SE457000B - Foerfarande foer framstaellning av en carcinostatisk och immunostimulerande tf-2-substans, carcinostatisk tf-2-substans samt carcinostatiskt medel. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av en carcinostatisk och immunostimulerande tf-2-substans, carcinostatisk tf-2-substans samt carcinostatiskt medel.Info
- Publication number
- SE457000B SE457000B SE8201016A SE8201016A SE457000B SE 457000 B SE457000 B SE 457000B SE 8201016 A SE8201016 A SE 8201016A SE 8201016 A SE8201016 A SE 8201016A SE 457000 B SE457000 B SE 457000B
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- precipitate
- water
- substance
- reaction
- sulfuric acid
- Prior art date
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 246
- 101000651310 Desulfitobacterium hafniense (strain Y51) Trigger factor 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 title claims abstract description 19
- 230000003327 cancerostatic effect Effects 0.000 title claims description 155
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 92
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 118
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 61
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 327
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 223
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 204
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 claims description 126
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 109
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 86
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 76
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 75
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 65
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 61
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 60
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 54
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 53
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 48
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 41
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 41
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 41
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 41
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 41
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 41
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 34
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 33
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 31
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 29
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 29
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 28
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 27
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 27
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 27
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 25
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Diphosphoinositol tetrakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 241000605986 Fusobacterium nucleatum Species 0.000 claims description 24
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 24
- 239000004158 L-cystine Substances 0.000 claims description 24
- 235000019393 L-cystine Nutrition 0.000 claims description 24
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims description 24
- WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N hexahydrofarnesyl acetone Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)=O WHWDWIHXSPCOKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 208000003468 Ehrlich Tumor Carcinoma Diseases 0.000 claims description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 19
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 claims description 18
- -1 proteospeptone Substances 0.000 claims description 18
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 17
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 16
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 16
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 claims description 16
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 15
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 15
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 15
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 claims description 13
- 208000006268 Sarcoma 180 Diseases 0.000 claims description 13
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 12
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 12
- 229940046307 sodium thioglycolate Drugs 0.000 claims description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 12
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 claims description 6
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 claims description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 claims description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 4
- GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M sodium thioglycolate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CS GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 claims description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims 85
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims 63
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 48
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 48
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 32
- 239000010200 folin Substances 0.000 claims 30
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 23
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims 16
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims 16
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 claims 16
- RJTZUHVCZIGJMB-UHFFFAOYSA-N hydron;1h-indole;chloride Chemical compound Cl.C1=CC=C2NC=CC2=C1 RJTZUHVCZIGJMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 16
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims 16
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims 16
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims 9
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- ZQDPJFUHLCOCRG-UHFFFAOYSA-N 3-hexene Chemical group CCC=CCC ZQDPJFUHLCOCRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FIHZWZBEAXASKA-UHFFFAOYSA-N Anthron Natural products COc1cc2Cc3cc(C)cc(O)c3C(=O)c2c(O)c1C=CC(C)C FIHZWZBEAXASKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M Glycolate Chemical compound OCC([O-])=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims 1
- 239000006096 absorbing agent Substances 0.000 claims 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 5
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 abstract description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 90
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 67
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 62
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 39
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 39
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 32
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 27
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 23
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 23
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 101100298295 Drosophila melanogaster flfl gene Proteins 0.000 description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 11
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 10
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 8
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 8
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 7
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 6
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 3
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N D-Maltose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 241001446467 Mama Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 2
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- YKSIHFDRGQQOCJ-LHHMOHDTSA-N mycothione Chemical compound O([C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@H](NC(=O)C)C(=O)N[C@H]1[C@H](O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O)O)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O YKSIHFDRGQQOCJ-LHHMOHDTSA-N 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229940001482 sodium sulfite Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/05—Immunological preparations stimulating the reticulo-endothelial system, e.g. against cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Oncology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
457 000 2 tillhörande Fusobacterium-släktet och avlägsnande av organis- merna från kulturen, samt funnit att en specifik komponent som erhålles från den överstående vätskan har carcinostatisk akti- vitet, och att denna komponent har en indirekt carcinostatisk aktivitet genom att öka värdmedierad antitumöraktivitet eller immunitet hos värden samt utnyttjar hjälpen av immuniteten, samt att denna komponent har mycket låg giftighetsgrad och kan erhållas även genom behandling av kulturen.
Uppfinningen avser ett förfarande för framställning av en TF-2-substans, som utgöres av TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-300 (TF-310, TF-320 eller TF-330), TF-340 eller TF-350, som definieras i patentkraven, och kännetecknas av att det såsom steg innefattar odling av under anaeroba betingelser vid pH 5-8,5 och vid 30 till 45°C under 1-5 dygn de TF-2- -substansproducerande bakterierna Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) i ett odlingsmedium innehål- lande kvävekällor, kolkällor, vitaminkällor, reduktionsmedel och oorganiska salter med eller utan agar, tillsats av ett utfällningsmedel till den på detta sätt framställda odlingen eller till dess överstående vätska, varvid utfällningsmedlet är ett hydrofilt organiskt lösningsmedel i en koncentration av 30-80 volymprocent och vid ett pH av l,5-7, fällningen tillå- tes bildas, fällningen uppsamlas, fällningen fraktioneras beroende på pH, eller fraktioneras beroende på pH och den erhållna fraktionen underkastas deproteiniseringsbehandling, samt TF-2-substansen tillvaratages.
Uppfinningen avser även ett carcinostatiskt medel, som inne- håller dessa TF-2-substanser.
Såsom bakterier kan man enligt uppfinningen använda godtyck- liga TF-2-substansproducerande bakterier tillhörande Fuso- bacterium nucleatum. Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) och liknande användes.
De bakteriologiska egenskaperna hos Fusobacterium nucleatum TF-031 är följande: 'w (I) Form (l) (2) (3) (4) (5) (6) 457 000 Form hos cellerna: spindelformad (figur 1) Polymorfism hos cellerna: saknas M°t11itet= Sporer: saknas saknas Gramfärgning: gram-negativ Syrabeständighet: negativ (II) Odlingsbetingelser i ett odlingsmedium (1) (2) TF-a agarplatta och lutande kulturmedium rund form ca 1 mm halvsfärisk form daggdroppsliknande Extern form: Storlek: Protuberans: Struktur: Yta: jämn Kanter: jämna mjölkigt gulvit opak Färg: Transparens: TF-a vätskekulturmedium Tillväxtgrad: kraftig Turbiditet: coagulum Fällning: Tillväxt på yta: ingen ingen, ingen tillväxt till ett djup av ca 5 mm Gas: ingen (III) Fysiologiska egenskaper (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (ll) Bildning av vätesulfid: + Reduktion av nitrater: F Produktion av smörsyra: + Produktion av inao1= + ' Ureas: - Katalas: ~ Hydrolys av stärkelse: - Beteende mot syre: anaerobiskt Produktion av ammonium: + Produktion av koldioxid: í+ Tillväxtområdez pH 5,0-8,É, temperatur 30-45°C 457 ÛÛÛ 4 (12) Produktion av gas av sackarider: Å-arabinos (-), D-xylos (-), D-glukos (-), D-mannos (-), D-fruktos (-), D-galaktos (-), maltsocker (-), sackaros (-), trehalos (-),- sorbitol (-), mannitol (-), inositol (Ä), glycerol (-), stärkelse (-).
De nya TF-2-substanserna enligt uppfinningen framställes exempelvis på följande sätt.
IJ, “W v nu 457 000 mcfluwmflnflwuoummüf Ommlmä Oflmlma Ofimlmü / \ fi Ommlmn.. Oø mlhn. OOmJmB “_ _ *_ *_ .__ L Ommlmfl Ovmlmß Omwlhfi Owwzha OHNIMB Ommlmß Allll N mm mums umfiHwmH:muum> cofluxmuw am >m møflafimmmmo ovwnfä. 4||||||||||| N mm man: uwfiwmfionmuum» :wa w mm mmm: umfiHmmHcmuum> cofluxmuw cm >m mcflflsmmmmo omwnma Ai||||||||||||||||| Q mm mun: umflHmwHocmuum> :we m mm www: um«HmmHcwuum> nofluxmum cm bm mcflaëmmmmb Owmlmß mlll m mm mun: umflHmmH0:wußw> Gofluxmuw nu >m mcflfiämmmms Oflmlma All! w mm mmm: umflfimmaocwvßmb nofluxmum nu >m mcflflämmmmn mm wm mmflwonwn mcflnwcoflnxmum \ I G0MUm> mniïwm coflumnmmwm |l|l||||l|||||||IV cofluxmnw mflflwwfl ^T||ll||HmumEmma«cmwH uxmflcmmno uflflmonwam .Mufiwflwä ÜmvC0¶uvmHU>m~ MWUÜ HÜAHU UQHfiUO Esumoflosc søfluwuumnomsm wmcmumnfififlu uwflumuxmn mmcmumosmonmwcmuwnsmn~|ma >m mflfifiwo 457 ÛÛÛ 6 Den ovannämnda produktionsprocessen åskådliggöres nedan på följande sättá (l) Bakterieodling.
Odlingen av bakterier tillhörande Fusobacterium-släktet genomföras med en konventionell metod för odling av anaeroba bakterier. Detta innebär att ett odlingsmedium innehållande en kvävekälla, exempelvis hjärn-hjärtextrakt av nötkreatur, olika peptoner eller liknande; en vitaminkälla, såsom jäst- extrakt eller liknande; ett oorganiskt salt, såsom natrium- klorid eller liknande; en kolkälla, såsom glukos, laktos eller liknande; ett reduktionsmedel, såsom L-cystin, natrium- sulfit, tioglykolat eller liknande, justeras till pH 6 till 8,5, företrädesvis s,s ti11 7,5, een att bakterierna ynpes i odlingsmediet, varefter odling under stabila betingelser genomföres under anaeroba betingelser vid 30-42°C, företrä- desvis 32-37°c, under 1-s dygns tid, företrädesvis 24-96 timmar. Det är i synnerhet önskvärt att använda det odlings- medium som beskrives i tabell I (i det följande betecknat TF-odlingsmedium). Hjärn-hjärtinfusionen, som utgöres av ett hjärn-hjärtextrakt från nötkreatur, erfordras icke alltid såsom kolkälla och kan ersättas med en hjärtinfusion, som utgöres av ett nötkreaturköttextrakt, ett fiskextrakt, majs- U stöpvätska eller liknande. Bland de olika peptonerna är proteospepton och fytonpepton icke alltid nödvändiga och tryptikaspepton kan ersättas med polypepton.
När agar icke användes, är det önskvärt att genomföra omrör- a ning av odlingen.
V' u 457 ÛÛÛ 7 Tabell I.
Bestândsdelar av odlingsmediet g (g/liter) TF-a TF-b TF-c TF-d TF-e TF-f-.
Tryptikaspepton 17 17 17 17 17 17 Fytonpepton 3 3 1,5 - - - Proteospepton 10 5 5 - - - Hjärn-hjärt- infusion 35 17,5 - - - - Hjärtinfusion - - 25 20 10 15 Jästextrakt 3 3 3 3 3 3 Natriumklorid 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 Glukos 6 6 6 12 12 12 Laktos 5 5 S 10 10 10 L-cystin 0,25 0,5 0,5 - - - Natriumsulfit 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Tioglykolat 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Agar 0 eller 0 eller O eller Oeller 0 eller 0 eller ' 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 (2) Uppsamling av en överstående vätska från odlingen (avlägsnande av organismerna).
Organismerna avlägsnas från den enligt ovan erhållna odlingen, så att man erhåller en överstâende vätska. För avlägsnandet av organismerna kan man använda en konventionell metod, exem- pelvis centrifugering och en filtreringsmetod med användning av ett filterhjälpmedel, exempelvis "Hyf1o-Super-Cel“, och i synnerhet föredrages en centrifugeringsmetod med hänsyn till hanteringen, graden av avlägsnande av organismerna och ut- bytet av den överstâende vätskan. (3) Uppsamling av carcinostatisk substans TF-2. (i) (a) Ett hydrofilt organiskt lösningsmedel tillsättes till den överstående vätskan, som erhållits enligt ovan, eller till odlingen och den bildade fällningen uppsamlas.
Vid denna tidpunkt justeras den överstående vätskan eller odlingen företrädesvis till pH 1,5 till 7, i synnerhet till i 457 000 8 närheten av pH 2 (pH 1,5 till 2,5). Det hydrofila organiska lösningsmedlet innefattar exempelvis alkoholer, såsom etanol, metanol och liknande, samt ketoner, såsom aceton och liknande, även om alkoholer, i synnerhet etanol, ger det bästa resul- tatet. Det hydrofila organiska lösningsmedlet tillsättes lämpligen så att dess koncentration kan vara 30-80 %, i synnerhet 50-80 %, räknat på volymen. Efter tillsatsen av det hydrofila organiska lösningsmedlet tillåtes blandningen stå vid en låg temperatur, företrädesvis vid ca 5°C, under flera timmars tid till flera dygns tid för att fullborda bildningen av fällningen.
Den på detta sätt bildade fällningen separeras med konven- tionella metoder, såsom dekantering, centrifugering, filt- rering och liknande. (b) Till den enligt ovan separerade fällningen sättes vatten, generellt i en mängd av 5-20 gånger fällningen, och fällningen fraktioneras beroende på pH. Denna metod genom- föres speciellt enligt följande: (b-l) Blandningen enligt ovan av fällningen och -vatten justeras till ett pH av 7,5 till 8. Efter avlägsnande, om så erfordras, av den olösliga delen justeras blandningen till i närheten av pH 4 (3,5 till 4,5). De erhållna vatten- olösliga och vattenlösliga delarna separeras från varandra med användning av en konventionell metod, såsom centrifuge- ring, filtrering eller liknande. Den vattenolösliga delen som erhålles på detta sätt (TF-210) har de egenskaper som visas i tabell II. (b-2) Separat sättes till den enligt ovan (a) erhåll- na fällningen vatten generellt i en mängd av 5-20 gånger fällningens mängd. Blandningen justeras till pH 7,5 till 8.
Efter avlägsnande, om så erfordras, av den olösliga delen justeras blandningen till i närheten av pH 6 (5,5 till 6,5).
De erhållna yattenolösliga och vattenlösliga delarna separe- ras från varandra med en konventionell metod, såsom centri- -Wß V; 457 000 9 fugering, filtrering eller liknande. Den vattenolösliga delen som erhålles på detta sätt (TF-220) har de egenskaper som visas 1 tabell II. (b-3) Den vattenlösliga del som separerats enligt ovan (b-2) justeras till i närheten av pH 4 (3,5 till 4,5). Fäll- ningen och den vattenlösliga delen som erhålles separeras från varandra med en konventionell metod, såsom centrifugering, filtrering eller liknande. Den på detta sätt erhållna fäll- ningen (TF-230) har de egenskaper som visas i tabell II. (b-4) Den vattenlösliga delen som separerats enligt ovan (b-l) eller (b-3) justeras till i närheten av pH 2 (1,5 till 2,5), varefter en fällning bildas. Denna fällning sepa- reras från den vattenlösliga delen med en konventionell metod, såsom centrifugering, filtrering eller liknande. Den på detta sätt erhållna fällningen (TF-240) har de egenskaper som visas i tabell II. (b-5) Till den fällning som erhålles enligt ovan (a) sättes vatten generellt i en mängd av 5 till 20 gånger mängden av fällningen och pH hos blandningen justeras till exempelvis 7,5 till 8. Därefter justeras pH ytterligare till i närheten av pH 2 (1,5 till 2,5). Till den vattenlösliga del som er- hålles på detta sätt eller till den vattenlösliga del som separerats enligt ovan (b-4) sättes, om så erfordras, efter koncentrering av mängden av den vattenlösliga delen till en tredjedel till en sjundedel därav, ett hydrofilt organiskt lösningsmedel, företrädesvis en alkohol, så att dess koncent- ration blir 20-80 %, företrädesvis 20-60 %, räknat på volymen.
Uppsamling av den erhållna fällningen ger TF-250. Den carcinostatiska substansen TF~250 som erhålles på detta sätt har de egenskaper som visas i tabell II.
De carcinostatiska substanserna TF-210, TF-220, TF-230, TF-240 och TF-250 som erhålles på detta sätt kan var och en flera gånger underkastas samma fraktionering beroende på pH för rening. De carcinostatiska substanser som erhålles på detta 457 000 10 sätt kan var och en omvandlas med en konventionell metod till farmaceutiskt acceptabla salter, såsom alkalimetallsalter, exempelvis natriumsalter, kaliumsalter och liknande, samt alkaliska jordartsmetallsalter, exempelvis magnesiumsalter," kalciumsalter och liknande. 0 (ii) De fraktioner med carcinostatisk aktivitet, som er- hålles såsom anges ovan i (i), TF-210, TF-220, TF-230, TF-240 och TF-250, underkastas var och en deproteiniseringsbehand- ling enligt en konventionell metod, så att man erhåller TF-300 (TF-310, TF-320 och TF-330), TF-340 och TF-350. För deproteiniseringsbehandlingen kan man använda metoder, som är kända för fackmannen, och i synnerhet föredrages en sådan metod som sönderdelning med proteolytiska enzymer. Om man önskar att deproteiniseringen skall genomföras genom en behandling med ett proteolytiskt enzym, är det tillräckligt att var och en av fraktionerna med carcinostatisk aktivitet som erhålles enligt ovan vid (i) upplöses eller suspenderas i vatten eller en buffertlösning samt att ett proteinsönder- delande enzym tillsättes till den erhållna lösningen eller suspensionen och enzymbehandlingen genomföras på ett konven- tionellt sätt.
Såsom proteolytiska enzymer kan nämnas pronas, papain, trypsin, kemotrypsin och liknande. Pronas och trypsin föredrages. Det är lämpligt att vattenlösningen före eller under enzymbehand- lingen justeras till och hâlles vid ett pH av 7 till 8. För detta ändamål kan man använda natriumhydroxid, kaliumhydroxid, natriumkarbonat, natriumvätekarbonat och liknande. För att förhindra förruttnelse av reaktionsblandningen under enzym- behandlingen är det önskvärt att tillsätta en ringa mängd av ett organiskt lösningsmedel, såsom kloroform, toluen och liknande. Enzymet användes vanligen i en mängd av ca 1-2 viktprocent, baserat på vikten av det pulver (fasta material) som skall underkastas enzymbehandlingen.
Den ovan angivna enzymbehandlingen genomföres vanligen vid 30-40°C under l-72 timmars tid, företrädesvis 24-48 timmar. v11 457 000 ll Den kan även genomföras genom att man först tillsätter exem- pelvis ca l viktprocent av ett enzym till ett pulver (fast material) och underkastar pulvret (det fasta materialet) en- zymbehandling under 1-24 timmar och därefter tillsätter ca l viktprocent av enzymet på nytt för ytterligare enzym- behandling.
Efter den ovan angivna enzymbehandlingen kan olösliga bestånds- delar om så erfordras avlägsnas med en sådan metod som cent- rifugering, filtrering eller liknande, varefter från den vattenlösliga del som erhålles på detta sätt uppsamlas respektive fraktioner av carcinostatiska substanser TF-300 (TF-BIO, TF-320, TF-330), TF-34O Och TF-BSO. Pâ detta sätt kan TF-310 erhållas från TF-210, TF-320 från TF-220, TF-330 från TF-230, TF-340 från TF-240 och TF-350 från TF-250.
Isoleringen av fraktionerna av dessa TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 och TF-350 kan genomföras genom minst endera av fraktionering beroende på pH, separat utfällning från ett hydrofilt organiskt lösningsmedel, fraktionering med en jon- bytare, ultrafiltrering och liknande. Alternativt kan en eller fler av dessa operationer upprepas ett flertal.gånger.
Speciellt erhålles de carcinostatiska substanserna enligt uppfinningen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 och TF-350 genom justering av pH hos den ovan angivna vatten- lösliga delen till företrädesvis ett pH av icke mer än 2,5 (om så erfordras kan triklorättiksyra tillsättas), avlägs- nande av den erhållna fällnlngen, tillsats till den lösliga delen av ett hydrofilt organiskt lösningsmedel, såsom en alkohol, så att dess koncentration blir 30-80 %, företrädes- vis 60-80 %, räknat på volymen, tillvaratagande av den er- hållna fällningen, som utgör fraktionen av den önskade substansen, efterföljande behandling, om så erfordras, av denna fällning med ett starkt anjonbytarharts, såsom Dowex 1- -typ (varumärke), Amberlite IRA-400 (varumärke) eller lik- nande (denna behandling kan genomföras ett flertal gånger) för uppsamling av de oadsorberade fraktionerna, varefter man om så erfordras underkastar fraktionerna ultrafiltrering [exempelvis Toyo Ultrafilter UK-50 (nominell molekylvikts- 457 ÛÛÛ 12 avskärning: 50.000) eller Toyo Ultrafilter UK-200 (nominell molekylviktsavskärning: 200.000L] och därefter underkastar dem sådan behandling som koncentrering, utsaltning, torkning eller utfällning från ett hydrofilt organiskt lösningsmedel eller liknande. De på detta sätt erhållna carcinostatiska substanserna TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 och TF-350 har de egenskaper som visas i tabell II.
De carcinostatiska substanserna TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 och TF-350 kan omvandlas till farmaceutiskt acceptabla salter enligt en konventionell metod. I synnerhet kan exempelvis nämnas alkalimetallsalter, såsom natriumsalter, kalciumsalter och liknande, samt alkaliska jordartsmetall- salter, såsom magnesiumsalter, kalciumsalter och liknande, såsom farmaceutiskt acceptabla salter. 457 ÛÛÛ 13 OHMIMB ._ 2 \ 3 uwuwfiwuwflw A00 umumvmflæuw .fihomouoflx .nmmnmn .novwom .fionmuw = = Omwlmfi .aønmamfi fl mflfimnflo :OO nmuum> fl mflflmmq __ _. = = : = OMNIWB ._ _ .- : CN NIJWB nwuwfimuwfiø .umufl>fluxm :oo umumumH>uw munmuwfiøäflumoøsëfifi www: sno mmwä mon .EHOMOMOHM .comcmn mñocmflmz mfllm :oo Oæfi mëounmm _nmEdu OfiN|ma ~ QOUQUß _ .HOCMvÜ .Ho:«»wa « mflflwmfio øfiflom noflfiunm .uwadu|mmufiumm nuflfiusm >m uxw>Hflflu mwmuwnflsnfl cofluxmnw mccwn Hw>H5m vanan uuwfiiuuflämnw »wnmflfimwq cmMum> xmflmoaoxmäumm ÜÜQÜOMu-.D Hwmmxmcmm .HH Hflmßmfi 457 ÛÛÛ 14 OmmlhB _. ._ I m .umu«>fluxm wwnmumfløëflumocsfififl mmm: = :oo mwmfi mos umasaumwuflomm nufifinsm = ommnma >m uxm>Hfl«u mwmumnflsnfl :ofiuxmnm mamma Hmumfiæuwfiw :oo umuwumflmuw .Enouonoflx .cmmamn _ .uuufl>fluxm .noumom .Hocmuw wøcmumfidfiflumoøfiëëfi www: :no mmmä mon ommlms .flocmumë 4 mflflmmflo :oo =muum> « mfifiwmn w Owfl .WEOUHMW .S00 .HÛEÜHIWÜUHOWN SOfiHHSH >M Uunflxwfififlfl ÛUNHÜQflSGfi GOfiÜufiNHM MGGUQ Hw>H5m uflønn #umH|uufl>wn0 A.mflh0Mv HH AHNQMB 457 000 15 w|m . |Eo Oaæ S00 Owm ~ONOA|OæOH 0NHfl|OmHH ~OHNfi IOQNH .Owmfilofiwa ~OAma|OmmH .uooH~|m@fl msn mmuom .oNwH|owmfl .ommwlommm .oowm øflb mmumflmuuwunæm :oo omwnma noowm >m cmumsumn fl vann uxcsmuflmew mnmxm wxofl nmcoflumuomnm mmm: Eøuuxmmm w@mmfl>mmø :ofluxmuw ønnwn .H|Eo omm zoo omm .owofl .ofimfl ncæufl .ommfllofiwfi .oflmflnommfi .oomfi~|ooN fiauwfl mlw wmumm .o~mH|owwH .owmmnommm .oowm uH> mwwmfiwmumønmw zoo o«~|ma ooowm >m ømumnuma « vann uxcnmufiwew mumxm mxofl lmnoflumnomnm wwms Eøuuxmmm mflmmfl>mm: nofluxmnu mamma .uomwwlmæfl | | I nfl> mmmmflwuuwwnßm zoo I flfl od ß m m« ~« = uxcsmuflwew anwxw wxufl omw ma uømmfi>mm: coflnxmuw macwo .uoovmlowfl mlß >|m ~«|o« = mwmøwmwwwmwmmmmmmwmmm o-|ma mwmmfl>mmn nofluxmuu mamma .Tao oNoTONZ sno oN~H|ovNfl .oæmfl .ovvfl .ofimfinommfl .omwfl .uommN|owfl Ofilm ßlm mwnov noæma .ommwnømmm .oowmuoown flfl> mmflmfiwmuwwcmm suo ofimlma >m cmumnnwc fl namn uxnømuflwäm mnmxm mxufl lmcoflumuomnm mums Esuuxmmm wwmmfi>mms nofluxmuw mccmo .w.z .w.m .w.u ^H|ao. ofluxmum ^cmøo»wE|HmM. mhuxwmm uxcømmmcflcflmmumwcæm fimmvumïmæflflcmumuøwëmfim ...mcoflumnomnmwmhmuunnfi . ummmxwüm ^.muH0Hv HH HHNQNB 457 ÛÛÛ 16 .Huan oomnomæ :oo oßm .o~oH zoæofi .ooflH|o«HH _o«mH|ow«fi .uoøma uw>w uHw>mmnfinxnmE:m mmmmflmu wlfi wnm ßmnwm .oumfiloæmfi .omwanomwfi .øomw luwwcwm soc Uoofifi mo nommm .oommnoomm >m cmumswwfi fl wfl> mmflmwumwcmm uum unmnmcoflumuomnm mums Enuuxwmw wumfinwn nofluxmuw mccwc .H|Eo mmm sno Oßm _omoH|o~HH .ONNH .uooow uw>m lommfi .owmfluoflvfi .owvaaowwfl uuw>mmcflcxumE:m mmmmflwø mlm wlw wmlmm .Oflmfllømma .OvwH|OwwH ~OmæN Iuwflflflm :OO OO0vH mo Owmlmfi .ommw .oommnoomm >m cwuwnumø fl wfl> mmamwumwcæm »ua wamnmcofiumuomam mmm: Eøuuxwmm wflmfinmn nofluxmum mccmn §|H ßlm FVINM : . : ONNIWB ena ßlm ßvnmm = = Owmuma w|H >|m ßwaæm = = Ofimlma H|Eo ooæxomæ :oo oßm .owoflroæofl .oommfi uw>m _ .ONHH .ommflzoæma .oowanomwa unm>mm:fl:xuwEcm møømflwø vid ßum ßw|æm _o«ma|oæmH .omwfllowwfi .omww lumwcmm :no uoomfi nu oomlmß .ommw .oonm|oomm >m nwumnuwn « UZMQmCOfluQHOWQN Gwuflfl Eflhvufiwàw UH> wßfiüflhwflflßw #95 wwmfiuæn cofiuxmuu mnnwn ^.mßHOwV HH HAGAMB 457 000 17 .f .f + .f .f .I w .f .f L. .f .f || .f + + + + I .f .f + .f .f .I .f .f + + .f .l .f .f + .f .f I .f .f + .f .f .f .f .f .f .f / . \ .f + .f . .f .f X .f .f .f .f .f \ / .f .f .f .f .f fiowuxmwn cofluxmwu aofluxmmu cofiuxmmu coflvxmmu aofluxmwn neflomfåzoq åumåownH hdmfiTqounëæ -..omßfäonwm :nomfloz -afluuåcflz nofluxmwumuwm ^.muHOwv HH Hamnmä 457 000 18 .nmsofluxmnw mmflHmmacw#um> wm wmwumwâocmm mcflcumä « ".En< en «@~|m«~ mnwc :oo = mm mo | om mo awmmoumsoflumuownw ø«> ommuma . En mwmnomm mums :oo = om mo | ON mo Gommoumcoflumuomnm flfl> Owmnma = = = Ommlmh = ._ 2 O @ ._ _. : OH mlrmB v En Owmswvm mama :oo ofl mo w om nu | wfl mv nwmmoumcoflumuomnm U«> oomlma En mwmnævm mnwc :oo ow mn I m nu om mo 1 ow mo cmmmoumcoflumnounm wfl> Om~|ma Ed mwmuomw anwa :oo om mn | Om mo mm du I ma du cwmmoumcofiumnownm w«> Ow~|mB E: wwmxmvw mums zoo ow mn | om nu mm mv I m mo nmmmoumcofiumuownm w«> Ommlmß | *Ed wwmlæww mun: zoo Ga mo w ON av | m mo :mmmoumcofiumuomnm m«> Omwnma ai: mwmnmww mama :oo om mo | Om mo mm mo I m mo cwmmoumuoflumnomnm wfl> Oflmlma _ t: :wmöäea S. EE .âš 4 |:«aom|ausoA vvs uuwëmmø nouovmfilvowmmnflocmm .o.> mm flmä :ofluxmum cwfisnfimësnwm ucfi>on a wmä uumëmmß moxøflm H mc«cwmHnmuum>. muuxmmm uxoæuuus ufimscflmuoum uxuhnuuø vamßwfinmxumm :mco«ßmn0mnmuuwHofl>muuH: ummmxmcwmm ^.muuOmv HH HAUQMB 457 000 19 De farmakologiska aktiviteterna hos de carcinostatiska substanserna enligt uppfinningen TF-210, TF-220, TF-230, TF-24o, TF-zso, :PF-Boo (TF-no. TF-32o, TF-33o), 'rF-34o och TF-350 beskrives nedan. Vid följande farmakologiska prov- ningar var den använda provsubstansen TF-210 erhållén enligt exempel 1, TF-220 enligt exempel 3, TF-230 enligt exempel 5, TF-240 enligt exempel 7, TF-250 enligt exempel 9, TF-310-1 enligt exempel ll (l), TF-310-2 enligt exempel 18, TF-320 enligt exempel 12, TF-330 enligt exempel 13, TF-340 enligt exempel l9, TF-350 enligt exempel 24 och TF-300 enligt exempel ll-18. (1) Immunostimulerande aktivitet.
Tre möss av ICR-stam (honor, ålder 6 veckor) användes för varje grupp. Var och en av de provade substanserna upplös- tes i en fysiologisk saltlösning och 0,2 ml av var och en av de erhållna lösningarna administrerades intraperitonealt till mössen. 24 timmar efter administreringen injicerades 0,2 ml av en kolsuspension framställd genom sammanblandning av l ml av Perikan Drawing Ink 17 Black (tillverkad av Günther- -Wagner Co., Ltd.) med 2 ml av en fysiologisk saltlösning innehållande 3 viktprocent gelatin intravenöst i mussvansen och efter 1, 5, 10 och 15 minuter från injektionen uppsam- lades 0,02 ml av blodet från kretsloppet med användning av en hematokritkapillär belagd med heparin samt utspäddes omedelbart och hemolyserades med 1,6 ml av en 0,1 viktprocent vattenlösning av natriumkarbonat. Denna lösning underkas- tades kolorimetri vid 675 nm och fagocytindex (K-värde) bestämdes enligt ekvationen enligt Halpern et al.
Till mössen i kontrollgrupperna adminístrerades 0,2 ml av en fysiologisk saltlösning. log CO - log C t-to - K varvid CO = kolpulverhalten i blodet vid tidpunkten to och C = kolpulverhalten i blodet vid tidpunkten t. 457 ÛÛÛ 20 Resultaten visas i tabellerna III-V.
Tabell III.
Substans Dosering K-värde, medelvärde (ma/k9> _ 3 0 1155 1 0 0273 TF 210 s 0f1198 1 0:0231 _ 1,5 0 1087 1 o 0346 TF 22° 3 021292 * 0f0289 _ 5 o 1028 I o 0175 TF 23° 10 011194 1 010334 _ 5 0 1109 i 0 0250 TF 24° 10 0f1127 I 0f04ea 5 0 0855 1 0 0131 TF 25° 10 021120 i 020329 x0ntr011 - 0,0348 1 0,003? Tabell IV.
Substans Dosering K-värde, medelvärde (mg/kg) _ _ 0 1 0 0580 1 0 0088 *TF 31° 1 1' 0f0776 1 0:01s8 _ 0 1 0 0468 = 0 0123 TF 32° 1' 0f071s 1 0:0040 _ 0 1 0 0601 1 o 0098 TF 33° 1' ofoses i 0:0102 K0ntr011 - 0,029s i 0,0o07 Anm.: *Provningen gencmfördes på en grupp innefattande fyra möss. 457 000 21 Tabell v.
Substans Dosering K-värde, medelvärde (mg/kg) _ s o,1292 i o,o229 *TF 34° io o,1oo1 i o,oz9s _ s o 0811 i o oooz TF 35° 1o of14s3 I ofozzs xoni-.roii - o,o4o8 i o,oo16 Anm.: *Provningen genomfördes på en grupp innefattande fyra möss. (2) Carcinostatisk aktivitet. (i) Antitumöraktivitet mot Ehrlich ascites-tumör.
Ehrlich ascites-tumörceller inympades intraperitonealt i möss av ICR-stam (honor, ålder 6 veckor) i en mängd av 1 x 105 provsubstanserna i en fysiologisk saltlösning och 0,2 ml av celler per mus. Därefter upplöstes var och en av var och en av de erhållna lösningarna administrerades intra- peritonealt till mössen en gång per dygn under 7 dygn i följd från det första dygnet efter inympningen av tumör- cellerna. Till kontrollgrupperna administrerades 0,2 ml av en fysiologisk saltlösning på samma sätt som enligt ovan.
Resultaten visas i tabellerna VI och VII. överlevnadsdygn för mössen i en grupp till vilken T/C = provsubstansen administrerades överlevnadsdygn för mössen i kontrollgruppen x 100 (%) 457 000 22 æ\0 æ\O OOH u.N H æ.mH | Haouwcøx m\m w\m wmH^ m.m 1 @_m~^ ß x m w\N w\~ HNHÅ «_@ M m.o~^ ß x Å om~|@a w\m æ\m w@H^ m.> | m.«~^ ß x m w\~ w\~ wmH^ @.m M ~.m~^ ß x A o«~|ma m\> w\> ww~^ @.« 1 m.æ~^ ß x m @\ß æ\> >>~^ ~.o W m.m~^ ß x H om~|m@ m\m w\ß mßH^ fl.~ | H.@~^ ß x m.H æ\fi w\~ mmH^ ~.w m w_-^ ß x ~.o o-|ma oH\m ofi\> mmH^ m.@ 1 m.@~^ ß x m.m oH\> o~\w HwH^ ß.m M ~.>~^ ß x ß.o øH~|@a øwcmcxmfiamflfiflu :män Om hmm Anmmcfluwnumflnflfiwm umwmcmumfiasu wu:m>mHHm>m Aæ. uuflnwñocmm umflmunm x mx\mEv >m mucmfifiwsußm >m mucmflfiwsumh U\H .:m>ømum:>wHHm>o mcfiummoo mcmumnøw .H> flflmnmß 457 000 23 w\o w\o ooH m.~ H w.wH I HHoH@=om æ\w w\w mßH^ o.ø 1 o.om^ ß x m | w\o æ\o ßHH H.H M w.mH ß x H omm ma w\m w\m HHHA H.m H o.«~^ ß x m æ\m æ\~ wwH^ m.H H m.w~^ F x H owmnma w\> w\ß @>H^ m.o H @_m~^ ß x H w\> w\> >>H^ w.o H w_m~^ ß x m.o om~|@e æ\> w\> >@H^ m.< | H.w~^ > x H | @\> w\> ~>H^ w.~ m o.m~^ ß x m.o own ma m\w w\w oßH^ m.~ 1 w_æ~^ F x H | | w\« w\H @wH^ m.« W m.-^ > x H.o H oHm ma Qflflflflufimflhwflflflu. SONG Om Hßw fihflüfifläühflflmflflflåßfl umfiflømvmfifløu wmnm>wHum>m Aw. uuflømëonmm umamucm x mx\mEv >m owcmfifimnnmm >m øøcmflflwfluwm o\B .nm>wwwmc>mHum>n mcflumwon mømumnøm .HH> Hflwßwß 457 ÛÛÛ 24 (ii) Antitumör aktivitet mot Sarcoma 180-celler. (a) Sarcoma 180-celler transplanterades intraperi- tonealt till möss av ICR-stam (honor, ålder 6 veckor) i en mängd av l-x 105 celler per mus. Därefter upplöstes var och en av provsubstanserna i en fysiologisk saltlösning och 0,2 ml av var och en av de erhållna lösningarna administre- rades intraperitonealt till mössen en gång per dygn under 7 dygn i följd från det första dygnet efter transplante- ringen av carcinomacellerna. Till kontrollgruppen administ- rerades 0,2 ml av en fysiologisk saltlösning på samma sätt som ovan. Resultaten visas i tabell VIII. 457 ÛÛÛ 25 m\o m\o oofi ~.~ N w.«H | Hfiouuaox m\~ m\« NQHA ~.m | «.m~^ ß x m m\« m\« »QHA o.~ M o_m~^ ß x H om~|ma m\m m\m mo~^ o.o a o.om^ N x m m\H m\~ m«~^ m.> u @.H~^ ß x fi ovwuma m\~ m\m mwH^ m.m | w.«~^ ß x m m\v m\« >mH^ @.H m ~.m~^ ß x H om~|ma m\m m\m no~^ o.o | o.om^ ß x m.H m\~ m\~ >>H^ o.m H m.@~^ ß x m.o o-|ma m\m w\m mo~^ o.o | o.o~^ ß x F m\v m\« ~wH^ @.m M ~.ß~^ ß a m." oH~|ma mflcmcxmflnwaflfiu Gmäw Om Hmm fiummnfiumuumficflšflm umflwcmumfiuøw mwnm>øfluw>ß S; vuflcmñonøm umflmncm x 9295 >fl UUGMHHWQHQQ _GD>®mwmG>wHhw>D mGfiHwm0Q mdflßmfläm >m mwnflflflmflnwh u\B .HHH> flfiwnmfi 457 ÛÛÛ 26 (b) Sarcoma l80~celler transplanterades subkutant vid armhâlan till möss av ICR-stam (honor, ålder 6 veckor) i en mängd av l x 107 celler per mus. Därefter upplöstes var och en av provsubstanserna i en fysiologisk saltlösning eller en 5 % vattenlösning av glukos och 0,2 ml av var och en av de erhållna lösningarna administrerades intravenöst eller intramuskulärt till mössen en gång per dygn under 7 dygn i följd från det första dygnet efter transplanteringen av carcinomacellerna. Till kontrollgrupperna administrerades 0,2 ml av en 5 % vattenlösning av glukos eller en fysiolo- gisk saltlösning på samma sätt som ovan. Resultaten visas i tabell VIII-(2). 457 000 27 oofi m«.o H «~.m = | Hfioupøom Om HN~O H mO.H = ß N H.o mfi m~.o H Hm.H = ß x mo.o vv mN.O H mm.N = ß X HO.O >fl N|OHmlmB mv mm.O H mm.N = ß X mOO~O Hm o~.o H >w.~ = > x Hoo.o oofi ~«.~ H «m.« = 1 | Hflouuuow mv Nv.O H wm.N = ß X fi.O Efl moxøflm >m vn mm.o fl >w.H m=«amnHcwu»m> W m ß x H.o >fl HF m«.o H om_~ = ß x ~.o efl owmnma am >>.O H vm~H = ß x fl~o >fi OOH Hm.O H mv.a = I 1 HHOHQQOM Om ofi.O H ww.O = ß x fi~o Efl mnflamnflufimw Hnoflmuma Om mfl.O H mN.O xmflmoaoflmæm ß x fi~O >fl mmumwflmmfl Aummnfluwuumflüflñflm Aæv Am. Gmmcmumnsw uwfimuøm x mx\mE. mw> u\e »xfl>»msøa nwxHfl> « «xm»w> wøfiuwmøn .eu< mamumnsm ..~v|HHH> flflmnma 457 000 28 wnofimzma :oo Ommzma umw m:mwnw> nwuuw uwcmæfl wuß »mv cmumufiflmmn nmwfl> Hloflmlwh Hmm mumu mc>flmcm cm>o .nmflfimunoæfi mfiouumm >m nmmøflumucmfimmnmnu umumw ummmhw anwa nwumuflømmu ummfl> .nmflflmuxoæfi mëooumm >m ammnflnmvamflmmcmuu 03 üuzo .. ä; _. | .Jäouuflom + Efi moxøflm >m mm 0n~o H æm_H mcfi:mæH:wuum> w m ß M H.O N|oHm|ma .muuom ^~.|HHH> Hfiwnma 457 ÛÛÛ 29 (iii) Antitumöraktivitet mot Ehrlich solid tumör.
Ehrlich-tumörceller transplanterades subkutant vid armhålan hos möss av ICR-stam (honor, ålder 6 veckor) i en mängd av 4 x 106 celler per mus. Därefter upplöstes var och en av provsubstanserna i en fysiologisk saltlösning eller en 5 % vattenlösning av glukos och 0,2 ml av varje av de erhållna lösningarna administrerades intraperitonealt till mössen en gång per dygn under 7 dygn i följd från det första dygnet efter transplanteringen av tumörcellerna eller en gång varannat dygn under 10 dygn från det 8:e dygnet efter trans- planteringen av tumörcellerna. Till kontrollgrupperna administrerades 0,2 ml av en fysiologisk saltlösning eller en 5 % vattenlösning av glukos på samma sätt som ovan.
Vikten av varje tumör bestämdes. Bestämningen av vikten av tumören genomfördes genom uppmätning av den största dia- metern (a mm) och den minsta diametern (b mm) med hjälp av skjutmâtt och insättning av de värden som erhölls för a och b i följande ekvation: 2 Tumörvikt = É-å-ä- (mg) Resultaten visas i tabellerna IX-(1) och IX-(2). 457 ÛÛÛ 30 COA ßw m~.H u m~.m ß x o~ E. .BJ H oïm ß x o." omTÉ. om mmfn H NOÃ~ ß M ON mm mß.O M >o.v ß x Ca O«N|mB @~ w@_o H «o.~ ß x o~ mm -.H u mw.N > x OH onwuhfi ~« .~.a u mæ.N . ß ~w .m .w _ > x m Nm H.~ H o«.« m .N .H amwo ß x n o-|@a mm m.A w ~w.~ F x > m~ >.o M wm_H > x m.m oH~|ßa ä ëmwafiå Amfiflwwmwgvwflfl *ua :män mflfißwm0% mzflumaøm ._H.|xH flflwnma 457 ÛÛÛ 31 |aw»»m> mflnwm nu fl mzflcmnfi fi www:w>nw Hnoflmnma .mmuumëamø cmnwfiøu >m nwuxfl> uw: :mun umo «« .« .woxsflw >m mcficmmfl .mcficmwfiufimm xmflmofloflmww cm fl maflnmmfimmø uwvuw mmwuw>nm om~|ma Hflfiu o-|ma ”.e=« wfl _vH ~NH mm Ho.~ H w>.« .ofl .m =m>a m x H Hvoflmume ^w_ ^mv Aummdflumuumflcflëwm 0\a uxfi>umEsa cmæmmcofiumuumflnfläøfl umfimucm x mx\mEV mflmumnøm mqflummoo ææmfi Gmæü ..~v|xH Hflwnma 457 ÛÛÛ 32 (iv) Antitumöraktivitet mot B-16-melanomceller. (a) B-16-melanomceller transplanterades subkutant i arm- hâlan hos möss av BDFl-stam (hanar, ålder 7 veckor) i en 6 celler per mus. Därefter upplöstes var och mängd av 1 x 10 en av provsubstanserna i en fysiologisk saltlösning och 0,2 ml av var och en av de erhållna lösningarna administre- rades intraperitonealt till mössen en gång per dygn under 7 dygn i följd från det första dygnet efter transplantering- en av tumörcellerna. Till kontrollgrupperna administrerades 0,2 ml av en fysiologisk saltlösning på samma sätt som ovan.
Vikterna av tumörerna bestämdes på det 17:e eller 23:e dygnet efter transplanteringen av tumörcellerna. Bestämningsmetoden var densamma som anges ovan (iii). Resultaten visas i tabell X. 457 000 33 . MÉHOHHÜUHÛEÜU >fl mwwswuwwn .mcuwflfimunmësu >ß cwwcfluwunmflmmcmuu umumm umcmæw annu www H|oHm|mH www cmuxH>HmE:u >m »wwnw>Hmuw2 :mwcfiumucmflmmcmuu uwumw uwnmæw w“BH »mv mmwsmumwa omwams Hfiflu oH~|ma www mcumuxfl>umEsu >m cmvuw>fiwUm2 ".E:« OCH mæ.O N oO.w I Hflouucøm mm Hw.H H mm.N B x m fi|oHm|ma oofi mm.o fl @B_« | Hfiouunom wm Bw.o 1 mB_~ B x od Nm mB_o N Bm_~ B x m omN|ma vw wm.H | oo.w B x OH BB @~_H M æB_m B w m o«~|ma BB wo.H 4 HB.m B.x cd Bm «w_o m H~.~ B x m om~»ma BB fiw.o | mw.m B x m Næ m~.~ m ~m_m B x m.H o-|ma vw ß.O M B0~n B x B ofiwuma AW. Uxa .av Bummcflumuumflcflñflm mcmumnøm uxfl>H$E!u >m uwfimuum X mx\mE_ m©uw>HwwmS mcfiummon .x AHOQMB 457 ÛÛÛ 34 (b) B-16-melanomceller transplanterades subkutant i arm- hâlan hos möss av BDFI-stam (hanar, ålder 6 veckor) i en mängd av l x 106 celler per mus. Därefter upplöstes prov- substansen i en 5%-ig vattenlösning av glukos och 0,2 ml av den erhållna lösningen administrerades samtidigt intratumört och intraperitonealt en gång vartannat dygn under 12 dygns tid från det 13:e dygnet efter transplanteringen av tumör- cellerna. Till kontrollgruppen administrerades till var och en 0,2 ml av en 5%-ig vattenlösning av glukos på samma sätt som ovan. Resultaten visas i tabell X-(2). 457 ÛÛÛ 35 .uwcmæfl wnmm umw umwnn mwuvwñmmø øwuxflbumfida oofl Ow~o M mw_m I Hflouucom _ m mm wm_o H ~m.H W w x o.H wß vw.o u ~m.« ufl w N m_O mm @~.o M w~.m w x o_oH ~|oHm|ms Oß ~ß.o H æ0.v ufi w x 0.m om m~.o H ~m.~ w x o- _æ. U\H Am. mw> fiumwflfiuwuumflcflfiflm mcmumnøm uxfl>umE:H .Emm vwflmudw N mx\mE. mflflummon .AN~|N Hflwnmfi -457 000 36 (3) Akut toxicitet.
LDSO-värden för möss (honor, ICR-stam, ålder 6 veckor, intra- venös administrering) visas i tabell XII. _ Tabell XII.
Substans LDSO (mg/kg TF-210 >lOO TF-220 >200 'rF-zao _ >1oo TF~24O >200 TF-250 >200 mr-:oo ' > io TF-340 >200 TF-350 >200 Såsom framgår av ovan angivna farmakologiska försök är TF-2- -substanserna enligt uppfinningen användbara såsom carcino- statiska medel, kan förväntas ha aktiviteter mot olika cancersjukdomar och kan förväntas ha markant aktivitet mot speciellt solid cancer. Samtliga TF-2-substanser enligt uppfinningen har mycket goda effekter.
TF-2-substanserna enligt uppfinningen kan användas efter anpassning till olika farmaceutiska former, såsom orala medel, injektionsmedel, suppositorier eller liknande, men de användes företrädesvis i farmaceutisk form för injektion.
När de användes såsom orala medel kan de orala medlen inne- hålla olika utspädningsmedel och kan formas till kapslar, tabletter, pulver eller granuler. När de användes såsom injektionsmedel kan injektionerna utföras såsom subkutana injektioner, intramuskulära injektioner och intravenösa injektioner och de kan användas i form av en suspension, en _lösning eller ett pulver, som upplöses i en saltlösning, eller också kan lösning innehållande glukos eller lokalbedöv- 457 000 37 ningsmedel användas.
Doseringen av TF-2-substanserna (TF-210, 220, 230, 240, 250, 300 (310, 320, 330), 340 och 350) enligt uppfinningen väljes på lämpligt sätt beroende pâ patientens tillstånd, men i all- mänhet är det önskvärt att administrera dem i en dosering för vuxen av 0,005 till 50 mg/kg en gång per dygn eller flera gånger per dygn, och vad beträffar administreringsmetoden administreras de företrädesvis genom subkutan, intramuskulär eller intravenös injektion eller injektion i det påverkade omrâdet.
Uppfinningen förklaras ytterligare i detalj i det följande under hänvisning till utföringsexempel och bifogade rit- ningar, i vilka figur l visar ett mikrofotografi, som åskådf liggör formen av Fusobacterium nucleatum TF-031 som användes enligt uppfinningen. Figur 2 visar infrarödabsorptions- spektrum för den carcinostatiska substansen TF-210, som erhålles enligt exempel 1, som anges i det följande. Figur 3 visar ultraviolettabsorptionsspektrum för denna substans.
Figur 4 visar infrarödabsorptionsspektrum för den carcino- statiska substansen TF-220, som erhålles enligt exempel 3.
Figur 5 visar ultraviolettabsorptionsspektrum för samma substans. Figur 6 visar infrarödabsorptionsspektrum för den carcinostatiska substansen TF-230 enligt exempel 5. Figur 7 visar ultraviolettabsorptionsspektrum för denna substans.
Figur 8 visar infrarödabsorptionsspektrum för den carcino- statiska substansen TF-240 enligt exempel 7. Figur 9 visar ultraviolettabsorptionsspektrum för denna substans. Figur 10 visar infrarödabsorptionsspektrum för den carcinostatiska substansen TF-250 enligt exempel 9. Figur ll visar ultra- violettabsorptionsspektrum för denna substans. Figur 12 visar infrarödabsorptionsspektrum för den carcinostatiska substansen TF-310, som erhålles enligt exempel ll. Figur 13 visar ultraviolettabsorptionsspektrum för denna substans.
Figur 14 visar ett högupplösande vätskekromatogram för denna substans. Figur 15 visar ett infrarödabsorptionsspektrum för den carcinostatiska substansen TF-320 enligt exempel 12. 4.57 ÛÛÛ 38 Figur 16 visar ett ultraviolettabsorptionsspektrum för denna substans. Figur 17 visar ett högupplösande vätskekromatogram för denna substans. Figur 18 visar ett infrarödabsorptions- spektrum för den carcinostatiska substansen TF-330, som er- hålles enligt exempel 13. Figur 19 visar ett ultraviolett- absorptionsspektrum för denna substans. Figur°2O visar ett högupplösande vätskekromatogram för denna substans. Figur 21 visar ett infrarödabsorptionsspektrum för den carcinostatiska substansen TF-330 (renad), som erhålles enligt exempel 13.
Figur 22 visar ett ultraviolettabsorptionsspektrum för denna substans. Figur 23 visar ett infrarödabsorptionsspektrum för den carcinostatiska substansen TF-310 (renad), som erhålles enligt exempel 18. Figur 24 visar ett ultraviolettabsorp- tionsspektrum för denna substans. Figur 25 visar ett hög- uppsamlande vätskekromatogram för denna substans. Figur 26 visar ett infrarödabsorptionsspektrum för den carcinostatiska substansen TF-340, som erhålles enligt exempel 19. Figur 27 visar ett ultraviolettabsorptionsspektrum för denna substans.
Figur 28 visar ett höguppsamlande vätskekromatogram för denna substans. Figur 29 visar ett infrarödabsorptionsspektrum för den carcinostatiska substansen TF-350, som erhålles enligt exempel 24. Figur 30 visar ett ultraviolettabsorptions- spektrum för denna substans. Figur 31 visar ett höguppsam- lande vätskekromatogram för denna substans.
Exempel l. (1) I en fermenteringsanordning med ett 10-liters kar (tillverkad av Marubishi Rika Kenkyusho) infördes 8 liter av ett TF-e-odlingsmedium innehållande 17'g tryptikaspepton, 10 g hjärtinfusion, 3 g jâstextrakt, 7,5 g natriumklorid, 12 g glukos, 10 g laktos, 0,1 g natriumsulfit och 0,5 g natriumtioglykolat per liter destillerat vatten. Odlings- mediet steriliserades 30 minuter vid l20°C. Efter kylning av odlingsmediet fördes kvävgas genom detta i en mängd av 100 ml/minut under 1 timmes tid. I detta odlingsmedium ympades 1 liter av en förkulturlösning av Fusobacterium nucleatum 'rF-osl (FERM-SQTI. ATcc-31647), som i förväg fram- 457 000 39 ställts genom odling därav i ett TF-e-odlingsmedium med samma sammansättning som ovan. Cellerna odlades 3 dygn vid 37°C med omrörning (30 varv/minut) under införing av kvävgas i en mängd av 65 ml/minut. Efter odlingen sattes till kulturen 160 g Celite och 80 g cellulosapulver och blandningen omrör- des samt filtrerades under reducerat tryck, så att man erhöll 7,8 liter av en bakteriefri överstâende vätska från odlingen. (2) Till 7,8 liter av den ovan angivna överstâende vätskan sattes 117 ml koncentrerad saltsyra för justering av pH hos den överstående vätskan till 2,0, varefter ll,7 liter etanol tillsattes till denna, så att man erhöll en 60%-ig vatten- -etanollösning, vilken därefter fick stå 24 timmar vid 4°C.
Därefter avlägsnades den överstâende vätskan genom dekante- ring och den återstående delen underkastades centrifugering (6 x 103 varv/minut, 5 minuter) vid 4°C för uppsamling av fällningen. Denna fällning tvättades med 400 ml av en 60%-ig vatten-etanollösning med ett pH av 2,0, 400 ml etanol, 200 ml aceton och 200 ml dietyleter i den angivna ordningsföljden samt torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 3,9 g pulver. (3) Det enligt (2) erhållna pulvret suspenderades i 25 ml vatten. pH-värdet hos den erhållna suspensionen justerades till 7,5-8,0 genom tillsats av lN vattenlösning av natrium- hydroxid och efter omrörning 30 minuter vid rumstemperatur tillsattes lN saltsyra för justering av pH till 4,0. Där- efter, efter omrörning 2 timmar med iskylning, underkastades 4 varv/minut, 10 minuter) blandningen centrifugering (1 x 10 för separering av fällningen från den överstâende vätskan.
Denna fällning tvättades med 10 ml vatten med ett pH av 4,0 och fällningen separerades från tvättvattnet genom centri- fugering (l x 104 varv/minut, 10 minuter). Tvättvätskan och den ovan angivna överstående vätskan sammanfördes och under- kastades den behandling som beskrives i exempel 9. Fäll- ningen tvättades med 10 ml etanol och torkades under redu- cerat tryck och man erhöll 1,5 g av den carcinostatiska substansen TF-210. 457 ÛÛÛ 40 Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-210 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorp- tionsspektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum därav visas på figur 2 resp. 3.
Exemgel 2. (1) I en fermenteringsanordning med ett 10-liters kar infördes 8 liter av ett TF-d-odlingsmedium innehållande 17 g tryptikaspepton, 20 g hjärtinfusion, 3 g jästextrakt, 7,5 g natriumklorid, 12 g glukos, 10 g laktos, 0,1 g natriumsulfit och 0,5 g natriumtioglykolat per liter destillerat vatten.
Odlingsmediet steriliserades 30 minuter vid l20°C. Efter kylning av odlingsmediet fördes kvävgas genom detta under l timme i en mängd av 100 ml/minut. I detta odlingsmedium ympades 1 liter förkultiverad lösning av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647), som beretts i för- väg genom odling därav i ett TF-d-odlingsmedium med samma sammansättning som anges ovan. Cellerna odlades 3 dygn vid 37°C med omrörning (30 varv/minut) under införing av kvävgas i en mängd av 65 ml/minut. Efter odlingen sattes till odlingslösningen 160 g Celite och 80 g cellulosapulver och den erhållna blandningen omrördes samt filtrerades under reducerat tryck, så att man erhöll 7,8 liter av en bakterie- fri överstående vätska av odlingen. (2) Till 7,8 liter av den överstående vätska som erhålles enligt ovan (1) sattes 117 ml av koncentrerad saltsyra för justering av pH hos den överstående vätskan till 2,0. Där- efter tillsattes 11,7 liter etanol till den överstående vätskan, så att man erhöll en 60%-ig vatten-etanollösning, vilken aärefter fick stå under 24 timmars tia vid 4°c.
Därefter avlägsnades den överstâende vätskan genom dekante- ring och den âterstående delen underkastades centrifugering (6 x 103 varv/minut, 5 minuter) Vid 4°C för uppsamling av fällningen. Denna fällning tvättades med 400 ml av en 60%-ig vatten-etanollösning med pH 2,0, 400 ml etanol, 200 ml aceton och 200 ml dietyleter i denna ordningsföljd samt tor- 457 000 41 kades under reducerat tryck, så att man erhöll 4,5 g pulver. (3) Detta pulver underkastades samma behandling som anges i exempel l (3), så att man erhöll 1,6 g av den carcinosta- tiska substansen TF-210.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-210 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorp- tionsspektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum därav var väsentligen identiska med de som erhållits enligt exempel 1.
Exempel 3. (1) I en fermenteringsanordning med volymen 10 liter in- fördes 8 liter av ett TF-e-odlingsmedium med samma samman- sättning som enligt exempel l. Odlingsmediet steriliserades 30 minuter vid l20°C. Efter kylning av odlingsmediet fördes kvävgas genom detta under l timme i en mängd av 100 ml/minut.
I detta odlingsmedium ympades l liter av en förkulturlösning av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647), som beretts i förväg genom odling i ett TF-e-odlingsmedium med samma sammansättning som ovan. Cellerna odlades 5 dygn vid 37°C med omrörning (30 varv/minut) under införing av kvävgas i en mängd av 65 ml/minut. Efter odlingen sattes till odlingsmediet 160 g Celite och 80 g cellulosapulver och den erhållna blandningen omrördes samt filtrerades under reducerat tryck, så att man erhöll 7,8 liter av en bakterie- fri överstående vätska av odlingslösningen. (2) Till 7,8 liter av den överstående vätska som erhålles enligt ovan (l) sattes ll? ml koncentrerad saltsyra för justering av pH hos den överstående vätskan till 2,0. Där- efter tillsattes ll,7 liter etanol till den överstående vätskan till bildning av en 60%-ig vatten-etanollösning, vilken därefter fick stå vid 4°C under 24 timmar. Därefter avlägsnades den överstående vätskan genom dekantering och den återstående delen underkastades centrifugering (6 x 103 varv/minut, 5 minuter) vid 4°C för uppsamling av fällningen. 457 000 42 Denna fällning tvättades med 400 ml av en 60%-ig vatten- -etanollösning med pH 2,0, 400 ml etanol, 200 ml aceton och 200 ml dietyleter i angiven ordningsföljd samt torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 4,9 g pulver. (3) Det pulver som erhålles ovan vid (2) suspenderades i 49 ml vatten. pH hos den erhållna suspensionen justerades till 7,5-8,0 genom tillsats av lN vattenlösning av natrium- hydroxid och efter omrörning 30 minuter vid rumstemperatur justerades pH hos suspensionen till 6,0 genom tillsats av lN saltsyra. Därefter omrördes suspensionen med iskylning 2 timmar, varefter blandningen underkastades centrifugering (1 x 104 ningen från den överstående vätskan. Denna fällning tvätta- varv/minut, 10 minuter) för separering av fäll- des med 5 ml vatten med pH 6,0 och fällningen separerades från tvättvätskan genom centrifugering (l x 104 varv/minut, 10 minuter). Fällningen tvättades med 10 ml etanol och torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 1,8 g av den carcinostatiska substansen TF-220.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-220 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorp- tionsspektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum för substansen visas på figur 4 resp. 5.
Exemgel 4. (1) I en fermenteringsanordning med ett kar med volymen 10 liter infördes 8 liter av ett TF-d-odlingsmedium med samma sammansättning som enligt exempel 2. Odlingsmediet steriliserades 30 minuter vid l20°C. Efter kylning av odlingsmediet fördes kvävgas genom detta under l timme i en mängd av 100 ml/minut. Vid detta odlingsmedium ympades l liter av en förkulturlösning av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647), som tidigare framställts genom odling i ett TF-d-odlingsmedium med samma sammansätt- ning som ovan. Cellerna odlades 5 dygn vid 37°C med omrör- ning (3O varv/minut) under införing av kvävgas 1 en mängd av 457 000 43 65 ml/minut. Efter odlingen sattes till odlingslösningen 160 g Celite och 80 g cellulosapulver och den erhållna bland- ningen omrördes och filtrerades under reducerat tryck, så att man erhöll-7,8 liter av en bakteriefri överstående vätska'av odlingen. (2) Till 7,8 liter av den enligt ovan erhållna överstående vätskan sattes 117 ml koncentrerad saltsyra för justering av pH hos den överstående vätskan till 2,0. Därefter tillsattes 11,7 liter etanol till den överstående vätskan, så att man erhöll en 60%-ig vatten-etanollösning, vilken därefter fick stå vid 4°C 24 timmar. Därefter avlägsnades lösningsdelen genom dekantering och den återstående delen underkastades centrifugering (6 x 103 varv/minut, 5 minuter) vid 400 för uppsamling av fällningen. Denna fällning tvättades med 400 ml 60%-ig vatten-etanollösning med pH 2,0, 400 ml etanol, 200 ml aceton och 200 ml dietyleter i angiven ordningsföljd samt torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 5,07 g av pulvret. (3) Det på detta sätt erhållna pulvret behandlades på samma sätt som enligt exempel 3 (3), så att man erhöll 1,9 g av den carcinostatiska substansen TF-220.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-220 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorp- tionsspektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum var i huvudsak identiska med de som erhållits enligt exempel 3.
Exemgel 5. (1) I en fermenteringsanordning med ett kar med volymen 10 liter infördes 8 liter av ett TF-e-odlingsmedium med samma sammansättning som enligt exempel l. Odlingsmediet sterili- serades 30 minuter vid l20°C. Efter kylning av odlingsmediet fördes kvävgas genom detta l timme med 100 ml/minut. Vid detta odlingsmedium ympades 1 liter av en förkulturlösning av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-S077, ATCC-31647), som 457 000 44 beretts i förväg genom odling i ett TF-e-odlingsmedium med samma sammansättning som ovan. Cellerna odlades 2 dygn vid 37°C med omrörning (30 varv/minut) under införing av kvävgas i en mängd-av 65 ml/minut. Efter odlingen sattes till odlingslösningen 160 g Celite och 80 g cellulosapulver och den erhållna blandningen omrördes samt filtrerades under reducerat tryck, så att man erhöll 7,8 liter av en bakterie- fri överstâende vätska av odlingen. (2) Till 7,8 liter av den enligt ovan (l) erhållna över- stående vätskan sattes 117 ml koncentrerad saltsyra för justering av pH till 2,0. Därefter tillsattes ll,7 liter etanol till den överstående vätskan till bildning av en 60%-ig vatten-etanollösning, vilken därefter fick stå vid 4°C 24 timmar tills fällningen hade avsatts fullständigt.
Därefter avlägsnades den överstâende vätskan genom dekante- ring och den återstående delen underkastades centrifugering (6 x 103 varv/minut, 5 minuter) vid 4°C för uppsamling av fällningen. Denna fällning tvättades med 400 ml av en 60%-ig vatten-etanollösning vid pH 2,0, 400 ml etanol, 200 ml aceton och 200 ml dietyleter i angiven ordningsföljd och torkades under reducerat tryck så att man erhöll 2,73 g pulver. (3) Det enligt ovan (2) erhållna pulvret suspenderades i 25 ml vatten. pH hos den erhållna suspensionen justerades till 7,5-8,0 genom tillsats av lN vattenlösning av natrium- hydroxid och suspensionen omrördes vid rumstemperatur 30 minuter, varefter lN saltsyra.tillsattes för justering av pH till 6,0. Därefter omrördes suspensionen med iskylning under 2 timmar och därefter underkastades den centrifugering (1 x 1o4 ningen från den överstående vätskan. Denna fällning tvätta- varv/minut, 10 minuter) för separering av fäll- des med 5 ml vatten med pH 6,0 och fällningen separerades 4 varv/minut, från tvättvätskan genom centrifugering (l x 10 10 minuter). Tvättvätskan och den överstående vätskan sammanfördes och den erhållna lösningen tilläts, efter justering av pH till 4,0 genom tillsats av lN saltsyra, att 457 000 45 stå vid en temperatur av icke mer än 5°C 12 timmar och under- kastades därefter centrifugering (1 x 104 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstående vätskan. Denna fällning tvättades med 15 ml vatten med pH. 4,0 och fällningen separerades från tvättvätskan genom centrifugering (1 x 104 varv/minut, 10 minuter) och fäll- ningen tvättades med 10 ml etanol samt torkades därefter under reducerat tryck, så att man erhöll 0,58 g av den carcinostatiska substansen TF-230.
Den sålunda erhållna carcinostatiska substansen TF-230 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorptions- spektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum för substansen visas på figur 6 resp. 7.
Exempel 6. (1) I en fermenteringsanordning med ett kar med volymen 10 liter infördes 8 liter av ett TF-d-odlingsmedium med samma sammansättning som enligt exempel 2. Odlingsmediet steriliserades 30 minuter vid l20°C. Efter kylning av odlingsmediet fördes kvävgas genom detta under 1 timmes tid i en mängd av 100 ml/minut. I detta odlingsmedium ympades l liter av en förkulturlösning av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647), som beretts i förväg genom odling i ett odlingsmedium med samma sammansättning som anges ovan. Cellerna odlades 2 dygn vid 37°C med omrörning (30 varv/minut) under införing av kvävgas i en mängd av 65 ml/minut. Efter odlingen tillsattes till odlingslösningen 160 g Celite och 80 g cellulosapulver och den erhållna bland- ningen omrördes och filtrerades under reducerat tryck, så att man erhöll 7,8 liter av en bakteriefri överstående vätska från odlingen. (2) Till 7,8 liter av den överstående vätskan som erhållits enligt ovan (1) sattes 117 ml koncentrerad saltsyra för justering av pH hos den överstående vätskan till 2,0. Där- efter tillsattes 11,7 liter etanol till den överstående 457 000 46 vätskan till bildning av en 60%-ig vatten-etanollösning, vilken aäreffier fick stå via 4°c under 24 timmar. Därefter avlägsnades den överstående vätskan genom dekantering och_ den återstående delen underkastades centrifugering (6 x 103 . varv/minut, 5 minuter) vid 4°C för uppsamling av fällningen.
Denna fällning tvättades med 400 ml av en 60%-ig vatten- -etanollösning med pH 2,0, 400 ml etanol, 200 ml aceton och 200 ml dietyleter i angiven ordningsföljd och torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 3,15 g pulver. (3) Det pulver som erhållits enligt ovan (2) behandlades på samma sätt som enligt exempel 5 (3), så att man erhöll 0,8 g av den carcinostatiska substansen TF-230. Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-230 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorptions- - spektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum för denna var väsentligen identiska med de som erhållits enligt exempel 5.
Exempel 7. (l) I 25 ml vatten suspenderades 3,9 g av det pulver som erhållits på samma sätt som enligt exempel 1 (1) och (2).
Genom tillsats av lN vattenlösning av natriumhydroxid justerades pH hos den erhållna suspensionen till 7,5-8,0 och efter omrörning av suspensionen vid rumstemperatur under 30 minuter justerades pH på nytt till 6,0 genom tillsats av 1N saltsyra. Efter omrörning 2 timmar med iskylning under- kastades suspensionen centrifugering (1 x 104 varv/minuter, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstâende vätskan. Denna fällning tvättades med 5 ml vatten med ett pH av 6,0 och fällningen separerades från tvättvätskan genom centrifugering (1 x 104 varv/minut, 10 minuter). Denna tvättvätska och den ovan angivna överstâende vätskan samman- fördes och underkastades den behandling som beskrivas i (2) nedan. Fällningen tvättades med 10 ml etanol och torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 1,06 g av den carcinostatiska substansen TF-220. 457 000 47 Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-220 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorp- tionsspektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum för denna var väsentligen identiska med de som erhållits enligt 4' exempel 3. I (2) Till den sammanförda lösningen bestående av den över- stående vätskan och tvättvätskan som erhållits enligt ovan (1) sattes 1N saltsyra för justering av pH till 4,0 och där- efter fick blandningen stå 12 timmar vid icke mer än 5°C.
Därefter underkastades blandningen centrifugering (1 x 104 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstående vätskan. Denna fällning tvättades med 5 ml vatten med pH 4,0 och fällningen samt tvättvätskan under- kastades centrifugering (1 x 104 varv/minut, 10 minuter).
Tvättvätskan sammanfördes med den ovan angivna överstående vätskan och den kombinerade lösningen underkastades den behandling som beskrives i (3) nedan. Fällningen tvättades med 5 ml etanol och torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 0,48 g av den carcinostatiska substansen TF-230.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-230 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorp- tionsspektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum för denna var väsentligen identiska med de som erhållits enligt exempel 5. (3) Till den kombinerade lösning, som bestod av den över- stående vätskan och tvättvätskan som erhållits enligt ovan (2), sattes lN saltsyra för justering av pH till 2,0 och blandningen fick stå 2 timmar med iskylning. Blandningen underkastades centrifugering (6 x 103 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstâende vätskan.
Denna fällning tvättades med 3 ml vatten med pH 2,0 och fäll- ningen samt tvättvätskan underkastades centrifigering (6 x 103 varv/minut, 10 minuter). Tvättvätskan sammanfördes med den ovan angivna överstående vätskan och den kombinerade lösningen underkastades den behandling som beskrives i (4) 457 D00 48 nedan. Fällningen tvättades med 5 ml etanol och torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 0,10 g av den carcinostatiska substansen TF-240.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-240 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infraröd- absorptionsspektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum för denna visas i figur 8 resp. 9. ß Q (4) Etanol tillsattes till den kombinerade lösning som bestod av den överstående vätskan och tvättvätskan som er- hållits ovan (3) till bildning av en 80%-ig vatten-etanol- lösning och vatten-etanollösningen fick stå vid icke mer än 5°C 12 timmar. Den substans som avsattes avlägsnades genom 3 varv/minut, 10 minuter) och det centrifugering (6-x 10 avsatta materialet tvättades med 10 ml av en 80%-ig vatten- -etanollösning och 10 ml etanol i angiven ordningsföljd samt torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 2,08 g av den carcinostatiska substansen TF-250.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-250 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorp- tionsspektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum för substansen var väsentligen identiska med de som erhölls enligt exempel 9 1 det följande. ' Exempel 8.
I 45 ml vatten suspenderades 4,5 g av ett pulver erhållet på det sätt som anges i exempel 2 (1) och (2). Genom tillsats av lN vattenlösning av natriumhydroxid justerades pH hos den erhållna suspensionen till 7,5-8,0 och efter omrörning vid rumstemperatur 30 minuter justerades pH på nytt till 4,0 genom tillsats av lN saltsyra. Suspensionen underkastades 4 varv/minut, 10 minuter) för separe- centrifugering (l x 10 ring av fällningen från den överstâende vätskan. Denna fällning tvättades med 5 ml vatten med pH 4,0 och fällningen samt tvättvätskan underkastades centrifugering (1 x 104 457 non 49 varv/minut, 10 minuter). Denna tvättvätska och den ovan angivna överstâende vätskan sammanfördes och pH hos den kom- binerade lösningen justerades till 2,0 genom tillsats av lN saltsyra, varefter lösningen fick stå 2 timmar under kylning' med isvatten, samt underkastades därefter centrifugering (s x 103 hållna fällningen från den överstâende vätskan. Den separe- rade fällningen tvättades med 3 ml vatten vid pH 2,0 och varv/minut, 10 minuter) för separering av den er- fällningen samt tvättvätskan underkastades centrifugering (6 x 103 varv/minut, lO minuter). Den erhållna fällningen tvättades med 5 ml etanol och torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 0,12 g av den carcinostatiska substansen TF-240.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-240 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorp- tionsspektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum för substansen var väsentligen identiska med de som erhölls enligt exempel 7.
Exemgel 9. (l) Till den kombinerade lösning, som bestod av den över- stâende vätskan och tvättvätskan som erhållits enligt exempel l (3), sattes lN saltsyra för justering av pH till 2,0 och därefter fick blandningen stå 2 timmar med iskylning.
Därefter underkastades blandningen centrifugering (6 x 103 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstâende vätskan. Denna fällning tvättades med 3 ml vatten med pH 2,0 och fällningen samt tvättvätskan under- kastades centrifugering (6 x 103 varv/minut, lO minuter).
Tvättvätskan kombinerades med den ovan angivna överstâende vätskan och den kombinerade lösningen underkastades en behandling som beskrives i (2) nedan. Fällningen tvättades med 5 ml etanol och torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 0,11 g av den carcinostatiska substansen TF-240.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-240 457 ÛÛÛ 50 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorp- tionsspektrum'och ultraviolettabsorptionsspektrum var väsent- ligen identiska med de som erhållits enligt exempel 7. (2) Etanol tillsattes till den kombinerade lösningen, som bestod av den överstående vätskan och tvättvätskan som er- hållits enligt ovan (1), till bildning av en 80%-ig vatten- -etanollösning och etanollösningen fick stå 12 timmar vid icke mer än 5°C. Den avsatta substansen avlägsnades genom centrifugering (6 x 103 varv/minut, 10 minuter) och avsätt- ningen tvättades med 10 ml av en 80%-ig vatten-etanollösning och 10 ml etanol i angiven ordningsföljd samt torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 2,1 g av den carcino- statiska substansen TF-250.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-250 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorp- tionsspektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum för denna visas i figur 10 resp. ll.
Exempel 10.
I 45 ml vatten suspenderades 4,5 g av ett pulver erhållet på samma sätt som anges i exempel 2 (l) och (2). Genom till- sats av lN vattenlösning av natriumhydroxid justerades pH hos den erhållna suspensionen till 7,5-8,0 och efter omrör- ning vid rumstemperatur 30 minuter justerades pH på nytt till 2,0 genom tillsats av lN saltsyra. Blandningen underkastades centrifugering (6 x 103 varv/minut, 10 minuter) för separe- ring av fällningen från den överstående vätskan. Denna fällning tvättades med 10 ml vatten med pH 2,0 och fäll- ningen samt tvättvätskan underkastades centrifugering (6 x 103 varv/minut, 10 minuter). Denna tvättvätska och den ovan angivna överstående vätskan sammanfördes och etanol tillsattes till lösningen till bildning av en 80%-ig vatten- -etanollösning. Lösningen fick stå 12 timmar vid icke mer än 5°C och underkastades därefter centrifugering (6 x 103 varv/minut, 10 minuter), så att man erhöll fällningen. Den 457 ÛÛÛ 51 separerade fällningen tvättades med 10 ml av en 80%-ig vat- ten-etanollösning och 10 ml etanol i angiven ordningsföljd samt torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 2,68 g av den carcinostatiska substansen TF-250. h Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-250 hade de egenskaper som visas 1 tabell II. Infrarödabsorp- tionsspektrum och ultraviolettabsorptionssbektrum för denna var väsentligen identiska med de som erhållits enligt exempel 9.
Exemggl ll . (1) I 15 ml vatten suspenderades 1,5 g av den carcinosta- tiska substansen TF-210, som erhållits enligt exempel l.
Till den erhållna suspensionen sattes lN vattenlösning av natriumhydroxid med omrörning för justering av pH hos sus- pensionen till 7,8. Suspensionen upphettades till 37°C och till denna sattes 15 mg Pronase E (varumärke för Kaken Kagaku; 1.000.000 tyrosinenheter/g) och flera droppar toluen.
Med omrörning underkastades blandningen enzymbehandling vid pH 7,8-8,0 vid 37-40°C 24 timmar. Efter behandlingen under- kastades blandningen centrifugering (4000 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstâende vätskan. Till fällningen sattes 3 ml vatten med ett pH av 8,0 och blandningen underkastades centrifugering (4000 varv/- minut, 10 minuter) för separering av fällningen från tvätt- vätskan. Denna tvättvätska och den ovan angivna överstâende vätskan sammanfördes och lN saltsyra tillsattes till denna för justering av pH till 2,0, varefter en fällning bildades.
Denna blandning fick stå vid 5°C 12 timmar och underkastades därefter centrifugering (l x 104 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstående vätskan. Till fällningen sattes 3 ml vatten med pH 2,0 och blandningen underkastades centrifugering (l x 104 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från tvättvätskan. Denna tvätt- vätska och den ovan angivna överstâende vätskan sammanfördes och etanol tillsattes till denna lösning till bildning av en 457 000 52 80%-ig vatten-etanollösning. Vatten-etanollösningen omrördes 2 timmar med iskylning och underkastades därefter centrifu- gering (4000 varv/minut, 10 minuter) för separering av fäll- ningen frân den överstâende vätskan. Fällningen tvättadés med 5 ml av en 80%-ig vatten-etanollösning och 5 ml etanol i denna ordningsföljd och torkades därefter under reducerat tryck, så att man erhöll 327 mg av den carcinostatiska substansen TF-310-fraktionen.
I 5 ml vatten upplöstes 327 mg av ovan angivna pulver och pH hos den erhållna lösningen justerades till 7,0 genom till- sats av lN vattenlösning av natriumhydroxid. Den på detta sätt beredda lösningen hälldes i en kolonn packad med 45 ml Amberlite IRA 400 (varumärke för Rohm and Haas), som i förväg justerats till OH-typ med lN vattenlösning av natriumhydroxid.
Därefter fördes 200 ml vatten genom kolonnen. Alla eluaten kombinerades och pH hos dessa justerades till 7,0 genom till- sats av lN saltsyra. Denna lösning koncentrerades under reducerat tryck och filtrerades därefter genom ett Millipore- -filter med en pordiameter av 0,3,um (Millipore: varumärke för Japan Millipore Limited) och frystorkades slutligen, så att man erhöll 210 mg av den frystorkade carcinostatiska substansen TF-310.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-310 hade de egenskaper som visas i tabell II och sackaridhalten var generellt ca 20-60 % uttryckt såsom glukos. Infraröd- absorptionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum och högupplösande vätskekromatogram av en typisk sådan visas i figur 12, l3 resp. 14. (2) I 50 ml vatten upplöstes 140 mg av den carcinostatiska substansen TF-310, som erhållits enligt ovan, och den erhåll- na lösningen koncentrerades till en koncentration av 100 gånger den ursprungliga med användning av Ultrafilter UK-50 (varumärke för ultrafiltermembran från Toyo Roshi Kabushiki Kaisha, nominell molekylviktsavskärning: 50.000). Detta koncentrat filtrerades genom ett Millipore-filter med en por- 457 000 53 diameter av 0,2,um och frystorkades därefter, så att man erhöll 88 mg av den renade, frystorkade carcinostatiska substansen TF-310. Den renade carcinostatiska substansen _ TF-310 som erhållits på detta sätt hade de egenskaper som visas i tabell II och sackaridhalten i denna var i allmänhet ca 16-30 % uttryckt såsom glukos.
Exemgel 12. (1) I 10 ml vatten suspenderades l g av den carcinostatiska substansen TF-220, som erhållits på samma sätt som enligt exempel 7 (1). Till den erhållna suspensionen sattes lN vattenlösning av natriumhydroxid med omrörning för justering av pH till 7,8. Blandningen upphettades till 37°C och till denna sattes 15 mg Pronase E och ett flertal droppar toluen.
Med omrörning underkastades blandningen enzymbehandling vid ett pn av 7,s-a,o vid 37-4o°c 24 timmer. Efter behandlingen underkastades blandningen centrifugering (4000 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstâende vätskan. Till fällningen sattes 3 ml vatten med ett pH av 8,0 och blandningen underkastades centrifugering (4000 varvl- minut, 10 minuter) för separering av fällningen från tvätt- vätskan. Denna tvättvätska och den ovan angivna överstående vätskan sammanfördes och till lösningen sattes lN saltsyra för justering av pH till 2,0, varefter en fällning bildades.
Denna blandning fick stå vid 5°C 12 timmar och underkastades därefter centrifugering (l.x 104 varv/minut, l0 minuter) för separering av fällningen från den överstående vätskan. Till fällningen sattes 3 ml vatten med ett pH av 2,0 och bland- ningen underkastades centrifugering (1 x 104 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från tvättvätskan.
Denna tvättvätska och den ovan angivna överstâende vätskan kombinerades och etanol tillsattes till denna lösning för bildning av en 80%-ig vatten-etanollösning. Vatten-etanol- lösningen omrördes 2 timmar med iskylning och underkastades därefter centrifugering (4000 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstâende vätskan. Fäll- ningen tvättades med 5 ml av en 80%-ig vatten-etanollösning 457 000 54 och 5 ml etanol i angiven ordningsföljd samt torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 163 mg av den carcino- statiska substans TF-320-fraktionen.
I 5 ml vatten upplöstes l50 mg av det ovan angivna pulvret och den erhållna lösningen justerades till ett pH av 7,0 genom tillsats av lN vattenlösning av natriumhydroxid. Den på detta sätt beredda lösningen hälldes i en kolonn fylld med 25 ml Amberlite IRA 400, som i förväg justerats till OH-typen med lN vattenlösning av natriumhydroxid. Därefter fördes 100 ml vatten genom kolonnen. Alla eluat samman- fördes och lN saltsyra tillsattes för justering av pH till 7,0. Denna lösning koncentrerades under reducerat tryck och filtrerades genom ett Millipore-filter med en pordiameter av 0,3;1m samt frystorkades slutligen, så att man erhöll 110 mg av den frystorkade carcinostatiska substansen TF-320.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-320 hade de egenskaper som visas i tabell II och sackaridhalten i denna var generellt ca 20-60 % uttryckt såsom glukos.
Infrarödabsorptionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum och högupplösande vätskekromatogram av typisk form visas pâ figur 15, l6 resp. 17. (2) I 50 ml vatten upplöstes 100 mg av den carcinostatiska substansen TF-320 erhållen enligt ovan och den erhållna lös- ningen koncentrerades till en koncentration av 100 gånger utgângskoncentrationen genom användning av Ultrafilter UK-50.
Detta koncentrat filtrerades genom ett Millipore-filter med en pordiameter av 0,2;4m och frystorkades därefter, så att man erhöll 72 mg av den renade, frystorkade carcinosta- tiska substansen TF-320. Den på detta sätt erhållna renade carcinostatiska substansen TF-320 hade de egenskaper som visas i tabell II och sackaridhalten var allmänt ca 16-30 % uttryckt såsom glukos. 457 000 55 Exemgel l3. (l) I 5 ml vatten suspenderades 0,48 g av den carcino- M statiska substansen TF-230, som erhållits på samma sätt som anges i exempel 7 (2). Till suspensionen sattes lN vatten- lösning av natriumhydroxid med omrörning för justering av pH till 7,8. Blandningen upphettades till 37°C och man till- sattes 5,0 mg Pronase E och ett flertal droppar toluen. Med omrörning underkastades blandningen enzymbehandling vid pH 7,8-8,0 vid 37-40°C under 24 timmars tid. Efter behand- lingen underkastades blandningen centrifugering (4000 varv/- minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstående vätskan. Till fällningen sattes 3 ml vatten med pH 8,0 och blandningen underkastades centrifugering (4000 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från tvättvätskan. Denna tvättvätska och den ovan angivna över- stående vätskan sammanfördes och till lösningen sattes lN saltsyra för justering av pH 2,0, varefter en fällning bildades. Denna blandning fick stå vid 5°C under 12 timmars tid och därefter underkastades den centrifugering (l x 104 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstàende vätskan. Till fällningen sattes 3 ml vatten med pH 2,0 och blandningen underkastades centrifugering (l x 104 varv/minut, 10 minuter) för separering av fäll- ningen från tvättvätskan. Denna tvättvätska och den ovan angivna överstâende vätskan sammanfördes och etanol till- sattes till denna lösning till bildning av en 80%-ig vatten- -etanollösning. Vatten-etanollösningen omrördes 2 timmar med iskylning och underkastades därefter centrifugering (4000 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstående vätskan. Fällningen tvättades med 5 ml av en 80%-ig vatten-etanollösning och 5 ml etanol i denna ordningsföljd samt torkades därefter under reducerat tryck, så att man erhöll 100 mg av den carcinostatiska substans TF-330-fraktionen.
I 5 ml vatten upplöstes 100 mg av det ovan angivna pulvret och pH hos den erhållna lösningen justerades till 7,0 genom 457 ÛÛÛ 56 tillsats av lN vattenlösning av natriumhydroxid. Den på detta sätt beredda lösningen hälldes i en kolonn fylld med 15 ml Amberlite IRA 400, som i förväg justerats till OH-typ med lN vattenlösning av natriumhydroxid. Därefter fördes 60 ml vatten genom kolonnen. Samtliga eluat sammanfördes och justerades till pH 7,0 genom tillsats av lN saltsyra.
Denna lösning koncentrerades under reducerat tryck och filt- rerades därefter genom ett Millipore-filter med en pordia- meter av O,3,um samt frystorkades slutligen, så att man erhöll 70 mg av den frystorkade carcinostatiska substansen TF-330.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-330 hade de egenskaper som visas i tabell II. Infrarödabsorpë tionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum och högupp- lösande vätskekromatogram av typisk form visas på figurerna l8, 19 resp. 20. (2) I 50 ml vatten upplöstes 70 mg av den carcinostatiska substansen TF-330, som erhållits enligt ovan, och den er- hållna lösningen koncentrerades till en koncentration av 100 gånger utgångskoncentrationen genom användning av Ultrafilter UK-50. Detta koncentrat filtrerades genom ett Millipore-filter med en pordiameter av 0,2/rm samt frys- torkades därefter, så att man erhöll 49 mg av den renade, frystorkade carcinostatiska substansen TF-330. Den renade carcinostatiska substansen TF-330, som erhölls på detta sätt, hade de egenskaper som visas i tabell II och sackaridhalten i denna var generellt ca 16-30 % uttryckt i glukos. Infra- rödabsorptionsspektrum och ultraviolettabsorptionsspektrum för en typisk TF-330 visas på figur 21 resp. 22.
Exempel 14. (l) På samma sätt som anges i exempel 2 (3), 7 (1) eller 7 (2) behandlades 4,5 g av den substans, som erhållits på samma sätt som anges i exempel 2 (1) och (2), så att man erhöll den carcinostatiska substansen TF-210, TF-220 resp. 457 ÛÛÛ 57 TF~230. (2) Den carcinostatiska substansen TF-210, TF-220 eller TF-230, som erhållits enligt (1), behandlades på samma sätt som anges i exempel ll (l), exempel 12 (1) eller exempel 13 (1), så att man erhöll den frystorkade carcinostatiska substansen TF-310, TF-320 eller TF-330 i en mängd av 220, 120 resp. 75 mg.
De på detta sätt erhållna carcinostatiska substanserna TF-310, TF~320 och TF-330 hade de egenskaper som visas i tabell II och de. infrarödabsorptionsspektra, ultraviolett- absorptionsspektra samt högupplösande vätskekromatogram, som var väsentligen identiska med de som erhållits enligt exempel 11, 12 resp. 13.
Exempel 15.
Pâ samma sätt som anges i exempel ll behandlades 1,5 g av den carcinostatiska substansen TF-210, som erhållits enligt exempel 1, med undantag av att (a) 15 mg trypsin (tillverkad av Difcc) användes i stället för Pronase E vid enzymbehand- lingen och (b) en 60%-ig vatten-etanollösning bereddes i stället för den 80%-iga vatten-etanollösningen, när fäll- ningen uppsamlades från den vattenlösliga delen med ett pH av 2 efter enzymbehandlingen. Pâ detta sätt erhölls 200 mg av den frystorkade, carcinostatiska substansen TF-310.
Pâ samma sätt erhölls följande frystorkade, carcinostatiska substanser TF-320 och TF-330.
Carcinostatisk Frystorkad, substans Trypsin carcinostatisk substans TF-220 l g 15 mg TF-320 100 mg TF-230 0,48 g 5 mg TF-330 65 mg De enligt ovan erhållna carcinostatiska substanserna TF-310, 457 000 d 58 TF-320 och TF-330 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorptionsspektra, ultraviolettabsorptions- ' spektra samt högupplösande vätskekromatogrammen var väsent- ligen identiska med de som erhölls enligt exempel ll, 12 resp. 13 (l).
Exempel 16.
De carcinostatiska substanserna TF-210, TF-220 eller TF-230, som erhölls enligt exempel 1, exempel 7 (l) eller exempel 7 (2), behandlades på samma sätt som enligt exempel ll (l), exempel 12 (l) eller exempel l3 (l), med undantag av att efter enzymbehandlingen bereddes en 60%-ig vatten-etanol- lösning i stället för den 80%-iga vatten-etanollösningen, när fällningen uppsamlades från den vattenlösliga delen med ett pH av 2,0. De frystorkade, carcinostatiska substanserna TF-310, TF-320 och TF-330 erhölls sålunda i mängder av 190, 98 resp. 66 mg.
De på detta sätt erhållna carcinostatiska substanserna TF-310, TF-320 och TF-330 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorptionsspektra, ultraviolettabsorptions- spektra samt högupplösande vätskekromatogrammen var väsent- ligen identiska med de som erhölls enligt exempel ll, l2 resp. l3 (l).
Exempel 17.
De carcinostatiska substanserna TF-210, TF-220 eller TF-230, som erhölls enligt exempel l, exempel 7 (l) resp. exempel 7 (2), behandlades pâ samma sätt som enligt exempel ll (l), exempel 12 (1) resp. exempel 13 (1), men efter enzymbehand- lingen och i stället för uppsamlingen av fällningen från den vattenlösliga delen med ett pH av 2,0 tillvaratogs den genom tillsats av en 40%-ig triklorättiksyravattenlösning följt av tillsats av etanol till den vattenlösliga delen, så att man erhöll en 80%-ig vatten-etanollösning, samt underkastades samma efterföljande behandling som vid resp. exempel, så att man erhöll 192 mg, lO2 mg resp. 65 mg av de frystorkade, 457 000 59 ' carsinostatiska substanserna TF-310, TF-320 resp. TF-330.
De på detta sätt erhållna carcinostatiska substanserna TF-310, TF-320 och TF-330 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorptionsspektra, ultraviolett- absorptionsspektra samt högupplösande vätskekromatogrammen var väsentligen identiska med de som erhölls enligt exempel ll, 12 resp. 13 (1).
Exemgel 18.
I en fermenteringsanordning med ett 90-liters kärl (MSJ-U2- -typ, tillverkad av Marubishi Rika Kenkyusho) infördes ett TF-f-cdlingsmedium framställt genom tillsats till 70 liter destillerat vatten av 1190 g tryptikaspepton, 1050 g hjärt- infusion, 210 g jästextrakt, 525 g natriumklorid, 840 g glukos, 700 g laktos, 7 g natriumsulfit, 35 g natriumtio- glykolat och 175 g sekundärt kaliumfosfat. Odlingsmediet steriliserades vid ll8°C 15 minuter. Efter kylning fördes kvävgas genom mediet i en mängd av 250 ml/minut under l timmes tid.
I detta odlingsmedium ympades ca 900 ml av en förodlad lös- ning av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC- -31647), som i förväg beretts genom förodling i en TF-f- -odling med samma sammansättning som ovan. Cellerna odlades 4 dygn vid ca 33°C med omrörning (90 varv/minut) under in- föring av kvävgas i en mängd av 250 ml/minut. Efter odlingen sattes till odlingslösningen 10 g/liter Celite och 5 g/liter cellulosapulver och blandningen omrördes samt filtrerades under reducerat tryck, så att man erhöll ca 65 liter av en bakteriefri överstående vätska av odlingen. (2) Till 7,5 liter av den ovan angivna överstàende vätskan sattes 113 ml koncentrerad saltsyra för justering av pH hos den överstående vätskan till 2,0. Därefter tillsattes 11,4 liter etanol till den överstående vätskan till bildning av en 60%-ig vatten-etanollösning, vilken därefter fick stå 457 ÛÛÛ 50 vid 4°C 24 timmar. Därefter avlägsnades lösningsdelen genom dekantering och den återstående delen underkastades centri- fugering (4 x 103 varv/minut, 10 minuter) vid 4°C för upp- samling av fällningen. Denna fällning tvättades med två" b 100-ml portioner av en 60%-ig vatten-etanollösning med pH 2,0, med en 150-ml portion av etanol, med en 150-ml portion av metanol och slutligen med en 150-ml portion aceton i angiven ordningsföljd samt lufttorkades, så att man erhöll 3,0 g pulver. (3) Det pulver som erhållits vid (2) ovan suspenderades i 30 ml vatten. pH hos den erhållna suspensionen justerades till 7,5-8,0 genom tillsats av 4N vattenlösning av natrium- hydroxid och efter omrörning vid rumstemperatur 15 minuter justerades pH på nytt till 4,0 genom tillsats av 4N saltsyra.
Därefter fick suspensionen stå med iskylning 2 timmar, bland- 4 varv/minut, ningen underkastades centrifugering (1 x 10 10 minuter) för separering av fällningen från den överstående vätskan. Till den separerade fällningen sattes 6 ml vatten för tvättning, varigenom en suspension bildades, till vilken 4N vattenlösning av natriumhydroxid sattes för justering av pH till 7,5-8,0. Suspensionen omrördes vid rumstemperatur 15 minuter, varefter 4N saltsyra tillsattes till suspensionen för justering av pH till 4,0 och suspensionen fick stå 2 timmar med iskylning. Därefter underkastades suspensionen centrifugering (l x 104 varv/minut, 10 minuter) för uppsam- ling av fällningen. Denna fällning tvättades med 4 ml vatten 4 varvl- med pH 4,0 och underkastades centrifugering (1 x 10 minut, 10 minuter), så att man erhöll 6,2 g (våt vikt) av en fällning (TF-210).
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-210 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorp- tionsspektrum samt ultraviolettabsorptionsspektrum för substansen var väsentligen identiska med de som erhållits enligt exempel l. (4) Fällningen (6,2 g (våt vikt)), som erhållits enligt (3) 457 ÛÛÛ 61 ovan, suspenderades i 6 ml vatten. Till suspensionen sattes, med omrörning, en mättad vattenlösning av ammoniumkarbonat för justering av pH hos suspensionen till 7,8. Suspensionen upphettades till 37°C och till denna sattes 21 mg Pronase E och därefter ett flertal droppar toluen. Den erhållna blandningen underkastades, med omrörning, enzymbehandling vid ett pa av 7,s-a,o vid 37-4o°c under 24 timmars eid. pH hos den på detta sätt behandlade blandningen justerades till l,0 genom tillsats av 4N saltsyra, varefter en fällning bildades. Denna suspension fick stå 2 timmar med iskylning och underkastades därefter centrifugering (1 x 104 varvl- minut, 10 minuter) för uppsamling av den överstående vätskan.
Till den överstående vätskan sattes 29 ml etanol till bild- ning av en 60%-ig etanol-vattenlösning, varefter en fällning bildades. Denna uppslamning fick stå 2 timmar med iskylning och underkastades därefter centrifugering (6 x 103 varv/minut, 10 minuter) för uppsamling av fällningen. Den uppsamlade fällningen tvättades med 5 ml 60%-ig vatten-etanollösning, l0 ml etanol och l0 ml aceton i denna ordningsföljd samt lufttorkades, så att man erhöll 315 mg råa kristaller av den carcinostatiska substansen TF-310.
De råa kristallerna (3l5 mg) upplöstes i 30 ml vatten och 4N vattenlösning av natriumhydroxid tillsattes för justering av pH till 8,0. Den erhållna lösningen hälldes i en kolonn packad med 30 ml Dowex lx4 (varumärke för Dow Chemical) Cl-typ. Därefter fördes l00 ml vatten genom kolonnen och alla eluaten sammanfördes, justerades till pH 6,5-7,0 och filtrerades genom Ultrafilter UK-50, varefter filtratet koncentrerades till en koncentration av 100 gånger utgångs- värdet. Detta koncentrat filtrerades genom ett Millipore- -filter med en pordiameter av O,3,um och frystorkades där- efter, så att man erhöll 230 mg av den frystorkade, renade, carcinostatiska substansen TF-310.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-310 hade de egenskaper som visas i tabell II och sackaridhalten i denna var i allmänhet ca 16-30 % uttryckt såsom glukos. 457 ÛÛÛ 62 Infrarödabsorptionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum och högupplösande vätskekromatogram som är typiska visas på figur 23, 24 resp. 25.
Exemgel 19.
I 10 ml vatten suspenderades 0,9 g av den carcinostatiska substansen TF-240, som erhållits på samma sätt som enligt exempel 7 (3), och lN vattenlösning av natriumhydroxid till- sattes till den erhållna suspensionen med omrörning för justering av pH till 7,8. Efter upphettning till 37°C sattes till suspensionen 9 mg Pronase E och flera droppar toluen i denna ordningsföljd. Den erhållna blandningen underkastades, med omrörning, enzymbehandling vid 37-40°C vid pH 7,8-8,0 under 24 timmars tid. Den behandlade bland- ningen underkastades centrifugering (4000 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstående vätskan. Till fällningen sattes 3 ml vatten med pH 8,0 och den erhållna suspensionen underkastades centrifugering (4000 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från tvättvätskan. Tvättvätskan och den ovan angivna över- stående vätskan sammanfördes och lN saltsyra tillsattes till den sammanförda lösningen för justering av pH till 2,0, var- efter en fällning bildades. Den erhållna uppslamningen tilläts stå vid S°C 12 timmar och underkastades därefter centrifugering (1 x 104 varv/minut, 10 minuter) för separe- ring av fällningen från den överstâende vätskan. Till fäll- ningen sattes 5 ml vatten med pH 2,0 och den erhållna sus- pensionen underkastades centrifugering (l x 104 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från tvättvätskan.
Denna tvättvätska och den ovan angivna överstående vätskan sammanfördes och etanol tillsattes till den kombinerade lösningen till bildning av en 80%-ig vatten-etanollösning.
Vatten-etanollösningen omrördes 2 timmar med iskylning och underkastades därefter centrifugering (1 x 104 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstâende vätskan. Denna fällning tvättades med 5 ml av en 80%-ig vatten-etanollösning och 5 ml etanol i denna ordningsföljd 457 ÛÛÛ 63 samt torkades under reducerat tryck, så att man erhöll 170 mg av den carcinostatiska substans TF-340-fraktionen.
I 5 ml vatten upplöstes 150 mg av detta pulver och pH hos den erhållna lösningen justerades till 7,0 genom tillsats av 1N vattenlösning av natriumhydroxid. Denna lösning hälldes i en kolonn fylld med 25 ml Amberlite IRA 400, som i förväg justerats till OH-typ genom användning av lN vattenlösning av natriumhydroxid. Därefter fördes 100 ml vatten genom kolonnen och hela mängden eluat sammanfördes samt justerades till pH 7,0 genom tillsats av lN saltsyra. Den erhållna lösningen koncentrerades under reducerat tryck och filtrera- des genom ett Millipore-filter med en pordiameter av O,3;1m samt frystorkades därefter, så att man erhöll 110 mg av den frystorkade, carcinostatiska substansen TF-340.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-340 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorp- tionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum samt högupp- lösande vätskekromatogram för substansen visas på figur 26, 27 resp. 28.
Exempel 20.
Pâ samma sätt som anges i exempel 19 behandlades 0,9 g av den carcinostatiska substansen TF-240, som erhållits på samma sätt som enligt exempel 8, för erhållande av 115 mg av den frystorkade, carcinostatiska substansen TF-340.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-340 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorp- tionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum samt högupp- lösande vätskekromatogram för substansen var väsentligen identiska med de som erhållits enligt exempel 19.
Exempel 21.
Pâ samma sätt som enligt exempel 19 behandlades 0,9 g av den 457 ÛÛÛ 64 carcinostatiska substansen TF-240, som erhållits enligt exempel 7 (3)} med undantag av att (a) enzymbehandlingen genomfördes med användning av 9 mg trypsin (framställt av Difco) i stället för Pronase E och (b) efter enzymbehand- H lingen, vid tillvaratagande av fällningen från den vatten- lösliga delen med pH 2,0, en 60%-ig vatten-etanollösning bereddes i stället för den 80%-iga vatten-etanollösningen.
Sålunda erhölls 105 mg av den frystorkade, carcinostatiska substansen TF-340.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TP-340 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorp- tionsspektrum samt ultraviolettabsorptionsspektrum för substansen var väsentligen identiska med de som erhållits enligt exempel 19.
Exempel 22.
Den carcinostatiska substansen TF-240, som erhållits enligt exempel 7 (3) behandlades på samma sätt som enligt exempel 19, med undantag av att efter enzymbehandlingen, efter tillvara- tagande av fällningen från den vattenlösliga delen med pH 2,0, en 60%-ig vatten-etanollösning bereddes i stället för den 80%-iga vatten-etanollösningen. På detta sätt erhölls ldl mg av den frystorkade, carcinostatiska substansen TF-340.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-340 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorp- tionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum samt högupp- lösande vätskekromatogram för substansen var.väsent1igen identiska med de som erhölls enligt exempel 19.
Exempel 23.
Den carcinostatiska substansen TF-240, som erhållits enligt exempel 7 (3), underkastades samma enzymbehandling som enligt exempel 19, varefter man i stället för tillvaratagandet av fällningen från den vattenlösliga delen med ett pH av 2,0 457 ÛÛÛ 65 tillvaratog fällningen genom tillsats av 40%-ig triklor- ättiksyra till en triklorättiksyrakoncentration av 10 % och beredde den vattenlösliga del som erhölls på detta sätt till en 80%-ig vatten-etanollösning, varefter man genomförde samma behandling som enligt exempel 19 för erhållande av 99 mg av den frystorkade, carcinostatiska substansen TF-340.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-340 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorp- tionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum samt högupp- lösande vätskekromatogram för substansen var väsentligen identiska med de som erhölls enligt exempel 19.
Exempel 24.
I 10 ml vatten suspenderades 0,82 g av den carcinostatiska substansen TF-250, som erhållits på samma sätt som enligt exempel 7 (4), och lN vattenlösning av natriumhydroxid till- sattes med omrörning för justering av pH till 7,8. Efter upphettning till 37°C sattes till suspensionen 8 mg Pronase E och ett flertal droppar toluen i denna ordningsföljd. Den erhållna blandningen underkastades, med skakning, enzymbe~ handling via pn 1,a-s,o via s7-4o°c 24 timmar. Den behand- lade blandningen underkastades centrifugering (4000 varv/- minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstående vätskan. Till fällningen sattes 3 ml vatten med pH 8,0 och den erhållna suspensionen underkastades centrifugering (4000 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från tvättvätskan. Denna tvättvätska och den ovan angivna överstâende vätskan sammanfördes, lN saltsyra tillsattes för justering av pH till 2,0, varefter en fällning bildades. Den erhållna uppslamningen fick stå vid 5°C 12 timmar och underkastades därefter centrifugering (l x 104 varv/minut, 10 minuter) för separering av fällningen från den överstâende vätskan. Till fällningen sattes 5 ml vatten med 2,0 och den erhållna suspensionen underkastades centri- fugering (l x 104 varv/minut, l0 minuter) för separering av fällningen från tvättvätskan. Denna tvättvätska och den 457 ÛÛÛ 66 ovan angivna överstående vätskan sammanfördes och etanol tillsattes till den kombinerade lösningen till bildning av en 80%-ig vatten-etanollösning. Vatten-etanollösningen om- rördes 2 timmar med iskylning och underkastades därefter- 4 varv/minut, 10 minuter) för separe- centrifugering (1 x 10 ring av fällningen från den överstående vätskan. Denna fällning tvättades med 5 ml av en 80%-ig vatten-etanollös- ning och 5 ml etanol i denna ordningsföljd samt torkades under reducerat tryck för erhållande av 430 mg av den carcinostatiska substans TF-350-fraktionen.
I 5 ml vatten upplöstes 300 mg av detta pulver och lN vatten- lösning av natriumhydroxid tillsattes till den erhållna lösningen för justering av pH till 7,0. Denna lösning häll- des i en kolonn packad med 45 ml Amberlite IRA 400, som i förväg justerats till OH-typ med användning av lN vatten- lösning av natriumhydroxid. Därefter fördes 200 ml vatten genom kolonnen och hela mängden eluat sammanfördes och justerades till pH 7,0 genom tillsats av lN saltsyra. Den erhållna lösningen koncentrerades under reducerat tryck och filtrerades genom ett Millipore-filter med en pordiameter av 0,3A;un och frystorkades därefter, så att man erhöll 260 mg av den frystorkade, carcinostatiska substansen TF-350.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-350 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorp- tionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum och högupp- lösande vätskekromatogram för substansen visas på figur 29, 30 resp. 31.
Exempel 25.
Pâ samma sätt som anges i exempel 24 underkastades 0,85 g av den carcinostatiska substansen TF-250 erhâllen enligt exempel 9 enzymbehandling med användning av 8 mg Pronase E för erhållande av 265 mg av den frystorkade, carcinostatiska substansen TF-350. 457 ÛÛÛ 67 Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-350 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorp- tionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum samt högupp: lösande vätskekromatogram för substansen var väsentligen identiska med de som erhölls enligt exempel 24.
Exempel 26.
På samma sätt som anges i exempel 24 underkastades 0,80 g av den carcinostatiska substansen TF-250 erhållen enligt exempel 10 enzymbehandling med användning av 8 mg Pronase E, så att man erhöll 253 mg av den frystorkade, carcinostatiska substansen TF-350.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-350 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorp- tionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum samt högupp- lösande vätskekromatogram för substansen var väsentligen identiska med de som erhållits enligt exempel 24.
Exempel 27.
Pâ det sätt som anges i exempel 24 behandlades 0,85 g av den carcinostatiska substansen TF-250, som erhållits enligt exempel 7 (4), med undantag av att (a) enzymbehandlingen genomfördes med användning av 8 mg trypsin (tillverkat av Difco) i stället för Pronase E och (b) efter enzymbehand- lingen, vid uppsamling av fällningen från den vattenlösliga delen med pH 2,0, bereddes en 60%-ig vatten-etanollösning i stället för den 80%-iga vatten-etanollösningen, så att man erhöll 247 mg av den frystorkade, carcinostatiska substansen TF-350.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-350 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorp- tionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum samt högupp- lösande vätskekromatogram för substansen var väsentligen identiska med de som erhållits enligt exempel 24. 457 000 68 Exempel 28. 0,85 g av den carcinostatiska substansen TF-250, som erhål- lits på samma sätt som enligt exempel 7 (4), behandlades på samma sätt som enligt exempel 24, med undantag av att efter enzymbehandling vid uppsamling av fällningen från den vatten- lösliga delen med ett pH av 2,0 bereddes en 60%-ig vatten- -etanollösning i stället för den 80%-iga vatten-etanollös- ningen, så att man erhöll 242 mg av den frystorkade, carcino- statiska substansen TF-350.
Den på detta sätt erhållna TF-350 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorptionsspektrum, ultra- violettabsorptionsspektrum samt högupplösande vätskekromato- gram för substansen var väsentligen identiska med de som erhållits enligt exempel 24.
Exempel 29. 0,8 g av den carcinostatiska substansen TF-250, som erhållits på samma sätt som enligt exempel 7 (4), underkastades samma enzymbehandling som enligt exempel 24, varefter i stället för tillvaratagande av fâllningen från den vattenlösliga delen med ett pH av 2,0 fällningen tillvaratogs genom till- sats av en 40%-ig triklorättíksyravattenlösning till den erhållna lösningen till bildning av en 10%-ig triklorättik- syralösning och tillsats av etanol till den vattenlösliga del som erhölls på detta sätt till bildning av en 80%-ig vatten-etanollösning och därefter genomfördes samma efter- behandlingar som enligt exempel 24, så att man erhöll 238 mg av den frystorkade, carcinostatiska substansen TF-350.
Den på detta sätt erhållna carcinostatiska substansen TF-350 hade de egenskaper som visas i tabell II och infrarödabsorp- tionsspektrum, ultraviolettabsorptionsspektrum samt högupp- lösande vätskekromatogram för denna var väsentligen identiska med de som erhållits enligt exempel 24. 457 ÛÛÛ 69 Preparationsexempel l.
En utspädd vattenlösning av natriumhydroxid tillsattes till 3-4 mg av den carcinostatiska substansen TF-210 i pulverform, så att man erhöll en lösning med pH 7,0-7,5. Den vatten- lösliga delen av den erhållna lösningen infördes i en ampull och frystorkades. Detta material upplöses, vid användning, i en steriliserad fysiologisk saltlösning, en O,5%-ig lido- kainlösning, en 5%-ig vattenlösning av glukos eller liknande och den erhållna lösningen användes för injektion.
Preparationsexempel 2.
En utspädd vattenlösning av natriumhydroxid tillsattes till 2-3 mg av den carcinostatiska substansen TF-220 i pulverform, så att man erhöll en lösning med pH 7,0-7,5. Den vatten- lösliga delen av den erhållna lösningen infördes i en ampull och frystorkades. Det erhållna materialet upplöses vid an- vändning i en steriliserad fysiologisk saltlösning, en 0,5%-ig lidokainlösning, en 5%fig vattenlösning av glukos eller liknande och den erhållna lösningen användes för injektion.
Preparationsexempel 3.
En utspädd vattenlösning av natriumhydroxid tillsattes till 1 mg av den carcinostatiska substansen TF-230 i pulverform till bildning av en lösning med PH 7,0-7,5. Denna lösning beskickades i en ampull och frystorkades. Detta material upplöses vid användning i en steriliserad fysiologisk salt- lösning, en 0,5%-ig lidokainlösning, en 5%-ig vattenlösning av glukos eller liknande och den erhållna lösningen användes för injektion.
Preparationsexempel 4.
En utspädd vattenlösning av natriumhydroxid tillsattes till 1 mg av den carcinostatiska substansen TF-240 i pulverform 457 ÛÛÛ 70 till bildning av en lösning med pH 7,0-7,5 och lösningen beskickades i'en ampull och frystorkades. Detta material upplöses vid användning 1 en steriliserad fysiologisk salt: lösning, en O,5%-ig lidokainlösning, en 5%-ig vattenlösning av glukos eller liknande och den erhållna lösningen användes för injektion.
Preparationsexempel S.
En utspädd vattenlösning av natriumhydroxid tillsattes till l mg av den carcinostatiska substansen TF-250 i pulverform till bildning av en lösning med pH 7,0-7,5 och lösningen beskickades i en ampull och frystorkades. Detta material upplöses vid användning i en steriliserad fysiologisk salt- lösning, en O,5%-ig lidokainlösning, en 5%-ig vattenlösning av glukos eller liknande och den erhållna lösningen användes för injektion.
Preparationsexempel 6.
En vattenlösning med pH 7,0-7,5 innehållande den carcino- statiska substansen TF-3lO-l infördes i en ampull och frys- torkades, så att man erhöll en preparation av frystorkad, carcinostatisk substans TF-310 med en 0,5 eller l mg enhet.
Detta material upplöses vid användning i en steriliserad fysiologisk saltlösning, en O,5%-ig lidokainlösning, en 5%fig vattenlösning av glukos eller liknande och den erhållna lös- ningen användes för injektion.
Preparationsexempel 7.
En vattenlösning med pH 7,0-7,5 innehållande den carcino- statiska substansen TF-310-2 infördes i en ampull och frys- torkades, så att man erhöll en preparation av frystorkad, carcinostatisk substans TF-310 med en 0,5 eller l mg enhet.
Detta material upplöses vid användning i en steriliserad fysiologisk saltlösning, en O,5%-ig lidokainlösning, en 5%-ig vattenlösning av glukos eller liknande och den erhållna lös- 457 000 71 ningen användes för injektion.
Preparationsexempel 8.
En vattenlösning med pH 7,0-7,5 innehållande den carcino- statiska substansen TF-320 infördes i en ampull och frys- torkades, så att man erhöll en preparation av frystorkad, carcinostatisk substans TF-320 med 0,5 eller l mg enhet.
Detta material upplöses vid användning i en steriliserad fysiologisk saltlösning, en 0,5%-ig lidokainlösning, en S%~ig vattenlösning av glukos eller liknande och den erhållna lös- ningen användes för injektion.
Preparationsexempel 9.
En vattenlösning med pH 7,0-7,5 innehållande den carcino- statiska substansen TF-330 infördes i en ampull och frys- torkades, så att man erhöll en preparation av frystorkad, carcinostatisk substans TF-330 med 0,5 eller l mg enhet.
Detta material upplöses vid användning i en steriliserad fysiologisk saltlösning, en 0,5%-ig lidokainlösning, en 5%-ig vattenlösning av glukos eller liknande och den erhållna lös- ningen användes för injektion.
Preparationsexempel 10.
En vattenlösning med pH 7,0-7,5 innehållande den carcino- statiska substansen TF-340 infördes i en ampull och frys- torkades, så att man erhöll en preparation av frystorkad, carcinostatisk substans TF-340 med 0,5 eller l mg enhet.
.Detta material upplöses vid användning i en steriliserad fysiologisk saltlösning, en 0,5%-ig lidokainlösning, en 5%~ig vattenlösning av glukos eller liknande och den erhållna lös- ningen användes för injektion.
Preparationsexempel ll.
En vattenlösning med pH 7,0-7,5 innehållande den carcino- 457 ÛÛÛ 72 statiska substansen TF-350 infördes i en ampull och frys- torkades, så att man erhöll en preparation av frystorkad, carcinostatisk substans TF-350 med 0,5 eller 1 mg enhet.
Detta material upplöses vid användning i en steriliserad" fysiologisk saltlösning, en 0,5%-ig lidokainlösning, en 5%-ig vattenlösning av glukos eller liknande och den erhållna lös- ningen användes för injektion.
Claims (35)
1. _ Förfarande för framställning av en TF-2-substans, innefattande salt därav, som utgöres av TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-300 (TF-310, TF-320 eller TF-330), TF-340 eller TF-350, k ä n n e t_e c k n a t därav, att det såsom steg innefattar odling av under anaeroba betingelser vid pH 5-8,5 och vid 30 till 45°C under 1-5 dygn de TF-2-substans- producerande bakterierna Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) i ett odlingsmedium innehållande kvävekäl- lor, kolkällor, vitaminkällor, reduktionsmedel och oorganiska salter med eller utan agar, tillsats av ett utfällningsmedel till den på detta sätt framställda odlingen eller till dess överstående vätska, varvid utfällningsmedlet är ett hydrofilt organiskt lösningsmedel i en koncentration av 30-80 volympro- cent och vid ett pH av 1,5-7, fällningen tillåtes bildas, fällningen uppsamlas, fällningen fraktioneras beroende på pH, eller fraktioneras beroende på pH och den erhållna fraktionen underkastas deproteiniseringsbehandling, samt TF-2-substansen tillvaratages, innefattande (A) substans TF-210 eller salt därav med följande egen- skaper: (a) grâvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich solid tumör, sarcom 180 och B-16-melanom hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) är olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloro- form, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt och sönderdelas vid 160-235°C, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 och 1120-1920 mfl, (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark 457 000 '?ë absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 248-265 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 40-43 % H: 5-7 % N: 9-10 %, (i) har en sackaridhalt i den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7 bestämd med en fenol-svavelsyrametod av ca 5-25 viktprocent uttryckt i glukos, samt en proteinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 20-50 viktprocent uttryckt i bovint serumalbumin, (B) substans TF-220, eller salt därav, med följande egenskaper: I (a) gråvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich solid tumör, sarcom 180 och B-16-melanom hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) är olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloro- form, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt och sönderdelas vid 160-240°C, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en Kßr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3600-0200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 och 1120-1020 cm'l, (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 248-266 nm, (Q) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion, (h) har elementaranalysvärdena c: 40-42 % H; s-7 % N; 1-9 %, ' (i) har en sackarídhalt i den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7 bestämd med en fenol-svavelsyrametod av ca 457 000 '15 5-20 viktprocent uttryckt i glukos, samt en proteinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 10 viktprocent uttryckt i bovint serumalbumin, (C) substans TF-230, eller salt därav, med följande egenskaper: (a) gråvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich solid tumör, sarcom 180 och B-16-melanom hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) är olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloro- form, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt och sönderdelas vid 185-22S°C, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 och 1120-1020 cnfl, (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 249-264 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 42-45 % H: 5-7 % N: l0-ll %, (i) har en sackaridhalt i den vattenlösliga fraktionen -1 vid ett pH av 1 bestämd med en fenol-svavelsyrametod av ca 5-25 viktprocent uttryckt i glukos, samt en proteinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 30-60 viktprocent uttryckt i bovint serumalbumin, (D) substans TF-240, eller salt därav, med följande egenskaper: (a) gråvitt ljust brunt pulver, 5 (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich solid tumör, sarcom 180 och B-16-melanom hos möss samt 457 ÛÛÛ '?é har immunostimulerande aktivitet,' (c) är olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloro- form, etylacetat och díetyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt och sönderdelas vid 200-2l5°C, ' (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptíonsband i närheten av 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1520, 1410-1360, 1280-1210, 1060, 960 och 820 cm_l, (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 250-265 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 35-38 % H: 4-7 % N: 12-14 %, (i) -har en sackaridhalt bestämd med en feno1-svave1syra- metod av ca 15-35 viktprocent uttryckt i glukos, samt en pro- teinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 20-30 viktpro- cent uttryckt i bovint serumalbumin, (E) substans TF-250, eller salt därav, med följande egenskaper: I (a) gråvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich solid tumör, sarcom 180 och B-16-melanom hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) I är lèslig i vatten men olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt och sönderdelas vid 165-2l0°C, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en Kßr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1sso-1510, 1410-1380, 1240-1210, 1150-1120, loso-1020, sso och 810 cm'l, (f) ultraviolettabsorptíonsspektrum för en vattenlösning 457 000 7? av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 248-269 nm, (g) är positiv vid holisch-reaktion, feno1-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 30-33 % H: 3-5 % N: 3-5 %, (i) har en sackaridhalt bestämd med en feno1-svave1syra- metod av ca 60-80 viktprocent uttryckt i glukos samt en pro- teinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 5-20 viktprocent uttryckt i bovint serumalbumin, (F) substans TF-300 (TF-310, TF-320 och TF-330), eller salt därav, har följande egenskaper: (a) 2 gråvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich solid tumör, sarcom 180 och B-16-melanom hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) är löslig i vatten men olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid l80°C och sönderdelas tydligt vid icke mindre än 195°C, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3500-3300, 2920, 2850, 1660-1620, 1580-1540, 1460-1400, 1380-1360, 1120, 1080-1020. 970 ash 820-800 cnflf (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 246-280 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svave1syra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion men negativ vid ninhydrinreaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 38-47 % H: 5-7 % N: l-4 %, (i) har en sackaridhalt bestämd med en feno1-svave1syra- metod av ca 16-60 viktprocent uttryckt i glukos samt en pro- 457 ÛÛÛ 'â-Sš teinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 10 viktprocent eller mindre uttryckt i bovint serumalbumin, (G) substans TF-310, eller ett salt därav, vari sacka- ridhalten bestämd med fenol-svavelsyrametoden är ca 16-30 viktprocent uttryckt i glukos, (H) substans TF-320, TF-330, eller ett salt därav, vari sackaridhalten bestämd med fenol-svavelsyrametoden är ca 20-60 viktprocent uttryckt i glukos, (I) substans TF-340, eller salt därav, med följande egenskaper: (a) gråvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör hos möss samt har immunostímulerande aktivitet, (c) är löslig i vatten men olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid ca l40°C och sönderdelas tydligt vid 200°C eller mer, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3500-3300, 2920, 2850, 1660-1640, 1580-1520, 1460-1440, 1410-1340, lzso-izzo, lizo-loao, 970 och ass cnfl, (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 250-265 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion men negativ vid ninhydrinreaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 32-34 % H: 4-6 % N: 3-5 %, (i) har en sackaridhalt bestämd med en fenol-svave1syra- metod av ca 20-50 viktprocent uttryckt i glukos samt en pro- teinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 10 viktprocent eller mindre uttryckt i bovint serumalbumin, 457 000 :LW I (J) substans TF-350, eller salt därav, med följande egenskaper: (a) gråvítt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) är löslig i vatten men olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid ll0°C och sönderdelas tydligt vid l80°C eller mer, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3500-3300, 2920-2900, 1660-1630, 1580-1520, 1460-1340, 1140-1100, 1080-1020, 970 och szo-eoo cnfl, (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 245-264 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion. fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion men negativ vid ninhydrinreaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 34-37 % H: 5-6 % N: 1-2 %, (i) har en sackaridhalt bestämd med en fenol-svavelsyra- metod av ca 80-95 viktprocent uttryckt i glukos samt en pro- teinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 10 viktprocent eller mindre uttryckt i bovint serumalbumin.
2. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fraktioneringen av fällningen beroende på pH genomföres genom tillsats av vatten till fällningen och juste- ring av pH hos den erhållna lösningen, så att en fraktion som är olöslig i vatten vid ett pH av 3,5-4,5 kan tillvaratagas.
3. Förfarande enligt patentkrav 2, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fraktioneringen av fällningen beroende på pH genomföres genom tillsats av vatten till fällningen och juste- ring av pH hos den erhållna lösningen till 3,5-4,5 och att den erhållna vattenolösliga andelen tillvaratages. 457 ÛÛÛ ID
4. Förfarande enligt patentkrav l, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fraktioneringen av fällningen beroende pâ pH genomföres genom tillsats av vatten till fällningen och juste- ring av pH hos den erhållna lösningen, så att en fraktion som är olöslig i vatten vid ett pH av 5,5-6,5 kan tillvaratagas.
5. Förfarande enligt patentkrav l, k ä n n e t e c k - n a t idärav, att fraktioneringen av fällningen beroende på pH genomföres genom tillsats av vatten till fällningen och juste- ring av pH hos den erhållna lösningen, så att en fraktion som är löslig i vatten vid ett pH av 5,5-6,5 men olöslig i vatten vid ett pH av 3,5-4,5 kan tillvaratagas.
6. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fraktioneringen av fällningen beroende på pH genomföras genom tillsats av vatten till fällningen och juste- ring av pH hos den erhållna lösningen, så att en fraktion som är löslig i vatten vid ett pH av 3,5-4,5 men olöslig i vatten vid ett pH av 1,5-2,5 kan tillvaratagas.
7. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fraktioneringen av fällningen beroende på pH genomföres genom tillsats av vatten till fällningen och juste- ring av pH hos den erhållna lösningen, så att en fraktion som är löslig i vatten vid ett pH av 1,5-2,5 kan tillvaratagas.
8. Förfarande enligt patentkrav l, k ä n n e t e c k - n a t därav, att tillvaratagandet av TF-2-substanserna från fällningen âstadkommes genom fraktionering av fällningen beroende på pH och genom att den fraktionerade fraktionen underkastas en enzymbehandling med ett proteolytiskt enzym sàmt att de på detta sätt erhållna TF-2-substanserna tillvara- tages.
9. Förfarande enligt patentkrav 8, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fraktioneringen av fällningen beroende på pH genomföres genom tillsats av vatten till fällningen och juste- ring av pH hos den erhållna lösningen, så att en fraktion som 457 ÛÛÛ i! är olöslig i vatten vid ett pH av 3,5-4,5 kan tillvaratagas.
10. Förfarande enligt patentkrav 9, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fraktioneringen av fällningen beroende på pH genomföres genom tillsats av vatten till fällningen och juste- ring av pH hos den erhållna lösningen till 3,5-4,5 och att den erhållna vattenolösliga delen tillvaratages.
11. ll. Förfarande enligt patentkrav 8, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fraktioneringen av fällningen beroende på pH genomföres genom tillsats av vatten till fällningen och juste- ring av pH hos den erhållna lösningen, så att en fraktion som är olöslig i vatten vid ett pH av 5,5-6,5 kan tillvaratagas.
12. Förfarande enligt natentkrav 8, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fraktioneringen av fällningen beroende på pH genomföres genom tillsats av vatten till fällningen och juste- ring av pH hos den erhållna lösningen, så att en fraktion som är löslig i vatten vid ett pH av~5,5-6,5 men olöslig i vatten vid ett pH av 3,5-4,5 kan tillvaratagas.
13. Förfarande enligt patentkrav 8, k ä n n e t e c k - n a t därav, att_fraktioneringen av fällningen beroende på pH genomföres genom tillsats av vatten till fällningen och juste- ring av pH hos den erhållna lösningen, så att en fraktion som är löslig i vatten vid ett pH av 3,5-4,5 men olöslig i vatten vid ett pH av 1,5-2,5 kan tillvaratagas.
14. Förfarande enligt patentkrav 8, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fraktioneringen av fällningen beroende på pH genomföres genom tillsats av vatten till fällningen och juste- ring av pH hos den erhållna lösningen, så att en fraktion som är löslig i vatten vid ett pH av 1,5-2,5 kan tillvaratagas.
15. Förfarande enligt något av patentkraven 8-14, k ä n n e t e c k n a t därav, att enzymbehandlingen genom- föres med pronas eller trypsin. 457 000 $2
16. Förfarande enligt något av patentkraven 8-15, k ä n n e t e c k n a t därav, att de fraktioner som har underkastats enzymbehandlingen underkastas minst en av frak- tíoneringen beroende på pH, separat fällning från hydrofilt organiskt lösningsmedel, en ultrafiltreringsbehandling, en fraktionering med en jonbytare och tillvaratagande av TF-2- -substansfraktioner, så att härigenom tillvaratager TF-2- -substansfraktionerna.
17. Förfarande enligt patentkrav 16, k ä n n e - t e c k n a t därav, att den fraktion som har underkastats enzymbehandlingen underkastas fraktioneringen av den vatten- lösliga delen genom justering av denna till pH 2,5 eller lägre, tillsats av det hydrofila organiska lösningsmedlet till den vattenlösliga del som erhålles på detta sätt, behandling av den erhållna fällningen med en jonbytare och tillvara- tagande av den oadsorberade fraktionen.
18. Förfarande enligt patentkrav 17, k ä n n e - t e c k n a t därav, att den uppsamlade oadsorberade fraktio- nen ultrafiltreras.
19. Förfarande enligt något av patentkraven l-18, k ä n n e t e c k n a t därav, att den överstâende vätskan, till vilken det hydrofila organiska lösningsmedlet skall till- sättas, justeras till ett pH av 1,5-2,5 före tillsatsen.
20. Förfarande enligt något av patentkraven l-18, k ä/n n e t e c k n a t därav, att det hydrofila organiska lösningsmedlet som tillsättes till den överstående vätskan är en alkohol.
21. Förfarande enligt något av patentkraven 1-20, k ä n n e t e c k n a t därav, att odlingsmedíet som användes för odling av bakterierna innehåller tryptikaspepton, hjärn- -hjärtinfusion (eller hjärtinfusion), jästextrakt, natriumklo- rid, glukos, laktos, natriumsulfit och natriumtioglykolat, innefattande de ovan angivna 8 komponenterna och agar, inne- 457 ÛÛÛ 33 fattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, pro- teospepton och L-cystin, eller innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton, L-cystin och agar.
22. Förfarande enligt något av patentkraven 1-2l, k ä n n e t e c k n a t därav, att odlingen genomföres vid 32-37°C under l-4 dygn i ett odlingsmedium med ett pH av 6,5-7,5.
23. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) odlas under anaeroba betingelser vid 30-42°C under l-5 dygns tid i ett odlingsmedium innefattande tryptikaspep- ton, en hjärn-hjärtinfusion (eller hjärtinfusion), jäst- extrakt, natriumklorid, glukos, laktos, natriumsulfit och tio- glykolat eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna och agar eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton och L-cystin eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton, L-cystin och agar, odlingens överstående vätska uttages, pH hos den överstående vätskan justeras till 1,5-2,5, en alkohol tillsät- tes så att koncentrationen därav i den erhållna lösningen är 50-70 volymprocent samt den erhållna fällningen tillvaratages, vatten tillsättes till fällningen, pH hos blandningen justeras till 7,5-8,0, pH justeras därefter till 3,5-4,5 samt den bil- dade fällningen tillvaratages (om så erfordras kan denna av pH beroende fraktionering upprepas) så att man erhåller TF-2l0- -substansen.
24. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM S077; ATCC 31647) odlas under anaeroba betingelser vid 30-42°C under 1-S dygns tid i ett odlingsmedium innefattande tryptikaspep- ton, en hjärn-hjärtinfusion (eller hjärtinfusion), jäst- extrakt, natriumklorid, glukos, laktos, natriumsulfit och tio- glykolat eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna och agar eller ett odlingsmedium innefattande 457 000 36' de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton och L-cystin eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton, L-cystin och agar, odlingens överstâende vätska uttages, pH hos den överstâende vätskan justeras till 1,5-2,5, en alkohol tillsät- tes sâ att koncentrationen därav i den erhållna lösningen är 50-70 volymprocent samt den erhållna fällningen tillvaratages, vatten tillsättes till fällningen, pH hos blandningen justeras till 7,5-8,0, pH justeras därefter till 5,5-6,5 samt den bil- dade fällningen tillvaratages (om så erfordras kan denna av pH beroende fraktionering upprepas) så att man erhåller TF-220- -substansen.
25. Förfarande enligt patentkrav 3, k ä n n e t e c k - n a t därav, att Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) odlas under anaeroba betingelser vid 30-42°C under l-5 dygns tid i ett odlingsmedium innefattande tryptikaspep- ton, en hjärn-hjärtinfusion (eller hjärtinfusion), jäst- extrakt, natriumklorid, glukos, laktos, natriumsulfit och tio- glykolat eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna och agar eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton och L-cystin eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton, L-cystin och agar, odlingens överstâende vätska uttages, pH hos den' överstâende vätskan justeras till 1,5-2,5, en alkohol tillsät- tes så att koncentrationen därav i den erhållna lösningen är 50-70 volymprocent samt den erhållna fällningen tillvaratages, vatten tillsättes till fällningen, pH hos blandningen justeras till 7,5-8,0, pH justeras därefter till 5,5-6,5, den över- stående vätskan uppsamlas, pH hos den överstâende vätskan jus- teras till 3,5-Ä,5 samt den bildade fällníngen tillvaratages (om så erfordras kan denna av pH beroende fraktionering upp- repas) så att man erhåller TF-230-substansen.
26. Förfarande enligt patentkrav l, k ä n n e t e c k - n a t därav, att Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) odlas under anáeroba betingelser vid 30-42°C under 457 000 425 l-5 dygns tid i ett odlingsmedium innefattande tryptikaspep- ton, en hjärn-hjärtínfusion (eller hjärtinfusion), jäst- extrakt, natriumklorid, glukos, laktos, natriumsulfit och tio- glykolat eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna och agar eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton och L-cystin eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton, L-cystin och agar, odlingens överstående vätska uttages, pH hos den överstående vätskan justeras till 1,5-2,5, en alkohol tillsät- tes så att koncentrationen därav i den erhållna lösníngen är 50-70 volymprocent samt den erhållna fällningen tillvaratages, vatten tillsättes till fällningen, pH hos blandningen justeras till 7,5-8,0, pH justeras därefter till 3,5-4,5, den över- stående vätskan uttages, dess pH justeras till 1,5-2,5 samt den bildade fällningen tillvaratages (om så erfordras kan denna av pH beroende fraktionering upprepas) så att man erhål- ler TF-240-substansen.
27. Pörfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) odlas under anaeroba betingelser vid 30-42°C under l-5 dygns tid i ett odlingsmedium innefattande tryptikaspep- ton, en hjärn-hjärtinfusion (eller hjärtinfusion), jäst- extrakt, natriumklorid, glukos, laktos, natriumsulfit och tio- glykolat eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna och agar eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton och L-cystin eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton, L-cystin och agar, odlingens överstâende vätska uttages, pH hos den överstående vätskan justeras till 1,5-2,5, en alkohol tillsät- tes så att koncentrationen därav i den erhållna lösningen är 50-70 volymprocent samt den erhållna fällningen tillvaratages, vatten tillsättes till fällningen, pH hos blandningen justeras till 7,5-8,0, pH justeras därefter till 1,5-2,5, den över- stâende vätskan uttages, en alkohol tillsättes till den över- stående vätskan, så att dess koncentration i den erhållna lös- 457 000 Q 6 ningen blir 20-80 volymprocent, samt den bildade fällníngen tillvaratages (om så erfordras kan denna av pH beroende frak- tionering upprepas) så att man erhåller TF-250~substansen.
28. i Förfarande enligt patentkrav l, k ä n n e t e c k - n a t därav, att Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) odlas under anaeroba betingelser vid 30-42°C under 1-5 dygns tid i ett odlingsmedium innefattande tryptikaspep- ton, en hjärn-hjärtinfusion (eller hjärtinfusion), jäst- extrakt, natriumklorid, glukos, laktos, natriumsulfit och tio- glykolat eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna och agar eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton och L-cystin eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton, L-cystin och agar, odlingens överstående vätska uttages, pH hos den överstående vätskan justeras till 1,5-2,5, en alkohol tillsät- tes så att koncentrationen därav i den erhållna lösningen är S0-70 volymprocent samt den erhållna fällningen tillvaratages, vatten tillsättes till fällningen, pH hos blandningen justeras till 7,5-8,0, pH justeras därefter till 3,5-4,5 samt den bil- dade fällningen tillvaratages (om så erfordras kan denna av pH beroende fraktionering upprepas), vatten tillsättes till den erhållna fällningen, pH justeras till 7-8, därefter tillsättes pronas eller trypsin, blandningen underkastas enzymbehandling vid 30-40°C under l-72 timmars tid, pH hos den behandlade blandningen justeras till 2,5 eller lägre och den överstående vätskan som erhålles på detta sätt separeras, en alkohol till- sättes till den överstående vätskan, så att alkoholkoncentra- tionen i den kombinerade lösningen blir 30-80 volymprocent, och den bildade fällningen tillvaratages eller, om så erford- ras, den ovan angivna fällningen behandlas med ett starkt anjonbytarharts och dess oadsorberade fraktion ultrafiltreras (denna ultrafiltrering kan upprepas om så erfordras), filtre- ras därefter genom ett milliporfilter och frystorkas så att man erhåller TF-310-substansen. i
29. Förfarande enligt patentkrav l, k ä n n e t e c k - 457 ÛÛÛ ï? n a t därav, att Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) odlas under anaeroba betingelser vid 30-42°C under 1-5 dygns tid i ett odlingsmedium innefattande tryptikaspep- ton, en hjärn-hjärtinfusion (eller hjärtinfusion), jäst- extrakt, natriumklorid, glukos, laktos, natriumsulfit och tio- glykolat eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna och agar eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton och L-cystin eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton, L-cystin och agar, odlingens överstående vätska uttages, pH hos den överstående vätskan justeras till 1,5-2,5, en alkohol tillsät- tes så att koncentrationen därav i den erhållna lösningen är 50-70 volymprocent samt den erhållna fällningen tillvaratages, vatten tillsättes till fällningen, pH hos blandningen justeras till 7,5-8,0, pH justeras därefter till 5,5-6,5 samt den bil- dade fällningen tillvaratages (om så erfordras kan denna av pH beroende fraktionering upprepas), vatten tillsättes till den erhållna fällningen, pH justeras till 7-8, därefter tillsättes pronas eller trypsin, blandningen underkastas enzymbehandling vid 30-40°C under 1-72 timmars tid, pH hos den behandlade blandningen justeras till 2,5 eller lägre och den överstâende vätskan som erhålles på detta sätt separeras, en alkohol till- sättes till den överstâende vätskan, så att alkoholkoncentra- tionen i den kombinerade lösningen blir 30-80 volymprocent, och den bildade fällningen tillvaratages eller, om så erford- ras, den ovan angivna fällningen behandlas med ett starkt anjonbytarharts och dess oadsorberade fraktion ultrafiltreras (denna ultrafiltrering kan upprepas om så erfordras), filtre- ras därefter genom ett milliporfilter och frystorkas så att man erhåller TF-320-substansen.
30. Förfarande enligt patentkrav 1, k ä n n e t e c k - n a t därav, att Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) odlas under anaeroba betingelser vid 30-42°C under l-5 dygns tid i ett odlingsmedium innefattande Éryptikaspep- ton, en bjärn-hjärtinfusion (eller hjärtinfusion), jäst- extrakt, natriumklorid, glukos, laktos, natriumsulfit och tio- 457 000 S22' glykolat eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna och agar eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton och L-cystin eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton, L-cystin och agar, odlingens överstående vätska uttages, pH hos den överstående vätskan justeras till l,5-2,5, en alkohol tillsät- tes så att koncentrationen därav i den erhållna lösningen är 50-70 volymprocent samt den erhållna fällningen tillvaratages, vatten tillsättes till fällningen, pH hos blandningen justeras till 7,5-8,0, pH justeras därefter till 5,5-6,5, den över- stående vätskan tillvaratages och dess pH justeras till 3,5-4,5 samt den bildade fällningen tillvaratages (om så erfordras kan denna av pH beroende fraktionering upprepas), vatten tillsättes till den erhållna fällningen, pH justeras till 7-8, därefter tillsättes pronas eller trypsín, bland- ningen underkastas enzymbehandling vid 30-40°C under 1-72 timmars tid, pH hos den behandlade blandningen justeras till 2,5 eller lägre och den överstående vätskan som erhålles på detta sätt separeras, en alkohol tillsättes till den över- stående vätskan, så att alkoholkoncentrationen i den kombine- rade lösningen blir 30-80 volymprocent, och den bildade fäll- ningen tillvaratages eller, om så erfordras, den ovan angivna fällningen behandlas med ett starkt anjonbytarharts och dess oadsorberade fraktion ultrafiltreras (denna ultrafiltrering kan upprepas om så erfordras), filtreras därefter genom ett milliporfilter och frystorkas så att man erhåller TF-330- -substansen.
31. Förfarande enligt patentkrav l, k ä n n e t e c k - n a t därav, att Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) odlas under anaeroba betingelser vid 30-42°C under 1-5 dygns tid i ett odlingsmedium innefattande tryptikaspep- ton, en hjärn-hjärtinfusion (eller hjärtinfusion), jäst- extrakt, natriumklorid, glukos, laktos, natriumsulfit och tio- glykolat eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna och agar eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton 457 ÛÛÛ 120 och L-cystin eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton, L-cystin och agar, odlingens överstående vätska uttages, pH hos den överstående vätskan justeras till 1,5-2,5, en alkohol tillsät- tes så att koncentrationen därav i den erhållna lösningen är 50-70 volymprocent samt den erhållna fällningen tillvaratages, vatten tillsättes till fällningen, pH hos blandningen justeras till 7,5-8,0, pH justeras därefter till 3,5-4,5, den över- stående vätskan tillvaratages och dess pH justeras till 1,5-2,5, den bildade fällningen tillvaratages (om så erfordras kan denna av pH beroende fraktionering upprepas), vatten till- sättes till den erhållna fällningen, pH justeras till 7-8, därefter tillsättes pronas eller trypsin, blandningen under- kastas enzymbehandling vid 30-40°C under l-72 timmars tid, pH hos den behandlade blandningen justeras till 2,5 eller lägre och den överstående vätskan som erhålles på detta sätt separe- ras, en alkohol tillsättes till den överstående vätskan, så att alkoholkoncentrationen i den kombinerade lösningen blir 30-80 volymprocent, och den bildade fällningen tillvaratages eller, om så erfordras, den ovan angivna fällningen behandlas med ett starkt anjonbytarharts och dess oadsorberade fraktion ultrafiltreras (denna ultrafiltrering kan upprepas om så erfordras), filtreras därefter genom ett milliporfilter och frystorkas så att man erhåller TF-340-substansen.
32. Förfarande enligt patentkrav l, k ä n n e t e c k - n a t därav, att Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) odlas under anaeroba betingelser vid 30-42°C under l-5 dygns tid i ett odlingsmedium innefattande tryptikaspep- ton, en hjärn-hjärtinfusion (eller hjärtinfusion), jäst- extrakt, natriumklorid, glukos, laktos, natriumsulfit och tio- glykolat eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna och agar eller ett odlingsmedium innefattande de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton och L-cystin eller ett odlingsmedium innefattande_de ovan angivna 8 komponenterna, fytonpepton, proteospepton, L-cystin och agar, odlingens överstående vätska uttages, pH hos den överstâende vätskan justeras till 1,5-2,5, en alkohol tillsät- 457 000 qU tes så att koncentrationen därav i den erhållna lösningen är 50-70 volymprocent samt den erhållna fällningen tillvaratages, vatten tillsättes till fällningen, pH hos blandningen justeras till 7,5-8,0, pH justeras därefter till 1,5-2,5, den över- stående vätskan uttages, en alkohol tillsättes till denna, så att alkoholkoncentrationen i den erhållna lösningen blir 20-80 volymprocent, den bildade fällningen tillvaratages (om så erfordras kan denna av pH beroende fraktionering upprepas), vatten tillsättes till den erhållna fällningen, pH justeras till 7-8, därefter tillsättes pronas eller trypsin, bland- ningen underkastas enzymbehandling vid 30-40°C under l-72 tim- mars tid, pH hos den behandlade blandningen justeras till 2,5 eller lägre och den överstående vätskan som erhålles på detta sätt separeras, en alkohol tillsättes till den överstående vätskan, så att alkoholkoncentrationen i den kombinerade lös- ningen blir 30-80 volymprocent, och den bildade fällningen tillvaratages eller, om så erfordras, den ovan angivna fäll- ningen behandlas med ett starkt anjonbytarharts och dess oadsorberade fraktion ultrafiltreras (denna ultrafiltrering kan upprepas om så erfordras), filtreras därefter genom ett milliporfilter och frystorkas så att man erhåller TF-350' -substansen.
33. Carcinostatisk TF-2-substans vald från TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-300 (TF-310, TF-320 eller TF-330), TF-340 och TF-350, som framställts genom odling av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) under anaeroba betingelser och tillvaratagande av den carcinosta- tiska substansen från odlingen eller dess överstående vätska, klä n n e t e c k n a d därav, att den utgöres av (A) substans TF-210, eller salt därav, med följande egenskanerz (a) gråvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich solid tumör, sarcom l80 och B-16-melanom hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) är olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloro- 457 000 0: form, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt och sönderdelas vid 160-235°C, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 och 1120-1020 cm'1, (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 248-265 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 40-43 % H: 5-7 % N: 9-10 %, (i) har en sackaridhalt i den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7 bestämd med en fenol-svavelsyrametod av ca 5-25 viktprocent uttryckt i glukos, samt en proteinhalt bestämd med Lowry~Folins metod av ca 20-50 viktprocent uttryckt i bovint serumalbumin, (B) substans TF-220, eller salt därav, med följande egenskaper: (a) gråvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich solid tumör, sarcom 180 och B-16-melanom hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) är olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloro- form, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt och sönderdelas vid 160-240°C, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 och 1120-1020 cm“l, (f) ultraviolettabscrptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark 457 ÛÛÛ 71 absorption vid absorptíonskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 248-266 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 40-42 % H: 5-7 % N: 7-9 %, (i) har en sackaridhalt i den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7 bestämd med en fenol-svavelsyrametod av ca 5-20 viktprocent uttryckt i glukos, samt en proteinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca l0 viktprocent uttryckt i bovint serumalbumin, (C) substans TF-230, eller salt därav, med följande egenskaper: (a) gråvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich solid tumör, sarcom 180 och B-16-melanom hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) är olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloro- form, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt och sönderdelas vid 185-225°C, (el infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KB:-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2950-2920, l680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 och 1120-lozo cm"l. (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 249-264 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 42-45 % H: 5-7 % N: 10-ll %, (i) har en sackaridhalt i den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7 bestämd med en fenol-svavelsyrametod av ca 457 ÛÛÛ 43 5-25 viktprocent uttryckt i glukos, samt en proteinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 30-60 viktprocent uttryckt i bovint serumalbumin, (D) substans TF-240, eller salt därav, med följande egenskaper: (a) ' grâvítt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich solid tumör, sarcom 180 och B-16-melanom hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) är olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloro- form, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt och sönderdelas vid 200-2l5°C, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1520, 1410-1360, 1280-1210, 1060, 960 och 820 cm'l, (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 250-265 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svave1syra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 35-38 % H: 4-7 % N: 12-14 %, (i) har en sackaridhalt bestämd med en fenol-svavelsyra- metod av ca 15-35 viktprocent uttryckt i glukos, samt en pro- teinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 20-30 viktpro- cent uttryckt i bovint serumalbumin, (E) substans TF-250, eller salt därav, med följande egenskaper: (a) grâvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich solid tumör, sarcom 180 och B-16-melanom hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, 457 000 filf (c) är löslig i vatten men olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt och sönderdelas vid 165-210°C, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1410-1380, 1240-1210, 1150-1120, 1080-1020, 980 och 810 cm'l, (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 248-269 nm, A (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 30-33 % H: 3-5 % N: 3-5 %, (i) har en sackaridhalt bestämd med en feno1-svavelsyra- metod av ca 60-80 víktprocent uttryckt i glukos samt en pro- teinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 5-20 viktprocent uttryckt i bovint serumalbumin, (F) substans TF-300 (TF-310, TF-320 och TF-330), eller salt därav, med följande egenskaper: (a) gråvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör, Ehrlich solid tumör, sarcom 180 och B-16-melanom hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) är löslig i vatten men olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid l80°C och sönderdelas tydligt vid icke mindre än l95°C, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3500-3300, 2920, 2850, 1660-1620, 1580-1540, 1460-1400, 1380-1360, 1120, 1080-1020. 970 aan 820-800 cm'1, (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark 457 ÛÛÛ 66 absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 246-280 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion men negativ vid ninhydrinreaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 38-47 % H: 5-7 % N: 1-4 %, (i) har en sackarídhalt bestämd med en fenol-svavelsyra- metod av ca 16-60 viktprocent uttryckt i glukos samt en pro- teinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 10 viktprocent eller mindre uttryckt i bovint serumalbumin, (G) substans TF-310, eller ett salt därav, vari sacka- ridhalten bestämd med fenol-svavelsyrametoden är ca 16-30 viktprocent uttryckt i glukos, (H) substans TF-320, TF-330, eller ett salt därav, vari sackaridhalten bestämd med fenol-svavelsyrametoden är ca 20-60 viktprocent uttryckt i glukos, (I) substans TF-340, eller salt därav, med följande egenskaper: (a) gråvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) är löslig i vatten men olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid ca l40°C och sönderdelas tydligt vid 200°C eller mer, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3500-3300, 2920, 2850, 1660-1640, 1580-1520, 1460-1440, l4l0-1340, 1250-1220, 1120-1030, 970 och 835 cm_l, (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 250-265 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- 'If r- 457 000 f” reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion men negativ vid ninhydrinreaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 32-34 % H: 4-6 % N: 3-5 %, (i) har en sackaridhalt bestämd med en fenol-svavelsyra- metod av ca 20-50 viktprocent uttryckt i glukos samt en pro- teinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 10 viktprocent eller mindre uttryckt i bovint serumalbumin, (J) substans TF-350, eller salt därav, med följande egenskaper: (a) gråvitt ljust brunt pulver, (b) förhindrar tillväxt av Ehrlich ascites-tumör hos möss samt har immunostimulerande aktivitet, (c) är löslig i vatten men olöslig i metanol, etanol, aceton, bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter, (d) har ingen tydlig smältpunkt, börjar sönderdelas vid l10°C och sönderdelas tydligt vid l80°C eller mer, (e) infrarödabsorptionsspektrum som erhållits med en KBr-tablettmetod har absorptionsband i närheten av 3500-3300, 2920-2900, 1660-1630, 1580-1520, 1460-1340, ll40-1100, 1080-1020, 970 och 820-800 and, (f) ultraviolettabsorptionsspektrum för en vattenlösning av den vattenlösliga fraktionen vid ett pH av 7,0 visar stark absorption vid absorptionskanten samt visar en absorptionstopp i närheten av 245-264 nm, (g) är positiv vid Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra- reaktion, antron-svavelsyrareaktion, indol-saltsyrareaktion och Lowry-Folins reaktion men negativ vid ninhydrinreaktion, (h) har elementaranalysvärdena C: 34-37 % H: 5-6 % N: l-2 %, (i) har en sackaridhalt bestämd med en fenol-svavelsyra- metod av ca 80-95 viktprocent uttryckt i glukos samt en pro- teinhalt bestämd med Lowry-Folins metod av ca 10 viktprocent eller mindre uttryckt i bovint serumalbumin.
34. Carcinostatiskt medel, k ä n n e t e c k n a t därav, att det innefattar en carcinostatisk substans TF-2 m 457 000 417' (TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-300 (TF-310, TF-320 eller TF-330), TF-340 eller TF-350) eller ett salt därav enligt patentkrav 33.
35. Carcinostatiskt medel enligt patentkrav 34, k ä n - n e t e c k n a t därav, att det innefattar en carcinostatisk substans TF-300 (TF-310, TF-320 eller TF-330) eller ett salt därav.
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56022276A JPS57139088A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-340, its preparation and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022271A JPS57136594A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-220, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022275A JPS57136598A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-300, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022272A JPS57136595A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-230, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022273A JPS57136596A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-240, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022270A JPS57136593A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-210, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022277A JPS57139089A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-350, its preparation and carcinostatic agent containing the same |
| JP56022274A JPS57136597A (en) | 1981-02-19 | 1981-02-19 | Carcinostatic substance tf-250, its preparation, and carcinostatic agent containing the same |
| JP57011744A JPS58129977A (ja) | 1982-01-29 | 1982-01-29 | 制癌性物質ｔｆ−３００−２及びその製造法並びにこれを含有する制癌剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE8201016L SE8201016L (sv) | 1982-08-20 |
| SE457000B true SE457000B (sv) | 1988-11-21 |
Family
ID=27576620
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE8201016A SE457000B (sv) | 1981-02-19 | 1982-02-18 | Foerfarande foer framstaellning av en carcinostatisk och immunostimulerande tf-2-substans, carcinostatisk tf-2-substans samt carcinostatiskt medel. |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4591558A (sv) |
| AT (1) | AT381722B (sv) |
| BE (1) | BE892204A (sv) |
| CA (1) | CA1184864A (sv) |
| CH (1) | CH651052A5 (sv) |
| DE (1) | DE3205074A1 (sv) |
| DK (1) | DK151640C (sv) |
| FI (1) | FI69096C (sv) |
| FR (1) | FR2499855B1 (sv) |
| GB (1) | GB2093347B (sv) |
| IT (1) | IT1189224B (sv) |
| NL (1) | NL8200640A (sv) |
| NO (1) | NO157426C (sv) |
| NZ (1) | NZ199771A (sv) |
| PT (1) | PT74455B (sv) |
| SE (1) | SE457000B (sv) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5931715A (ja) * | 1982-08-17 | 1984-02-20 | Toyama Chem Co Ltd | 制癌性物質ｔｆ−５００の製造法 |
| CA2752989A1 (en) * | 2009-02-20 | 2010-08-26 | Frymaster L.L.C. | Racking system for deep fryer |
| WO2011008977A1 (en) | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Frymaster L.L.C | Automated rack/basket lifting system for deep open vat frying system |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5461112A (en) * | 1977-10-24 | 1979-05-17 | Ono Pharmaceut Co Ltd | Oncostatic polysaccharide* its preparation* and oncostatic drugs containing it as an effective component |
| JPS5943929B2 (ja) * | 1979-08-13 | 1984-10-25 | サッポロビール株式会社 | 多糖体ｒｂｓ物質，その製法およびそれを有効成分とする抗腫瘍性剤 |
| DE3031152A1 (de) * | 1979-08-24 | 1981-03-19 | Toyama Chemical Co. Ltd., Tokyo | Carcinostatische substanzen, verfahren zur herstellung derselben und mittel mit einem gehalt derselben |
| US4477437A (en) * | 1981-02-19 | 1984-10-16 | Toyama Chemical Co., Ltd. | Substances having carcinostatic and immunostimulating activity |
-
1982
- 1982-02-12 GB GB8204093A patent/GB2093347B/en not_active Expired
- 1982-02-12 DE DE19823205074 patent/DE3205074A1/de active Granted
- 1982-02-17 FR FR8202601A patent/FR2499855B1/fr not_active Expired
- 1982-02-17 CA CA000396425A patent/CA1184864A/en not_active Expired
- 1982-02-17 CH CH979/82A patent/CH651052A5/de not_active IP Right Cessation
- 1982-02-17 DK DK069282A patent/DK151640C/da not_active IP Right Cessation
- 1982-02-17 FI FI820527A patent/FI69096C/fi not_active IP Right Cessation
- 1982-02-17 IT IT47817/82A patent/IT1189224B/it active
- 1982-02-18 PT PT74455A patent/PT74455B/pt not_active IP Right Cessation
- 1982-02-18 NL NL8200640A patent/NL8200640A/nl not_active Application Discontinuation
- 1982-02-18 NO NO820509A patent/NO157426C/no unknown
- 1982-02-18 SE SE8201016A patent/SE457000B/sv unknown
- 1982-02-18 NZ NZ199771A patent/NZ199771A/en unknown
- 1982-02-19 AT AT0064682A patent/AT381722B/de not_active IP Right Cessation
- 1982-02-19 BE BE0/207355A patent/BE892204A/fr not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-08-06 US US06/619,895 patent/US4591558A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT1189224B (it) | 1988-01-28 |
| FI69096C (fi) | 1985-12-10 |
| IT8247817A0 (it) | 1982-02-17 |
| AT381722B (de) | 1986-11-25 |
| DE3205074A1 (de) | 1982-12-16 |
| GB2093347B (en) | 1985-03-27 |
| DK151640C (da) | 1988-06-20 |
| PT74455B (en) | 1984-12-04 |
| US4591558A (en) | 1986-05-27 |
| NO820509L (no) | 1982-08-20 |
| NO157426C (no) | 1988-03-16 |
| NL8200640A (nl) | 1982-09-16 |
| DK69282A (da) | 1982-08-20 |
| NO157426B (no) | 1987-12-07 |
| DK151640B (da) | 1987-12-21 |
| FI820527L (fi) | 1982-08-20 |
| DE3205074C2 (sv) | 1987-09-24 |
| PT74455A (en) | 1982-03-01 |
| SE8201016L (sv) | 1982-08-20 |
| FR2499855A1 (fr) | 1982-08-20 |
| FI69096B (fi) | 1985-08-30 |
| FR2499855B1 (fr) | 1985-07-12 |
| CA1184864A (en) | 1985-04-02 |
| CH651052A5 (de) | 1985-08-30 |
| ATA64682A (de) | 1986-04-15 |
| BE892204A (fr) | 1982-08-19 |
| NZ199771A (en) | 1985-09-13 |
| GB2093347A (en) | 1982-09-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4051314A (en) | Polysaccharides and method for producing same | |
| US4289688A (en) | Protein-bound polysaccharides | |
| US4140578A (en) | Method of producing polysaccharides | |
| JPH0412960B2 (sv) | ||
| US3868464A (en) | Production of maltose with amylases produced by streptomyces | |
| US4614733A (en) | Polysaccharides pharmaceutical compositions and the use thereof | |
| SE457000B (sv) | Foerfarande foer framstaellning av en carcinostatisk och immunostimulerande tf-2-substans, carcinostatisk tf-2-substans samt carcinostatiskt medel. | |
| EP0057349B1 (de) | Neues Peptid-Antibiotikum Komponente B, Verfahren zu seiner Herstellung sowie seine Verwendung in Arzneimitteln | |
| US4497797A (en) | β-Galactosidase inhibitor GT-2558 and its derivatives | |
| US3674866A (en) | Moenomycin and process for producing same | |
| US4477437A (en) | Substances having carcinostatic and immunostimulating activity | |
| US4744985A (en) | Novel substances having carcinostatic and immunostimulating activity, process for preparing the same and carcinostatic agent containing the same | |
| EP0067000A2 (en) | Production of a nitrogen-containing polysaccharide having antitumour activity | |
| US4547462A (en) | Process for preparing substance having carcinostatic and immunostimulating activity | |
| CA1086720A (en) | Polysaccharides and process for the preparation thereof | |
| US3804717A (en) | Production of new amylases by cultivation of streptomyces and uses of these new amylases | |
| US4197292A (en) | Novel amylase inhibitors | |
| Okami et al. | A streptomyces producing O-carbamyl-D-serine | |
| US3625830A (en) | Cultivating streptomyces desdanus var. desdanus to produce desdanine | |
| Wood et al. | The mucopolysaccharides of avian oviduct, egg, skin, and comb, and of porcine skin | |
| US3718741A (en) | N-1 and N-2 FRACTIONS OF NEOCARZIONSTATIN | |
| US2932608A (en) | Process for the production of cobalamins | |
| US2921887A (en) | Process for the production of cobalamins | |
| NO155697B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av fysiologisk aktive forbindelser ved fermentering. | |
| GB1561370A (en) | Bl580 zeta |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NAL | Patent in force |
Ref document number: 8201016-6 Format of ref document f/p: F |