin vesiliuokseen ja 0,2 ml kutakin saatua liuosta annettiin laskimonsisäisesti tai lihaksensisäisesti hiirille kerran päivässä seitsemän perättäisenä päivänä syöpäsolujen istuttamisen jälkeisestä ensimmäisestä päivästä alkaen. Kontio rolliryhmille annettiin samalla tavalla kuin edellä 0,2 ml 5 %:ista glukoosin vesiliuosta tai fysiologista suolaliuosta. Tulokset on esitetty taulukossa 8-(2).
30 69096
✓—N N
^ |
Eh h H
2 3 £ ^ ^ 00 C\JCVJOVO\O^D rHON
~ Ί. ^ ^ ^ ^ °i. 3L ™ ™ ™ ^
o O O O O O OOJOOOOOO
+l +' Ή +l +l +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +, fÖ CT\ U3 . LH -=r O f^COj3-|v_rTsfv-\_i,«_ ft c\j co -sr m in ό f^ONvonDoornonj ö .— *· ^ g O OrHrHm r-\ OJ^TC\JC\Jf\JH1Hin g ui 8
& I
5 I
T
00 Ω g Jrt ^ 3 (0 I ^ I w
I 1.5 s I
O -H C 8 rH
•n+) -H _ _ l to .ti g* " " s fi s 8 s s s B s s s
<1) -P ft i S -H
-P Q O W 1 C IH
ω -h w 9 f <#> « ^ M I »«5 ~x I------------ S', I>-C- t- t- t'- C- t-~ Γ— c— t— Γ— S? X * , * * x X x * «IXX X X | i—l LPi x
H —J i , O O fH IT\ I
ΉΗ r-1 r—I rH rH rH (H O O O O rH
u) HS w *“ ^ * ·»* _ ä §1 ° ° ! o o o o o o o o o fcj -Γ-» - ---- , _ . , _____ _ _ t __ lyt <JS > j= I > ε > E I > g Π ·Π H Ή -H -H -h ° 3 o 3 2 ^ä"
8 ? f 7 I 7 S
1 S UI g! lii S |fi 69096 31 ·«
CN
0 H
:r0 m
c I
1) fc) c O -P Eh Q) on ο β oi H W <0 h £ ·(-> g <D (Ö 10 β -P -P ·· -P -H O 0
--<U CM +J
BO) (11 1 ·Η (ΰ Pn
•H Et G
n a) ,¾ 4J -n 0 o- 0 p 3 0 M 0 O O -P <C to +. +, £ · s Π3 C 00
CO CO m ^ V
»η «λ d) I
-p ,* «J
Γ-, ^rr -P Ή £ ·Η :(0 0 0 -m o to
0 G P Q> (0 /0 to W
•p -H i—I g «0 ---- (0 nj β to +) :nj O -P > 3 -H G -P W ·· W £L| •S V 'H .
55 o e Tf
8 '—I 1) H
_ö m -rt 3 I 0 (0
^ fcl I—I -H
01 £ En O to
c § : w X
5 .3 -P I o
0 H OOH
• •H > 00 0
** K P H -P
“S ” i,*.
—.---P £ :<tS
>1 O >
C_ -P 0 W
* -P P -P
H «3 H
_j tn to to _ o <u · o wc -—-- W C «0 Φ
H 'M3 -p Φ H > H ,¾ e (1) H (Ö H
Ό W to :<tj W ft O Ή -r-- ™ ' Ή
I rH
O H
ä B
1 c & |fi 32 69096 (iii) Kasvaimen vastainen aktiivisuus Ehrlich1in kiinteätä kasvainta vastaan.
Ehrlich*in kasvaimen soluja istutettiin nahan alaisesti ICR-kannan hiirten (naarashiiriäf 6 viikon 5 ikäisiä) kainaloon määrin 4 x 10^ solua hiirtä kohden.
Sen jälkeen kutakin koeainetta liuotettiin fysiologiseen suolaliuokseen tai 5 %:iseen glukoosin vesiliuokseen ja 0,2 ml kutakin saatua liuosta annettiin vatsa-ontelonsisäisesti hiirille kerran päivässä seitsemänä 10 perättäisenä päivänä kasvainsolujen istuttamisen jälkeisestä ensimmäisestä päivästä alkaen, tai kerran joka toinen päivä 10 päivän ajan alkaen kahdeksannesta päivästä kasvainsolujen istuttamisen jälkeen. Kontrolliryhmille annettiin samalla tavalla kuin edellä 0,2 ml 15 fysiologista suolaliuosta tai 5 %:ista glukoosin vesi-liuosta. Määritettiin kunkin kasvaimen paino. Kasvaimen painon määrittäminen suoritettiin mittaamalla suurin läpimitta (a mm) ja pienin läpimitta (b mm) mitta-harppien avulla, ja sijoittamalla saadut arvot a:n 20 ja b:n paikoille seuraavassa yhtälössä: 2
Kasvaimen paino = £- (mg)
Tulokset on esitetty taulukoissa 9-(l) ja 9- (2) .
25 33 69096 - c^ooru C\JOO σ\ σ\ σ\ KO t~~ o \vt CMmMD^roncMir\un.=r.g-o
H w rH
3K " ----------- =? M , Λ CM VO LT\ Ό ,_< Ό -^-
C^ONfHCMOJVOt^VOOOJrH
OiHOJrHiHOOiHrHrHrH
:(0 c Ä +l +I +l +l +i +i +i +i +i +i +i > 33 tn h p voouOCT\m^rt^-c\iocr\(\i ΛΑΟ co o o o r-t rHco h -5 'HOU-^-OJOJCM^j-^-rOo^Tus*
[a a, I I I
* !π n T « ^ O' CM ·>
Q MD
5 ;[0 * *X t> i—I * H Sj 10 :S> E-i 43 -!h pr s s § •ΓΊ 2 t c— c— e— t— t^- c— c— c— t—
S *XXXXXXXXX I
3^:¾ LAO-rOMDOOOOOO
4-> tT> :(Q ' Ή CM f-H CM r-t CM
w \ B °° I si ° ° O o o Ih ^ cm on .=r un ή
CM CM CM CM ai P
0) & Γ Γ1 1 1 5
ti ε-c Eh Eh Eh Q
34 r—τ—690 9 6 " 3 ^ ·Ρ ιβ ΪΛ -P ti m o w o m o +J w 0 .H O * ^ 3 0
En -H 3 i—t Ή
rH •H
-H ti O ·Η
•H 0) +J
* ti +> * <u
---3 -P
£ M rt
<1) rH
CU I
3« O
►> i—I iH
:d Λ rt m g 9 -n i Λ Ή t°\ h 3 3 O O ti En 01 a - - <u co rr _ c\i ro in nt ii
Ci S *=. -P CO
1 g -S +i +i ti -P ^ <n -h -H O) o _ Λ oo O -H 4J 3
9 K 1 t— C'- -p O -H
2 Λ - - -P 3 Ή
^ S -=r oo QJ E-t -H
H -P oi
3 >i · CU
Λ rt G >
^ Λί <D
<U C
- ----- o CO -H
in x co «vo 700 ? 3 1-1 i 3 i . d « H rH 3 -
/5 λ jrr fö »H
f 00 m 1 o 01 ti , « o 3 nj <3 rt' ο, ή co co > ™ ro co rl· r_* ICO) :m &h <u 01 ---Ei__ En ω -h 1 K +)
Q rt (β -H +J
£.¾ ir\ -P to C! § rt -H O 0)
1 CU rH CO
01 x 3 * 1 -p O O
2 rr.'S -p Ή U
U* H g 5, P* ggg EH m (¾ M-» .·
CO
----3
rH -P
I -H 3 O rH (0
rH H E
* ? i § ä 1 ® 35 6 9 0 9 6 (iv) Kasvaimen vastainen aktiivisuus B-lb-mela-nooma-soluja vastaan (a) B-16-melanooma-soluja istutettiin nahanalai-sesti BDF,-kannan hiirien (uroshiiriä, 7 viikon ikäisiä) g 5 kainaloon määrin 1 x 10 solua hiirtä kohden. Sen jälkeen kutakin koeainetta liuotettiin fysiologiseen suolaliuokseen ja 0,2 ml kutakin saatua liuosta annettiin vatsaontelonsisäisesti hiirille kerran päivässä seitsemänä perättäisenä päivänä kasvainsolujen istuttamisen 10 jälkeisestä ensimmäisestä päivästä alkaen. Kontrolliryhmille annettiin samalla tavalla kuin edellä 0,2 ml fysiologista suolaliuosta. Kasvainten painot määritettiin 17. tai 23. päivänä kasvainsolujen istuttamisen jälkeen. Määritysmenetelmä oli sama kuin edellä kohdas-15 sa (iii). Tulokset on esitetty taulukossa 10.
69096 ' 36 0 in e «n <l)
1 W
Ph -H G
HE +J
------T----______ <0 iH
I -P (0
P (AG
_ 0 3 O CU
** tH 4J (A
<N (A r—I -H
i -h i g => nj o- o— f"- crv^r c\j oo o on o Ph o m
O ^ 0-00 VO ΙΠ O VO o En g iH 4J
rH I—| Φ O -p ε-1 c -o i g
<D 3 Ph -P
Ό H En (A
—-—------- -HO -H
<D (A g
.L -P C (D G
:3 -p -H <D O
p O (0 -P -r-ι :<g 3 > -P 3
•Si ·Ρ (A 0 H
.5 CT\i—I ^03 lOifl OOrH ·β 3 0 X cv co vo o c\j on t— md vo vo in -P M -P w
tn -—- *· — - — ··-·. «- -- _ cq O G
Φ O1 OCVOOr-IcHr—lOOOrH W G ·*β O Ή ' ** Q *P 3 G (0 CO +1 +1 +1 +1 +| +| +1 +1 +| +| +| +| 5 :J0 •'j >
flj 2 CU fu CO
3 5 ‘3 ^-ovJOvHHoooo-invoono ,, J CU ro ^ «a 9. °^°_ ^ ^ o_ % q * wc ononononon on-=r cv oj .=r cv -=r” -ho C ? 3 ä c ·*β >-H -h aö H P aO S>
2 :3 C P -H
fi »0 -P :n} aö ^ E -H rt Λ •H -P g S* -P -Pm _ wo) λ; (n ‘f? Φ -P w
P o- t—O- O-C— t—t— O-1— [- ^ ’p X -H
ΧΧΧΧΧΧΧχχ | X I φίίο C £ W X m jj c φ λ» j» #
5 trim un m m o in o in o on ö C E © C
(ö y g , 1-1 H --1 Ή ID O Ή 4J ]J
0^3 ^ 3 -P O <0 -H <D
S 51¾ > rH Λ- > p X
S 2 (A (¾ iH W ao f—I
^ m w ao g aö aö --------5>_ « O -m « g -n
, <H
I W
oo o o O I -p O -p 3 Ήον on^r m !~j pH !Τ! P „4 °i Ί ™ Λ) i n °ο "o 3 SS r' 1 1 1 I P I P 10 .5 fcfc fc ti, &, p &, P g < ^E-1 Eh Eh Eh' g 6-1 fi g
_L__J_____*___& EC
69096 (b) B-16-melanooma-soluja istutettiin nahanalai-sesti BDF,-kannan hiirien (uroshiiriä, 6 viikon ikäisiä) g kainaloon määrin 1 x 10 solua hiirtä kohden. Sen jälkeen koeainetta liuotettiin 5 %:iseen glukoosin vesi-5 liuokseen ja 0,2 ml saatua liuosta annettiin samanaikaisesti kasvaimensisäisesti ja vatsanontelonsisäisesti kerran joka toinen päivä 12 päivän aikana alkaen 13 päivästä kasvainsolujen istuttamisen jälkeen. Kontrolliryhmän kullekin hiirelle annettiin samalla tavalla 10 kuin edellä 0,2 ml 5 %:ista glukoosin vesiliuosta. Tulokset on esitetty taulukossa 10-(2).
38 69 096 0 o o vo -=r on o \ in n in t— m o
E·4 rH
ΓΠ OJ \Q -=T OO o f'J C— oj - OJ PO · oo o o o o o o*" —^ § fr +> +1 +1 +1 +1 +| CN £ — 1 '3 _ ^ 00 'O rH CM on o PQctnocm en <j\ oo 1—I fij .3 _ * * ·“ — r- «.
Λ kj rö =*· on -a· h Lrn ^ «ft -d -p a
2 J. ,r4 ·Η + ·Η H
Eh -Ö 0) ^ λ. ^ ^ /~^—\ f X 5 vä s § S -5 VO ·Η “ ^ * x xx la
S& ° o ^ o I
8 .8 rH LP, O O rH q 1 g .g --—-:- & cv - o pe
rH P P
m o 5 a ' S s
Ml & 1 g I 2 39 69096 (3) Akuuttinen toksisuus LDcn-arvot hiirien (ICR-kantar naarashiiriä, 50 6 viikon ikäisiä, anto laskimoruiskeena) osalta on esitetty taulukossa 12.
Taulukko 12
Aine ^^50 _ ___^_ _______ » TF-210 >100 j TF-220 >200 TF-230 >100 TF-240 >200 TF-250 >200 TF-300 > 10 TF-340 >200 TF-350 >200 40 69096
Kuten edellä mainittujen farmakologisten kokeiden perusteella on ilmeistä, tämän keksinnön TF-2-aineet ovat käyttökelpoisia karsinostaattisina aineina, niiden voidaan odottaa olevan aktiivisia erilaisia 5 syöpätauteja vastaan, ja niiden voidaan odottaa olevan huomattavan aktiivisia erityisesti kiinteitä syöpiä vastaan. Kaikilla tämän keksinnön TF-2-aineilla on erinomaisia vaikutuksia.
Tämän keksinnön TF-2-aineita voidaan käyttää 10 sen jälkeen kun niistä on valmistettu erilaisia farmaseuttisia muotoja kuten suun kautta annettavia lääkkeitä, ruiskeita, peräpuikkoja tai näiden kaltaisia lääke-muotoja, joskin niitä käytetään lähinnä farmaseuttisina ruiskemuotona. Kun niitä käytetään suun kautta annetta-15 vina lääkkeinä, suun kautta annettavat lääkkeet voivat sisältää erilaisia apuaineita, ja ne voivat olla valmistettuja kapselien, tablettien, jauheen, tai rakeiden muotoon. Kun niitä käytetään ruiskeina, ruiskeet voivat olla mitä tahansa ihonalaisesti annettavia ruis-20 keitä, lihaksensisäisesti annettavia ruiskeita ja laskimoon annettavia ruiskeita, ja niitä käytetään suspensiona, liuoksena tai jauheena, joka on liuotettuna suolaliuokseen tai liuokseen, jossa on glukoosia tai paikallispuudutusaineita, milloin niitä käytetään.
25 Tämän keksinnön TF-2-aineiden ZJT-210, 220, 230, 240, 250, 300 (310, 320, 330), 340 ja 35Q7 annostus valitaan sopivaksi riippuen potilaan tilasta, joskin yleensä, on toivottavaa antaa niitä täysikasvuiselle annoksena, jonka määrä on 0,005-50 mg/kg kerran 30 päivässä tai useina kertoina päivän kuluessa annettaessa, ja antomenetelmän ollessa kysymyksessä, niitä annetaan lähinnä ihonalaisena, lihaksensisäisenä tai laskimonsisäisenä ruiskeena tai ruiskeena tautikohtaan.
Tätä keksintöä selostetaan edelleen yksityiskoh-35 taisesti seuraavassa viittaamalla esimerkkeihin ja
It 41 69096 oheisiin piirroksiin, joissa piirroksissa kuva 1 esittää mikroskooppista valokuvaa, josta ilmenee tässä keksinnössä käytetyn Fusobacteriam nucleatum TF-031:n muoto; 5 kuva 2 esittää infrapuna-absorptiospektriä karsinostaat-tisesta aineesta TF-210, jota on saatu alla seuraavas-sa esimerkissä 1; kuva 3 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorptio-spektriä; 10 kuva 4 esittää infrapuna-absorptiospektriä karsinostaat-tisesta aineesta TF-220, jota on saatu alla seuraavas-sa esimerkissä 3; kuva 5 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorptio-spektriä; 15 kuva 6 esittää infrapuna-absorptiospektriä karsinostaat-tisesta aineesta TF-230, jota on saatu alla seuraavas-sa esimerkissä 5; kuva 7 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorptio-spektriä; 20 kuva 8 esittää infrapuna-absorptiospektriä karsinostaat-tisesta aineesta TF-240, jota on saatu alla seuraavas-sa esimerkissä 7; kuva 9 esittää mainitun aineen uitravioletti-absorptio-spektriä; 25 kuva 10 esittää infrapuna-absorptiospektriä karsino-staattisesta aineesta TF-250, jota on saatu alla seu-raavassa esimerkissä 9; kuva 11 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorp-tiospektriä; 30 kuva 12 esittää infrapuna-absorptiospektriä karsino-staattisesta aineesta TF-310, jota on saatu alla seu-raavassa esimerkissä 11; kuva 13 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorp-tiospektriä; 35 kuva 14 esittää mainitun aineen suurtehonestekroma-togrämmiä; 42 69096 kuva 15 esittää infrapuna-absorptiospektriä karsino-staattisesta aineesta TF-320, jota on saatu alla seu-raavassa esimerkissä 12; kuva 16 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorp-5 tiospektriä; kuva 17 esittää mainitun aineen suurtehonestekromato-grämmiä; kuva 18 esittää infrapuna -absorptiospektriä karsino-staattisesta aineesta TF-330, jota on saatu alla seulo raavassa esimerkissä 13; kuva 19 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorp-tiospektriä; kuva 20 esittää mainitun aineen suurtehonestekromato-grämmiä; 15 kuva 21 esittää infrapuna-absorptiospektriä karsino- staattisesta aineesta TF-330 (puhdistettu), jota on saatu alla seuraavassa esimerkissä 13; kuva 22 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorp-tiospektriä; 20 kuva 23 esittää infrapuna-absorptiospektriä karsino- staattisesta aineesta TF-310 (puhdistettu), jota on saatu alla seuraavassa esimekissä 18; kuva 24 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorp-tiospektriä; 25 kuva 25 esittää mainitun aineen suurtehonestekromato- grämmiä; kuva 26 esittää infrapuna-absorptiospektriä karsino-staattisesta aineesta TF-340, jota on saatu alla seuraavassa esimerkissä 19; 30 kuva 27 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorp-tiospektriä; kuva 28 esittää mainitun aineen suurtehonestekromato-grämmiä; kuva 29 esittää infrapuna-absorptiospektriä karsino-35 staattisesta aineesta TF-350, jota on saatu alla seuraavassa esimerkissä 24;
II
69096 kuva 30 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorp-tiospektriä; kuva 31 esittää mainitun aineen suurtehonestekromato-grämmiä.
5 Esimerkki 1 (1) 10 litran käymisastiaan (valmistaja Marubishi Rika Kenkyusho) pantiin 8 litraa TF-e-viljelyväliai-netta, jossa oli 17 g tryptikaasi-peptonia, 10 g sydän-infuusiota, 3 g hiivauutetta, 7,5 g natriumkloridia, 12 g glukoosia, 10 g laktoosia, 0,1 g natriumsulfiittia ja 0,5 g natriumtioglykolaattia litraa kohden tislattua vettä. Viljelyväliainetta . steriloitiin 30 min. 120°C:ssa. Viljelyväliaineen jäähdyttämisen jälkeen sen läpi johdettiin typpikaasua nopeudella 100 ml/min tunnin ajan. Tähän viljelyväliäineeseen istutettiin 1 litra Fusobacterium nucleatum TF-031:n (FERM-5077, ATCC-31647) esiviljelmäliuosta, jota oli valmistettu aikaisemmin viljelemällä sitä TF-e-viljelyväliainee-sa, jonka kokoomus oli sama kuin edellä. Soluja viljel-20 tiin 3 päivää 37°C:ssa sekoittaen (30 kierr./min.) johdettaessa typpikaasua nopeudella 65 ml/min. Viljelyn jälkeen viljelmään lisättiin 160 g Celite'ä ja 80 g selluloosajauhetta ja seosta sekoitettiin ja se suodatettiin vakuumissa, jolloin saatiin 7,8 litraa baktee-25 ritonta viljelmän pintanestettä.
(2) 7,8 litraan edellä mainittua pintanestettä lisättiin 117 ml väkevää suolahappoa pintanesteen pH:n säätämiseksi arvoon 2,0, minkä jälkeen siihen lisättiin 11,7 litraa etanolia, jolloin muodostui 60 % sinen 30 etanolin vesiliuos, jonka annettiin sitten olla paikoillaan 24 tuntia 4°C:ssa. Sen jälkeen pintaneste poistettiin dekantoimalla ja jäljelle jäänyt osa sentri-fugoitiin (6 x 10^ kierr./min. 5 min.) 4°C:ssa sakan kokoamiseksi talteen. Tämä sakka pestiin 400 ml:11a 35 60 %:ista etanolin vesiliuosta, jonka pH oli 2,0, 400 ml:11a etanolia, 200 ml:11a asetonia ja 200 ml:11a 44 6 9 0 9 6 dietyylieetteriä, tässä järjestyksessä, ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 3,9 g jauhetta.
(3) Edellä kohdassa (2) saatu jauhe suspendoi-tiin 25 ml:aan vettä. Saadun suspension pH säädettiin 5 välille 7,5-8,0 lisäämällä 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta, ja kun oli sekoitettu 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, siihen lisättiin 1-norm. suolahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 4,0. Sen jälkeen, kun oli sekoitettu 2 tuntia jäillä jäähdyttäen, seos sentrifugoitiin 4 10 (1 x 10 kierr./min., 10 min.) sakan erottamiseksi pin- tanesteestä. Tämä sakka pestiin 10 ml:11a vettä, jonka pH oli 4,0, ja sakka erotettiin pesunesteestä sentrifu-goimalla (1 x 10^ kierr./min. 10 min). Pesuneste ja edellä mainittu pintaneste yhdistettiin ja sitä käsitel-15 tiin esimerkissä 9 selostetulla tavalla. Sakka pestiin 10 ml:11a etanolia ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 1,5 g karsinostaattista ainetta TF-210.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-210 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infrapuna-20 absorptiospektri ja ultravioletti-absorptiospektri on esitetty vastaavasti kuvioissa 2 ja 3.
Esimerkki 2 (1) 10 litran käymisastiaan pantiin 8 litraa TF-d-viljelyväliainetta, joka sisälsi 17 g tryptikaasi-25 peptonia, 20 g sydäninfuusiota, 3 g hiivauutetta, 7,5 g natriumkloridia, 12 g glukoosia, 10 g laktoosia, 0,1 g natriumsulfiittia ja 0,5 g natriumtioglykolaattia litraa kohden tislattua vettä. Viljelyväliainetta steriloitiin 30 min. 120°C:ssa. Viljelyväliaineen jäähdyt-30 tämisen jälkeen sen läpi johdettiin typpikaasua tunnin ajan nopeudella 100 ml/min. Tähän viljelyväliaineeseen istutettiin litra Fusobacterium nucleatum TF-031:n (FERM-5077, ATCC-31647) esiviljelmäliuosta, jota oli valmistettu aikaisemmin viljelemällä sitä TF-d-vilje-35 lyväliaineessa, jonka kokoomus oli sama kuin edellä.
45 69096
Soluja viljeltiin 3 päivää 37°C:ssa sekoittaen (30 kierr./ min) johdettaessa siihen typpikaasua nopeudella 65 ral/min. Viljelyn jälkeen vil je.i mäliuokseen lisättiin 160 g Celite'ä ja 80 g selluloosajauhetta, ja saatua seosta 5 sekoitettiin ja se suodatettiin vakuumissa, jolloin saatiin 7,8 litraa bakteeritonta viljelmän pintanestettä.
(2) 7,8 litraan edellä kohdassa (1) saatua pintanestettä lisättiin 117 ml väkevää suolahappoa pinta-nesteen pH:n säätämiseksi arvoon 2,0. Sitten pintanesteseen 10 lisättiin 11,7 litraa etanolia, jolloin muodostui 60 %:ista etanolin vesiliuosta, jonka annettiin sitten olla paikoillaan 24 tuntia 4°C:ssa. Sen jälkeen pintaneste poistettiin dekantoimalla, ja jäljelle jäänyt osa sentrifugoi-tiin (6 x 103 kierr/min., 5 min.) 4°C:ssa sakan ottami-15 seksi talteen. Tämä sakka pestiin 400 ml:11a 60 %:ista etanolin vesiliuosta, jonka pH oli 2,0, 400 ml:11a etanolia, 200 ml:11a asetonia ja 200 ml:11a dietyyli-eetteriä, tässä järjestyksessä, ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 4,5 g jauhetta.
20 (3) Tätä jauhetta käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 1 (3), jolloin saatiin 1,6 g karsino-staattista ainetta TF-210.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-210 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infrapuna-25 absorptiospektri ja ultravioletti-absorptiospektri olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 1 saatujen spektrien kanssa.
Esimerkki 3 (1) 10 litran käymisastiaan pantiin 8 litraa 30 TF-e-viljelyväliainetta, jonka kokoomus oli sama kuin esimerkissä 1. Viljelyväliainetta steriloitiin 30 minuuttia 120°C:ssa. Viljelyväliaineen jäähdyttämisen jälkeen sen läpi johdettiin typpikaasua tunnin ajan nopeudella 100 ml/min. Tähän viljelyväliaineeeeen istu-35 tettiin litra Fusobacterium nucleatum TF-031:n (FERM-5077, 69096 46 ATCC-31647) esiviljelmäliuosta, jota oli valmistettu aikaisemmin viljelemällä sitä TF-e-viljelyväliainee-sa, jonka kokoomus oli sama kuin edellä. Soluja viljeltiin 5 päivää 37°C:ssa sekoittaen (30 kierr./min) joh-5 dettaessa typpikaasua nopeudella 65 ml/min. Viljelyn jälkeen viljelyväliaineeseen lisättiin 160 g Celite'ä ja 80 g selluloosajauhetta, ja 3aatua eeosta sekoitettiin ja se suodatettiin vakuumissa, jolloin saatiin 7,8 litraa bakteeritonta viljelmäliuoksen pintanestettä.
10 (2) 7,8 litraan edellä kohdassa (1) saatua pinta- nestettä lisättiin 117 ml väkevää suolahappoa pintanes-teen pH:n säätämiseksi arvoon 2,0. Sitten pintanestee-seen lisättiin 11,7 litraa etanolia, jolloin muodostui 60 %:ista etanolin vesiliuosta, jonka annettiin sitten 15 olla paikoillaan 4°c:ssa 24 tuntia. Sen jälkeen pinta-neste poistettiin dekantoimalla ja jäljelle jäänyt osa sentrifugoitiin (6 x 103 kierr./min. 5 min.) 4°C:ssa sakan ottamiseksi talteen. Tämä sakka pestiin 400 ml:11a 60 %:ista etanolin vesiliuosta, jonka pH oli 2,0, 400 ml: 20 11a etanolia, 200 ml:11a asetonia, ja 200 ml:11a dietyy- lieetteriä, tässä järjestyksessä, ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 4,9 g jauhetta.
(3) Edellä kohdassa (2) saatu jauhe suspendoi-tiin 49 ml:aan vettä. Saadun suspension pH säädettiin 25 välille 7,5-8,0 lisäämällä 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta, ja 30 min. huoneen lämpötilassa sekoittamisen jälkeen suspension pH säädettiin arvoon 6,0 lisäämällä 1-norm. suolahappoa. Sen jälkeen suspensiota sekoitettiin jäillä jäähdyttäen 2 tuntia, minkä jälkeen 4 30 seos sentrifugoitiin (1 x 10 kierr./min, 10 min) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Tämä.sakka pestiin 5 ml :11a vettä, jonka pH oli 6,0, ja sakka erotettiin pesunes- 4 teestä sentrifugoimalla (1 x 10 kierr./min, 10 min). Sakka pestiin 10 ml:11a etanolia ja kuivattiin vakuumissa, 35 jolloin saatiin 1,8 g karsinostaattista ainetta TF-220.
47 69096 Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-220 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infrapuna -absorptiospektri ja ultravioietti-absorptiospektri on esitetty vastaavasti kuvissa 4 ja 5.
5 Esimerkki 4 (1) 10 litran käymisastiaan pantiin 8 litraa TF-d-viljelyväliainetta, jonka kokoomus oli sama kuin esimerkissä 2. Viljelyväliainetta steriloitiin 30 minuuttia 120°C:ssa. Viljelyväliaineen jäähdyttämisen 10 jälkeen sen läpi johdettiin typpikaasua tunnin ajan nopeuden ollessa 100 ml/min. Tähän viljelyväliaineeseen istutettiin litra Fusobacterium nucleatum TF-031:n (FERM-5077, ATCC-31647) esiviljelmäliuosta, jota oli valmistettu aikaisemmin viljelemällä sitä TF-d-viljely-15 väliaineessa, jonka kokoomus oli sama kuin edellä. Soluja viljeltiin 5 päivää 37°C:ssa sekoittaen (30 kierr./ min.) johtamalla siihen typpikaasua nopeudella 65 ml/min. Viljelyn jälkeen viljelmäliuokseen lisättiin 160 g Celite'ä ja 80 g selluloosajauhetta, ja saatua seosta 20 sekoitettiin ja se suodatettiin vakuumissa, jolloin saatiin 7,8 litraa viljelmän bakteeritonta pintanestettä.
(2) 7,8 litraan edellä mainittua pintanestettä lisättiin 117 ml väkevää suolahappoa pintanesteen pH:n säätämiseksi arvoon 2,0. Sitten pintanesteeseen lisät- 25 tiin 11,7 litraa etanolia, jolloin saatiin 60 %:ista etanolin vesiliuosta, jonka annettiin sitten olla paikoillaan 4°C:ssa 24 tuntia. Sen jälkeen liuososa poistettiin dekantoimalla, ja jäljelle jäänyt osa sentrifu-goitiin (6 x 10^ kierr./min. 5 min) 4°C:ssa sakan otta-30 miseksi talteen. Tämä sakka pestiin 400 ml:11a 60 %:ista etanolin vesiliuosta, jonka pH oli 2,0, 400 ml:lla etanolia, 200 ml:11a asetonia ja 200 ml:11a dietyyli-eetteriä, tässä järjestyksessä ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 5,07 g jauhetta.
35 48 69096 (3) Näin saatua jauhetta käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 3 (3), jolloin saatiin 1,9 g karsinostaattista ainetta TF-220.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-220 5 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infrapuna-absorptiospektri ja ultravioletti-absorptiospektri olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 3 saatujen kanssa.
Esimerkki 5 10 (1) 10 litran käymisastiaan pantiin 8 litraa TF-e-viljelyväliainetta, jonka kokoomus oli sama kuin esimerkissä 1. Viljelyväliainetta steriloitiin 30 minuuttia 120°C:ssa. Viljelyväliaineen jäähdyttämisen jälkeen sen läpi johdettiin typpikaasua tunnin ajan no-15 peudella 100 ml/min. Tähän viljelyväliaineeseen istutettiin litra Fusobacterium nucleatum TF-031:n (FERM-5077, ATCC-31647) esiviljelmäliuosta, jota oli valmistettu aikaisemmin viljelemällä sitä TF-e-viljelyväli-aineessa, jonka kokoomus oli sama kuin edellä. Soluja 20 viljeltiin 2 päivää 37°C:ssa sekoittaen (30 kierr/min) johtamalla typpikaasua nopeudella 65 ml/min. Viljelyn jälkeen viljelmäliuokseen lisättiin 160 g Celite'ä ja 80 g selluloosajauhetta, ja saatua seosta sekoitettiin ja se suodatettiin vakuumissa, jolloin saatiin 7,8 25 litraa bakteeritonta viljelmän pintanestettä.
(2) 7,8 litraan edellä kohdassa (1) saatua pintanestettä lisättiin 117 ml väkevää suolahappoa sen pH:n säätämiseksi arvoon 2,0. Sitten pintanesteeseen lisättiin 11,7 litraa etanolia, jolloin muodostui 60 %: 30 inen etanolin vesiliuos, jonka annettiin sitten olla paikoillaan 4°C:ssa 24 tuntia kunnes sakka oli laskenut täydellisesti. Sen jälkeen pintaneste poistettiin dekantoimalla, ja jäljelle jäänyt osa sentrifugoi-tiin (6 x 10^ kierr./min., 5 min) 4°C:ssa sakan ottami-35 seksi talteen. Tämä sakka pestiin 400 ml:11a 60 %:ista etanolin vesiliuosta, jonka pH oli 2,0, 400 ml:11a eta- 49 6 9 0 9 6 nolia, 200 ml:11a asetonia ja 200 ml:11a dietyylieette-riä, tässä järjestyksessä, ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 2,73 g jauhetta.
(3) Kohdassa (2) saatu jauhe suspendoitiin 25 ml: 5 aan vettä. Saadun suspension pH säädettiin välille 7,5 - 8,0 lisäämällä 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta, ja suspensiota sekoitettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, minkä jälkeen siihen lisättiin 1-norm. suolahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 6,0. Sen jälkeen sus-10 pensiota sekoitettiin jäillä jäähdyttäen 2 tuntia, ja sen jälkeen sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min 10 min.) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Tämä sakka pestiin 5 ml:11a vettä, jonka pH oli 6,0, ja sakka ero- 4 tettiin pesunesteestä sentrifugoimalla (1 x 10 kierr/ 15 min., 10 min). Pesuneste ja edellä mainittu pintaneste yhdistettiin ja saadun liuoksen, sen jälkeen kun sen pH oli säädetty arvoon 4,0 lisäämällä 1-norm. suolahappoa, annettiin olla paikoillaan 12 tuntia lämpötilassa, joka ei ollut korkeampi kuin 5°C, ja sen jälkeen sentri- 4 20 fugoitiin (1 x 10 kierr/min. 10 min) sakan erottamisek si pintanesteestä. Tämä sakka pestiin 15 ml:11a vettä, jonka pH oli 4,0, ja sakka erotettiin pesunesteestä 4 sentrifugoimalla (1 x 10 kierr./min., 10 min.), ja sakka pestiin 10 ml:11a etanolia ja kuivattiin sen jäl-25 keen vakuumissa, jolloin saatiin 0,58 g karsinostaattis- ta ainetta TF-230.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-230 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infrapuna-absorptiospektri ja ultravioletti-absorptiospektri on 30 esitetty vastaavasti kuvissa 6 ja 7.
Esimerkki 6 (1) 10 litran käymisastiaan pantiin 8 litraa TF-d-viljelyväliainetta, jonka kokoomus oli sama kuin esimerkissä 2. Viljelyväliainetta steriloitiin 30 mi-35 nuuttia 120°C:ssa. Viljelyväliaineen jäähdyttämisen jäi- so 09096 keen sen läpi johdettiin typpikaasua tunnin ajan nopeuden ollessa 100 ml/min. Tähän viljelyväliaineeseen istutettiin litra Fusobacterium nucleatum TF-031:n (FERM-5077, ATCC-31647) esiviljelmäliuosta, jota oli 5 valmistettu aikaisemmin viljelemällä sitä viljelyvä^- liaineessa, jonka kokoomus oli sama kuin edellä. Soluja viljeltiin 2 päivää 37°C:ssa sekoittaen (30 kierr./min) ja johtamalla typpikaasua nopeudella 65 ml/min. Viljelyn jälkeen viljelmäliuokseen lisättiin 160 g Celite'ä 10 ja 80 g selluloosajauhetta, ja saatua seosta sekoitettiin ja se suodatettiin vakuumissa, jolloin saatiin 7,8 litraa bakteeritonta viljelmän pintanestettä.
(2) 7,8 litraan edellä kohdassa (1) saatua pinta-nestettä lisättiin 117 ml väkevää suolahappoa pintanes- 15 teen pH:n säätämiseksi arvoon 2,0. Sitten pintanestee-seen lisättiin 11,7 litraa etanolia, jolloin muodos-: tui 60 %:inen etanolin vesiliuos, jonka annettiin sitten olla paikoillaan 4°C:ssa 24 tuntia. Sen jälkeen pinta-neste poistettiin dekantoimalla ja jäljelle jäänyt osa 20 sentrifugoitiin (6 x 10^ kierr/min., 5 min) 4°C:ssa sakan ottamiseksi talteen. Tämä sakka pestiin 400 ml:11a 60 %:ista etanolin vesiliuosta, jonka pH oli 2,0, 400 ml: 11a etanolia, 200 ml:11a asetonia ja 200 ml:11a dietyy-lieetteriä, tässä järjestyksessä, ja kuivattiin vakuumis-25 sa, jolloin saatiin 3,15 g jauhetta.
(3) Edellä kohdassa (2) saatua jauhetta käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 5 (3), jolloin saatiin 0,8 g karsinostaattista ainetta TF-230. Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-230 oli tau- 30 lukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infrapuna-absorp-tiospektri ja ultravioletti-absorptiospektri olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 5 saatujen spektrien kanssa.
li 69096
Esimerkki 7 (1) 25 ml:aan vettä suspendoitiin .3,9 g jauhetta, jota oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 1 (1) ja (2). Lisäämällä 1-norm. natriumhydroksidin vesi-5 liuosta saadun suspension pH säädettiin välille 7,5-8,0, ja sen jälkeen kun suspensiota oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 30 minuuttia, pH säädettiin uudelleen arvoon 6,0 lisäämällä 1-norm. suolahappoa. 2 tunnin ajan jäillä jäähdyttäen suoritetun sekoittamisen jälkeen 4 10 suspensio sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min, 10 min) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Tämä sakka pestiin 5 ml:11a vettä, jonka pH oli 6,0, ja sakka ero- 4 tettiin pesunesteestä sentrifugoimalla (1 x 10 kierr/ min., 10 min). Tämä pesuneste ja edellä mainittu pinta-15 neste yhdistettiin ja sitä käsiteltiin alla kohdassa (2) selostetulla tavalla. Sakka pestiin 10 ml:11a etanolia ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 1,06 g karsinostaattista ainetta TF-220.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-220 20 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infrapuna-absorptiospektri ja ultravioletti-absorptiospektri olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 3 saatujen spektrien kanssa.
(2) Yhdistettyyn liuokseen, jossa oli edellä 25 kohdassa (1) saatu pintaneste ja pesuneste, lisättiin 1-norm. suolahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 4,0, ja sitten seoksen annettiin olla paikoillaan 12 tuntia enintään 5°C:n lämpötilassa. Sen jälkeen seos sentrifugoi- 4 tiin (1 x 10 kierr./min., 10 min) sakan erottamiseksi 30 pintanesteestä. Tämä sakka pestiin 5 ml:11a vettä, jonka pH oli 4,0, ja sakka ja pesuneste sentrifugoi- 4 tiin (1 x 10 kierr/min, 10 min). Pesuneste yhdistettiin edellä mainitun pintanesteen kanssa ja yhdistettyä liuosta käsiteltiin alla kohdassa (3) selostetulla ta-35 valla. Sakka pestiin 5 ml:11a etanolia ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 0,48 g karsinostaattista 52 69096 ainetta TF-230.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-230 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infrapuna-absorptiospektri ja ultravioletti-absorptio-5 spektri olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 5 saatujen spektrien kanssa.
(3) Yhdistettyyn liuokseen, jossa oli edellä kohdassa (2) saatu pintaneste ja pesuneste, lisättiin 1-norm. suolahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 2,0, ja 10 ‘seoksen annettiin olla paikoillaan 2 tuntia jäillä jäähdyttäen. Seos sentrifugoitiin (6 x 10^ kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Tämä sakka pestiin 3 mltlla vettä, jonka pH oli 2,0, ja sakka ja pesuneste sentrifugoitiin (6 x 10^ kierr/min., 10 min).
15 Pesuneste yhdistettiin edellä mainitun pintanesteen kanssa ja yhdistettyä liuosta käsiteltiin alla kohdassa (4) selostetulla tavalla. Sakka pestiin 5 ml:11a etanolia ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 0,10 g karsinostaattista ainetta TF-240.
20 Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-240 011 taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infrapuna-absorptiospektri ja ultravioletti-absorptiospektri on esitetty vastaavasti kuvissa 8 ja 9.
(4) Yhdistettyyn liuokseen, jossa oli edellä 25 kohdassa (3) saatu pintaneste ja pesuneste, lisättiin etanolia, jolloin muodostui 80 %:inen etanolin vesi-liuos, ja etanolin vesiliuoksen annettiin olla paikoillaan 12 tuntia enintään 5°C:n lämpötilassa. Saostunut 3 aine poistettiin sentrifugoimalla (6 x 10 kierr/min., 30 10 min) ja sakka pestiin 10 ml:11a 80 %:ista etanolin vesiliuosta ja 10 ml:11a etanolia, tässä järjestyksessä, ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 2,08 g karsinostaattista ainetta TF-250.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-250 35 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infrapuna-
II
53 69096 absorptiospektri ja νΰtxavioletti-absorptiospektri olivat pääasiallisesti identtiset myöhemmässä esimerkissä 9 saatujen spektrien kanssa.
Esimerkki 8 5 45 mitään vettä suspendoitiin 4,5 g jauhetta, jota oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 2 (1) ja (2). Lisäämällä 1-norm. natriumhydroksidin vesi-liuosta saadun suspension pH säädettiin välille 7,5 - 8,0, ja 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa sekoitta-10 misen jälkeen pH säädettiin uudelleen arvoon 4,C lisäämällä 1-norm. suolahappoa. Suspensio sentrifugoitiin 4 (1 x 10 kierr/min., 10 min.) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Tämä sakka pestiin 5 ml:11a vettä, jonka pH oli 4,0, ja sakka ja pesuneste sentrifugoitiin 15 (1 x 10 kierr/min., 10 min). Tämä pesuneste ja edellä mainittu pintaneste yhdistettiin ja yhdistetyn liuoksen pH säädettiin arvoon 2,0 lisäämällä 1-norm. suolahappoa, minkä jälkeen liuoksen annettiin olla paikoillaan 2 tuntia jäävedellä jäähdyttäen, ja sen jälkeen 3 20 sentrifugoitiin (6 x 10 kierr/min., 10 min) muodostuneen sakan erottamiseksi pintanesteestä. Erotettu sakka pestiin 3 ml:11a vettä, jonka pH oli 2,0, ja sakka 3 ja pesuneste sentrifugoitiin (6 x 10 kierr/min., 10 min). Saatu sakka pestiin 5 ml:11a etanolia ja kuivat-25 tiin vakuumissa, jolloin saatiin 0,12 g karsinostaattis-ta ainetta TF-240.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-240 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infrapuna-absorptiospektri ja ultravioletti-absorptiospektri 30 olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 7 saatujen spektrien kanssa.
Esimerkki 9 (1) Yhdistettyyn liuokseen, jossa oli esimerkissä 1 (3) saatua pintanestettä ja pesunestettä, li-35 sättiin 1-norm. suolahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 2,0, ja sen jälkeen seoksen annettiin olla paikoillaan 2 tun- 54 6909ο tia jäillä jäähdyttäen. Sen jälkeen seos sentrifugoi-3 tiin (6 x 10 kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Tämä sakka pestiin 3 ml :11a vettä, jonka pH oli 2,0, ja sakka ja pesuneste sentrifugoi- 3 5 tiin (6 x 10 kierr/min., 10 min). Pesuneste yhdistettiin edellä mainitun pintanesteen kanssa ja yhdistettyä liuosta käsiteltiin alla kohdassa (2) selostetulla tavalla. Sakka pestiin 5 ml:11a etanolia ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 0,11 g karsinostaattista 10 ainetta TF-240.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-240 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Infrapu-na-absorptiospektri ja ultravioletti-absorptiospektri olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 7 saatu-15 jen spektrien kanssa.
(2) yhdistettyyn liuokseen, jossa oli edellä kohdassa (1) saatu pintaneste ja pesuneste, lisättiin etanolia, jolloin saatiin 80 %:inen etanolin vesiliuos, ja etanoli liuoksen annettiin olla paikoillaan 12 tuntia 20 enintään 5°C:n lämpötilassa. Saostunut aine poistet- 3 tiin sentrifugoimalla (6 x 10 kierr/min., 10 min) ja sakka pestiin 10 ml:11a 80 %:ista etanolin vesiliuosta ja 10 ml:lla etanolia, tässä järjestyksessä, ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 2,1 g karsinostaat-25 tista ainetta TF-250.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-250 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infrapuna-absorptiospektri ja ultravioletti-absorptiospektri on esitetty vastaavasti kuvissa 10 ja 11.
30 Esimerkki 10 45 ml:aan vettä suspendoitiin 4,5 g jauhetta, jota oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 2 (1) ja (2). Lisäämällä 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta saadun suspension pH säädettiin välille 7,5-8,0, ja 35 30 minuutin sekoittamisen jälkeen huoneen lämpötilassa pH säädettiin uudelleen arvoon 2,0 lisäämällä 1-norm.suo- 55 69096 3 lahappoa. S-^os sentrifugoitiin (6 x 10 kierr/min., 10 min.) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Tämä sakka pestiin 10 ml:11a vettä, jonka pH oli 2,0, ja sakka ja pesuneste sentrifugoitiin (6 x 10 kierr/min., 10 min).
5 Tämä pesuneste ja edellä mainittu pintaneste yhdistettiin, ja tähän liuokseen lisättiin etanolia siten, että saatiin 80 %;ista etanolin vesiliuosta. Liuoksen annettiin olla paikoillaan 12 tuntia enintään 5°C:n lämpöti- 3 lassa, ja sitten sentrifugoitiin (6 x 10 kierr/min, 10 10 min) sakan talteenottamiseksi. Eroitettu sakka pestiin 10 ml:11a 80 %:ista etanolin vesiliuosta ja 10 ml: 11a etanolia, tässä järjestyksessä, ja kuivattiin va-kuumissa, jolloin saatiin 2,68 g karsinostaattista ainetta TF-250.
15 Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-250 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Sen infra -puna-absorptiospektri ja ultravioletti-absorptiospektri olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 9 saatujen spektrien kanssa.
20 Esimerkki 11 (1) 15 ml:aan vettä suspendoitiin 1,5 g esimerkissä 1 saatua karsinostaattista ainetta TF-210. Saatuun suspensioon lisättiin sekoittaen 1-norm. natrium-hydroksidin vesiliuosta suspension pH:n säätämiseksi 25 arvoon 7,8. Suspensio lämmitettiin 37°C:seen ja siihen lisättiin 15 mg tuotetta Pronase E, (Raken Kagaku'n kauppanimi; 1,000,000 tyrosiini-yksikköä/g) ja useita pisaroita tolueenia. Seoksen entsyymikäsittely tapahtui ravistamalla pH:n ollessa välillä 7,8-8,0 37°C:ssa 30 24 tunnin ajan. Käsittelyn jälkeen seos sentrifugoi tiin (4 000 kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Sakkaan lisättiin 3 ml vettä, jonka pH oli 8,0 ja seos sentrifugoitiin (4 000 kierr/min., 10 min.) sakan erottamiseksi pesunesteestä. Tämä pesu-35 neste ja edellä saatu pintaneste yhdistettiin ja siihen 56 69096 lisättiin 1-norm. suolahappoa pHsn säätämiseksi arvoon 2,0, jolloin muodostui sakkaa. Tämän seoksen annettiin olla paikoillaan 5°C:ssa 12 tuntia ja sen jälkeen sentrifugoitiin (1 x 10^ kierr/min., 10 min) sakan erot-5 tamiseksi pintanesteestä. Sakkaan lisättiin 3 ml vettä, 4 jonka pH oli 2,0. ja seos sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pesunesteestä. Tämä pesuneste ja edellä mainittu pintaneste yhdistettiin, ja tähän liuokseen lisättiin etanolia siten, 10 että saatiin muodostumaan 80 %:inen etanolin vesiliuos. Etanolin vesiliuosta sekoitettiin 2 tuntia jäillä jäähdyttäen ja sitten sentrifugoitiin (4 000 kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Sakka pestiin 5 ml:11a 80 %:ista etanolin vesiliuosta ja 5 ml:11a 15 etanolia, tässä järjestyksessä, ja sitten kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 327 mg karsinostaattista ainetta, TF-310-fraktiota.
5 ml:aan vettä liuotettiin 327 mg edellä mainittua jauhetta, ja saadun liuoksen pH säädettiin ar-20 voon 7,0 lisäämällä 1-norm. natriumhydroksidin vesi-liuosta. Näin valmistettu liuos kaadettiin kolonniin, joka oli täytetty 45 ml:11a valmistetta Amberlite IRA 400 (Rohm and Haas'in kauppanimi) esisäädettynä OH-muotoon 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuoksella. Sen jälkeen 25 kolonnin läpi laskettiin 200 ml vettä. Kaikki eluaatit yhdistettiin ja sen pH säädettiin arvoon 7,0 lisäämällä 1-norm. suolahappoa. Tämä liuos konsentroitiin vakuumissa ja suodatettiin sitten Millipore-suodattimen läpi, jonka huokosläpimitta oli 0,3 ^,um (Millipore: Japan 30 Millipore Limited'n kauppanimi) ja lopuksi jäädytyskui-vattiin, jolloin saatiin 210 mg jäädytyskuivattua karsinostaattista ainetta TF-310.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-310 011 taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet ja sen sakkaridi-35 pitoisuus oli yleensä noin 20-60 % glukoosiksi laskien.
57 69096
Tyypillisen tuotteen inirapuna-absorptiospektri, ultra-violetti-absorptiospektri ja suurtehonestekromer co-grammi on esitetty vastaavasti kuvissa 12, 13 ja 14.
(2) 50 ml:aan vettä liuotettiin 140 mg edellä 5 saatua karsinostaattista ainetta TF-310, ja saatu liuos konsentroitiin alkuperäiseen nähden konsentraatiol-taan 100-kertaiseksi käyttämällä Ultrafilter UK-50-val-mistetta (Togo Roshi Kabushiki Kaisha'n kauppanimi ultrasuodatinkalvolle, molekyylipainoja: 10 50.000). Tämä konsentraatti suodatettiin Millipore- suodattimen läpi, jonka huokosläpimitta oli 0,2 ^,m ja sitten jäähdytyskuivattiin, jolloin saatiin 88 mg puhdistettua, jäädytyskuivattua karsinostaattista ainetta TF-310. Näin saadulla puhdistetulla karsinostaat-15 tisella aineella TF-310 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet ja sen sakkaridi-pitoisuus eli yleensä noin 16-30 % glukoosiksi laskien.
Esimerkki 12 (1) 10 ml:aan vettä suspendoitiin 1 g karsino-20 staattista ainetta TF-220, jota oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 7 (1). Saatuun suspensioon lisättiin sekoittaen 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta sen pH:n säätämiseksi arvoon 7,8. Seos lämmitettiin 37°C: seen, ja siihen lisättiin 15 mg Pronase E:tä ja useita 25 tippoja tolueenia. Seoksen entsyymikäsittely suoritettiin ravistelemalla, pH:n ollessa välillä 7,8-8,0, 37°-40°C:ssa 24 tunnin ajan. Käsittelyn jälkeen seos sentrifugoitiin (4 000 kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Sakkaan lisättiin 3 ml vettä, 30 jonka pH oli 8,0 ja seos sentrifugoitiin (4 000 kierr/ min., 10 min) sakan erottamiseksi pesunesteestä. Tämä pesuneste ja edellä mainittu pintaneste yhdistettiin ja liuokseen lisättiin 1-norm. suolahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 2,0, minkä jälkeen muodostui sakkaa. Tämän 35 seoksen annettiin olla paikoillaan 5°C:ssa 12 tuntia ja 58 69096 4 sitten sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min,, 10 min) sakan erottamiseksi pintanestaestä. Sakkaan lisättiin 3 ml vettä, jonka pH oli 2,0 ja seos sentrifugoi- 4 tiin (1 x 10 kierr/min., 10 min.) sakan erottamiseksi 5 pesunesteestä. Tämä pesuneste ja edellä mainittu pinta-neste yhdistettiin ja tähän liuokseen lisättiin etanolia 80 %:isen etanolin vesiliuoksen muodostamiseksi. Etanolin vesiliuosta sekoitettiin 2 tuntia jäillä jäähdyttäen ja sitten sentrifugoitiin (4 000 kierr/min., 10 10 min.) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Sakka pes tiin 5 ml:lla 80 %:ista etanolin vesiliuosta, ja 5 ml:11a etanolia, tässä järjestyksessä, ja sitten kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 163 mg karsinostaattista ainetta, TF-320-fraktiota.
15 5 ml saan vettä liuotettiin 150 mg edellä mainit tua jauhetta ja saadun liuoksen pH säädettiin arvoon 7,0 lisäämällä 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta. Näin valmistettu liuos kaadettiin kolonniin, joka oli täytetty 25 ml:11a valmistetta Amberlite IRA 400, esi-20 säädettynä 0H-muotoon 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuoksella. Sen jälkeen kolonnin läpi laskettiin 100 ml vettä. Kaikki eluaatit yhdistettiin, ja siihen lisättiin 1-norm. suolahappoa sen pH:n säätämiseksi arvoon 7,0. Tämä liuos konsentroitiin vakuumissa 25 ja suodatettiin sitten Millipore-suodattimen läpi, jonka huokosläpimitta oli 0,3 ^um, ja lopuksi jäädytys-kuivattiin, jolloin saatiin 110 mg jäädytyskuivattua karsinostaattista ainetta TF-320.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-320 30 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet ja sen sakkaridi-pitoisuus oli yleensä noin 20-60 % glukoosiksi laskien. Tyypillisen aineen infrapuna-absorptiospektri, ultra-violetti-absorptiospektri ja suurtehonestekromatogrammi on esitetty vastaavasti kuvissa 15, 16 ja 17.
I! 35 59 69096 (2) 50 ml s aan vettä liuotettiin 100 mg saatua karsinostaattista ainetta TF-320, ja saatu liuos konsentroitiin alkuperäisestä kcr sensaatiostaan noin 100-kertaiseksi käyttämällä Ultrafilter UK-50:tä. Tämä kon-5 sentraatti suodatettiin Millipore-suodattimen läpi, jonka huokosläpimitta oli 0,2 ^um, ja sitten jäädytys-kuivattiin, jolloin saatiin 72 mg puhdistettua, jäädy-tyskuivattua karsinostaattista ainetta TF-320. Näin saadulla puhdistetulla karsinostaattisella aineella 10 TF-320 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet ja sen sakkaridipitoisuus oli yleensä noin 16-30 % glukoosiksi laskien.
Esimerkki 13 (1) 5 ml:aan vettä suspendoitiin 0,48 g karsi-15 nostaattista ainetta TF-230, jota oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 7 (2). Suspensioon lisättiin sekoittaen 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta pH:n säätämiseksi arvoon 7,8. Seos lämmitettiin 37°C:seen ja siihen lisättiin 5,0 mg Pronase E:tä, ja useita tip-20 poja tolueenia. Seoksen entsyymikäsittely suoritettiin ravistelemalla, pH:n ollessa välillä 7,8-8,0, 37°-40°C: ssa 24 tuntia. Käsittelyn jälkeen seos sentrifugoi-tiin (4 000 kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pin-tanesteestä. Sakkaan lisättiin 3 ml vettä, jonka pH 25 oli 8,0, ja seos sentrifugoltiin (4 000 kierr/min., 10 min.) sakan erottamiseksi pesunesteestä. Tämä pesuneste ja edellä mainittu pintaneste yhdistettiin ja liuokseen lisättiin 1-norm. suolahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 2,0, jolloin muodostui sakkaa. Tämän seoksen annet-30 tiin olla paikoillaan 5°C:ssa 12 tuntia, ja sen jälkeen sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Sakkaan lisättiin 3 ml vettä, jonka pH oli 2,0, ja seos sentrifugoitiin (1 x 104 kierr/ min., 10 min) sakan erottamiseksi pesunesteestä. Tämä 35 pesuneste ja edellä mainittu pintaneste yhdistettiin 60 6 9 0 9 6 ja tähän liuokseen lisättiin etanolia 80 %:isen etanolin vesiliuoksen muodostamiseksi. Etanolin vesiliuosta sekoitettiin 2 tuntia jäillä jäähdyttäen ja sitten sent-rifugoitiin (4 000 kierr/min., 10 min.) sakan erottami-5 seksi pintanesteestä. Sakka pestiin 5 ml:11a 80 %:ista etanolin vesiliuosta ja 5 ml:11a etanolia, tässä järjestyksessä, ja sitten kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 100 mg karsinostaattista ainetta, TF-330-fraktiota.
5 ml:aan vettä liuotettiin 100 mg edellä saatua 10 jauhetta ja saadun liuoksen pH säädettiin arvoon 7,0 lisäämällä 1-norm, natriumhydroksidin vesiliuosta. Näin valmistettu liuos kaadettiin kolonniin, joka oli täytetty 15 ml:11a valmistetta Amberlite IRA 400, esisäädet-tynä OH- muotoon 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuok-15 sella. Sen jälkeen kolonnin läpi laskettiin 60 ml vettä. Kaikki eluaatit yhdistettiin ja pH säädettiin arvoon 7,0 lisäämällä 1-norm. suolahappoa. Tämä liuos konsentroitiin vakuumissa ja suodatettiin sitten Millipore-suo-dattimen läpi, jonka huokosläpimitta oli 0,3 ^um, ja 20 lopuksi jäädytyskuivattiin, jolloin saatiin 70 mg jäädy-tyskuivattua karsinostaattista ainetta TF-330.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-330 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet. Tyypillisen aineen infrapuna-absorptiospektri, ultravioletti-absorp-25 tiospektri ja suurtehonestekromatogrammi on esitetty vastaavasti kuvissa 18, 19 ja 20.
(2) 50 ml:aan vettä liuotettiin 70 mg edellä saatua karsinostaattista ainetta TF-330, ja saatu liuos konsentroitiin alkuperäisestä konsentraatiostaan 30 noin 100-kertaiseksi käyttämällä Ultrafilter UK-50:tä. Tämä konsentraatti suodatettiin Millipore-suodattimen läpi, jonka huokosläpimitta oli 0,2 ^um, ja sitten jäädytyskuivattiin, jolloin saatiin 49 mg puhdistettua, jäädytyskuivattua karsinostaattista ainetta TF-330.
35 Näin saadulla puhdistetulla karsinostaattisella aineella TF-330 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja li 61 69096 sakkaridipitoisuus oli yleensä noin 16-30 % glukoosiksi laskien. Tyypillisen TF-330:n infrapuna-absorptio-spektri ja ultravioletti-absorptiospektri on esitetty vastaavasti kuvissa 21 ja 22.
5 Esimerkki 14 (1) 4,5 grammaa ainetta, jota oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 2 (1) ja (2), käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 2 (3), 7 (1) tai 7 (2), jolloin saatiin vastaavasti karsinostaattista ainetta 10 TF-210, TF-220 tai TF-230.
(2) Kohdassa (1) saatuja karsinostaattisia aineita TF-210, TF-220 tai TF-230 käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 11 (1) , esimerkissä 12 (1) tai esimerkissä 13 (1), jolloin saatiin jäädytyskuivat-15 tua karsinostaattista ainetta TF-310, TF-320 tai TF-330 vastaavien määrien ollessa 220, 120 tai 75 mg.
Näin saaduilla karsinostaattisilla aineilla TF-310, TF-320 ja TF-330 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet ja niiden infrapuna-absorptiospektrit, 20 uitravioletti-absorptiospektrit ja suurtehonestekroma- togrämmit olivat pääasiallisesti identtiset esimerkeissä 11, 12 ja vastaavasti 13 saatujen kanssa.
Esimerkki 15 1,5 grammaa esimerkissä 1 saatua karsinostaat-25 tista ainetta TF-210 käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 11, paitsi että (a) entsyymikäsittelyssä käytettiin Pronase E:n asemesta 15 mg trypsiiniä (valmistaja Difco) ja (b) 80 %:isen etanolin vesiliuoksen asemesta valmistettiin 60 %:ista etanolin vesiliuosta 30 koottaessa entsyymikäsittelyn jälkeen sakka vesiliukoisesta osasta, jonka pH oli 2. Tällä tavalla saatiin 200 mg jäädytyskuivattua, karsinostaattista ainetta TF-310.
Samalla tavalla saatiin seuraavia jäädytyskuivat-35 tuja karsinostaattisia aineita TF-320 ja TF-330.
62 69096
Karsine staattinen Trypsiini Jäädytyskuivattu karsine- _aine_staattinen aine _ TF-220 1 g 15 mg TF-320 100 mg TF-230 0,48 g 5 mg TF-330 65 mg 5 Edellä saaduilla karslnostaattisilla aineilla TF-310, TF-320 ja TF-330 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja infrapuna-absorptiospektrit, ultravio-letti-absorptiospektrit ja suurtehonestekromatogrammit olivat pääasiallisesti identtiset esimerkeissä 11, 12 10 ja vastaavasti 13 (1) saatujen kanssa.
Esimerkki 16
Karsinostaattisia aineita TF-210, TF-220 tai TF-230, joita oli saatu vastaavasti esimerkissä 1, esimerkissä 7 (1) tai esimerkissä 7 (2), käsiteltiin 15 samalla tavalla kuin esimerkissä 11 (1), esimerkissä 12 (1) tai vastaavasti esimerkissä 13 (1), paitsi että, entsyymikäsittelyn jälkeen, 80 % risen etanolin vesi-liuoksen asemesta valmistettiin 60 %rinen etanolin vesiliuos koottaessa sakka vesiliukoisesta osasta, jonka 20 pH oli 2,0. Tällä tavalla jäädytyskuivattuja karsinostaattisia aineita TF-310, TF-320 ja TF-330 saatiin vastaavasti määrin 190 mg, 98 mg ja 66 mg.
Näin saaduilla karsinostaattisilla aineilla TF-310, TF-320 ja TF-330 oli taulukossa 2 esitetyt 25 ominaisuudet, ja infrapuna-absorptiospektrit, ultra-violetti -absorptiospektrit ja suurtehonestekromato-? grammit olivat pääasiallisesti identtiset esimerkeissä 11, 12 ja vastaavasti 13 (1) saatujen kanssa.
Esimerkki 17 30 Karsinostaattisia aineita TF-210, TF-220 tai TF-230, joita oli saatu esimerkissä 1, esimerkissä 7 (1) tai vastaavasti esimerkissä 7 (2), käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 11 (1), esimerkissä 12 (1) tai vastaavasti esimerkissä 13 (1), paitsi että 35 entsyymikäsittelyn jälkeen, 80 % risen etanolin vesiliuok- 63 69096 sen asemesta valmistettiin 60 %:ista etanolin vesi-liuosta koottaessa sakka vesiliukoisesta osasta, jonka pH oli 2,0, ja sen jälkeen suoritettiin sama jatkokäsittely^)) kuin vastaavissa esimerkeissä, jolloin saatiin 5 vastaavasti 192 mg, 102 mg tai 65 mg jäädytyskuivattu-ja karsinostaattisia aineita TF-310, TF-320 tai TF-330-Näin saaduilla karsinostaattisilla aineilla TF-310, TF-320 ja TF-330 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet ja infrapuna-absorptiospektrit, ultravio-10 letti-absorptiospektrit ja suurtehonestekromatogrammit olivat pääasiallisesti identtiset esimerkeissä 11, 12 ja vastaavasti 13 (1) saatujen kanssa.
Esimerkki 18 90 litran käymisastiaan (MSJ-U2 type, valmistaja 15 Marubishi Rika Kenkyusho) pantiin TF-f-viljelyväliai- netta, jota oli valmistettu lisäämällä 70 litraan tislattua vettä 1190 g tryptikaasipeptonia, 1050 g sydän-uutetta, 210 g hiivauutetta, 525 g natriumkloridia, 840 g glukoosia, 700 g laktoosia, 7 g natriumsulfiit-20 tia, 35 g natriumtioglykolaattia ja 175 g sekundaarista kaliumfosfaattia. Viijelyväliainetta steriloitiin 118°C:ssa 15 minuuttia. Jäähdyttämisen jälkeen väliaineen läpi johdettiin typpikaasua nopeudella 250 ml/min. tunnin ajan.
25 Tähän viljelyväliaineeseen istutettiin noin 900 ml Fusobacterium nucleatum TF-031sn (FERM-5077, ATCC-31647) esiviljelmäliuosta, jota oli valmistettu aikaisemmin esivil jelemällä TF-f-viljelyaineessa, jonka kokoomus oli sama kuin edellä mainittu. Soluja viljeltiin 4 30 päivää noin 33°C;ssa sekoittaen (90 kierr/min) johdettaessa viljelmään typpikaasua nopeudella 250 ml/min. Viljelyn jälkeen viljelmälluokseen lisättiin 10 g/lit-ra Celite'ä ja 5 g/litra selluloosajauhetta ja seosta sekoitettiin ja se suodatettiin vakuumissa, jolloin saa-35 tiin noin 65 litraa bakteeritonta viljelmän pintanes-tettä.
64 69096 (2) 7,5 litraan edellä mainittua pintanestettä lisättiin 113 ml väkevää suolahappoa pintanesteen pH:n säätämiseksi arvoon 2,0. Sitten pintanesteeseen lisättiin 11,4 litraa etanolia, jolloin muodostui 60 %:inen 5 etanolin vesiliuos, jonka annettiin sitten olla paikoillaan 4°Cissa 24 tuntia. Sen jälkeen liuososa poistettiin dekantoimalla ja jäljelle jäänyt osa sentrifugoi-tiin (4 x 10^ kierr/min., 10 min) 4°C:ssa Seikan kokoamiseksi talteen. Tämä sakka pestiin kahdella 100 ml:n 10 erällä 60 %:ista etanolin vesiliuosta, jonka pH oli 2,0, yhdellä 150 ml:n erällä etanolia, yhdellä 150 ml:n erällä metanolia ja lopuksi yhdellä 150 ml:n erällä asetonia, tässä järjestyksessä, ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin 3,0 g jauhetta.
15 (3) Kohdassa (2) saatu jauhe suspendoitiin 30 ml: aan vettä. Saadun suspension pH säädettiin välille 7,5-8,0 lisäämällä 4-norm. natriumhydroksidin vesi-liuosta, ja kun seos oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 15 minuuttia, pH säädettiin uudelleen arvoon 4,0 20 lisäämällä 4-norm. suolahappoa. Sen jälkeen suspension annettiin olla paikoillaan jäillä jäähdyttäen 2 tuntia, ja seos sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Erotettuun sakkaan lisättiin pesua varten 6 ml vettä, jolloin muodostui 25 suspensio, johon lisättiin 4-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta pH:n säätämiseksi välille 7,5-8,0. Suspensiota sekoitettiin huoneen lämpötilassa 15 minuuttia, minkä jälkeen suspensioon lisättiin 4-norm. suolahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 4,0, ja suspension annettiin 30 olla paikoillaan 2 tuntia jäillä jäähdyttäen. Sitten suspensio sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min., 10 min) sakan kokoamiseksi talteen. Tämä sakka pestiin 4 ml:11a 4 vettä, jonka pH oli 4,0 ja sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min, 10 min), jolloin saatiin 6,2 g (märkäpaino) 35 sakkaa (TF-210).
II
65 69096 Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-210 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet ja sen infrapuna-absorptiospektri ja uitravioletti-absorptio-spektri olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 1 5 saatujen spektrien kanssa.
(4) Edellä kohdassa (3) saatu sakka (6,2 g, mär-käpaino) suspendoitiin 6 ml:aan vettä. Suspensioon lisättiin, sekoittaen, kyllästettyä ammoniumkarbonaatin vesiliuosta suspension pH:n säätämiseksi arvoon 7,8.
10 Suspensio lämmitettiin 37°C:seen ja siihen lisättiin 21 mg Pronase E:tä ja sitten useita tippoja tolueenia. Saadun seoksen entsyymikäsittely suoritettiin ravistellen pH:n ollessa välillä 7,8 - 8,0, 37-40°C:ssa 24 tunnin kuluessa. Näin käsitellyn seoksen pH säädet-15 tiin arvoon 1,0 lisäämällä 4-norm. suolahappoa, jolloin muodostui sakka. Tämän suspension annettiin olla paikoillaan 2 tuntia jäillä jäähdyttäen, ja sitten sentri-fugoitiin (1 x 104 kierr/min., 10 min.) pintanesteen ottamiseksi talteen. Pintanesteeseen lisättiin 29 ml 20 etanolia, 60 %:isen etanolin vesiliuoksen muodostamiseksi, jolloin muodostui sakkaa. Tämän lietteen annettiin olla paikoillaan 2 tuntia jäillä jäähdyttäen ja 3 sen jälkeen sentrifugoitiin (6 x 10 kierr/min., 10 min.) sakan ottamiseksi talteen. Koottu sakka pestiin 5 ml:11a 25 60 %:ista etanolin vesiliuosta, 10 ml:11a etanolia ja 10 ml:11a asetonia, tässä järjestyksessä, ja kuivattiin ilmassa, jolloin saatiin 315 mg karsinostaattisen aineen TF-310 epäpuhtaita kiteitä.
Raakakiteet (315 mg) liuotettiin 30 ml:aan 30 vettä, ja tähän lisättiin 4-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta pH:n säätämiseksi arvoon 8,0. Saatu liuos kaadettiin kolonniin, joka oli täytetty 30 ml:11a valmistetta Dowex 1x4 (Dow Chemical'in kauppanimi), Cl-tyyppiä. Sen jälkeen kolonnin läpi laskettiin 100 ml 35 vettä ja kaikki eluaatit yhdistettiin, pH säädettiin 66 6 9 0 9 6 välille 6,5-7,0, ja suodatettiin Ultrafilter UK-50;n läpi, minkä jälkeen suodos konsentroitiin alkuperäiseen konsentraatioonsa verrattuna 100-kertaiseksi. Tämä konsentraatti suodatettiin Millipore-suodattimen läpi, 5 jonka huokosten läpimitta oli 0,3 ^um, ja sitten jäädy tysku ivat ti in, jolloin saatiin 230 mg jäädytyskui-vattua, puhdistettua karsinostaattista ainetta TF-310.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-310 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja sen sakkari-10 dipitoisuus oli yleensä noin 16-30 % glukoosiksi laskien. Tyypillisen aineen infrapuna-absorptiospektri, ultravioletti-absorptiospektri ja suurtehonestekroma-togrammi on esitetty vastaavasti kuvissa 23, 24 ja 25.
Esimerkki 19 15 10 ml:aan vettä suspendoitiin 0,9 g karsinostaat tista ainetta TF-240, jota oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 7 (3), ja saatuun suspensioon lisättiin sekoittaen 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta pH:n säätämiseksi arvoon 7,8. 37°C:seen lämmittämisen 20 jälkeen suspensioon lisättiin 9 mg Pronase E:tä ja useita tippoja tolueenia, tässä järjestyksessä. Saadun seoksen entsyymikäsittely suoritettiin ravistellen 30-40°C:ssa, pH:n ollessa välillä 7,8-8,0, 24 tunnin kuluessa. Käsitelty seos sentrifugoitiin (4 000 kierr/ 25 min., 10 min.) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Sakkaan lisättiin 3 ml vettä, jonka pH oli 8,0, ja saatu suspensio sentrifugoitiin (4 000 kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pesunesteestä. Tämä pesuneste ja edellä mainittu pintaneste yhdistettiin, ja yhdistettyyn 30 liuokseen lisättiin 1-norm. suolahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 2,0, jolloin muodostui sakkaa. Muodostuneen lietteen annettiin olla paikoillaan 5°C:ssa 12 4 tuntia, ja sitten sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min., 10 min.) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Sakkaan 35 lisättiin 5 ml vettä, jonka pH oli 2,0 ja saatu suspen- 67 6 9 0 9 6 4 sio sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pesunesteestä. Tämä pesuneste ja edellä saatu pintaneste yhdistettiin, ja yhdistettyyn liuokseen lisättiin etanolia siten, että muodostui 80 %:ista 5 etanolin vesiliuosta. Etanolin vesiliuosta sekoitettiin 2 tuntia jäillä jäähdyttäen ja sitten sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min., 10 min.) sakan erottamiseksi pin-tanesteestä. Tämä sakka pestiin 5 ml:11a 80 %:ista etanolin vesiliuosta ja 5 ml:11a etanolia, tässä järjestyk-10 sessä, ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 170 mg karsinostaattista ainetta, TF-340-fraktiota.
5 ml:aan vettä liuotettiin 150 mg tätä jauhetta, ja saadun liuoksen pH säädettiin arvoon 7,0 lisäämällä 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta. Tämä 15 liuos kaadettiin kolonniin, joka oli täytetty 25 ml:11a valmistetta Amberlite IRA 400, esisäädettynä 0H-muo-toon käyttämällä 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta. Sitten kolonnin läpi laskettiin 100 ml vettä ja kaikki eluaatit yhdistettiin ja pH säädettiin 20 arvoon 7,0 lisäämällä 1-norm. suolahappoa. Saatu liuos konsentroitiin vakuumissa ja suodatettiin Millipore-suodattimen läpi, jonka huokosten läpimitta oli 0,3 ^um, ja sitten jäädytyskuivattiin, jolloin saatiin 110 mg jäädytyskuivattua karsinostaattista ainet- 25 ta TF-340.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-340 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja sen infrapuna-absorptiospektri, ultravioletti-absorptio-spektri ja suurtehonestekromatogrammi on esitetty 30 vastaavasti kuvissa 26, 27 ja 28.
Esimerkki 20 0,9 g karsinostaattista ainetta TF-240, jota oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 8, käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 19, jolloin saa-35 tiin 115 mg jäädytyskuivattua karsinostaattista ainet ta TF-340.
68 69096 Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-340 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja sen infrapuna -absorptiospektri, ultravioletti-absorptiospektri ja suurtehonestekromatograimni olivat pääasiallisesti 5 identtiset esimerkissä 19 saatujen kanssa.
Esimerkki 21 0,9 grammaa esimerkissä 7 (3) saatua karsinostaat-tista ainetta TF-240 käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 19, pätsi että (a) entsyymikäsittely suori-10 tettiin käyttämällä 9 mg trypsiiniä (valmistaja Difco) Pronase E:n asemesta ja (b) koottaessa sakka entsyymi-käsittelyn jälkeen vesiliukoisesta osasta, jonka pH oli 2,0, 80 %:isen etanolin vesiliuoksen asemesta muodostettiin 60 % sinen etanolin vesiliuos. Näin saa-15 tiin 105 mg jäädytyskuivattua karsinostaattista ainetta TF-340.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-340 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja sen infrapu-na-absorptiospektri ja ultravioletti-absorptiospektri 20 olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 19 saatujen spektrien kanssa.
Esimerkki 22
Esimerkissä 7 (3) saatua karsinostaattista ainetta TF-240 käsiteltiin samalla tavalla kuin esimer-25 kissä 19, paitsi että entsyymikäsittelyn jälkeen koottaessa sakka vesiliukoisesta osasta, jonka pH oli 2,0, 80 %:isen etanolin vesiliuoksen asemesta muodostettiin 60 %:inen etanolin vesiliuos. Näin saatiin 101 mg jäädytyskuivattua karsinostaattista ainetta TF-340.
30 Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-340 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja sen in f rapuna-ab sorpt io spektri, uitr aviolett i-ab sorpt io-spektri ja suurtehonestekromatogrammi olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 19 saatujen kanssa.
It 35 69 69096
Esimerkki 23
Esimerkissä 7 (3) saadulle karsinoscaattiselle aineelle TF-240 suoritettiin sama entsyymikäsittely kuin esimerkissä 19, minkä jälkeen sen sijasta, että 5 sakka koottaisiin vesiliukoisesta osasta, jonka pH
on 2,0, sakka koottiin lisäämällä 40 %:ista trikloori-etikkahappoa siten, että trikloorietikkahapon konsent-raatioksi tuli 10 % ja muodostamalla näin saadusta vesiliukoisesta osasta 80 %:inen etanolin vesiliuos, 10 ja sen jälkeen suoritettiin samat käsittelyt kuin esimerkissä 19, jolloin saatiin 99 mg jäädytyskuivattua karsinostaattista ainetta TF-340.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-340 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja sen 15 infrapuna-absorptiospektri, ultravioletti-absorptio- spektri ja suurtehonestekromatogrammi olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 19 saatujen kanssa.
Esimerkki 24 10 ml:aan vettä suspandoitiin 0,82 g karsino-20 staattista ainetta TF-250, jota oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 7 (4) ja siihen lisättiin sekoittaen 1-norm. natriumhydroksidin vesiliuosta pH:n säätämiseksi arvoon 7,8. 37°C:seen lämmittämisen jälkeen suspensioon lisättiin 8 mg Pronase E:tä ja useita tippoja 25 tolueenia, tässä järjestyksessä. Saadulle seokselle suoritettiin ravistelemalla entsyymikäsittely, pH:n ollessa välillä 7,8-8,0, 37°C:ssa 24 tunnin kuluessa. Käsitelty seos sentrifugoitiin (4 000 kierr/min., 10 min.) sakan erottamiseksi pintanesteestä. Sakkaan li-30 sättiin 3 ml vettä, jonka pH oli 8,0 ja saatu suspensio sentrifugoitiin (4 000 kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pesunesteestä. Tämä pesuneste ja edellä saatu pintaneste yhdistettiin, siihen lisättiin 1-norm. suolahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 2,0, jolloin muo-35 dostui sakkaa. Saadun lietteen annettiin olla paikoillaan 5°C:ssa 12 tuntia ja sitten sentrifugoitiin 4 70 69096
(1 x 10 kierr/min., 10 min) sakan erottamiseksi pinta-nesteestä. Sakkaan lisättiin 5 ml vettä/ jonka pH
4 oli 2/0 ja saatu suspensio sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min./ 10 min) sakan erottamiseksi pesunesteestä.
5 Pesuneste ja edellä mainittu pintaneste yhdistettiin/ ja yhdistettyyn liuokseen lisättiin etanolia 80 % risen etanolin vesiliuoksen muodostamiseksi. Etanolin vesi-liuosta sekoitettiin 2 tuntia jäillä jäähdyttäen ja 4 sen jälkeen sentrifugoitiin (1 x 10 kierr/min., 10 min) 10 sakan erottamiseksi pintanesteestä. Tämä sakka pestiin 5 ml:11a 80 %:ista etanolin vesiliuosta ja 5 ml:11a etanolia, tässä järjestyksessä, ja kuivattiin vakuumis-sa, jolloin saatiin 430 mg karsinostaattista ainetta, TF-350-fraktiota.
15 5 ml:aan vettä liuotettiin 300 mg tätä jauhetta, ja saatuun liuokseen lisättiin 1-norm. natriumhydroksi-din vesiliuosta pH:n säätämiseksi arvoon 7,0. Tämä liuos kaadettiin kolonniin, joka oli täytetty 45 ml:11a valmistettu Amberlite IRA 400, joka oli esisäädetty 20 OH-muotoon käyttämällä 1-norm. natriumhydroksidin ve siliuosta. Sitten kolonnin läpi laskettiin 200 ml vettä ja kaikki eluaatit yhdistettiin ja pH säädettiin arvoon 7,0 lisäämällä 1-norm. suolahappoa. Saatu liuos konsentroitiin vakuumissa ja suodatettiin Millipore-25 suodattimen läpi, jonka huokosten läpimitta oli 0,3 ^um ja sitten jäädytyskuivattiin, jolloin saatiin 260 mg jäädytyskuivattua karsinostaattista ainetta TF-350.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-350 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja sen 30 infrapuna-absorptiospektri, ultravioletti-absorptio- spektri ja suurtehonestekromatogrammi on esitetty vastaavasti kuvissa 29, 30 ja 31.
71 69096
Esimerkki 25 0,85 grammalle esimerkissä 9 saatua karsino-staattista ainetta TF-250 suoritettiin entsyymikäsit-tely samalla tavalla kuin esimerkissä 24, käyttämäl-5 lä 8 mg Pronase Estä, jolloin saatiin 265 mg jäädytys-kuivattua karsinostaattista ainetta TF-350.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-350 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja sen infrapuna -ab sorptio spektri, ultravioletti-absorptiospektri ja 10 suurtehonestekromatogrammi olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 24 saatujen kanssa.
Esimerkki 26 0,80 grammalle esimerkissä 10 saatua karsino-staattista ainetta TF-250 suoritettiin entsyymikäsit-15 tely samalla tavalla kuin esimerkissä 24, käyttämällä 8 mg Pronase E:tä, jolloin saatiin 253 mg jäädytyskui-vattua karsinostaattista ainetta TF-350.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-350 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja sen 20 infrapuna-absorptiospektri, ultravioletti-absorptio spektri ja suurtehonestekromatogrammi olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 24 saatujen kanssa.
Esimerkki 27 0,85 grammaa esimerkissä 7 (4) saatua karsino-25 staattista ainetta TF-250 käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 24, paitsi että (a) entsyy-mikäsittely suoritettiin käyttämällä 8 mg trypsiiniä (Difco'n tuote) Pronase E:n asemesta ja (b) entsyymikä-sittelyn jälkeen, koottaessa sakka vesiliukoisesta 30 osasta, jonka pH oli 2,0, 80 %:isen etanolin vesiliuoksen asemesta valmistettiin 60 %:inen etanolin vesiliuos, jolloin saatiin 247 mg jäädytyskuittua karsinostaattista ainetta TF-350.
Näin saadulla karsinostaattisella aineella 35 TF-350 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja sen infrapuna-absorptiospektri, ultravioletti-absorptio- 72 69096 spektri ja suurtehonestekromatogranuni olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 24 saatujen kanssa.
Esimerkki 28 0,85 grammaa karsinostaattista ainetta TF-250, 5 jota oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 7 (4), käsiteltiin samalla tavalla kuin esimerkissä 24, paitsi että entsyymikäsittelyn jälkeen koottaessa sakka vesiliukoisesta osasta, jonka pH oli 2,0, 80 %:isen etanolin vesiliuoksen asemesta valmistettiin 60 %:ista etanolin 10 vesiliuosta, jolloin saatiin 242 mg jäädytyskuivattua karsinostaattista ainetta TF-350.
Näin saadulla TF-350:llä oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja sen infrapuna-absorptiospektri, ultravioletti-absorptiospektri ja suurtehonestekroma-15 togrammi olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 24 saatujen kanssa.
Esimerkki 29 0,8 grammalle karsinostaattista ainetta TF-250, jota oli saatu samalla tavalla kuin esimerkissä 7 (4), 20 suoritettiin sauna entsyymikäsittely kuin esimerkissä 24, minkä jälkeen, sen sijaan että sakka koottaisiin vesiliukoisesta osasta, jonka pH on 2,0, sakka koottiin lisäämällä 40 %:ista trikloorietikkahappoa siten, että trikloorietikkahapon konsentraatioksi tuli 10 % ja muo-25 dostamalla saadusta vesiliukoisesta osasta 80 %:inen etanolin vesiliuos, minkä jälkeen suoritettiin samat jälkikäsittelyt kuin esimerkissä 24, jolloin saatiin 238 mg jäädytyskuivattua karsinostaattista ainetta TF-350.
30 Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-350 oli taulukossa 2 esitetyt ominaisuudet, ja sen infrapuna-absorptiospektri, ultravioletti-absorptiospektri ja suurtehonestekromatogrammi olivat pääasiallisesti identtiset esimerkissä 24 saatujen kanssa.
M
li
Claims (33)
1. Menetelmä TF-2-aineen valmistamiseksi, joka aine on TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-300 (TF-310,
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että sakan fraktiointi pH:sta riippuen suoritetaan lisäämällä vettä sakkaan ja säätämällä muodostuvan liuoksen pH siten, että voidaan ottaa talteen fraktio, joka on veteen liukenematon pH:ssa 3,5-4,5.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että sakan fraktiointi pH:sta riippuen 69096 suoritetaan lisäämällä vettä sakkaan ja säätämällä muodostuvan liuoksen pH arvoon 3,5-4,5 ja otetaan talteen muodostuva veteen liukenematon osa.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -5 n e t t u siitä, että sakan fraktiointi pH:sta riippuen suoritetaan lisäämällä vettä sakkaan ja säätämällä muodostuvan liuoksen pH siten, että voidaan ottaa talteen fraktio, joka on veteen liukenematon pH:ssa 5,5-6,5.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -10 n e t t u siitä, että sakan fraktiointi pH:sta riippuen suoritetaan lisäämällä vettä sakkaan ja säätämällä muodostuvan liuoksen pH siten, että voidaan ottaa talteen fraktio, joka on vesiliukoinen pHtssa 5,5-6,5 mutta veteen liukenematon pH:ssa 3,5-4,5.
5 TF-320 tai TF-330), TF-340 tai TF-350, tai näiden suola, tunnettu siitä, että viljellään anaerobisissa olosuhteissa pH:ssa 5-8,5 ja lämpötilassa 30-45°C 1-5 vuorokautta TF-2-ainetta tuottavia bakteereita, jotka kuuluvat Fusobacterium-sukuun, kasvualustassa, joka sisältää typpi-10 lähteen, hiililähteen, vitamiinilähteen, pelkistimiä ja epäorgaanisia suoloja yhdessä agarin kanssa tai sitä ilman, lisätään saostavaa ainetta näin muodostuneeseen viljelmään tai sen emä]luokseen, mainitun saostavan aineen ollessa hydrofiilinen orgaaninen liuotin, pitoisuuteen 30-80 tila-15 vuusprosenttia ja pH:ssa 1,5-7, annetaan sakan muodostua, otetaan sakka talteen, fraktioidaan sakka pH:sta riippuen ja otetaan talteen TF-2-aine, joka on TF-210, TF-220, TF-TF-230, TF-240 tai TF-250 tai fraktioidaan sakka pHssta riippuen ja saatetaan saatu fraktio deproteinisointikäsit-20 telyyn ja otetaan talteen TF-2-aine, joka on TF-300 (TF-310, TF-320 tai TF-330), TF-340 tai TF-350 ja haluttaessa muodostetaan tavanomaisella tavalla fysiologisesti hyväksyttävä suola, jolloin mainitulla TF-210 aineella on seuraavat ominaisuudet: 25 (a) harmahtavan valkea - vaalean ruskea jauhe (b) estää hiirellä Ehrlichin vesivatsakasvaimen, Ehr-lichin kiinteän kasvaimen, sarkooma 180:n ja B-16 melanooman kasvun, ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, 30 bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyyli- eetteriin, (d) sillä ei ole terävää sulamispistettä ja hajoaa 160-235°C:ssa, (e) KBr-tablettimenetelmällä saadussa IR-absorptio-35 spektrissä on absorptiohuiput alueella 3600-3200, 2950- 2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 ja 1120-1020 cm ^, 74 69096 (f) UV-absorptiospektrissä, joka on otettu pH:ssa 7,0 vesiliukoisen fraktion vesiliuoksesta, esiintyy voimakas absorptio absorptioreunalla sekä absorptiohuippu alueella 248-265 nm, 5 (g) antaa positiivisen Molisch-reaktion, fenoli-rikki- happoreaktion, antroni-rikkihappo-reaktion, indoli-kloori-vetyhappo-reaktion ja Lowry-Folin'in reaktion, (h) alkuaineanalyysi: C: 40 - 43 % H: 5 - 7 % N: 9 - 10 % 10 (i) pH:ssa 7 vesiliukoisen fraktion fenoli-rikkihappo- menetelmällä määritetty sakkaridipitoisuus on noin 5-25 pai-no-% glukoosiksi laskettuna, ja Lowry-Folin'in menetelmällä määritetty proteiinipitoisuus on noin 20-50 paino-% naudan seerumin albumiiniksi laskettuna, ja mainitulla TF-220 ai- 15 neella on seuraavat ominaisuudet: (a) harmahtavan valkea - vaalean ruskea jauhe (b) estää hiirellä Ehrlichin vesivatsakasvaimen, Ehr-lichin kiinteän kasvaimen, sarkooma 180:n ja B-16 melanooman kasvun, ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, 20 (c) on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyyli-eetteriin, (d) sillä ei ole terävää sulamispistettä ja hajoaa 160-240°C:ssa, 25 (e) KBr-tablettimenetelmällä saadussa IR-absorptio- spektrissä on absorptiohuiput alueella 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 ja 1120-1020 cm ^, (f) UV-äbsorptiospektrissä, joka on otettu pH:ssa 30 7,0 vesiliukoisen fraktion vesiliuoksesta, esiintyy voima kas absorptio absorptioreunalla sekä absorptiohuippu alueella 248-266 nm, (g) antaa positiivisen Molisch-reaktion, fenoli-rik-kihappo-reaktiön, antroni-rikkihappo-reaktion, indoli- 35 kloori-vetyhappo-reaktion ja Lowry-Folin'in reaktion, (h) alkuaineanalyysi: 69096 c: 40 - 42 % H: 5 - 7 % N: 7 - 9 % (i) pH:ssa 7 vesiliukoisen fraktion fenoli-rikkihap-po-menetelmällä määritetty sakkaridipitoisuus on noin 5-20 paino-% glukoosiksi laskettuna, ja Lowry-Folin'in menetel-5 mällä määritetty proteiinipitoisuus on noin 10 paino-% tai sen alle naudan seerumin albumiiniksi laskettuna, ja mainitulla TF-230 aineella on seuraavat ominaisuudet: (a) harmahtavan valkea - vaalean ruskea jauhe (b) estää hiirellä Ehrlichin vesivatsakasvaimen, Ehr-10 lichin kiinteän kasvaimen, sarkooma 180:n ja B-16 melanooman kasvun, ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyyli-eetteriin, 15 (d) sillä ei ole terävää sulamispistettä ja hajoaa 185-225°C:ssa, (e) KBr-tablettimenetelmällä saadussa IR-absorptio-spektrissä on absorptiöhuiput alueella 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 ja 1120- 20 1020 cm"1, (f) UV-absorptiospektrissä, joka on otettu sen vesi-liuoksesta, jonka pH on 7,0 esiintyy voimakas absorptio absorptioreunalla sekä absorptiohuippu alueella 249-264 nm, (g) antaa positiivisen Molisch-reaktion, fenoli-rik-25 kihappo-reaktion, antroni-rikkihappo-reaktion, indoli-kloo- rivetyhappo-reaktion ja Lowry-Folin'in reaktion, (h) alkuaineanalyysi: C: 42 - 45 % H: 5 - 7 % N: 10 - 11 % (i) pH:ssa 7 vesiliukoisen fraktion fenoli-rikkihap-30 pomenetelmällä määritetty sakkaridipitoisuus on noin 5-25 paino-% glukoosiksi laskettuna, ja Lowry-Folin'in menetelmällä määritetty proteiinipitoisuus on noin 30-60 paino-% naudan seerumin albumiiniksi laskettuna, ja mainitulla TF-240 aineella on seuraavat ominaisuudet: 35 (a) harmahtavan valkea - vaalean ruskea jauhe 76 69096 (b) estää hiirellä Ehrlichin vesivatsakasvaimen, Ehr-lichin kiinteän kasvaimen, sarkooma 180:n ja B-16 melanooman kasvun, ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) on liukenematon raetanoliin, etanoliin, asetoniin, 5 bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyyli- eetteriin, (d) sillä ei ole terävää sulamispistettä ja hajoaa 200-215°C:ssa, (e) KBr-tablettimenetelmällä saadussa IR-absorptio- 10 spektrissä on absorptiohuiput alueella 3600-3200, 2950- 2920, 1680-1620, 1550-1520, 1410-1360, 1280-1210, 1060, 960 ja 820 cm 1, (f) UV-absorptiospektrissä, joka on otettu sen vesi-liuoksesta, jonka pH on 7,0, esiintyy voimakas absorptio 15 absorptioreunalla sekä absorptiohuippu alueella 250-265 nm, (g) antaa positiivisen Molisch-reaktion, fenoli-rik-kihappo-reaktion, antroni-rikkihappo-reaktion, indoli-kloo-rivetyhappo-reaktion ja Lowry-Folin'in reaktion, (h) alkuaineanalyysi s
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että sakan fraktiointi pH:sta riippuen suoritetaan lisäämällä vettä sakkaan ja säätämällä muodostuvan liuoksen pH siten, että voidaan ottaa talteen fraktio, joka on vesiliukoinen pH:ssa 3,5-4,5 mutta veteen liu-20 kenematon pH:ssa 1,5-2,5.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakan fraktiointi pH:sta riippuen suoritetaan lisäämällä vettä sakkaan ja säätämällä muodostuvan liuoksen pH siten, että voidaan ottaa talteen frak- 25 tio, joka on vesiliukoinen pHsssa 1,5-2,5.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-n e t t u siitä, että TP-2-aineiden talteenotto sakastei toteutetaan fraktioimalla sakka pH:sta riippuen ja saattamalla erotettu fraktio entsyymikäsittelyyn., jossa käytetään 30 proteolyyttistä entsyymiä, ja näin saadut TF-2-aineet otetaan talteen.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakan fraktiointi pH:sta riippuen suoritetaan lisäämällä vettä sakkaan ja säätämällä muodos-35 tuvan liuoksen pH siten, että voidaan ottaa talteen fraktio, joka on veteen liukenematon pHsssa 3,5-4,5. si 69096
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakan fraktiointi pHrsta riippuen suoritetaan lisäämällä vettä sakkaan ja säätämällä muodostuvan liuoksen pH arvoon 3,5-4,5 ja muodostuva veteen liu- 5 kenematon osa otetaan talteen.
11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakan fraktiointi pH:sta riippuen suoritetaan lisäämällä vettä sakkaan ja säätämällä muodostuvan liuoksen pH siten, että voidaan ottaa talteen fraktio, 10 joka on veteen liukenematon pH:ssa 5,5-6,5.
12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakan fraktiointi pHrsta riippuen suoritetaan lisäämällä vettä sakkaan ja säätämällä muodostuvan liuoksen pH siten, että voidaan ottaa talteen fraktio, 15 joka on vesiliukoinen pH:ssa 5,5-6,5 mutta veteen liukenematon pHrssa 3,5-4,5.
13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakan fraktiointi pH:sta riippuen suoritetaan lisäämällä vettä sakkaan ja säätämällä muodos- 20 tuvan liuoksen pH siten että voidaan ottaa talteen fraktio, joka on vesiliukoinen pH:ssa 3,5-4,5 mutta veteen liukenematon pH:ssa 1,5-2,5.
14. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sakan fraktiointi pHrsta riippuen 25 suoritetaan lisäämällä vettä sakkaan ja säätämällä muodostuvan liuoksen pH siten, että voidaan ottaa talteen fraktio, joka on vesiliukoinen pHrssa 1,5-2,5.
15. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 8-14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymikäsittely on 30 käsittely pronaasilla tai trypsiinillä.
16. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 8-15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fraktiot, jotka on saatettu entsyymikäsittelyyn saatetaan ainakin yhteen seu-raavista käsittelyistä: fraktiointi pHrsta riippuen, ero- 35 tusaostus hydrofiilisestä orgaanisesta liuottimesta, ultra-suodatusmenetelmä, fraktiointi ioninvaihtimella ja TF-2-ainefraktioiden talteenotto. o 9 69096
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fraktiosta, joka on saatettu entsyy-mikäsittelyyn, fraktioidaan vesiliukoinen osa säätämällä sen pH arvoon 2,5 tai sen alle, lisäämällä hydrofiilistä orgaa- 5 nista liuotinta näin saatuun vesiliukoiseen osaan, käsittelemällä muodostuvaa sakkaa ioninvaihtimella ja ottamalla talteen adsorboitumaton fraktio.
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että talteen otettu adsorboitumaton frak- 10 tio ultrasuodatetaan.
19. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että emäliuos, johon hydrofiilinen orgaaninen liuotin on lisättävä, säädetään pH-arvoon 1,5-2,5 ennen lisäystä.
20. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että emäliuokseen lisätty hydrofiilinen orgaaninen liuotin on alkoholi.
20 C: 35 - 38 % H: 4 - 5 % N: 12 - 14 % (i) fenoli-rikkihappo-menetelmällä määritetty sakka-ridipitoisuus on noin 15-35 paino-% glukoosiksi laskettuna, ja Lowry-Folin'in menetelmällä määritetty proteiinipitoisuus on noin 20-30 paino-% naudan seerumin albumiiniksi 25 laskettuna, ja mainitulla TF-250 aineella on seuraavat ominaisuudet: (a) harmahtavan valkea - vaalean ruskea jauhe (b) estää hiirellä Ehrlichin vesivatsakasvaimen, Ehrlichin kiinteän kasvaimen, sarkooma 180:n ja B-16 melanoo- 30 man kasvun, ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) liukenee veteen, mutta on liukenematon metano-liin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole terävää sulamispistettä ja hajoaa 35 165-210°C:ssa, M 77 6 9 0 9 6 (e) KBr-tablettimenetelmällä saadussa IR-absorptio-spektrissä on absorptiohuiput alueella 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1410-1380, 1240-1210 ja 1150-1120, 1080-1020, 980 ja 810 cm-1, 5 (f) UV-absorptiospektrissä, joka on otettu sen vesi- liuoksesta, jonka pH on 7,0, esiintyy voimakas absorptio absorptioreunalla sekä absorptiohuippu alueella 248-269 nm, (g) antaa positiivisen Molisch-reaktion, fenoli-rik-kihappo-reaktion, antroni-rikkihappo-reaktion, indoli-kloo- 10 rivetyhappo-reaktion ja Lowry-Folin1 in reaktion, (h) alkuaineanalyysi: C: 30 - 33 % H: 3 - 5 % N: 3 - 5 % (i) fenoli-rikkihappo-menetelmällä määritetty sakka-ridipitoisuus on noin 60-80 paino-% glukoosiksi laskettuna, 15 ja Lowry-Folin1 in menetelmällä määritetty proteiinipitoisuus on noin 5-20 paino-% naudan seerumin albumiiniksi laskettuna, ja mainitulla TF-300 aineella (TF-310, TF-320 ja TF-330) on seuraavat ominaisuudet: (a) harmahtava valkea - vaalean ruskea jauhe 20 (b) estää hiirellä Ehrlichin vesivatsakasvaimen, Ehr- lichin kiinteän kasvaimen, sarkooma 180:n ja B-16 melanooman kasvun, ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) liukenee veteen, mutta on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliase- 25 taattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole terävää sulamispistettä ja se alkaa hajota noin 180°C:ssa ja merkittävästi hajoaa yli 195°C:ssa, (e) KBr-tablettimenetelmällä saadussa IR-absorptio-spektrissä on absorptiohuiput alueella 3500-3300, 2920- 30 2850, 1660-1620, 1580-1540, 1460-1400, 1380-1360, 1120, 1080-1020, 970 ja 820-800 cm"1, (f) UV-absorptiospektrissä, joka on otettu sen vesi-liuoksesta, jonka pH on 7,0, esiintyy voimakas absorptio absorptioreunalla sekä absorptiohuippu alueella 246-280 nm, 35 (g) antaa positiivisen Molisch-reaktion, fenoli-rik- kihappo-reaktion, antroni-rikkihappo-reaktion, indoli-kloo- 78 69096 rivetyhappo-reaktion ja Lowry-Folin'in reaktion, mutta negatiivisen ninhydriini-reaktion, (h) alkuaineanalyysi: C: 38 - 47 % H: 5 - 7 % N: 1 - 4 % 5 (i) fenoli-rikkihappo-menetelmällä määritetty sakka- ridipitoisuus on noin 16-60 paino-% glukoosiksi laskettuna, ja Lowry-Folin1 in menetelmällä määritetty proteiinipitoisuus on noin 10 paino-% tai sen alle naudan seerumin albumiiniksi laskettuna, ja mainitulla TF-340 aineella on seu-10 raavat ominaisuudet: (a) harmahtavan valkea - vaalean ruskea jauhe (b) estää hiirellä Ehrlichin vesivatsakasvaimen kasvun, ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) liukenee veteen, mutta on liukenematon metanoliin, 15 etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, (d) sillä ei ole terävää sulamispistettä, se alkaa hajota noin 140°C:ssa ja merkittävästi hajoaa 200°C:ssa tai sitä korkeammassa lämpötilassa, 20 (e) KBr-tablettimenetelmällä saadussa IR-absorptio- spektrissä on absorptiohuiput alueella 3500-3300, 2920-2850, 1660-1640, 1580-1520, 1460-1440, 1410-1340, 1250-1220, 1120-1030, 970 ja 835 cm"1, (f) UV-absorptiospektrissä, joka on otettu sen vesi-25 liuoksesta, jonka pH on 7,0, esiintyy voimakas absorptio absorptioreunalla sekä absorptiohuippu alueella 250-265 nm, (g) antaa positiivisen Molisch-reaktion, fenoli-rikki-happo-reaktion, antroni-rikkihappo-reaktion, indoli-kloori-vetyhappo-reaktion ja Lowry-Folin'in reaktion, mutta nega- 30 tiivisen ninhydriini-reaktion, (h) alkuaineanalyysi: C: 32 - 34 % H: 4 - 6 % N: 3 - 5 % (i) fenoli-rikkihappo-menetelmällä määritetty sakka-ridipitoisuus on noin 20-50 paino-% glukoosiksi laskettuna, 35 ja Lowry-Folin'in menetelmällä määritetty proteiinipitoisuus on noin 10 paino-% tai sen alle naudan seerumin albu- li 79 69096 miiniksi laskettuna, ja mainitulla TF-350 aineella on seu-raavat ominaisuudet: (a) harmahtavan valkea - vaalean ruskea jauhe (b) estää hiirellä Ehrlichin vesivatsakasvaimen kasvun, 5 ja sillä on immunostimuloiva vaikutus, (c) liukenee veteen> mutta on liukenematon metanoliin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliase-taattin ja dietyyliaeetteriin, (d) sillä ei ole terävää sulamispistettä ja se alkaa 10 hajota noin 110°C:ssa ja merkittävästi hajoaa 180°C:ssa tai sitä korkeammassa lämpötilassa, (e) KBr-tablettimenetelmällä saadussa IR-absorptio-spektrissä on absorptiohuiput alueella 3500-3300, 2920-2900, 1660-1630, 1580-1520, 1460-1340, 1140-1100, 1080-1020, 15 970 ja 820-800 cm"1, (f) UV-absorptiospektrissä, joka on otettu sen vesi-liuoksesta, jonka pH on 7,0, esiintyy voimakas absorptio absorptioreunalla sekä absorptiohuippu alueella 245-264 nm, (g) antaa positiivisen Molisch-reaktion, fenoli-rikki-20 happo-reaktion, antroni-rikkihappo-reaktion, indoli-kloori- vetyhappo-reaktion ja Lowry-Folin'in reaktion, mutta negatiivisen ninhydriini-reaktion, (h) alkuaineanalyysi: C: 34 - 37 % H: 5 - 6 % N: 1 - 2 % 25 (i) fenoli-rikkihappo-menetelmällä määritetty sakka- ridipitoisuus on noin 80-95 paino-% glukoosiksi laskettuna, ja Lowry-Folin'in menetelmällä määritetty proteiinipitoisuus on noin 10 paino-% tai sen alle naudan seerumin albumiiniksi laskettuna.
21. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerien viljelys- 20 sä käytetty kasvualusta sisältää tryptikaasipeptonia, aivo-sydän-infuusiota (tai sydäninfuusiota), hiivauutetta, nat-riumkloridia, glukoosia, laktoosia, natriumsulfiittia ja natriumtioglykolaattia, tai se sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa ja agaria, tai se sisältää yllä mainittuja 8 aine- 25 osaa, fytonipeptonia, proteoosipeptöniä ja L-kystiiniä tai se sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, proteoosipeptonia, L-kystiiniä ja agaria.
22. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljely suoritetaan 30 32-37°C:ssa 1-4 vuorokautta kasvualustassa, jonka pH on 6,5-7,5.
23. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Fusobacterium-su-kuun kuuluva bakteeri on Fusobacterium nucleatum.
24. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että Fusobacterium nucleatumia viljellään II p o 69096 anaerobisissa olosuhteissa 30-42°C:ssa 1-5 vuorokautta kasvualustassa, joka sisältää tryptikaasipeptonia, aivosydän-infuusiota (tai sydän-infuusiota), hiivauutetta, natrium-kloridia, glukoosia, laktoosia, natriumsulfiittia ja nat-5 riumtioglykolaattia, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa ja agaria, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, pro-teoosipeptonia ja L-kystiiniä, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, proteoo-10 sipeptonia, L-kystiiniä ja agaria, viljelmän emäliuos erotetaan, emäliuoksen pH säädetään arvoon 1,5-2,5, lisätään alkoholia niin että sen pitoisuudeksi muodostuvassa liuoksessa tulee 50-70 tilavuus-%, ja muodostunut sakka otetaan talteen, tähän sakkaan lisätään vettä, seokseen pH säädetään 15 arvoon 7,5-8,0, sitten sen pH säädetään arvoon 3,5-4,5, ja muodostunut sakka otetaan talteen (mikäli on tarpeen, voidaan tämä fraktiointi pH:sta riippuen toistaa) TF-210 saamiseksi.
25. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n -20 n e t t u siitä, että Fusobacterium nucleatumia viljellään anaerobisissa olosuhteissa 30-42°C:ssa 1-5 vuorokautta kasvualustassa, joka sisältää tryptikaasipeptonia, aivo-sydän-infuusiota (tai sydäninfuusiota), hiivauutetta, natriumklo-ridia, glukoosia, laktoosia, natriumsulfiittia ja natrium-25 tioglykolaattia, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa ja agaria, kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, proteoosi-peptonia ja L-kystiiniä, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, proteoosipepto-30 nia, L-kystiiniä ja agaria, viljelmän emäliuos erotetaan, emäliuoksen pH säädetään arvoon 1,5-2,5; lisätään alkoholia, niin että sen pitoisuudeksi muodostuvassa liuoksessa tulee 50-70 tilavuus-%, ja muodostunut sakka otetaan talteen, tähän sakkaan lisätään vettä; seoksen pH säädetään arvoon 35 5,5-6,5 ja muodostunut sakka otetaan talteen (mikäli on tar peen, voidaan tämä fraktiointi pH:sta riippuen toistaa) TF-220 saamiseksi. 84 6 9 0 9 6
26. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Fusobacterium nucleatumia viljellään anaerobisissa olosuhteissa 30-42°C:ssa 1-5 vuorokautta kasvualustassa, joka sisältää tryptikaasipeptonia, aivo-sydän- 5 infuuslota (tai sydän-infuusiota), hiivauutetta, natrium-kloridia, glukoosia, laktoosia, natriumsulfiittia ja nat-riumtioglykolaattia, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa ja agaria, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, prote-10 oosipeptonia ja L-kystiiniä, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, proteoo-sipeptonia, L-kystiiniä ja agaria, tämän viljelmän emäliuos erotetaan, emäliuoksen pH säädetään arvoon 1,5-2,5, lisätään alkoholia, niin että sen pitoisuudeksi muodostuvassa 15 liuoksessa tulee 50-70 tilavuus-%, muodostunut sakka otetaan talteen, tähän sakkaan lisätään vettä, seoksen pH säädetään arvoon 7,5-8,0, sitten sen pH säädetään arvoon 5,5 - 6,5, emäliuos otetaan talteen, emäliuoksen pH säädetään arvoon 3,5-4,5 ja muodostunut sakka otetaan talteen (mikäli 20 on tarpeen, tämä fraktiointi pH:sta riippuen voidaan toistaa) TF-230 saamiseksi.
27. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Fusobacterium nucleatumia viljellään anaerobisissa olosuhteissa 30-42°C:ssa 1-5 vuorokautta kas- 25 vualustassa, joka sisältää tryptikaasipeptonia, aivo-sydän-infuusiota (tai sydän-infuusiota), hiivauutetta, natrium-kloridia, glukoosia, laktoosia, natriumsulfiittia, ja nat-riumtioglykolaattia, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa ja agaria, tai kasvualustassa, 30 joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, proteoosipeptonia, ja L-kystiiniä, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, proteoosipeptonia, L-kystiiniä ja agaria, ja viljelmän emä-liuos erotetaan, emäliuoksen pH säädetään arvoon 1,5-2,5, 35 lisätään alkoholia, niin että sen pitoisuudeksi muodostuvassa liuoksessa tulee 50-70 tilavuus-%, muodostunut sakka II 85 69096 otetaan talteen, tähän sakkaan lisätään vettä, seoksen pH säädetään arvoon 7,5-8,0 sitten sen pH säädetään arvoon 3,5-4,5, emäliuos erotetaan, sen pH säädetään arvoon 1,5 - 2,5 ja muodostunut sakka otetaan talteen (mikäli on tarpeen, 5 tämä fraktiointi pH:sta riippuen voidaan toistaa) TF-240 saamiseksi.
28. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Fusobacterium nucleatumia viljellään anaerobisissa olosuhteissa 30-42°C:ssa 1-5 vuorokautta kasvu- 10 alustassa, joka sisältää tryptikaasipeptonia, aivo-sydän- infuusiota (tai sydäninfuusiota), hiivauutetta, natriumklo-ridia, glukoosia, laktoosia, natriumsulfiittia ja natrium-tioglykolaattia, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa ja agaria, tai kasvualustassa, joka 15 sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, pro-teoosipeptonia ja L-kystiiniä, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, prote-oosipeptonia, L-kystiiniä ja agaria, ja viljelmän emäliuos otetaan talteen, emäliuoksen pH säädetään arvoon 1,5-2,5, 20 lisätään alkoholia, niin että sen pitoisuudeksi muodostuvassa liuoksessa tulee 50-70 tilavuus-%, muodostunut sakka otetaan talteen, tähän sakkaan lisätään vettä, seoksen pH säädetään arvoon 7,5-8,0 sitten sen pH säädetään arvoon 1,5- 2,5, emäliuos otetaan talteen, tähän emäliuokseen lisätään 25 alkoholia, niin että sen pitoisuudeksi muodostuvassa liuoksessa tulee 20-80 tilavuus-% ja muodostunut sakka otetaan talteen TF-250 saamiseksi.
29. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Fusobakterium nucleatumia viljellään 30 anaerobisissa olosuhteissa 30-42°C:ssa 1-5 vuorokautta kasvualustassa, joka sisältää tryptikaasipeptonia, aivo-sydän-infuusiota (tai sydäninfuusiota), hiivauutetta, natriumklo-ridia, glukoosia, laktoosia, natriumsulfiittia ja natrium-tioglykolaattia, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä 35 mainittuja 8 aineosaa ja agaria, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, pro- 86 69096 teoosipeptonia ja L-kystiiniä, tai kasvualustassa/ joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa# fytonipeptonia, proteoo-sipeptonia, L-kystliniä ja agaria, viljelmän emäliuos otetaan talteen, emäliuoksen pH säädetään arvoon 1,5-2,5, li-5 sätään alkoholia, niin että sen pitoisuudeksi muodostuvassa liuoksessa tulee 50-70 tilavuus-%, muodostunut sakka otetaan talteen, tähän sakkaan lisätään vettä, seoksen pH säädetään arvoon 7,5-8,0, sitten sen pH säädetään arvoon 3,5- 4,5, muodostunut sakka otetaan talteen (mikäli on tarpeen, 10 voidaan tämä fraktiointi pHrsta riippuen toistaa), saatuun sakkaan lisätään vettä, pH säädetään arvoon 7-8, sitten lisätään pronaasia tai trypsiiniä, seos saatetaan entsyymi-käsittelyyn 30-40°C:ssa 1-72 tunniksi, käsitellyn seoksen pH säädetään arvoon 2,5 tai sen alle ja näin saatu emäliuos 15 erotetaan, tähän emäliuokseen lisätään alkoholia, niin että alkoholipitoisuudeksi yhdistetyssä liuoksessa tulee 30-80 tilavuus-% ja muodostunut sakka otetaan talteen tai, mikäli on tarpeen, käsitellään yllä saatua sakkaa vahvalla anioninvaihtohartsilla ja sen adsorboitumaton osa ultrasuo-20 datetaan (tämä ultrasuodatus voidaan toistaa mikäli se on tarpeen), sen jälkeen suodatetaan millipore-suotimen läpi ja jäädytyskuivataan TF-310 saamiseksi.
30. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Fusobacterium nucleatumia viljel-25 lään anaerobisissa olosuhteissa 30-42°C:ssa 1-5 vuorokautta kasvualustassa, joka sisältää tryptikaasipeptonia, aivo-sydän-infuusiota (tai sydäninfuusiota), hiivauutetta, nat-riumkloridia, glukoosia, laktoosia, natriumsulfiittia ja natriumtioglykolaattia, tai kasvualustassa, joka sisältää 30 yllä mainittuja 8 aineosaa ja agaria, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, proteoosipeptonia ja L-kystiiniä, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, proteoosipeptonia, L-kystiiniä ja agaria, viljelmän emäliuos 35 otetaan talteen, emäliuoksen pH säädetään arvoon 1,5-2,5, lisätään alkoholia, niin että sen pitoisuudeksi muodostu- li 87 6 9 0 9 6 vassa liuoksessa tulee 50-70 tilavuus-%, muodostunut sakka otetaan talteen, tähän sakkaan lisätään vettä» seoksen pH säädetään arvoon, 7,5-8,0, sitten sen pH säädetään arvoon 5,5-6,5, muodostunut sakka otetaan talteen (mikäli on tar-5 peen, voidaan tämä fraktiointi pH:sta riippuen toistaa), lisätään vettä saatuun sakkaan, sen pH säädetään arvoon 7-8, lisätään pronaasia tai trypsiiniä, seos saatetaan entsyymi-käsittelyyn 30-40°C:ssa 1-72 tunniksi, käsitellyn seoksen pH säädetään arvoon 2,5 tai sen alle, näin saatu emäliuos 10 erotetaan, tähän emäliuokseen lisätään alkoholia, niin että alkoholipitoisuudeksi yhdistetyssä liuoksessa tulee 30-80 tilavuus-% ja muodostunut sakka otetaan talteen, tai, mikäli on tarpeen, käsitellään yllä saatua sakkaa vahvalla anio-ninvaihtohartsilla ja sen adsorboitumaton osa ultrasuodate-15 taan (tämä ultrasuodatus voidaan toistaa, mikäli se on tarpeen) , sen jälkeen suodatetaan millipore-suotimen läpi ja jäädytyskuivataan TF-320 saamiseksi.
31. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Fusobacterium nucleatumia viljellään 20 anaerobisissa olosuhteissa 30-42°C:ssa 1-5 vuorokautta kasvualustassa, joka sisältää tryptikaasipeptonia, aivo-sydän-infuusiota (tai sydäninfuusiota), hiivauutetta, natriumklo-ridia, glukoosia, laktoosia, natriumsulfiittia ja natrium-tioglykolaattia, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä 25 mainittuja 8 aineosaa ja agaria, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, prote-oosipeptonia ja L-kystiiniä, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, prote-oosipeptonia, L-kystiiniä ja agaria, viljelmän emäliuos 30 otetaan talteen, emäliuoksen pH säädetään arvoon 1,5-2,5, lisätään alkoholia, niin että sen pitoisuudeksi muodostuvassa liuoksessa tulee 50-70 tilavuus-%, muodostunut sakka otetaan talteen, tähän sakkaan lisätään vettä, seoksen pH säädetään arvoon 7,5-8,0, sitten sen pH säädetään arvoon 35 5,5-6,5, emäliuos otetaan talteen, emäliuoksen pH sääde tään arvoon 3,5-4,5, muodostunut sakka otetaan talteen 88 6 9 0 9 6 (mikäli on tarpeen, voidaan tämä fraktiointi pHrsta riippuen toistaa), saatuun sakkaan lisäätään vettä, sen pH säädetään arvoon 7-8, lisätään pronaasia tai trypsiiniä, seos saatetaan entsyymikäsittelyyn 1-72 tunniksi 30-40°C:ssa, 5 käsitellyn seoksen pH säädetään arvoon 2,5 tai sen alle ja näin saatu emäliuos erotetaan, tähän emäliuokseen lisätään alkoholia, niin että alkoholipitoisuudeksi yhdistetyssä liuoksessa tulee 30-80 tilavuus-%, muodostunut sakka otetaan talteen tai mikäli on tarpeen, käsitellään yllä saatua 10 sakkaa vahvalla anioninvaihtohartsilla ja sen adsorboituma-ton osa ultrasuodatetaan (tämä ultrasuodatus voidaan toistaan, mikäli se on tarpeen), sen jälkeen suodatetaan milli-pore- suot imen läpi ja jäädytyskuivataan TF-330 saamiseksi,
32. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-15 n e t t u siitä, että Fusobacterium nucleatumia viljellään anaerobisissa olosuhteissa 30-42°C:ssa 1-5 vuorokautta kasvualustassa, joka sisältää tryptikaasipeptonia, aivo-sydän-infuusiota (tai sydäninfuusiota), hiivauutetta, nat-riumkloridia, glukoosia, laktoosia, natriumsulfiittia ja 20 natriumtioglykolaattia, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa ja agaria, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, proteoosipeptonia ja L-kystiiniä, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, pro-25 teoosipeptonia, L-kystiiniä ja agaria, viljelmän emäliuos otetaan talteen, emäliuoksen pH säädetään arvoon 1,5-2,5, lisätään alkoholia, niin että sen pitoisuudeksi muodostuvassa liuoksessa tulee 50-70 tilavuus-%, muodostunut sakka otetaan talteen, tähän sakkaan lisätään vettä, seoksen pH 30 säädetään arvoon 7,5-8,0, sitten sen pH säädetään arvoon 3,5-4,5, saadaan emäliuos, tämän emäliuoksen pH säädetään arvoon 1,5-2,5, muodostunut sakka otetaan talteen (mikäli on tarpeen, voidaan tämä fraktiointi pH:sta riippuen toistaa) , saatuun sakkaan lisätään vettä, sen pH säädetään ar-35 voon 7-8, sitten lisätään pronaasia tai trypsiiniä, seos f 69096 saatetaan entsyymikäslttelyyn 30-40°C:ssa 1-72 tunniksi, käsitellyn seoksen pH säädetään arvoon 2,5 tai sen alle, näin saatu emäliuos erotetaan, tähän emäliuokseen lisätään alkoholia, niin että alkoholipitoisuudeksi yhdistetyssä 5 liuoksessa tulee 30-80 tilavuus-%, muodostunut sakka otetaan talteen, tai mikäli on tarpeen, käsitellään yllä saatua sakkaa vahvalla anioninvaihtohartsilla ja sen adsorboi-tumaton osa ultrasuodatetaan (tämä ultrasuodatus voidaan toistaa, mikäli se on tarpeen), sen jälkeen suodatetaan 10 millipore-suotimen läpi ja jäädytyskuivataan TF-340 saamiseksi.
33. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Fusobacterium nucleatumia viljellään annaerobisissa olosuhteissa 30-42°C:ssa 1-5 vuorokautta 15 kasvualustassa, joka sisältää tryptikaasipeptonia, aivo-sy-dän-infuusiota (tai sydäninfuusiota), hiivauutetta, natrium-kloridia, glukoosia, laktoosia, natriumsulfiittia ja nat-riumtioglykolaattia, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa ja agaria, tai kasvualustassa, 20 joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, proteoosipeptonia ja L-kystiiniä, tai kasvualustassa, joka sisältää yllä mainittuja 8 aineosaa, fytonipeptonia, proteoosipeptonia, L-kystiiniä ja agaria, viljelmän emäliuos otetaan talteen, emäliuoksen pH säädetään arvoon 1,5-2,5, 25 lisätään alkoholia, niin että sen pitoisuudeksi muodostuvassa liuoksessa tulee 50-70 tilavuus-%, muodostunut sakka otetaan talteen, tähän sakkaan lisätään vettä, seoksen pH säädetään arvoon 7,5-8,0, sitten sen pH säädetään arvoon 1,5-2,5, emäliuos otetaan talteen, tähän emäliuokseen lisä-30 tään alkoholia, niin että alkoholipitoisuudeksi muodostuvassa liuoksessa tulee 20-80 tilavuus-%, muodostunut sakka otetaan talteen (mikäli on tarpeen, voidaan tämä fraktioin-ti pH:sta riippuen toistaa), saatuun sakkaan lisätään vettä, sen pH säädetään arvoon 7-8, lisätään pronaasia tai 35 trypsiiniä, seos saatetaan entsyymikäsittelyyn 30-40°C:ssa 1-72 tunniksi, käsitellyn seoksen pH säädetään arvoon 2,5 69096 tai sen alle, näin saatu emäiiuos erotetun, tähän emäliuok-seen lisätään alkoholia, niin että yhdistetyn liuoksen alkoholipitoisuudeksi tulee 30-80 tilavuus-% ja muodostunut sakka otetaan talteen tai, mikäli se on tarpeen, käsitellään 5 yllä saatua sakkaa vahvalla anioninvaihtohartsilla ja sen adsorboituina ton osa ultrasuodatetaan (tämä ultrasuodatus voidaan toistaa, mikäli se on tarpeen), sen jälkeen suodatetaan millipore-suotimen läpi ja jäädytyskuivataan TF-350 saamiseksi. li Patentkrav 6 90 9 6
Applications Claiming Priority (18)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2227581 | 1981-02-19 | ||
| JP2227181 | 1981-02-19 | ||
| JP56022277A JPS57139089A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-350, its preparation and carcinostatic agent containing the same |
| JP2227281 | 1981-02-19 | ||
| JP56022274A JPS57136597A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-250, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022271A JPS57136594A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-220, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022275A JPS57136598A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-300, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022272A JPS57136595A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-230, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022273A JPS57136596A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-240, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP2227781 | 1981-02-19 | ||
| JP2227381 | 1981-02-19 | ||
| JP56022276A JPS57139088A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-340, its preparation and carcinostatic agent containing the same |
| JP2227681 | 1981-02-19 | ||
| JP56022270A JPS57136593A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-210, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP2227481 | 1981-02-19 | ||
| JP2227081 | 1981-02-19 | ||
| JP57011744A JPS58129977A (ja) | 1982-01-29 | 1982-01-29 | 制癌性物質ｔｆ−３００−２及びその製造法並びにこれを含有する制癌剤 |
| JP1174482 | 1982-01-29 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI820527L FI820527L (fi) | 1982-08-20 |
| FI69096B true FI69096B (fi) | 1985-08-30 |
| FI69096C FI69096C (fi) | 1985-12-10 |
Family
ID=27576620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI820527A FI69096C (fi) | 1981-02-19 | 1982-02-17 | Foerfarande foer framstaellning av en karcinostatisk och immunostimulerande tf-2-substans |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4591558A (fi) |
| AT (1) | AT381722B (fi) |
| BE (1) | BE892204A (fi) |
| CA (1) | CA1184864A (fi) |
| CH (1) | CH651052A5 (fi) |
| DE (1) | DE3205074A1 (fi) |
| DK (1) | DK151640C (fi) |
| FI (1) | FI69096C (fi) |
| FR (1) | FR2499855B1 (fi) |
| GB (1) | GB2093347B (fi) |
| IT (1) | IT1189224B (fi) |
| NL (1) | NL8200640A (fi) |
| NO (1) | NO157426C (fi) |
| NZ (1) | NZ199771A (fi) |
| PT (1) | PT74455B (fi) |
| SE (1) | SE457000B (fi) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5931715A (ja) * | 1982-08-17 | 1984-02-20 | Toyama Chem Co Ltd | 制癌性物質ｔｆ−５００の製造法 |
| CN102355838A (zh) * | 2009-02-20 | 2012-02-15 | 弗瑞马斯特公司 | 用于油炸机的托架系统 |
| CN102595987A (zh) | 2009-07-15 | 2012-07-18 | 弗瑞马斯特公司 | 用于深敞口桶式油炸系统的自动化托架/吊篮升降系统 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5461112A (en) * | 1977-10-24 | 1979-05-17 | Ono Pharmaceut Co Ltd | Oncostatic polysaccharide* its preparation* and oncostatic drugs containing it as an effective component |
| JPS5943929B2 (ja) * | 1979-08-13 | 1984-10-25 | サッポロビール株式会社 | 多糖体ｒｂｓ物質，その製法およびそれを有効成分とする抗腫瘍性剤 |
| DE3031152A1 (de) * | 1979-08-24 | 1981-03-19 | Toyama Chemical Co. Ltd., Tokyo | Carcinostatische substanzen, verfahren zur herstellung derselben und mittel mit einem gehalt derselben |
| US4477437A (en) * | 1981-02-19 | 1984-10-16 | Toyama Chemical Co., Ltd. | Substances having carcinostatic and immunostimulating activity |
-
1982
- 1982-02-12 GB GB8204093A patent/GB2093347B/en not_active Expired
- 1982-02-12 DE DE19823205074 patent/DE3205074A1/de active Granted
- 1982-02-17 DK DK069282A patent/DK151640C/da not_active IP Right Cessation
- 1982-02-17 IT IT47817/82A patent/IT1189224B/it active
- 1982-02-17 CH CH979/82A patent/CH651052A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-02-17 CA CA000396425A patent/CA1184864A/en not_active Expired
- 1982-02-17 FR FR8202601A patent/FR2499855B1/fr not_active Expired
- 1982-02-17 FI FI820527A patent/FI69096C/fi not_active IP Right Cessation
- 1982-02-18 PT PT74455A patent/PT74455B/pt not_active IP Right Cessation
- 1982-02-18 NZ NZ199771A patent/NZ199771A/en unknown
- 1982-02-18 NL NL8200640A patent/NL8200640A/nl not_active Application Discontinuation
- 1982-02-18 SE SE8201016A patent/SE457000B/sv unknown
- 1982-02-18 NO NO820509A patent/NO157426C/no unknown
- 1982-02-19 BE BE0/207355A patent/BE892204A/fr not_active IP Right Cessation
- 1982-02-19 AT AT0064682A patent/AT381722B/de not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-08-06 US US06/619,895 patent/US4591558A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK69282A (da) | 1982-08-20 |
| AT381722B (de) | 1986-11-25 |
| IT1189224B (it) | 1988-01-28 |
| NO157426B (no) | 1987-12-07 |
| GB2093347B (en) | 1985-03-27 |
| BE892204A (fr) | 1982-08-19 |
| NZ199771A (en) | 1985-09-13 |
| DE3205074A1 (de) | 1982-12-16 |
| NO820509L (no) | 1982-08-20 |
| PT74455A (en) | 1982-03-01 |
| PT74455B (en) | 1984-12-04 |
| CH651052A5 (de) | 1985-08-30 |
| CA1184864A (en) | 1985-04-02 |
| DK151640C (da) | 1988-06-20 |
| ATA64682A (de) | 1986-04-15 |
| FR2499855A1 (fr) | 1982-08-20 |
| NL8200640A (nl) | 1982-09-16 |
| FI820527L (fi) | 1982-08-20 |
| US4591558A (en) | 1986-05-27 |
| IT8247817A0 (it) | 1982-02-17 |
| DK151640B (da) | 1987-12-21 |
| GB2093347A (en) | 1982-09-02 |
| FR2499855B1 (fr) | 1985-07-12 |
| SE8201016L (sv) | 1982-08-20 |
| NO157426C (no) | 1988-03-16 |
| FI69096C (fi) | 1985-12-10 |
| SE457000B (sv) | 1988-11-21 |
| DE3205074C2 (fi) | 1987-09-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI69096B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av en karcinostatisk och immunostimulerande tf-2-substans | |
| JPH021154B2 (fi) | ||
| CA1239364A (en) | Hypotriglyceridemically active polysaccharides | |
| EP0172559A2 (en) | Polysaccharide RON substance, production of the same and use of the same | |
| US4209507A (en) | Novel anti-tumor substance and preparation thereof | |
| FI79140C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av ett tf-500-aemne med karsinostatisk och immunitet stimulerande aktivitet. | |
| JPS6359679B2 (fi) | ||
| KR890002256B1 (ko) | 항암 물질 tf-2 제조 방법 | |
| JPS627918B2 (fi) | ||
| FI68080C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av karcinostatiska och immunostimulerande substansen | |
| JPS627916B2 (fi) | ||
| EP0173228A2 (en) | Polysaccharide rin substance, production of the same and use of the same | |
| JPH0242478B2 (fi) | ||
| JPH021156B2 (fi) | ||
| JPS6261036B2 (fi) | ||
| KR830002817B1 (ko) | 생물학적으로 활성인 fr-900156물질의 제조방법 | |
| JPS648637B2 (fi) | ||
| JPH021151B2 (fi) | ||
| JPH021153B2 (fi) | ||
| JPS596890A (ja) | 抗腫瘍性物質５１１７およびその製造法 | |
| JPH039120B2 (fi) | ||
| JPH03184995A (ja) | 抗腫瘍剤 | |
| DK165641B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af tf-220, tf-230 og tf-240 forbindelser og de tilsvarende proteinfrie forbindelser | |
| JPS62164629A (ja) | 抗腫瘍性成分ｓｐｆ１０−１２及びその製法 | |
| JPH0156075B2 (fi) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: TOYAMA CHEMICAL CO. LTD. |