DE3205074A1 - Neue carcinostatische und immunostimulierende substanzen, verfahren zur herstellung derselben und carcinostatische mittel mit einem gehalt derselben - Google Patents
Neue carcinostatische und immunostimulierende substanzen, verfahren zur herstellung derselben und carcinostatische mittel mit einem gehalt derselbenInfo
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Description
Neue carcinostatische und immunostimulierende Substanzen,
Verfahren zur Herstellung derselben und carcinostatische Mittel mit einem Gehalt derselben
Anwendungsgebiet der Erfindung:
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
neuen Substanzen mit careinostatischer und immunostimulierender
Aktivität. Bei diesem Verfahren werden Bakterien, welche zum Genus Fusobacterium gehören und die TF-2-Substanzen
erzeugen, unter anaeroben Bedingungen kultiviert. Dabei erhält man aus der Kultur oder aus der überstehen-
den Flüssigkeit neuartige Substanzen, welche mit TF-2 bezeichnet werden. Ferner bezieht sich die Erfindung auf
die TF-2-Substanzen und insbesondere auf die Substanzen TF-21O, 220, 230, 240, 250, 300 (310, 320, 330), 3^0 und
350. Schließlich bezieht sich die Erfindung auch auf ein carcinostatisches Mittel mit einem Gehalt derselben.
Charakteristik der bekannten Lösungen:
Als Mittel zur Behandlung von Patienten mit verschiedenen Krebsarten werden in jüngster Zeit Mittel zur Steigerung
der immunologischen Funktion des Patienten intensiv untersucht.
Diese Mittel führen durch Unterstützung der immunologischen Funktion zu einem carcinostatischen Effekt
Derartige Antitumormittel werden aus verschiedensten Organismen, z.B. aus verschiedenen Bakterien oder aus den
Kulturen verschiedener Bakterien, gewonnen oder sie liegen in Form von Polysacchariden vor, welche aus Fruchtkörpern
von Basidiomycetes gewonnen werden oder aus kultivierten Funguskörpern derselben.
Die Erfinder haben die pharmakologische Wirksamkeit der
überstehenden Flüssigkeit untersucht, welche erhalten wird bei der Kultivierung von Bakterien der Gattung Fusobacterium,
und zwar nach Entfernung der Organismen von der Kulturbrühe. Es wurde festgestellt, daß eine spezifische
Komponente in der überstehenden Flüssigkeit eine carcinostatische Wirkung entfaltet. Ferner wurde festgestellt,
daß diese Komponente eine indirekte carcinostatische Wirkung zeitigt, und zwar durch Steigerung der
Wirt-vermittelten Antitumoraktivität oder der Immunität
des Wirts. Somit wird die Wirkung der Immunität ausgenützt. Ferner wurde festgestellt, daß diese Komponente
eine äußerst geringe Toxizität hat. Schließlich wurde festgestellt, daß diese Komponente durch Aufarbeitung der
Kultur isoliert werden kann.
Ziel der Erfindung:
Es ist Ziel der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, bei
dem Bakterien der Gattung Fusobacterium kultiviert werden,
und zwar unter anaeroben Bedingungen. Sodann isoliert man aus der erhaltenen Kultur oder aus der überstehenden
Flüssigkeit Substanzen der Bezeichnung "TF-2" mit carcinostatischer
und immunostimulierender Aktivität.
Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, die TF-2-Substanzen
zu schaffen.
Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, ein carcinostatisches Mittel mit einem Gehalt der TF-2-Substanzen zu
schaffen.
Darlegung des Wesens der Erfindung:
Als Bakterien für die Gewinnung der TF-2-Substanzen der Erfindung kommen Bakterien der Gattung Fusobacterium in
Frage, z.B. Fusobacterium nucleatum. Konkret wählt man am günstigsten Fusobacterium nucleatum TF-O31 (FERM 5077;
ATCC 31647). Ferner eignen sich Stämme, welche aufgrund
des allgemeinen Fachwissens der Mikrobiologie die gleichen Eigenschaften haben, nämlich spontane Mutanten und künstlich
modifizierte Stämme.
Das Fusobacterium nucleatum TF-031 hat die folgenden bakteriologischen
Eigenschaften:
(I) Form
(I) Form
(1) Form der Zellen: spindelförmig (Fig. 1)
(2) Polymorphismus der Zellen: abwesend
(3) Motilität: abwesend
(4) Sporen: abwesend
(5) Gram-Färbung: gramnegativ
(6) Säurebeständigkeit: negativ
(II) Wuchszustand im Kulturmedium
(1) TF-a Agarplatte und Schrägkulturmedien externe Form: runde Gestalt
Größe: etwa 1 mm Protuberanz: halbkugelförmige Gestalt Struktur: tautropfenartig
Oberfläche: glatt Kanten: glatt
Farbe: milchig gelblich-weiß Transparenz: opak
(2) TF-a Flüssigkulturmedium Wachstumsgrad: heftig Turbidität: Koagulum
Präzipitat: keines
Oberflächenwachstum: keines; kein Wachstum bis zu
einer Tiefe von etwa 5 mm Gas: keines
(III) Physiologische Eigenschaften
(1) Entwicklung von Schwefelwasserstoff: +
(2) Reduktion von Nitraten: -
(3) Produktion von Buttersäure: +
(4) Produktion von Indol: +
(5) Urease: -
(6) Catalase: -
(7) Stärkehydrolyse: -
(8) Verhalten gegenüber Sauerstoff: anaerob
(9) Erzeugung von Ammoniak: +
(10) Erzeugung von Kohlendioxid: +
(11) Wachstumsbereich: pH 5,0 bis 8,5; 30° bis 450C
(12) Produktion von Gas aus Sacchariden: L-Arabinose (-), D-Xylose (-), D-Glucose (-),
D-Mannose (-), D-Fructose (-), D-Galactose (-), Malzzucker (-), Saccharose (-), Trehalose (-),
Sorbit (-), Mannit (-), Inosit (-), Glycerin (-),
Stärke (-).
Die neuen TF-2-Substanzen können z.B. auf folgende Weise hergestellt werden.
Kultur eines TF-2-Substanzen erzeugenden Bakterienstamms der Species Fusobacterium nucleatum
Kulturmasse oder überstehende Flüssigkeit
hydrophiles organisches Lösungsmittel lösliche Fraktion
Trennung
I Präzipitat
Wasser ————--———--———--—--——--——-———-
Fraktionierung nach dem pH-Wert
in der Nähe des pH 4 wasserunlösliche Fraktion -———-———---—----in
der Nähe des pH 6 wasserunlösliche Fraktion —
in der Nähe des pH 6 wasserlösliche,jedoch in der Nähe von pH 4
wasserunlösliche Fraktion ■ ■
in der Nähe des pH 4 wasserlösliche, jedoch in der Nähe von pH 2 wasserunlösliche Fraktion -—-———----——— .
in der Nähe des pH 2 wasserlösliche Fraktion
TF-210
+
+
TF-220
+
+
TFr23O +
TF-24O
/TF-31O
TF-3OO
TF-340
TF-250
+
TF-350
TF-32O
TF-33OS
Deproteinisierung
TF-210 TF-220
TF-23O
TF-240 TF-250
-Jt).
Das oben beschriebene Herstellungsverfahren soll im folgenden näher erläutert werden.
(1) Kultivierung des Bakterienstamms
Die Kultivierung des Bakterienstamms der Gattung Fusobacte rium wird auf herkömmliche Weise, wie bei anaeroben Bakterien
üblich, durchgeführt. Es wird ein Kulturmedium mit ei nem Gehalt einer Stickstoffquelle, wie Rinder-Hirn-Herz-Extrakt,
verschiedene Peptone oder dergl., verwendet. Ferner enthält das Medium eine Vitaminquelle, wie Hefeextrakt
oder dergl.; anorganische Salze, wie Natriumchlorid oder dergl.; eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Lactose oder
dergl.; ein Reduktionsmittel, wie L-Cystin, Natriumsulfit, Thioglykolat oder dergl., und der pH-Wert wird auf 6 bis
8,5 und vorzugsweise auf 6,5 bis 7»5 eingestellt. Das Bakterium wird in das Kulturmedium eingeimpft. Danach erfolgt
eine Fließgleichgewichtskultur unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 420C und vorzugsweise 32 bis 370C
während 1 bis 5 Tagen und vorzugsweise 24 bis 96 Stunden.
Es ist insbesondere erwünscht, ein Kulturmedium gemäß Tabelle 1 zu verwenden. Dieses wird im folgenden als "TF-Kulturmedium"
bezeichnet. Es ist jedoch nicht unbedingt ein Hirn-Herz-Infusionsmedium erforderlich (dabei handelt
es sich um einen Rinder-Hirn-Herz-Extrakt) (als Kohlenstoffquelle).
Dieses Medium kann ersetzt werden durch ein Herzinfusionsmedium. Dabei handelt es sich um einen Rinderherzextrakt.
Ferner kann man einen Rindfleischextrakt, einen Fischextrakt oder eine Maisquellflüssigkeit oder
dergl. verwenden. Unter den verschiedenen Peptonen kommen Proteasepepton und Phytonpepton in Frage. Sie sind jedoch
nicht stets erforderlich. Man kann das Trypticasepepton auch durch Polypepton ersetzen. Wenn kein Agar verwendet
wird, so wird eine Rührkultur durchgeführt.
| Bestandteile des Kulturmediums (g/l) |
TF-a | TF-b | TF-C | TF-d | TF-e | TF-f |
| Trypticasepepton | 17 | 17 | 17 | 17 | 17 | 17 |
| Phytonpepton | 3 | 3 | 1,5 | - | - | - |
| Proteosepepton | 10 | 5 | 5 | -- | - | - |
| Hirn-Herz- Infusion |
35 . | 17,5 | _ | |||
| Herzinfusion | - | - | 25 | 20 | 10 | 15 |
| Hefeextrakt | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| Natriumchlorid | 7,5 | 7,5 | 7,5 | 7,5 | 7,5 | 7,5 |
| Glucose | 6 | 6 | 6 | 12 | 12 | 12 |
| Lactose | 5 | 5 | 5 | 10 | 10 | 10 |
| L-Cystin | 0,25 | 0,5 | 0,5 | - | - | - |
| Natriumsulfit | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| Thioglykolat | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 |
| Agar | 0 oder 0,7 |
0 od. 0,7 |
0 od. 0,7 |
0 od 0,7 |
. 0 od 0,7 |
. 0 od. 0,7 |
(2) Abtrennung der überstehenden Flüssigkeit von der
Kulturmasse (Entfernung der Organismen)
Die Organismen werden aus der erhaltenen Kultur entfernt,
wobei die überstehende Flüssigkeit gewonnen wird. Zur Entfernung der Organismen eignen sich herkömmliche Methoden,
z.B. Zentrifugierverfahren oder Filterverfahren. Man kann
dabei eine Filterhilfe verwenden, z.B. Hyflo-Super-Cel.
Das Zentrifugierverfahren ist bevorzugt vom Standpunkt der
Arbeitsweise, der Gründlichkeit der Beseitigung der Organismen und der Ausbeute an überstehender Flüssigkeit.
(3) Gewinnung der carcinostatischen Substanz TF-2
(i)(a) Ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel wird
der überstehenden Flüssigkeit oder der Kulturmasse zugesetzt und der Niederschlag wird abgetrennt. In dieser
Stufe wird die überstehende Flüssigkeit oder die Kultur-
masse vorzugsweise auf pH 1,5 bis 7 eingestellt und bevorzugt
auf einen pH in der Nähe von pH 2 (pH 1,5 bis 2,5). Als hydrophile, organische Lösungsmittel kommen z.B.
Alkohole in Frage, wie Äthanol, Methanol oder dergl.; Ketone, wie Aceton oder dergl., obwohl Alkohole und insbesondere
Äthanol bevorzugt sind, da sie die besten Ergebnisse erbringen. Das hydrophile, organische Lösungsmittel
wird vorzugsweise derart zugesetzt, daß seine Konzentration 30 bis 80 Vol-% und speziell 50 bis 80 Vol-# beträgt.
Nach dem Zusatz des hydrophilen, organischen Lösungsmittels wird die erhaltene Mischung bei niedriger Temperatur
stehengelassen, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 50C, und zwar während mehrerer Stunden bis mehrerer
Tage, bis zur beendeten Bildung des Präzipitats. Der gebildete Niederschlag wird mit herkömmlichen Verfahren abgetrennt,
z.B. durch Dekantieren, Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl..
(b) Zu dem abgetrennten Niederschlag gibt man Wasser, und zwar im allgemeinen die 5- bis 2Ofache Menge des Niederschlags.
Sodann wird der Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert. Dieses Verfahren wird im einzelnen
wie folgt durchgeführt.
(b-1) Die Mischung des Niederschlags und des Wassers
wird auf pH 7,5 bis θ eingestellt. Falls erforderlich, werden unlösliche Bestandteile entfernt. Sodann wird
die Mischung auf einen pH in der Nähe von pH 4 (3,5 bis 4,5) eingestellt. Die gebildeten, wasserunlöslichen und
wasserlöslichen Bestandteile werden sodann voneinander getrennt, und zwar durch Verwendung herkömmlicher Verfahren,
wie Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl.. Der wasserunlösliche Anteil (F-210) hat die in Tabelle 2 angegebenen
Eigenschaften.
(b-2) Sodann wird der in Stufe (a) erhaltene Niederschlag
gesondert mit Wasser versetzt, und zwar im allgemeinen mit der 5- bis 2Ofachen Menge des Niederschlags.
Die Mischung wird auf pH 7,5 bis 8 eingestellt. Nachdem
man erforderlichenfalls die unlöslichen Bestandteile entfernt hat, wird der pH in die Nähe von pH 6 gebracht (5,5
bis 6,5). Die erhaltenen, wasserunlöslichen und wasserlöslichen Bestandteile werden voneinander auf übliche Weise,
z.B. durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl., getrennt. Der erhaltene, wasserlösliche Anteil (TF-22O) hat
die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.
(b-3) Der wasserlösliche Anteil der Stufe (b-2) wird auf einen pH in der Nähe von 4 (3>5 bis 4,5) gebracht.
Der Niederschlag und der wasserlösliche Anteil werden voneinander auf übliche Weise durch Zentrifugieren, Filtrieren
oder dergl. getrennt. Der erhaltene Niederschlag (TF-23O) hat die in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.
(b-4) Der in Stufe (b-1) oder (b-3) abgetrennte,
wasserlösliche Anteil wird auf einen pH in der Nähe von
pH 2 gebracht (1,5 bis 2,5), worauf ein Niederschlag gebildet wird. Dieser Niederschlag wird vom wasserlöslichen
Anteil durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl. abgetrennt. Der erhaltene Niederschlag (TF-240) hat die in
Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.
(b-5) Der in Stufe (a) erhaltene Niederschlag wird mit Wasser versetzt, und zwar mit der 5-bis 2Ofachen Wassermenge,
bezogen auf die Menge an Niederschlag, worauf der pH der Mischung auf z.B. 7,5 bis 8eingestellt wird.
Dann wird der pH in die Nähe von pH 2 gebracht (1,5 bis 2,5). Zu dem so erhaltenen, wasserlöslichen Anteil oder
zu dem in Stufe (b-4) abgetrennten, wasserlöslichen Anteil gibt man, falls erforderlich, nach dem Einengen der
Menge des wasserlöslichen Anteils auf 1/3 bis 1/7 ein
hydrophiles, organisches Lösungsmittel zu, vorzugsweise einen Alkohol, so daß die Konzentration 20 bis 80 Vol-%
- -ve -
und vorzugsweise 20 bis 60 Vol-% beträgt. Dabei wird ein
Niederschlag gebildet, welcher mit TF-250 bezeichnet wird. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-250 hat die
in Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.
Die so erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-210,
TF-220, TF-230, TF-24O und TF-250 können jeweils mehrmals
der gleichen Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH-Wert unterzogen werden und auf diese Weise gereinigt werden.
Die so erhaltenen, carcinostatischen Substanzen können nach üblichen Verfahren in pharmazeutisch akzeptable Salze umgewandelt
werden, z.B. in Alkalimetallsalze, wie Natriumsalze, Kaliumsalze und dergl., und in Erdalkalimetallsalze,
wie Magnesiumsalze, Calciumsalze oder dergl..
(ii) Die Fraktionen mit carcinostatischer Aktivität, welche in Stufe (i) erhalten wurden, nämlich TF-210, TF-220,
TF-230, TF-240 und TF-250, werden jeweils einer Deproteinisierungsbehandlung
unterworfen. Diese erfolgt in üblicher Weise. Dabei erhält man die folgenden Substanzen:
TF-300 (TF-310, TF-320 und TF-33O), TF-340 und TF-350.
Zur Deproteinisierungsbehandlung kann man bekannte Verfahren heranziehen, wobei Verfahren der Zersetzung mit
proteoIytisehen Enzymen besonders bevorzugt sind. Wenn es
erwünscht 1st, die Deproteinisierung durch Behandlung mit einem proteolytischen Enzym durchzuführen, so reicht es
aus, daß jede der Fraktionen mit carcinostatischer Aktivität der Stufe (i) in Wasser oder einer Pufferlösung aufgelöst
oder suspendiert wird, worauf man ein Protein zersetzendes Enzym zur erhaltenen Lösung oder Suspension zusetzt
und danach die Enzymbehandlung in üblicher Weise durchführt.
Als proteolytische Enzyme kann man z.B. Pronase, Papain,
Trypsin, Chymotrypsin oder dergl. verwenden. Pronase und
-ds-
Trypsin sind bevorzugt. Es ist insbesondere bevorzugt, vor oder während der Enzymbehandlung die wäßrige Lösung
auf pH 7 bis 8 einzustellen und zu halten. Zu diesem Zweck kann man Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat,
Natriumhydrogencarbonat oder dergl. verwenden. Zur Verhinderung
einer Putrefaktion des Reaktionsgemisches während der Enzymbehandlung ist es erwünscht, eine geringe Menge
eines organischen Lösungsmittels, wie Chloroform, Toluol oder dergl., zuzusetzen. Das Enzym wird gewöhnlich in
einer Menge von 1 bis 2 Gew.96, bezogen auf das Gewicht
des der Enzymbehandlung zu unterwerfenden Pulvers (Festkörper), zugesetzt.
Die obige Enzymbehandlung erfolgt üblicherweise bei 30
bis 4O°C innerhalb von 1 bis 72 Stunden und vorzugsweise 24 bis 48 Stunden. Sie kann auch durchgeführt werden,
indem man zunächst z.B. etwa 1 Gew.% des Enzyms zum Pulver
(Festkörper) gibt und sodann das Pulver (Festkörper) der Enzymbehandlung während 1 bis 24 Stunden aussetzt,
worauf man nochmals etwa 1 Gew.% des Enzyms für zusätzliche
Enzymbehandlung zugibt.
Nach der obigen Enzymbehandlung werden, falls erforderlich,
unlösliche Bestandteile abzentrifugiert, filtriert oder dergl.. Sodann gewinnt man aus den wasserlöslichen
Anteilen jeweils Fraktionen carcinostatischer Substanzen, nämlich TF-3OO (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350.
Auf diese Weise gewinnt man TF-310 von TF-210; TF-320 von TF-220; TF-330 von TF-230; TF-340 von TF-240 und
TF-350 von TF-25O. Die Isolierung der Fraktionen TF-3OO
(TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350 kann durchgeführt werden durch mindestens eine Fraktionierung in Abhängigkeit
vom pH-Wert sowie durch gesonderte Fällung mit einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel, durch Fraktionierung
mit einem Ionenaustauscher, durch Ultrafiltra-
tion oder dergl.. Alternativ kann man auch eine oder mehrere
dieser Operationen mehrmals wiederholen. Genau gesprochen werden die vorliegenden, carcinostatischen Substanzen,
nämlich TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-34O
und TF-350, erhalten durch Einstellen des pH-Wertes des obigen wasserlöslichen Anteils auf vorzugsweise einen pH
von nicht mehr als 2,5, wobei man erforderlichenfalls Trichloressigsäure zusetzt. Dann wird der erhaltene Niederschlag
abgetrennt. Nun gibt man zum löslichen Anteil ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel, wie Alkohol, so
daß seine Konzentration 30 bis 80 Vol-96 und vorzugsweise
60 bis 80 Vol-% beträgt. Dann wird der gebildete Niederschlag
abgetrennt. Es handelt sich dabei um die Fraktion der angestrebten Verbindung. Nachfolgend kann, falls erforderlich,
dieser Niederschlag mit einem starken Anionenaustauscherharz
behandelt werden, z.B. mit Dowex 1 oder Amberlite IRA-400. Diese Behandlung kann mehrmals durchgeführt
werden. Auf diese Weise isoliert man die nichtadsorbierten Fraktionen, und diese werden, falls erforderlich,
einer Ultrafiltration unterworfen. Hierzu verwendet man z.B. ein Toyo Ultrafilter UK-50 mit einem nominellen
Molekulargewichtsabbruch von 50 000 oder ein Toyo Ultrafilter UK-200 mit einem nominellen Molekulargewichtsabbruch
von 200 000. Sodann werden die Substanzen weiteren Behandlungen unterzogen, wie einer Einengung, Entsalzung
oder Aussalzung, Trocknung oder Ausfällung mit Hilfe eines hydrophilen, organischen Lösungsmittels oder dergl..
Die so erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350 haben die in
Tabelle 2 angegebenen Eigenschaften.
Die carcinostatischen Substanzen TF-300 (TF-310, TF-320, TF-330), TF-340 und TF-350 können in pharmazeutisch
akzeptable Salze umgewandelt, und zwar nach herkömmlichen
* 3K
Verfahren, Man kann z.B. Alkalimetallsalze, wie Natriumsalze
oder Kaliumsalze, und Erdalkalimetallsalze, wie Magnesiumsalze, Calciumsalze oder dergl.,verwenden. Diese
Salze sind pharmazeutisch akzeptabel.
Fraktion
Eigenschaften
Aussehen
PharmakoIogisehe Wirkung
Löslichkeit
| TF-210 | grauweißes bis hellbraunes Pulver |
| TF-220 | π |
| TF-230 | η |
| TF-240 | ti |
| TF-250 | Il |
| TF-300 | π |
| TF-310 | η |
| TF-320 | Il |
η
π
π
diese Fraktion inhibiert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich
solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen; es hat eine immuno stimulierende
Wirkung
Il
Il
diese Fraktion inhibiert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor und
Sarcoma 180 bei Mäusen; sie hat eine immunostimulierende Wirkung
diese Fraktion inhibiert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor bei Mäusen;
sie hat eine immunostimulierende Wirkung
unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat
und Diäthylather
Il
it
löslich in Wasser; unlöslich in Methanol, Äthanolx Aceton,
Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthylather
η η
it η
Fraktion
Tabelle 2 (Fortsetzung) Eigenschaften
TF-210
TF-220 TF-23O TF-240 TF-250 TF-3OO
TF-31O TF-32O TF-330
Zersetzungspunkt
IR-Absorptionsspektrum
(KBr-Methode) ;Absorptionsbanden in der Nähe von
(KBr-Methode) ;Absorptionsbanden in der Nähe von
diese Fraktion zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei
bis 2350C
diese Fraktion zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt und_
zersetzt sich bei 160-2400C
diese Fraktion zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt und
zersetzt sich bei 185-225 C
diese Fraktion zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt und
zersetzt sich bei 200-215 C
diese Fraktion zeigt keinen scharfen Schmelzpunkt und_
zersetzt sich bei 165-21O°C
diese Fraktion beginnt sich bei etwa 1800C und stark bei
über 195°C zu zersetzen
3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220
und 1120-1020
It Il 40-42
3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1520, 1410-1360, 1280-1210, 1060, 960 und 820
3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1410-1380, 1240-1210,
1150-1120, 1080-1020, 980 und 810
3500-3300, 2920, 2850,1660-1620,
1580-1540, 1460-1400, 1380-1360, 1120, 1080-1020, 970 und 820-800
Il
40-43 5-7
5-7
9-10
7-9
| 42-45 | 5-7 | 10-11 | f te |
| 35-38 | 4-5 | 12-14 | I · |
| 30-33 | 3-5 | 3-5 | |
| 38-47 | 5-7 | 1-4 | |
| 38-47 | 5-7 | 1-4 | |
| 38-47 | 5-7 | 1-4 | |
| 38-47 | 5-7 | 1-4 | |
INJ) CD CJl CD
Tabelle 2 (Fortsetzung)
TF-34O diese Fraktion beginnt sich 3500-3300, 2920, 2850,1660-1640, 32-34 4-6 3-5
bei etwa 14O°C und stark bei 1580-1520, 1460-1440, 1410-1340,
über 2000C zu zersetzen 1250-1220, 1120-1030, 970 und 835
TF-350 diese Fraktion beginnt sich 3500-3300, 2920-2900, 1660-1630, 34-37 5-6 1-2
bei etwa 1100C und stark bei 1580-1520, 1460-1340, 1140-1100,
über 180°C zu zersetzen 1080-1020, 970 und 820-800
■CD -4
Tabelle 2 (Portsetzimg)
Fraktion Eigenschaften
Fraktion Eigenschaften
Farbreaktionen
Ninhydrin- Molisch- Fhenol-HaSÖZ,;- Änthron-H2S04- xndöT-HCl- Lowry-Folin
TF-21O + + + + +
TF-220 + ' + + + +
TF-23O .+.■■+ + + +
TF-24O ■+;'+.-.■ + + +
TF-25O + + + + +
TF-3OO -'.■'+'+ + + +
TF-3IO - + + + + " ■ +
TF-320 - + + + + +
TF-340 - + + + +■■■■■+
TF-350 - + + + + +
Fraktion
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Ei genschaften
Ei genschaften
UV-Absorptionsspektrum (wäßrige Lösung bei pH 7,0); Λ. max
an der Absorptionskante und in der Nähe von (nm)
Saccharidgehalt als Gluco- Proteingehalt als Rmderse,gemessen
nach dem Phe- serumalbumin, gemessen nach nol-HgSO^-Verfahren (%) dem Lowry-Folin-Verfahren(%)
| TF-210 | 248-265 |
| TF-220 | 248-266 |
| TF-230 | 249-264 |
| TF-240 | 250-265 |
| TF-25O | 248-269 |
| TF-300 | 246-280 |
| TF-3IO | η |
| TF-320 | η |
| TF-330 | η |
| TF-340 | 250-265 |
| TF-350 | 245-264 |
| ca. | 5 - | ca. | 25 | ca | .20 - | ca. | 50 |
| ca. | 5 - | ca. | 20 | = ca. | 10 | ||
| ca. | 5 - | ca. | 25 | ca | .30 - | ca. | 60 |
| ca. | 15 | - ca | . 35 | ca | .20 - | ca. | 30 |
| ca. | 60 | - ca | . 80 | ca | . 5 - | ca. | 20 |
| ca. | 16 | - ca | . 60 | = ca. | 10 | ||
| Il | Il | ||||||
| η | η | ||||||
| Il | Il | ||||||
| ca. | 20 | - ca | . 50 | Il | |||
| ca. | 80 | - ca | . 95 | Il |
Die Messung wurde an wasserlöslichen Fraktionen durchgeführt.
- 19 -
Die pharmakologischen Aktivitäten der erfindungsgemäßen
carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220, TF-23O, TF-240, TF-250, TF-3OO (TF-31O, TF-32O, TF-33O), TF-34O und
TF-350 werden im folgenden erläutert. Bei den nachfolgenden
pharmakologischen Tests wird die Testsubstanz TF-210 des Beispiels 1 eingesetzt sowie die Testsubstanz TF-220
des Beispiels 3, TF-230 des Beispiels 5, TF-240 des Beispiels 7, TF-250 des Beispiels 9, TF-31O-1 des Beispiels
11(1), TF-31O-2 des Beispiels 18, TF-320 des Beispiels
12, TF-33O des Beispiels 13» TF-340 des Beispiels 19, TF-350 des Beispiels 24 und TF-300 der Beispiele 11
bis 18.
(1) ImmunoStimulierende Wirkung
Drei Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) werden
in jeder Gruppe verwendet. Jede der Testsubstanzen wird in einer physiologischen Salzlösung aufgelöst und 0,2 ml
einer jeden Lösung werden intraperitoneal verabreicht.
24 h nach der Verabreichung werden in den Schwanz der Maus 0,2 ml einer Kohlenstoffsuspension intravenös injiziert.
Diese wird bereitet durch Vermischen von 1 ml Pelikan
Zeichentusche Nr. 17, schwarz (Günther Wagner GmbH.) mit
2 ml einer physiologischen Salzlösung, enthaltend 3 Gew.% Gelatine. 1,5, 10 und 15 min nach der Injektion werden *)
0,02 ml Blut gewonnen, wobei man eine Haematokritkapillare verwendet, die mit Heparin beschichtet ist. Das Blut
wird sofort verdünnt und haemolysiert, und zwar mit 1,6 ml einer 0,1 Gew.% wäßrigen Natriumcarbonatlösung. Diese Lö*·
sung wird colorimetriert, und zwar bei 675 nm. Der Phagocytose-Index
(K-Wert) wird aus der Gleichung von Halpern et al. ermittelt. Die Mäuse der Blindgruppe erhalten
0,2 ml einer physiologischen Salzlösung. *) aus der Orbita
log CQ - loc
t - t_
t - t_
C bezeichnet den Kohlenstoffpulvergehalt im Blut zum Zeit
punkt t ;
C bezeichnet den Kohlenstoffpulvergehalt im Blut zum Zeitpunkt t. Die Ergebnisse sind in den Tabellen
3 bis 5 aufgeführt.
Tabelle 3 Substanz
Dosis (mg/kg)
Durchschnittlicher K-Wert
TF-210 TF-220 TF-230 TF-240 TF-25O
"•"TF-310-1
TF-320 TF-330 Vergleich
3 6
1,5
5 10
5 10
5 10
0,1155
0,1198
0,1198
0,1087
0,1292
0,1292
0,1028
0,1194
0,1194
0,1109
0,1127
0,1127
0,0865
0,1120
0,1120
+ 0,0273 + 0,0231
+ 0,0346 + 0,0289
+ 0,0175 + 0,0334
+ 0,0250 + 0,0496
+ 0,0131 + 0,0329
| Vergleich | — | 0,0348 + 0,0037 | 4 |
| Tabelle | Durchschnittlicher K-Wert |
||
| Substanz | Dosis (mß/kff) |
0,1 1
0,1 1
0,1
0,0580
0,0776
0,0776
0,0468
0,0715
0,0715
0,0601
0,0965
0,0965
+ 0,0088 + 0,0168
+ 0,0123 + 0,0040
+ 0,0098 + 0,0102
0,0295 + 0,0007
Der Test wurde an einer aus vier Mäusen bestehenden Gruppe durchgeführt.
- «τ Tabelle 5
Substanz TF-34O+ TF-350
Vergleich
| Dosis (mg/kg) |
Durchschnittlicher K-Wert |
| 5 10 |
0,1292 η 0,1001 ] |
| 5 10 |
0,0817 η 0,1453 ] |
| - - | 0,0408 η |
| h 0,0229 [0,0295 |
|
| I- 0,0002 [ 0,0229 |
|
| I- 0,0016 |
Der Test wurde an einer aus vier Mäusen bestehenden
Gruppe durchgeführt.
(2) Carclnostatische Wirkung
■, (i) Antitumorwirkung gegen Ehrlich Ascites-Tumor
Ehrlich1s Ascites-Tumorzellen werden intraperitoneal in
Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) in einer Menge
von 1 χ 1(K Zellen/Maus eingeimpft. Nachfolgend wird
jeweils die Testsubstanz, aufgelöst in einer physiologischen Salzlösung, in einer Menge von 0,2 ml intraperitoneal
an die Mäuse verabreicht, und zwar einmal pro Tag an sieben aufeinanderfolgenden Tagen vom ersten Tag nach der
Einimpfung der Tumorzellen ab. Der Vergleichsgruppe gibt man 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, und zwar in
gleicher Weise. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 6 und 7 zusammengestellt.
Uberlebenstage der Mäuse bei Verab- _ reichung der Testsubstanz . ' x 100 (%)
Überlebenstage der Mäuse der Vergleichsgruppe.
Sub- Dosis (mg/kg x stanz Anzahl der Verabreichungen)
Durchschnittliche Überlebenstage (Tag)
T/G Anteil der über- Anteil der voll-
(%) lebenden Tiere ständigen Heilung nach 30 Tagen
| 0.7 χ 7 3.5 χ 7 |
>27.2 ± 5.7 >26.8 ± 4.9 |
>159 | 8/10 7/10 |
7/10 6/10 |
|
| 0.3 x 7 1.5 x 7 |
>22.8 ± 6.1 >29.1 ± 2.3 |
>135 >173 |
2/8 7/8 |
1/8 5/8 |
|
| 1x7 5x7 |
>29.9 ± 0.3 >28.3 ± 4.6 |
>177 >168 |
7/8 7/8 |
7/8 7/8 |
|
| 1x7 5x7 |
>23.2 ± 5.6 >24.5 ± 7.5 |
>138 >146 |
3/8 5/8 |
2/8 5/8 |
|
| 1x7 5x7 |
>20.3 ± 6.4 >26.6 ± 5.5 |
>158 | 2/8 5/8 |
2/8 5/8 |
|
| TF-210 | - | 16.8 ± 2.6 | 100 | 0/8 | 0/8 |
| TF-220 | |||||
| TF-23O | |||||
| TF-240 | |||||
| TF-25O | |||||
| Vergil |
Substanz Dosis (mg/kg χ
Anzahl der Verabreichungen)
Anzahl der Verabreichungen)
Durchschnittliche T/C Überlebenstage (%)
(Tag)
Anteil der Anteil der vollüberleb ,Tiere ständigen Heilung
nach 30 Tagen
| TP-310-1 | 0.1 χ 7 1x7 |
>27.9 ±4.5 >28.6 ± 2.3 |
>166 >170 |
4/8 6/8 |
4/8 6/8 |
| TF-320 | 0.5 χ 7 1x7 |
>29.0 ±2.6 >28.1 ± 4.9 |
>172 >167 |
7/8 7/8 |
7/8 7/8 |
| ΤΡ-330 | 0.5 χ 7 Ix 7 |
>29.8 ± 0.6 >29.6 ± 0.9 |
>177 >176 |
7/8 7/8 |
7/8 7/8 |
| ΤΡ-340 | 1x7 5x7 |
>28.3 ±4.5 >24.0 ± 9.4 |
>168 >143 |
7/8 5/8 |
5/8 5/8 |
| ΤΡ-350 | 1x7 5x7 |
19.6 ± 4.1 >30.0 ± 0.0 |
117 >17·9 |
0/8 8/8 |
0/8 8/8 |
| Vergleich | - | • 16.8 ± 2.3 | 100 | 0/8 | 0/8 |
(ii) Antitumorwirkung gegen Sarcoma-180-Zellen
(a) Sarcoma 180-Zellen werden intraperitoneal transplantiert, und zwar in Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich,
6 Wochen alt) in einer Menge von 1 χ 1Ο5 Zellen/Maus. Nachfolgend
wird eine jede der Testsubstanzen in einer physiologischen
Salzlösung aufgelöst, und 0,2 ml einer jeden der erhaltenen Lösungen werden intraperitoneal verabreicht,
und zwar einmal pro Tag an sieben aufeinanderfolgenden
Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Transplantation der Sarcoma-Zellen. Einer Vergleichsgruppe werden
0,2 ml einer physiologischen Salzlösung in gleicher Weise verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellte
Substanz
Dosis (mg/kg χ
Anzahl der Verabreichungen)
Anzahl der Verabreichungen)
Durchschnittliche T/C Überlebenstage (%)
(Tag)
Anteil der Anteil der vollüberleb. Tiere ständigen Heilung nach 30 Tagen
| TP-210 | 3.5 χ 7 7x7 |
>27.2 ± 5.6 >30.0 ± 0.0 |
>183 >203 |
4/5 5/5 |
4/5 5/5 |
| TF-220 | 0.3 χ 7 1.5 χ 7 |
>26.3 ± 6.0 >30.Ό ± 0.0 |
C- ΓΟ
C-O r-i OJ Λ Λ |
Ui ro
VJlUl |
2/5 5/5 |
| ΤΡ-230 | 1x7 5 χ 7 |
>29.2 ± 1.6 >24.8 ±9.9 |
>197 >168 |
4/5 3/5 |
ro J=-
UlUl |
| TF-240 | 1x7 5x7 |
>21.4 ± 7.3 >30.0 ± 0.0 |
ν ν
ro H-1 O J=- LOUl |
2/5 5/5 |
Ul H
UlUl |
| ΤΡ-250 | 1x7 5x7 |
>29.0 ±2.0 >28.4 + 3.2 |
>196 >192 |
J=-J=-
UlUI |
4/5 2/5 |
| Vergleich | - | 14.8 ± 2.3 | 100 | 0/5 | 0/5 |
- -26 -
(b) Sarcoma 180-Zellen werden subkutan transplantiert,
und zwar in die Achselhöhle von Mäusen des ICR-Stamms
(weiblich, 6 Wochen alt) in einer Menge von 1 χ 10' Zellen/Maus. Nachfolgend wird eine jede der Testsubstanzen,
aufgelöst in einer physiologischen Salzlösung oder in einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung, verabreicht.
Es werden jeweils 0,2 ml der erhaltenen Lösung intravenös (iv) oder intramuskulär (im) injiziert, und zwar einmal
pro Tag an sieben aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend mit dem ersten Tag nach der Transplantation der Sarcoma-Zellen.
Die Vergleichsgruppe erhält 0,2 ml einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder einer physiologischen Salzlösung,
und zwar in gleicher Weise. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8-(2) zusammengestellt.
| Sub- \ | Dosis(mg/kgx | Anz.d. Verabreich |
iv | 0.1 χ 7 | r Flüssigkeit für |
rabelle 8-(2) Tumorgewicht (g) |
T/C (%) |
| stanz Route | im | 0.1 χ 7 | die Auflösung ,) der Substanz |
||||
| TP-310-1 | - | - | Physiologische Salzlösung |
0.29 ± 0.15 | .20 | ||
| Vergleich | iv | 0.1 χ 7 | ti | 0.86 ± 0.10 | 60 | ||
| im | 0.1 χ 7 | Il ■ | 1.45 ± 0.31 | 100 | |||
| m-a ο O Π | iv | 0.1 χ 7 | Il | 1.54 ± 0.77 | 31 | ||
| Is! —3C.U | im | 0.1 χ 7 | Il | 3.50 ± 0.45 | 71 | ||
| - | - | 5#ige wäßrige Glucoselösung |
1.67 ± 0.58 | 34 | |||
| Vergleich | iv | 0.001x7 | Il | 2.38 ± 0.42 | 48 | ||
| 0.005x7 | Il | 4.94 ± 2.42 | 100 | ||||
| 0.01 x7 | Il | 2.67 ± 0-20 | 51 | ||||
| TP-310-2 | 0.05 x7 | It | 2.39 ±0.56 | 46 | |||
| 0.1 χ 7 | It | 2.33 ± Ο.26 | 44 | ||||
| - | ti | 1.31 ± 0.26 | 25 | ||||
| Vergl. | It | I.05 ± 0.21 | 20 | ||||
| Il | 5.24 ± 0.49 | 100 |
O CJl CD
| TF-310-2 | im | 0.1 χ 7 | 59äige wäßrige Glucoselösung |
1.68 ± 0.30 | 36 |
| Vergleich | - | If | 4.68 ± 0.57 | 100 |
Die obigen Daten für TF-310-1 zeigen die Ergebnisse am 7. Tag nach
der Transplantation der Sarcoma 180-Zellen. Die Daten für TF-320 und TF-310-2 zeigen die Ergebnisse am 14. Tag nach der Transplantation
der Sarcoma 180-Zellen.
(iii) Antitumorwirkung gegenüber Ehrlich1S solidem
Tumor
Ehrlich Tumorzellen werden subkutan in die Achselhöhle von Mäusen des ICR-Stamms (weiblich, 6 Wochen alt) in einer
Menge von 4 χ 10 Zellen/Maus transplantiert. Nachfolgend werden die jeweiligen Testsubstanzen in einer physiologischen
Salzlösung oder einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung aufgelöst. 0,2 ml einer jeden der Lösungen werden intraperitoneal
den Mäusen verabreicht, und zwar einmal pro Tag an sieben aufeinanderfolgenden Tagen, beginnend mit dem
ersten Tag nach der Transplantation der Tumorzellen, oder einmal an jedem zweiten Tag an insgesamt 10 Tagen, beginnend
am 8. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen. Der Vergleichsgruppe werden auf gleiche Weise 0,2 ml einer
physiologischen Salzlösung oder einer 5#igen wäßrigen Glucoselösung verabreicht. Das Gewicht eines jeden Tumors
wird ermittelt. Die Ermittlung des Tumorgewichts erfolgt durch Messen des großen Durchmessers (a mm) und des kleinen
Durchmessers (b mm) mittels einer Schiebelehre. Die Werte werden für a· und b in der folgenden Gleichung eingesetzt:
Gewicht des Tumors = (mg)
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 9-(1) und 9-(2) aufgeführt.
Substanz Dosis (mg/kg χ Anzahl der Verabreichungen)
Tabelle 9-(D
Verabreichungstag .
Verabreichungstag .
TF-210
TF-220
TF-230
TF-240
TF-250
Vergleich
3,5 x 7 7x7
3x7 6x7
10 χ 7 20 χ 7
10 χ 7 20 χ 7
10 χ 7 20 χ 7
Tag 1, 2, 3, 4, 5, 6, Tag 14*
Tumo rgewicht(g)
1,96 + 0,7
2.62 + 1,9
4,30 + 2,1
2,89 +1,2
2,89 +1,2
2.63 + 1,22
2,04 T 0,66
2,04 T 0,66
4,07 + 0,75
4,02 + 1,66
4,02 + 1,66
3,10 + 1,01
3,19 + 1,26
3,19 + 1,26
6,82 + 1,14
T/CC96)
29 38
62 42
38 29
59 59
46 47
100
Vi
ΪΝ0 CD
Tabelle 9-(2)
Substanz Dosis (mg/kg χ Anzahl Verabreichungstag Tag 15
der Verabreichungen) Tumorgewioht (gj T/C
{%)
TF-31O-1 1x5 Tag 8, 10, 12, 4,78+2,01 55
Vergleich - 14, 16 8,70 + 2,03 100
Bemerkungen: TF-210 bis TF-250 werden nach Auflösen in physiologischer Salzlösung
verwendet. TF-310-1 wird in einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung aufgelöst.
' ' ' Es ist der Tag angegeben, an dem das Gewicht des Tumors gemessen wird.
Jo «o
Ki) CD
(iv) Antitumoraktivitat gegen B-16 Melanom-Zellen
(a) B-16 Melanom-Zellen werden subkutan in die
Achselhöhle von Mäusen des BDF1-Stamms (männlich, 7 Wochen
alt) in einer Menge von 1 χ 10 Zellen/Maus transplantiert. Nachfolgend wird die jeweilige Testsubstanz in
physiologischer Salzlösung aufgelöst und jeweils 0,2 ml der jeweiligen Lösung werden intraperitoneal verabreicht,
und zwar einmal am Tag während sieben aufeinanderfolgender Tage, beginnend mit dem ersten Tag .nach der Transplantation
der Tumorzellen. Die Vergleichsgruppe erhält in gleicher Weise 0,2 ml physiologische Salzlösung. Die Tumorgewichte
werden am 17. oder 23. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen ermittelt. Die Bestimmungsmethode ist die gleiche wie im Testverfahren (iii). Die
Ergebnisse sind in Tabelle 10 aufgeführt.
| Sub- Dosis stanz zahl d |
7 | (mg/kg χ An- .Verabreich.) |
Durchschnittliches Tumorgewicht (g) |
T/C (96) |
| TF-210 | ,5 | x 7 | 3,07 + 0,7 | 64 |
| TF-220 1 | 5 10 |
x 7 x 7 |
3,92 + 2,29 3,69 + 0,81 |
82 77 |
| TF-230 | 5 10 |
χ 7 χ 7 |
3,21 + 0,64 3,71 + 1,08 |
67 77 |
| TF-240 | 5 10 |
χ 7 χ 7 |
3,78 + 1,26 4,00 + 1,36 |
79 84 |
| TF-250 | χ 7 χ 7 |
2,97 + 0,73 2,75 + 0,67 |
62 58 |
|
| Vergleich | 3 | — | 4,76 ± 0.68 | 100 |
| TF-310-1 | χ 7 | 2,53 + 1,61 | 63 | |
| Vergleich | - | 4,00 + 0,85 | 100 |
Bemerkungen: Durchschnittliche Tumorgewichte für TF-210 bis TF-250 werden am 17.Tag nach der Transplantation der
Tumorzellen bestimmt. Durchschnittliche Tumorgewichte für TF-310-1 werden am 23. Tag nach der Transplantation der
Tumorzellen bestimmt.
(b) Β-16 Melanom-Zellen werden subkutan in die
Achselhöhle von Mäusen des BDFi-Stamms (männlich, 6 Wochen
alt) in einer Menge von 1x10 Zellen/Maus transplantiert.
Nachfolgend wird die Testsubstanz in einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung aufgelöst. 0,2 ml der gebildeten Lösung werden
verabreicht, und zwar gleichzeitig intratumorös und intraperitoneal, und zwar einmal an jedem zweiten Tag an
insgesamt 12 Tagen, beginnend mit dem 13. Tag nach der Transplantation der Tumorzellen. Die Vergleichsgruppe erhält
jeweils 0,2 ml einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung auf gleiche Weise. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10-(2)
aufgeführt.
Tabelle 10-(2)
| Sub- Dosis (mg/kg x An stanz zahl d.Verabreich.) |
Route | Tumori | gewicht | 0,23 0,72 0,26 |
T/C |
| TF-310- 1,0 χ 6 ) 2 5,0 χ 6 ) 10,0 χ 6 ) |
it | 2,92 4,08 3,26 |
+ + + |
0,24 0,38 |
50 70 56 |
| 0,5 x 6 ) 1,0x6 ) |
it | 4,31 1,92 |
+ + |
0,80 | 74 33 |
| Vergleich - ) | IP | 5,83 | + | bestimmt. | 100 |
| Das Tumorgewicht wird am | 23. Tag | ||||
| (3) Akute Toxizität | |||||
Q werden bei Mäusen (ICR-Stamm, weiblich, 6 Wochen alt, intravenöse Verabreichung) gemessen. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 12 zusammengestellt.
-Sf-
Tabelle 12 Substanz ^50 ^ms/ks)
TF-210 über 100
TF-220 " 200
TF-230 " 100
TF-240 " 200
TF-250 " 200
TF-300 " 10
TF-340 " 200
TF-35O » 200
Man erkennt aus den obigen pharmakologischen Experimenten,
daß die TF-2-Substanzen der Erfindung brauchbare carcinostatische Mittel sind. Es kann eine Wirksamkeit
gegen verschiedenste Krebserkrankungen erwartet werden.
Insbesondere kann eine beträchtliche Wirksamkeit gegen solide Tumoren erwartet werden. Alle TF-2-Substanzen der
Erfindung zeigen ausgezeichnete Effekte.
Die TF-2-Substanzen der Erfindung können zu verschiedensten pharmazeutischen Darreichungsformen verarbeitet werden.
Insbesondere können orale Mittel hergestellt werden oder Injektionsmittel oder Suppositorien oder dergl.. Bevorzugt
sind Injektionsmittel. Im Falle oraler Mittel können diese verschiedene Hilfsstoffe enthalten und in Form
vin Kapseln, Tabletten, Pulvern oder Granulat vorliegen. Im Falle von Injektionsmitteln können diese für subkutane
Injektion, intramuskuläre Injektion und intravenöse Injektion vorgesehen sein. Es kann sich dabei um Suspensionen
oder Lösungen handeln oder um Pulver, welche vor Gebrauch in einer Salzlösung oder einer Glucose oder ein
Lokalanaesthetikum enthaltenden Lösung aufgelöst werden. Die Dosis der TF-2-Substanzen (TF-210, 220, 230, 240,
250, 300 [310, 320, 330], 340 und 350) kann je nach dem Zustand des Patienten ausgewählt werden. Es ist jedoch im
allgemeinen erwünscht, einem Erwachsenen 0,005 bis 50 mg/kg einmal oder mehrmals am Tag zu verabreichen. Was
die Verabreichungsmethode anbelangt, so ist die subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder die Injektion
in den erkrankten Bereich bevorzugt.
Ausführungsbeispiele:
Im folgenden wird die Erfindung im einzelnen anhand von Beispielen und Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:
Fig. 1 eine mikroskopische Photographie der Form des Fusobacterium nucleatum TF-031;
Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen
Substanz TF-210 des Beispiels 1;
Fig. 3 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser
Substanz;
Fig. 4 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen
Substanz TF-220 des Beispiels 3;
Fig. 5 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 6 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-230 des Beispiels 5;
Fig. 7 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 8 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-240 des Beispiels 7;
Fig. 9 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig.10 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen
Substanz TF-250 des Beispiels 9»
Fig.11 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser
Substanz;
Fig.12 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen
Substanz TF-310 des Beispiels 11;
Fig.13 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
(O-
Fig. 14 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
dieser Substanz;
dieser Substanz;
Fig. 15 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen
Substanz TF-320 des Beispiels 12;
Fig. 16 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser
Substanz;
Fig. 17 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
dieser Substanz;
dieser Substanz;
Fig. 18 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-330 gemäß Beispiel 13;
Fig. 19 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 20 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
dieser Substanz;
dieser Substanz;
Fig. 21 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen
Substanz TF-330 (gereinigt) des Beispiels
Fig. 22 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 23 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen
Substanz TF-310 (gereinigt) des Beispiels
18;
18;
Fig. 24 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 25 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz;
Fig. 26 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen
Substanz TF-340 des Beispiels 19;
Fig. 27 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Flg. 28 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm dieser Substanz;
Fig. 29 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der carcinostatischen Substanz TF-350 des Beispiels 24;
- 57 -
Fig. 30 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;
Fig. 31 ein Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
dieser Substanz.
Beispiel 1
(1) In ein 10 1 Fermentationsgefäß (Marubishi Rika
Kenkyusho) gibt man 8 1 TF-e Kulturmedium, enthaltend 17g
Trypticasepepton, 10 g Herzinfusion, 3 g Hefeextrakt,
7,5 g Natriumchlorid, 12 g Glucose, 10 g Lactose, 0,1 g
Natriumsulfit und 0,5 g Natriumthioglykolat, und zwar pro Liter destilliertes Wasser. Das Kulturmedium wird 30 min
bei 1200C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums
wird Stickstoffgas während einer Stunde mit einem Durchsatz von 100 ml/min hindurchgeleitet. Nun wird das
Kulturmedium mit 1 1 einer Vorkulturlösung von Fusobacterium
nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) geimpft, das
zuvor hergestellt wurde durch Kultivierung in einem TF-e Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung. Die Zellen werden
3 Tage bei 370C unter Rühren (30 U/min) kultiviert, wobei Stickstoffgas mit 65 ml/min hindurchgeleitet wird.
Nach der Kultivierung wird die Kultur mit 160 g CeIite
und 80 g Cellulosepulver versetzt und die Mischung wird gerührt und unter vermindertem Druck abfiltriert. Man erhält
7,8 1 einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit der Kultur.
(2) Zu 7,8 1 der überstehenden Flüssigkeit gibt man 117 ml konz.Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Sodann
gibt man 11,7 1 Äthanol hinzu, wobei eine 60#ige
wäßrige Äthanollösung erhält. Diese wird sodann während 24 h bei 40C stehengelassen. Nachfolgend wird die überstehende
Flüssigkeit abdekantiert und der verbleibende Anteil wird zentrifugiert (6 χ 10^ U/min; 5 min), und zwar
bei 4°C. Dabei wird der Niederschlag gewonnen. Das Präzi-
- fcL
pitat wird mit 400 ml einer 60&Lgen wäßrigen Äthanollösung
vom pH 2,0 gewaschen sowie mit 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthylather in dieser Reihenfolge. Dann
wird der Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 3,9 g eines Pulvers.
(3) Das Pulver der Stufe (2) wird in 25 ml Wasser suspendiert. Der pH-Wert der erhaltenen Suspension wird durch
Zugabe von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7»5 bis
8,0 eingestellt, und danach wird 30 min bei Zimmertemperatur
gerührt und 1N Salzsäure wird zugegeben, um den pH
auf 4,0 einzustellen. Sodann wird unter Eiskühlung während 2 h gerührt, und die Mischung wird mit 1 χ 10 U/min während
10 min zentrifugiert, um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Der Niederschlag
wird mit 10 ml Wasser vom pH 4,0 gewaschen und sodann wird der Niederschlag von der Waschflüssigkeit durch Zentrifugieren
(1 χ 10 U/min; 10 min) abgetrennt. Die Waschflüssigkeit und die oben erwähnte überstehende Flüssigkeit
werden kombiniert und der Behandlung gemäß Beispiel 9 unterworfen. Der Niederschlag wird mit 10 ml Äthanol gewaschen
und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,5 g der carcinostatischen Substanz TF-210. Die so erhaltene
careinostatische Substanz TF-210 hat die Eigenschaften
der Tabelle 2. Das Infrarot(IR)-Absorptionsspektrum und das Ultraviolett(UV)-Absorptionsspektrum sind in den
Fig. 2 bzw. 3 dargestellt.
Beispiel 2
(1) In ein 10 1 Fermentationsgefäß gibt man 8 1 eines TF-d Kulturmediums, enthaltend 17 g Trypticasepepton,
20 g Herzinfusion, 3 g Hefeextrakt, 7»5 g Natriumchlorid, 12 g Glucose, 10 g Lactose, 0,1 g Natriumsulfit und 0,5 g
Natriumthioglykolat/1 1 destilliertes Wasser. Das Kulturmedium
wird 30 min bei 1200C sterilisiert und nach dem Ab-
- -SÖ -
kühlen wird Stickstoffgas während 1 h mit 100 ml/min durchgeleitet.
In dieses Kulturmedium gibt man 1 1 einer Vorkultur lösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077,
ATCC-31647), welche zuvor bereitet wurde durch Kultivieren
in einem TF-d Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung.
Die Zellen werden 3 Tage bei 37°C unter Rühren mit 30 U/min kultiviert, wobei Stickstoffgas mit einem
Durchsatz von 65 ml/min hindurchgeleitet wird. Nach der Kultivierung wird der Ansatz mit 160 g Gelite und 80 g
Cellulosepulver versetzt und das erhaltene Gemisch wird
gerührt und filtriert (unter vermindertem Druck), wobei man 7,8 1 einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit
erhält.
(2) Zu 7,8 1 der überstehenden Flüssigkeit gibt man
117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Sodann gibt man 11,7 1 Äthanol zu der überstehenden Flüssigkeit,
wobei eine 60%ige wäßrige Äthanollösung erhalten wird. Diese läßt man 24 h bei 40C stehen. Nachfolgend
wird die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und die Restmenge wird zentrifugiert (6 χ 10^ U/min; 5 min) bei
4°C, wobei der Niederschlag erhalten wird. Dieser wird mit 400 ml einer 60&Lgen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0,
400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthylather in
dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 4,5 g eines Pulvers.
(3) Das Pulver wird der gleichen Behandlung wie in Beispiel
1(3) unterworfen, wobei man 1,6 g der carcinostatischen Substanz TF-210 erhält. Die so erhaltene, carcinostatische
Substanz TF-210 hat die in Tabelle 2 gezeigten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum
sind mit denjenigen des Beispiels 1 identisch.
Beispiel 3
(1) In ein 10 1 Fermentationsgefäß gibt man 8 1 eines TF-e Kulturmediums der gleichen Zusammensetzung wie in
Beispiel 1. Das Kulturmedium wird 30 min bei 1200C sterilisiert.
Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wird Stickstoff gas hindurchgeleitet, und zwar während 1 h mit einem
Durchsatz von 100 ml/min. In dieses Kulturmedium gibt man nun 1 1 einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum
TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647), welche zuvor durch Kultivieren in TF-e Kulturmedium bereitet wurde. Die Zellen
werden 5 Tage bei 370C unter Rühren (30 U/min) kultiviert,
und 3/ar unter Einleiten von Stickstoffgas mit einem Durchsatz
von 65 ml/min. Nach beendeter Kultivierung wird das Kulturmedium mit 160 g CeIite und 80 g Cellulosepulver
versetzt und das erhaltene Gemisch wird gerührt und unter vermindertem Druck filtriert. Man erhält 7,8 1 einer bakterienfreien,
überstehenden Flüssigkeit.
(2) Zu 7,8 1 der überstehenden Flüssigkeit der Stufe (1) gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH der überstehenden
Flüssigkeit auf 2,0 einzustellen. Sodann werden 11,7 1 Äthanol zur überstehenden Flüssigkeit gegeben, wobei
man eine 60%ige wäßrige Äthanollösung erhält. Diese läßt man nun während 24 h bei 40C stehen. Sodann wird die
überstehende Flüssigkeit abdekantiert und die Restmenge wird bei 4°C zentrifugiert (6 χ 10^ U/min; 5 min); der
dabei erhaltene Niederschlag wird mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0, 400 ml Äthanol,
200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei
man 4,9 g eines Pulvers erhält.
(3) Das Pulver der Stufe (2) wird in 49 ml Wasser suspendiert. Der pH der erhaltenen Lösung wird durch Zusatz
von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 8,0 ein-
gesteilt und 30 min bei Zimmertemperatur gerührt, worauf
der pH der Suspension mit 1N Salzsäure auf 6,0 eingestellt
wird. Nachfolgend wird die Suspension 2 h unter Eiskühlung
gerührt, worauf das Gemisch abzentrifugiert wird (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden
Flüssigkeit abzutrennen. Das Präzipitat wird mit 5 ml Wasser vom pH 6,0 gewaschen. Nun wird der Niederschlag
von der Waschflüssigkeit abzentrifugiert, und zwar während 10 min bei 1 χ 10 U/min, und mit 10 ml Äthanol
gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,8 g der careinostatischen Substanz TF-220. Die so
erhaltene, carcinostatische Substanz TF-220 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das
UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 4 bzw. 5 gezeigt.
B e i spiel 4
(1) In ein 10 1 Fermentationsgefäß gibt man 8 1 TF-d
Kulturmedium der Zusammensetzung des Beispiels 2. Das Kulturmedium wird 30 min bei 12O0G sterilisiert. Nach dem
Abkühlen wird Stickstoffgas während 1 h mit 100 ml/min
hindurchgeleitet. In dieses Kulturmedium gibt man 1 1 der Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031
(FERM-5077, ATCC-31647), welche zuvor im TF-d Kulturmedium
der gleichen Zusammensetzung bereitet wurde. Die Zellen werden 5 Tage bei 37°C unter Rühren (30 U/min) kultiviert,
wobei Stickstoffgas mit 65 ml/min hindurchgeleitet wird.
Nach der Kultivierung wird die Kulturlösung mit 160 g
Celite und 80 g Cellulosepulver versetzt und das erhaltene
Gemisch wird gerührt und unter vermindertem Druck abfiltriert. Man erhält 7,8 1 einer bakterienfreien, überstehenden
Flüssigkeit.
(2) Zu 7,8 1 der überstehenden Flüssigkeit gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen.
Dann werden 11,7 1 Äthanol zugegeben, wobei die überste-
-iahende Flüssigkeit zu einer 6O?6igen wäßrigen Äthanollösung
wird. Diese läßt man nun 24 h bei 4° C stehen. Nachfolgend
wird ein Lösungsanteil durch Abdekantieren entfernt und der restliche Anteil wird bei 40C zentrifugiert, und zwar
5 min bei 6 χ 1O^ U/min. Hierdurch wird der Niederschlag
gewonnen. Er wird mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung vom pH 2,0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und
200 ml Diäthyläther in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 5»07 g
eines Pulvers.
(3) Das erhaltene Pulver wird gemäß Beispiel 3(3) behandelt, wobei man 1,9 g der carcinostatischen Substanz
TF-220 erhält. Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-220 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum
und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen identisch mit denjenigen des Beispiels 3·
(1) In ein 10 1 Fermentationsgefäß gibt man 8 1 TF-e Kulturmedium der Zusammensetzung des Beispiels 1. Dieses
wird 30 min bei 1200C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des
Kulturmediums läßt man Stickstoffgas während 1 h mit 100 ml/min hindurchperlen. Nun wird mit 1 1 einer Vorkultur
lösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077,
ATCC-31647), welche zuvor im TF-e Kulturmedium der gleichen
Zusammensetzung bereitet wurde, geimpft. Die Zellen werden 2 Tage bei 370C unter Rühren (30 U/min) unter Einleiten
von Stickstoffgas mit einem Durchsatz von 65 ml/min kultiviert. Sodann wird die Kulturlösung mit 160 g Gelite
und 80 g Cellulosepulver versetzt und das erhaltene Gemisch
wird gerührt und unter vermindertem Druck abfiltriert, wobei man 7,8 1 einer bakterienfreien, überstehenden
Flüssigkeit erhält.
(2) Zu 7,8 g der überstehenden Flüssigkeit der Stufe
(1) gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0 einzustellen. Sodann werden 11,7 1 Äthanol zu der überstehenden
Flüssigkeit unter Bildung einer 60%igen wäßrigen Äthanollösung zugegeben, die man anschließend 24 h bei
40C stehenläßt, bis sich der Niederschlag vollständig abgeschieden
hat. Nachfolgend wird die überstehende Flüssigkeit abdekantiert und der restliche Anteil wird während
5 min mit 6 χ 1O^ U/min bei 4°C zentrifugiert. Sodann wird
der Niederschlag mit 400 ml einer 60&Lgen wäßrigen Äthanollösung
vom pH 2,0, 400 ml Äthanol, 200 ml Aceton und 200 ml Diäthyläther in dieser Reihenfolge gewaschen und
unter vermindertem Druck getrocknet; man erhält 2,73 g eines Pulvers.
(3) Das in Stufe (2) erhaltene Pulver wird in 25 ml Wasser suspendiert. Der pH der erhaltenen Suspension wird
durch Zusatz von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt. Die Suspension wird 30 min bei
Zimmertemperatur gerührt, worauf 1N Salzsäure zugesetzt
wird, um den pH auf 6,0 einzustellen. Nachfolgend wird die Suspension 2 h unter Eiskühlung gerührt und sodann
während 10 min bei 1 χ 10 U/min zentrifugiert. Auf diese Weise wird der Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit
abgetrennt. Der Niederschlag wird mit 5 ml Wasser vom pH 6,0 gewaschen. Sodann wird der Niederschlag von der
Waschflüssigkeit abzentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min).
Die Waschflüssigkeit und die überstehende Flüssigkeit werden kombiniert, und die erhaltene Lösung wird mit 1N Salzsäure
auf pH 4,0 eingestellt und sodann 12 h bei einer Temperatur von nicht mehr als 5GC stehengelassen und sodann
während 10 min mit 1 χ 10 U/min zentrifugiert, um den Niederschlag abzutrennen. Dieser wird nun mit 15 ml Wasser
vom pH 4,0 gewaschen und dann wird der Niederschlag von der Waschflüssigkeit abgetrennt, und zwar während 10 min
mit 1 χ 10 U/min. Nun wird der Niederschlag wiederum mit
10 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,58 g der carcinostatischen Substanz
TF-230, die die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften hat. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum
sind in den Fig. 6 bzw. 7 dargestellt.
B e i s τ> i e 1 6
(1) In ein 10 1 Fermentationsgefäß gibt man 8 1 TF-d Kulturmedium der Zusammensetzung des Beispiels 2, Dieses
wird 30 min bei 1200C sterilisiert. Nach dem Kühlen des
Kulturmediums wird Stickstoffgas während 1 h mit einem Durchsatz von 100 ml/min hindurchgeleitet. Nun wird das
Kulturmedium mit 1 1 einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) geimpft, die
zuvor in dem gleichen Kulturmedium bereitet wurde. Die Zellen werden 2 Tage bei 370C unter Rühren (30 U/min)
kultiviert, wobei Stickstoffgas mit 65 ml/min eingeleitet
wird. Nach der Kultivierung wird die Kulturlösung mit 16O g Celite und 80 g Cellulosepulver versetzt; das erhaltene
Gemisch wird gerührt und unter vermindertem Druck filtriert. Man erhält 7,8 1 einer bakterienfreien, überstehenden
Flüssigkeit.
(2) Zu 7,8 1 der überstehenden Flüssigkeit der Stufe (1) gibt man 117 ml konz. Salzsäure, um den pH auf 2,0
einzustellen. Dann werden 11,7 1 Äthanol zu der überstehenden Flüssigkeit unter Bildung einer 60%igen wäßrigen
Äthanollösung zugegeben, die dann 24 h bei 40C stehengelassen
wird. Die überstehende Flüssigkeit wird nun abdekantiert und die verbleibende Restmenge wird bei 40C
während 5 min bei 6 χ 1θ' U/min zentrifugiert, um den Niederschlag
zu gewinnen. Dieser wird nun mit 400 ml einer 60%igen wäßrigen Athanollösung vom pH 2,0, 400 ml Äthanol,
200 ml Aceton und 200 ml Diäthylather in dieser Reihen-
- 45- -
folge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Man erhält 3,15 g eines Pulvers,
(3) Das in Stufe (2) erhaltene Pulver wird gemäß Beispiel
5(3) behandelt. Man erhält 0,8 g der carcinostatischen Substanz TF-230 mit den in Tabelle 2 aufgeführten
Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen
des Beispiels 5 identisch.
(1) In 25 ml Wasser werden 3,9 g des Pulvers suspendiert, welches in gleicher Weise erhalten wie in Beispiel
1(1) und (2). Durch Zusatz von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung wird der pH der entstehenden Suspension auf 7,5
bis 8,0 eingestellt, und nach dem Rühren der Suspension bei Zimmertemperatur während 30 min wird der pH wiederum
durch Zusatz von 1N Salzsäure auf 6,0 eingestellt. Nach
2stündigem Rühren unter Eiskühlung wird die Suspension 10 min mit 1 χ 10 U/min abzentrifugiert; der abgetrennte
Niederschlag wird mit 5 ml Wasser vom pH 6,0 gewaschen und nun wird der Niederschlag während 10 min mit 1 χ 10 U/
min von der Waschflüssigkeit abzentrifugiert. Die Waschflüssigkeit und die obige, überstehende Flüssigkeit werden
kombiniert und der nachfolgenden Stufe (2) unterworfen. Der Niederschlag wird mit 10 ml Äthanol gewaschen und unter
vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,06 g der carcinostatischen Substanz TF-220 mit den Eigenschaften
der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum
sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 3 identisch.
(2) Zu der kombinierten Lösung der überstehenden Flüssigkeit und der Waschflüssigkeit der Stufe (1) gibt man
1N Salzsäure, um den pH auf 4,0 einzustellen. Dann wird
das Gemisch 12 h bei nicht mehr als 5°C stehengelassen. Nachfolgend wird die Mischung 10 min mit 1 χ 10 U/min
zentrifugiert, um den Niederschlag abzutrennen. Dieser wird mit 5 ml Wasser vom pH 4,0 gewaschen. Der Niederschlag
und die Waschflüssigkeit werden 10 min mit 1 χ 10 U/min zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit wird mit
der obigen überstehenden Flüssigkeit kombiniert und die kombinierte Lösung wird der Behandlung der nachfolgenden
Stufe (3) unterzogen. Der Niederschlag wird mit 5 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man
erhält 0,48 g der carcinostatischen Substanz TF-2j5O mit
den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum
und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 5 identisch.
(3) Die kombinierte Lösung, bestehend aus der überstehenden Flüssigkeit und der Waschflüssigkeit der Stufe (2),
wird mit 1N Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0 versetzt.
Dann läßt man das Gemisch 2 h unter Eiskühlung stehen. Die Mischung wird 10 min mit 6 χ 10^ U/min zentrifugiert,
wobei der Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit getrennt wird. Das Präzipitat wird mit 3 ml
Wasser vom pH 2,0 gewaschen. Das Präziptat und die Waschflüssigkeit werden 10 min bei 6 χ 10^ U/min zentrifugiert.
Die Waschflüssigkeit wird nun mit der obigen überstehenden Flüssigkeit kombiniert und die kombinierte Lösung
wird der im folgenden beschriebenen Stufe (4) unterzogen. Der Niederschlag wird mit 5 ml Äthanol gewaschen und unter
vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,10 g der carcinostatischen Substanz TF-240 mit den Eigenschaften
der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum
sind in den Fig. 8 bzw. 9 gezeigt.
(4) Äthanol wird zu der kombinierten Lösung der überstehenden
Flüssigkeit und der Waschflüssigkeit der Stufe
(3) unter Bildung einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung
zugesetzt. Die wäßrige Äthanollösung wird 12 h bei nicht mehr als 50C stehengelassen. Dann wird die abgeschiedene
Substanz während 10 min mit 6 χ 1O^ U/min zentrifugiert
und der Niederschlag wird mit 10 ml einer 80?£igen wäßrigen
Äthanollösung und 10 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man
erhält 2,08 g der carcinostatischen Substanz TF-250 mit den in Tabelle 2 gezeigten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum
und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen identisch mit denjenigen des Beispiels 9.
In 45 ml Wasser werden 4,5 g eines Pulvers suspendiert, das auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2(1) und (2) hergestellt
wurde. Durch Zusatz einer 1N wäßrigen Natriumhydroxidlösung
wird der pH der Suspension auf 7,5 bis 8,0 eingestellt, worauf 30 min bei Zimmertemperatur
gerührt wird. Dann wird der pH wiederum mit 1N Salzsäure
auf 4,0 eingestellt. Die Suspension wird 10 min mit 1 χ 10 U/min zentrifugiert und der Niederschlag wird von der
überstehenden Flüssigkeit getrennt. Der Niederschlag wird mit 5 ml Wasser vom pH 4,0 gewaschen und der Niederschlag
und die Waschflüssigkeit werden 10 min mit 1x10 U/min
zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit und die überstehende
Flüssigkeit werden kombiniert und der pH der erhaltenen Lösung wird durch Zusatz von 1N Salzsäure auf 2,0 eingestellt.
Danach wird die Lösung 2h unter Kühlung mit Eis-Wasser stehengelassen und schließlich 10 min mit 6 χ
10^ U/min zentrifugiert. Hierdurch wird der Niederschlag
von der überstehenden Flüssigkeit getrennt. Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 2,0 gewaschen und sodann
werden der Niederschlag und die Waschflüssigkeit 10 min mit 6 χ 10* U/min zentrifugiert. Der Niederschlag
320507A
wird mit 5 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,12 g der carcinpstatischen
Substanz TF-240 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind
im wesentlichen identisch mit denjenigen des Beispiels 7.
(1) Zu der kombinierten Lösung aus überstehender Flüssigkeit
und Waschflüssigkeit des Beispiels 1(3) gibt man 1N Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0 und läßt das
Gemisch 2 h unter Eiskühlung stehen. Anschließend wird das Gemisch 10 min mit 6 χ 10^ U/min zentrifugiert, um den
Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 2,0 gewaschen.
Das Präzipitat und die Waschflüssigkeit werden 1 10 min mit 6 χ 10^ U/min zentrifugiert. Die Waschflüssigkeit
wird mit der obigen überstehenden Flüssigkeit vereinigt und die kombinierte Lösung wird der in der folgenden
Stufe (2) beschriebenen Behandlung unterzogen. Das Präzipitat wird mit 5 ml Äthanol gewaschen und unter vermindertem
Druck getrocknet. Man erhält 0,11 g der carcinostatischen Substanz TF-240 mit den in Tabelle 2 aufgeführten
Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen
des Beispiels 7 identisch.
(2) Äthanol wird zu der Lösung, bestehend aus der überstehenden Flüssigkeit und der Waschflüssigkeit der
obigen Stufe (1) zugesetzt, um eine 80%ige wäßrige Äthanollösung zu bilden, die 12 h bei nicht mehr als 50C stehengelassen
wird. Die abgeschiedene Substanz wird 10 min mit
6 χ 10-5 U/min zentrifugiert und der Niederschlag mit 10 ml
einer 8O?6igen wäßrigen ÄthanoHösung und 10 ml Äthanol in
dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 2,1 g der carcinostatischen Sub-
stanz TF-250 mit den in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften.
Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum sind in den Fig. 10 bzw. 11 gezeigt.
In 45 ml Wasser werden 4,5 g eines Pulvers suspendiert,
das auf gleiche Weise wie in dem Beispiel 2(1) und (2) erhalten wurde. Durch Zugabe von-.TN wäßriger Natriumhydroxidlösung wird der pH der Suspension auf 7,5 bis 8,0
eingestellt. Dann rührt man 30 min bei Zimmertemperatur
und stellt den pH erneut durch Zusatz von 1N Salzsäure auf 2,0 ein. Das Gemisch wird 10 min mit 6 χ 10^ U/min zentrifugiert,
um das Präzipitat von der überstehenden Lösung abzutrennen«. Der Niederschlag wird mit 10 ml Wasser vom
pH 2,0 gewaschen, und das Präzipitat und die Waschflüssigkeit
werden 10 min mit 6 x" 10 ■-U/min zentrifugiert. Die
Waschflüssigkeit und die überstehende Flüssigkeit werden kombiniert und diese Lösung wird mit Äthanol unter Bildung
einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung versetzt. Die Lösung
wird 12 h bei nicht mehr als 5°C stehengelassen und dann
10 min mit 6 χ 10 .U/min zentrifugiert, wobei man einen
Niederschlag erhält. Dieser wird mit 10 ml einer 8O?6igen
wäßrigen Äthanollösung und 10 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet.
Man erhält 2,68 g der carcinostatischen Substanz TF-250 mit den in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. Das IR-Absorptionsspektrum
und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 9 identisch.
(1) In 15 ml Wasser werden 1,5 g der carcinostatischen
Substanz TF-210 des Beispiels 1 suspendiert. Zu der resultierenden
Suspension gibt man unter Rühren eine 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung, um den pH auf 7,8 einzustellen. Die
Suspension wird auf 37 C erhitzt und mit 15 mg Pronase E
(Warenzeichen der Kaken Kagaku; 1 000 000 Tyrosin-Einheiten/g)
und einigen Tropfen Toluol versetzt. Unter Schütteln wird die Mischung 24 h einer Enzymbehandlung bei pH
7,8 bis 8,0 und einer Temperatur von 37 bis 40°C unterzogen. Nach der Behandlung wird die Mischung 10 min mit
4000 U/min zentrifugiert, um das Präzipitat von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Zu dem Niederschlag
gibt man 3 ml V/asser vom pH 8,0 und zentrifugiert die Mischung 10 min bei 4000 U/min zur Abtrennung des Präzipitats
aus der Waschflüssigkeit. Die Waschflüssigkeit und die obige überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und mit
1N Salzsäure versetzt, um den pH auf 2,0 einzustellen,
worauf sich ein Niederschlag bildet. Diese Mischung wird 12 h bei 50C stehengelassen und dann 10 min mit 1 χ 10 U/
min zur Abtrennung des Präzipitats aus der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Das Präzipitat wird mit 3 ml
Wasser vom pH 2,0 versetzt und die Mischung wird 10 min mit 1 χ 10 U/min zentrifugiert, um das Präzipitat von
der Waschflüssigkeit abzutrennen. Die Waschflüssigkeit und die überstehende Flüssigkeit werden vereinigt, und die Lösung
wird mit Äthanol zur Bildung einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung versetzt. Die wäßrige Äthanollösung wird 2 h
unter Eisküh^ung gerührt und dann 10 min mit 4000 U/min zur Abtrennung des Niederschlags aus der überstehenden
Flüssigkeit zentrifugiert. Das Präzipitat wird mit 5 ml einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung und 5 ml Äthanol in
dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 327 mg der carcinostatischen Substanz
TF-310-Fraktion.
In 5 ml Wasser werden 327 mg dieses Pulvers aufgelöst, und
der pH der Lösung wird durch Zusatz von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung
auf 7,0 eingestellt. Die so bereitete Lösung wird in eine mit 45 ml Amberlite IRA-400 (Rohm and
Haas) gepackte Säule gegeben, welche zuvor auf den OH-Typ
eingestellt wurde, und zwar mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung.
Nachfolgend gibt man 200 ml Wasser durch die Säule. Alle Eluate werden vereinigt und der pH derselben
wird mit 1N Salzsäure auf 7,0 eingestellt. Diese Lösung
wird nun unter vermindertem Drück eingeengt und über
Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3/um (Japan Millipore Ltd.) filtriert und schließlich gefriergetrocknet.
Man erhält 210 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-310. Die so gewonnene, carcinostatische
Substanz TF-310 hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei
etwa 20 bis 60%, ausgedrückt als Glucose. Das IR-Absorptionsspektrum,
das UV-Absorptionsspektrum und das Hochlei stungs -Flüssigchroma to gramm einer typischen Probe sind
in den Fig. 12, 13 bzw. 14 dargestellt.
(2) In 50 ml Wasser werden 140 mg der carcinostatischen
Substanz TF-310 aufgelöst, und die erhaltene Lösung wird auf die 100fache Konzentration, bezogen auf die anfängliche
Konzentration, eingeengt. Hierzu wird ein Ultrafilter UK-50 (Ultrafiltermembran der Toyo Roshi Kabushiki
Kaisha; nomineller Molekulargewichtsabbruch: 50 000) verwendet. Dieses Konzentrat wird nun über ein Millipore-Filter
mit einem Porendurchmesser von 0,2 /um filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 88 mg der gereinigten,
gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz
TF-310. Diese gereinigte, carcinostatische Substanz TF-310 hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt
liegt im allgemeinen bei etwa 16 bis 30%, ausgedrückt
als Glucose.
-·. - .320.5Q7A
(1) In 10 ml suspendiert man 1 g der carcinostatischen
Substanz TF-220 des Beispiels 7(1)· Zu der erhaltenen
Suspension gibt man 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung unter Rühren, um den pH auf 7,8 einzustellen. Die Mischung wird
auf 370C erwärmt und mit 15 mg Pronase E und mit mehreren
Tropfen Toluol versetzt. Unter Schütteln wird die Mischung der Enzymbehandlung bei 37 bis 40°C während 24 h und bei
pH 7,8 bis 8,0 unterzogen. Nach der Behandlung wird die Mischung während 10 min bei 4000 U/min zentrifugiert, um
den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH
8,0 versetzt und die Mischung wird sodann 10 min bei 4000 U/min zentrifugiert, um den Niederschlag von der
Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden kombiniert
und die erhaltene Lösung wird mit 1N Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0 versetzt, wobei sich ein Niederschlag
bildet. Die Mischung wird 12 h bei 5°C stehengelassen und sodann 10 min bei 1 χ 10 U/min zentrifugiert,
um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Zum Niederschlag gibt man nun 3 ml Wasser
vom pH 2,0 und zentrifugiert die Mischung 10 min mit 1 χ 10 U/min, um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit
zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden kombiniert, und die Lösung
wird zur Bildung einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung mit Äthanol versetzt. Die wäßrige Äthanollösung wird 2 h
unter Eiskühlung gerührt und sodann zentrifugiert (4000 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden
Flüssigkeit zu trennen. Der Niederschlag wird mit 5 ml einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung und 5 ml Äthanol
in dieser Reihenfolge gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 163 mg der carcino-
— 53 — statischen Substanz TF-320-Fraktion.
In 5 ml Wasser werden 150 mg dieses Pulvers aufgelöst,
und die erhaltene Lösung wird durch Zusatz von 1N wäßriger
Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt. Die so bereitete Lösung wird in eine Säule gegossen, welche mit 25 ml
Amberlite IRA-400 gepackt ist. Dieses wurde zuvor mit 1N
wäßriger Natriumhydroxidlösung auf den OH-Typ eingestellt. Nachfolgend läßt man 100 ml Wasser durch die Säule laufen.
Alle Eluate werden vereinigt und 1N Salzsäure wird zur
Einstellung des pH auf 7,0 zugesetzt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt, sodann über ein Millipore-Filter
mit einem Porendurchmesser von 0,3/um filtriert und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält
110 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-320. Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-320
hat die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 20 bis 60%, ausgedrückt
als Glucose. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-Absorptionsspektrum
und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm einer typischen Probe sind in den Fig. 15, 16 bzw.
17 dargestellt.
(2) In 50 ml Wasser werden 100 mg der carcinostatischen
Substanz TF-320 aufgelöst, und die erhaltene Lösung wird auf das 10Ofache der anfänglichen Konzentration eingeengt.
Hierzu verwendet man das Ultrafilter UK-50. Das Konzentrat wird über ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser
von 0,2/um filtriert und sodann gefriergetrocknet.
Man erhält 72 mg der gereinigten, gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-320. Die gereinigte,
carcinostatische Substanz TF-320 hat.die Eigenschaften der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen
bei etwa 16 bis 30%, ausgedrückt als Glucose.
-«54 -
Beispiel 13
(1) In 5 ml Wasser werden 0,48 g der carcinostatischen
Substanz TF-23O des Beispiels 7(2) suspendiert. Zu der
Suspension gibt man 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung unter
Rühren zur Einstellung des pH auf 7,8. Die Mischung wird auf 370C erwärmt und mit 5,0 mg Pronase E sowie mit mehreren
Tropfen Toluol versetzt. Unter Schütteln wird die Mischung 24 h bei pH 7,8 bis 8,0 und bei 37 bis 400C der
Enzymbehandlung unterzogen. Nach dieser Behandlung wird das Gemisch zentrifugiert (4000 U/min; 10 min), um den
Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Zu dem Niederschlag gibt man 3 ml Wasser vom pH 8,0.
Die Mischung wird zentrifugiert (4000 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit zu trennen. Die
Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und die erhaltene Lösung wird
mit 1N Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0 versetzt,
worauf sich ein Präzipitat bildet. Diese Mischung wird
12 h bei 5°C stehengelassen und dann zentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden
Flüssigkeit zu trennen. Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser vom pH 2,0 versetzt und die Mischung zur Abtrennung
des Präzipitats aus der Waschflüssigkeit zentrifugiert (1 χ 10 U/min). Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte,
überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und Äthanol wird zugesetzt, um eine 80%ige wäßrige Äthanollösung
zu erhalten. Die wäßrige Äthanollösung wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und dann zentrifugiert (4000 U/
min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Der Niederschlag wird mit 5 ml
einer 80%igen wäßrigen Äthanollösung und 5 ml Äthanol in
dieser Reihenfolge gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 100 mg der carcinostatischen
Substanz TF-330-Fraktion.
In 5 ml Wasser werden 100 rag des vorerwähnten Pulvers aufgelöst
und der pH der erhaltenen Lösung wird durch Zusatz von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule gegeben, welche mit 15 ml Amberlite IRA-400 gepackt ist. Dieses wurde zuvor
mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf den OH-Typ
eingestellt. Nachfolgend läßt man 60 ml Wasser durch die Säule laufen. Alle Eluate werden vereinigt und durch Zusatz
von 1N Salzsäure auf pH 7,0 eingestellt. Diese Lösung
wird unter vermindertem Druck eingeengt und über ein Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3/um
filtriert und schließlich gefriergetrocknet. Man erhält 70 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz
TF-330 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum,
das UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm typischer Proben sind
in den Fig. 18, 19 bzw. 20 dargestellt.
(2) In 50 ml Wasser werden 70 mg der carcinostatischen
Substanz TF-330 aufgelöst, und die erhaltene Lösung wird auf die lOOfache Konzentration, bezogen auf die Anfangskonzentration, eingeengt, und zwar durch Verwendung des
Ultrafilters UK-50. Das Konzentrat wird über Millipore-Filter mit einem Porendurchraesser von 0,2/um filtriert
und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 49 mg gereinigte,
gefriergetrocknete, carcinostatische Substanz TF-330. Die gereinigte, carcinostatische Substanz TF-330 hat die Eigenschaften
der Tabelle 2 und ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 16 bis 30%, ausgedrückt als
Glucose. Das IR-Absorptionsspektrum und das UV-Absorptionsspektrum
einer typischen TF-330-Probe sind in den Fig. 21 bzw. 22 dargestellt.
- to-
Beispiel 14
(1) Gemäß Beispiel 2(3), 7(1) oder 7(2) wird die Behandlung von 4,5 g der jeweiligen Substanz des Beispiels
2(1) und (2) durchgeführt, wobei man die carcinostatische ;,
Substanz TF-21O, TF-220 bzw. TF-23O erhält. ^
(2) Die carcinostatischen Substanzen TF-21O, TF-220
oder TF-230 werden nun weiterbehandelt, und zwar gemäß den Beispielen 11(1), 12(1) oder 13(1), wobei man gefriergetrocknete,
carcinostatische Substanz TF-31O, TF-320
oder TF-33O in Mengen von 220, 120 bzw. 75 mg erhält.
Die so erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-310,
TF-320 und TF-330 haben die Eigenschaften der Tabelle 2. die IR-AbsorptionsSpektren, die UV-Absorptionsspektren
und die Hochleistungs-Flüssigchromatogramme sind im wesentlichen mit denjenigen der Beispiele 11, 12 bzw. 13
identisch.
Nach dem Verfahren des Beispiels 11 werden 1,5 g der carcinostatischen
Substanz TF-210 des Beispiels 1 behandelt, wobei man jedoch (a) 15 mg Trypsin (Difco) anstelle der
Pronase E bei der Enzymbehandlung einsetzt und (b) eine 60&Lge wäßrige Äthanollösung anstelle der 80%igen wäßrigen
Äthanollösung bereitet, wenn man den Niederschlag von dem wasserlöslichen Anteil mit einem pH von 2 nach der Enzymbehandlung
abtrennt. Man erhält 200 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-310.
In ähnlicher Weise werden die folgenden gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanzen TF-320 und TF-330 erhalten.
Carcinostatische Trypsin Gefriergetrocknete, carci-
TF-220 1 g 15 mg TF-320 100 mg
TF-230 0,48 g 5 mg TF-330 65 mg
Die obigen carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und
TF-330 haben die Eigenschaften der Tabelle 2. Die IR-Absorptionsspektren,
die UV-Absorptionsspektren und die Hochleistungs-Flüssigchromatogramme
sind im wesentlichen mit denjenigen der Beispiele 11, 12 bzw. 13(1) identisch.
Die carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220 und TF-230
der Beispiele 1, 7(1) bzw. 7(2) werden nach den Verfahren
der Beispiele 11(1), 12(1) bzw. 13(1) behandelt, mit der Ausnahme, daß nach der Enzymbehandlung eine 6O?6ige
wäßrige Äthanollösung anstelle der 80%igen wäßrigen Äthanollösung bereitet wird, wenn der Niederschlag aus dem
wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 abgetrennt wird. Man erhält die gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanzen
TF-310, TF-320 und TF-330 in Mengen von 190, 98
bzw. 66 mg. Die erhaltenen, carcinostatischen Substanzen TF-310, TF-320 und TF-330 haben die Eigenschaften gemäß
Tabelle 2. Die IR-Absorptionsspektren, die UV-Absorptionsspektren
und die Hochleistungs-Flüssigchromatogramme sind im wesentlichen mit denjenigen der Beispiele 11, 12 bzw.
13(1) identisch.
Die carcinostatischen Substanzen TF-210, TF-220 und TF-230
der Beispiele 1, 7(1) bzw. 7(2) werden nach den Verfahren der Beispiele 11(1), 12(1) bzw. 13(1) behandelt,
wobei jedoch nach der Enzymbehandlung beim Abtrennen des Niederschlags vom wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 eine
60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 80%igen wäßrigen
Äthanollösung bereitet wird. Im übrigen wird die gleiche Nachbehandlung wie bei den entsprechenden Beispielen
durchgeführt, wobei man 192 mg, 102 mg bzw. 65 mg der
gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanzen TF-31O,
TF-320 und TF-330 erhält. Die erhaltenen, carcinostatischen
Substanzen TF-31O, TF-320 und TF-330 haben die Eigenschaften
der Tabelle 2. Die IR-Absorptionsspektren, die UV-Absorptionsspektren
und die Hochleistungs-Flüssigchromatogramme sind im wesentlichen mit denjenigen der Beispiele
11, 12 bzw. 13(1) identisch.
(1) In ein 90 1 Fermentationsgefäß (MSJ-U2-TyP; Marubishi
Rika Kenkyusho) gibt man TF-f Kulturmedium. Dieses wurde dadurch bereitet, daß man 70 1 destilliertes Wasser
mit 1190 g Trypticasepepton, 1050 g Herzinfusion, 210 g
Hefeextrakt, 525 g Natriumchlorid, 840 g Glucose, 700 g Lactose, 7 g Natriumsulfit, 35 g Natrxumthioglykolat und
175 g Kalium-sek.-phosphat versetzt. Das Kulturmedium
wird 15 min bei 1180C sterilisiert. Nach dem Abkühlen leitet
man während 1 h Stickstoffgas mit einem Durchsatz von 250 ml/min hindurch.
Dieses Kulturmedium wird nun mit etwa 900 ml einer Vorkulturlösung
von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) geimpft. Diese wurde zuvor bereitet
durch Kultivierung in einem TF-f Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung. Die Zellen werden 4 Tage bei etwa 330C
unter Rühren (90 U/min) kultiviert, wobei man Stickstoffgas
mit einem Durchsatz von 250 ml/min einleitet. Nach dem Kultivieren wird die Kulturlösung mit 10 g/l CeIite
und 5 g/l Cellulosepulver versetzt und die Mischung wird gerührt und unter vermindertem Druck filtriert, wobei man
- 59 - ■ -lh-
etwa 65 1 einer bakterienfreien, überstehenden Flüssigkeit erhält.
(2) Zu 7,5 1 der überstehenden Flüssigkeit gibt man 113 ml konz.Salzsäure zur Einstellung des pH auf 2,0. Sodann
gibt man 11,4 1 Äthanol zur überstehenden Flüssigkeit,
um eine 60%ige wäßrige Äthanollösung zu erhalten. Diese läßt man nun 24 h bei 40C stehen. Nachfolgend wird der
Lösungsanteil abdekantiert und der verbleibende Anteil wird bei 4°C während 10 min mit 4 χ 1 Qr U/min zur Gewinnung
des Niederschlags zentrifugiert. Dieser wird mit zwei 100 ml-Portionen einer 6O96igen wäßrigen Äthanollösung vom
pH 2,0, einer 150 ml-Portion Äthanol, einer 150 ml-Portion
Methanol und schließlich einer 150 ml-Portion Aceton in
dieser Reihenfolge gewaschen und dann wird das Pulver an der Luft getrocknet. Man erhält 3,0 g des Pulvers.
(3) Das Pulver der Stufe (2) wird in 30 ml Wasser suspendiert. Der pH der erhaltenen Suspension wird mit 4N
wäßriger Natriumhydroxidlösung auf 7,5 bis 8,0 eingestellt. Dann rührt man 15 min bei Zimmertemperatur und stellt erneut
den pH durch Zusatz von 4N Salzsäure auf 4,0 ein. Nachfolgend läßt man die Suspension 2 h unter Eiskühlung
stehen. Das Gemisch wird 10 min mit 1 χ 10 U/min zur Abtrennung
des Niederschlags aus der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Zum abgetrennten Niederschlag gibt
man 6 ml Wasser als Waschflüssigkeit. Hierdurch wird eine Suspension gebildet, welche man mit einer 4N wäßrigen
Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH auf 7,5 bis
8,0 versetzt. Die Suspension wird 15 min bei Zimmertemperatur
gerührt, worauf man 4n Salzsäure zusetzt, um den pH auf 4,0 einzustellen. Nun läßt man die Suspension 2 h
unter Eiskühlung stehen. Sodann wird die Suspension 10 min mit 1 χ 10 U/min zentrifugiert, wobei der Niederschlag
gewonnen wird. Dieser wird mit 4 ml Wasser vom pH
4,0 gewaschen und dann wiedertun zentrifugiert (1 χ 10 ti/
min; 10 min). Man erhält 6,2 g (Naßgewicht) eines Niederschlags (TF-210) gewinnt. Die so erhaltene, carcinostatische
Substanz TF-210 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen
mit denjenigen des Beispiels 1 identisch.
(4) 6,2 g (Naßgewicht) des Niederschlags der Stufe (3) werden in 6 ml Wasser suspendiert. Zur Suspension gibt
man unter Rühren eine gesättigte, wäßrige Ammoniumcarbonatlösung, um den pH der Suspension auf 7»8 einzustellen.
Die Suspension wird auf 370C erwärmt und mit 21 mg Pronase
E und mehreren Tropfen Toluol versetzt. Das erhaltene Gemisch wird unter Schütteln einer Enzymbehandlung unterworfen,
und zwar während 24 h bei 37 bis 40°C und bei einem pH von 7,8 bis 8,0. Der pH der erhaltenen Mischung
wird unter Zusatz von 4N Salzsäure auf 1,0 einstellt, worauf der Niederschlag gebildet wird. Die Suspension wird
nun 2 h unter Eiskühlung stehengelassen und sodann zentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min), um die überstehende
Flüssigkeit zu gewinnen. Diese überstehende Flüssigkeit wird mit 29 ml Äthanol unter Bildung einer 6O96igen wäßrigen
Äthanollösung versetzt, worauf sich ein Niederschlag bildet. Man läßt die Aufschlämmung 2 h unter Eiskühlung
stehen. Sie wird sodann zentrifugiert (6 χ 10^ U/min;
10 min), um den Niederschlag abzutrennen. Dieser wird mit 5 ml einer 6O?6igen wäßrigen Äthanollösung, 10 ml Äthanol
und 10 ml Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen und so-. dann an der Luft getrocknet. Man erhält 315 mg rohe Kristalle
der carcinostatischen Substanz TF-310,
Die rohen Kristalle (315 mg) werden in 30 ml Wasser aufgelöst und eine 4N wäßrige Natriumhydroxidlösung wird
zur Einstellung des pH auf 8,0 zugesetzt. Die erhaltene
- or -
Lösung wird auf eine Säule gegossen, welche mit 30 ml
Dowex 1x4 gepackt ist, das auf-den"Cl-Typ eingestellt
wurde. Nachfolgend läßt man 100 ml Wasser durch die Säule laufen. Alle Eluate werden vereinigt und der pH wird auf
6,5 bis 7,0 eingestellt. Sodann wird die Lösung über Ultrafilter UK-50 filtriert, worauf das Filtrat auf die
10Ofache Konzentration der ursprünglichen Konzentration
eingeengt wird. Das Konzentrat wird über Milllpore-Filter
mit einem Porendurchmesser von 0,3/um filtriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 230 mg der gefriergetrockneten,
gereinigten, carcinostatischen Substanz TF-310. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-310 hat die
Eigenschaften gemäß Tabelle 2; ihr Saccharidgehalt liegt im allgemeinen bei etwa 16 bis 30%, ausgedrückt als
Glucose. Das IR-AbsorptionsSpektrum, das UV-Absorptionsspektrum
und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm typischer Proben sind in den Fig. 23, 24 bzw. 25 dargestellt.
In 10 ml Wasser werden 0,9 g der carcinostatischen Substanz TF-240 des Beispiels 7(3) suspendiert und der pH
wird unter Rühren durch Zusatz von 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung
zur erhaltenen Suspension auf 7,8 eingestellt. Nach der Erwärmung auf 370C gibt man zur Suspension
9 mg Pronase E sowie mehrere Tropfen Toluol in dieser
Reihenfolge. Das erhaltene Gemisch wird unter Schütteln einer Enzymbehandlung während 24 h bei 37 bis 400C
und bei einem pH von 7,8 bis 8,0 unterzogen. Die behandelte Mischung wird sodann zentrifugiert (4000 U/min;
10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit abzutrennen. Zu dem Niederschlag gibt man 3 ml
Wasser vom pH 8,0 und zentrifugiert die erhaltene Suspension (4000 U/min; 10 min) zur Abtrennung des Niederschlags
von der Waschflüssigkeit. Die Waschflüssigkeit und
die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt und durch Zusatz von 1N Salzsäure wird der pH auf 2,0 eingestellt.
Dabei wird ein Niederschlag gebildet. Die erhaltene Aufschlämmung wird 12 h bei 5°C stehengelassen und
sodann zentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen.
Der Niederschlag wird mit 5 ml Wasser vom pH 2,0 versetzt
und die erhaltene Suspension wird zentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der
Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit werden vereinigt
und zu der vereinigten Lösung wird Äthanol zur Bildung einer 80&Lgen wäßrigen Äthanollösung gegeben. Die wäßrige
Äthanollösung wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und sodann zentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag
von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. Der Niederschlag wird mit 5 ml einer 80&Lgen wäßrigen Äthanollösung
und 5 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und bei vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 170 mg der
carcinostatischen Substanz TF-34-O-Fraktion.
In 5 ml Wasser werden 150 mg dieses Pulvers aufgelöst und der pH der erhaltenen Lösung wird durch Zusatz einer
1N wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf 7,0 eingestellt.
Die Lösung wird sodann auf eine Säule gegeben, die mit 25 ml Amberlite IRA-400 gepackt ist. Dieses wurde zuvor
mit einer 1N wäßrigen Natriumhydroxidlösung auf den OH-Typ
eingestellt. Sodann läßt man 100 ml Wasser durch die Säule laufen. Alle Eluate werden vereinigt und der pH wird durch
Zusatz von 1N Salzsäure auf 7»0 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt und über
Millipore-Filter mit einem Porendurchmesser von 0,3/um filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 110 mg
der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-340.
- 65--
Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-340 hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum,
das UV-Absorptionsspektrum und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
sind in den Fig. 26, 27 bzw. 28 gezeigt.
Gemäß dem Verfahren des Beispiels 19 werden 0,9 g der
carcinostatischen Substanz TF-240 des Beispiels 8 behandelt.
Man erhält 115 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-340. Die erhaltene, carcinostatische
Substanz TF-340 hat die Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Das IR-Absorptionsspektrum, das UV-Absorptionsspektrum
und das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 19 identisch.
Gemäß dem Verfahren des Beispiels 19 werden 0,9 g der carcinostatischen Substanz TF-240 des Beispiels 7(3) behandelt,
wobei man aber (a)die Enzymbehandlung unter Verwendung von 9 mg Trypsin (Difco) anstelle der Pronase E
durchführt und (b) nach der Enzymbehandlung den Niederschlag vom wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 abtrennt
und eine 60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle einer
80%igen wäßrigen Äthanollösung bereitet. Man erhält 105 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-340.
Dieses Produkt hat die Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sind im wesentlichen
mit denjenigen des Beispiels 19 identisch.
Die carcinostatische Substanz TF-240 des Beispiels 7(3) wird gemäß Beispiel 19 behandelt, wobei jedoch nach der
Enzymbehandlung beim Sammeln des Niederschlags aus dem
wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 eine 6O?6ige wäßrige
Äthanollösung anstelle der 80%igen wäßrigen Äthanollösung bildet. Man erhält 101 rag der gefriergetrockneten, carcinostatischen
Substanz TF-340. Die erhaltene, carcinostatische Substanz TF-340 hat die Eigenschaften der Tabelle
2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 19 identisch.
Die carcinostatische Substanz TF-240 des Beispiels 7(3) wird der Enzymbehandlung des Beispiels 19 unterzogen,
worauf man anstelle der Abtrennung des Niederschlags vom wasserlöslichen Anteil mit pH 2,0 den Niederschlag durch
Zusatz von 40&Lger Trichloressigsäurelösung bis zu einer
Trichloressigsäure-Konzentration von 1096 abtrennt und den
gebildeten, wasserlöslichen Anteil in eine 80%ige wäßrige Äthanollösung umwandelt, worauf sich die Behandlungsstufen des Beispiels 19 anschließen. Man erhält 99 mg
der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-340.
Diese hat die Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 19 identisch.
In 10 ml Wasser werden 0,82 g der carcinostatischen Substanz
TF-250 des Beispiels 7(4) suspendiert und eine 1N
wäßrige Natriumhydroxidlösung "wird unter Rühren zur Einstellxing
des pH auf 7,8 zugesetzt. Nach dem Erwärmen auf 37°C gibt man 8 mg Pronase E und mehrere Tropfen Toluol
in dieser Reihenfolge zur Suspension. Die erhaltene Mischung wird sodann unter Schütteln der Enzymbehandlung,
und zwar bei pH 7,8 bis 8,0 bei 37 bis 400C während 24 h.
-ÄS-
Die behandelte Mischung wird zur Abtrennung des Niederschlags von der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert
(4000U/min; 10 min). Der Niederschlag wird mit 3 ml Wasser
vom pH 8,0 versetzt und die erhaltene Suspension wird zur Abtrennung des Niederschlags von der Waschflüssigkeit
zentrifugiert (4000 U/min; 10 min). Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende Flüssigkeit
werden vereinigt und zur Einstellung des pH auf 2,0 mit 1N Salzsäure versetzt, worauf sich ein Niederschlag bildet.
Die erhaltene Aufschlämmung wird 12 h bei 50C stehengelassen
und zentrifugiert (1 χ 10 U/min; 10 min), um den Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen.
Zu dem Niederschlag gibt man 5 ml Wasser vom pH 2,0 und
zentrifugiert die erhaltene Suspension (1 χ 10 U/min;
10 min), um den Niederschlag von der Waschflüssigkeit zu trennen. Die Waschflüssigkeit und die vorerwähnte, überstehende
Flüssigkeit werden vereinigt und zu dieser Lösung gibt man Äthanol zur Bildung einer 80J&Lgen wäßrigen Äthanollösung.
Diese wird 2 h unter Eiskühlung gerührt und sodann 10 min mit 1 χ 10 U/min zur Abtrennung des Niederschlags
von der überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert. Der Niederschlag wird mit 5 ml einer 80%igen wäßrigen
Äthanollösung und 5 ml Äthanol in dieser Reihenfolge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält
430 mg der carcinostatischen Substanz TF-350-Fraktion.
In 5 ml Wasser werden 300 mg des Pulvers aufgelöst. Zu der
erhaltenen Lösung gibt man 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung, um den pH auf 7,0 einzustellen. Die Lösung wird
auf eine Säule gegossen, welche mit 45 ml AmberIite IRA-400
gepackt ist. Dieses wurde zuvor mit TN wäßrigen Natriumhydroxidlösung
auf den QH-Typ eingestellt. Sodann gibt man 200 ml Wasser durch die Säule. Alle Eluate werden
nun vereinigt und der pH wird durch Zusatz von IN Salzsäure auf 7,0 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird unter
vermindertem Druck eingeengt und über Millipore-Filter
mit einem Porendurchmesser von 0,3/um filtriert und sodann gefriergetrocknet. Man erhält 260 mg der gefriergetrockneten,
carcinostatischen Substanz TF-350. Diese hat die Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum
sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
sind in den Fig. 29, 30 bzw. 31 dargestellt.
Gemäß Beispiel 24 werden 0,85 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 9 der Enzymbehandlung unter
Verwendung von 8 mg Pronase E unterworfen. Man erhält 265 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz
TF-350 mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.
Gemäß Beispiel 24 werden 0,80 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 10 der Enzymbehandlung unter
Verwendung von 8 mg Pronase E unterzogen. Man erhält 253 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-350. Diese hat die Eigenschaften der Tabelle 2.
Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.
Gemäß Beispiel 24 werden 0,85 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 7(4) behandelt, mit der
Ausnahme, daß (a) die Enzymbehandlung unter Verwendung von 8 mg Trypsin (Difco) anstelle von Pronase E durchge-
führt wird und (b) nach der Enzymbehandlung bei der Gewinnung des Niederschlags von dem wasserlöslichen Anteil
vom pH 2,0 eine 6O?6ige wäßrige Äthanollösung anstelle
der 8O?6igen wäßrigen Äthanollösung bereitet wird. Man erhält
247 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-350. Die erhaltene, carcinostatische Substanz
TF-350 hat die in Tabelle 2 aufgeführten Eigenschaften. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.
0,85 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels 7(4) werden gemäß Beispiel 24 behandelt, mit der Ausnahme,
daß nach der Enzyrabehandlung bei der Gewinnung des Niederschlags
aus dem wasserlöslichen Anteil mit pH 2,0 eine 60%ige wäßrige Äthanollösung anstelle der 80?&Lgen wäßrigen
Äthanollösung hergestellt wird. Man erhält 242 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-350
mit den Eigenschaften der Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm
sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.
0,8 g der carcinostatischen Substanz TF-250 des Beispiels
7(4) werden der Enzymbehandlung gemäß Beispiel unterzogen, worauf man bei der Abtrennung des Niederschlags
von dem wasserlöslichen Anteil vom pH 2,0 diese Abtrennung derart vornimmt, daß man eine 40&Lge Trichloressigsäure
bis zu einer Trichloressigsäure-Konzentration von 10% zusetzt und aus dem dabei erhaltenen, wasserlöslichen
Anteil eine 8O$6ige wäßrige Äthanollösung bereitet
und nachfolgend die Behandlungsstufen des Beispiels 24 durchführt. Man erhält 238 mg der gefriergetrockneten,
carcinostatischen Substanz TF-350 mit den Eigenschaften gemäß Tabelle 2. Das IR- und das UV-Absorptionsspektrum
sowie das Hochleistungs-Flüssigchromatogramm sind im wesentlichen mit denjenigen des Beispiels 24 identisch.
Präparat 1
Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird mit 3 bis 4 mg der carcinostatischen Substanz TF-210 (Pulver)
versetzt, wobei eine Lösung mit einem pH von 7»O bis 7,5
gebildet wird. Der wasserlösliche Anteil der erhaltenen Lösung wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet.
Das erhaltene Produkt wird vor Gebrauch in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5!&Lgen
Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder
dergl. aufgelöst und die dabei erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.
Präparat 2
Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird zu 2 bis 3 mg der carcinostatischen Substanz TF-220 (Pulver)
unter Bildung einer Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 gegeben. Der wasserlösliche Anteil der erhaltenen Lösung wird in
eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Vor Gebrauch wird das Pulver mit einer sterilisierten, physiologischen
Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst und
die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit verwendet .
Präparat g
Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird zu 1 mg der carcinostatischen Substanz TF-23O (Pulver) unter
Bildung einer Lösung mit einem pH von 7,0 bis 7,5 gegeben. Diese Lösung wird in eine Ampulle gegeben und ge-
"-■69 -
friergetrocknet. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer
sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder
dergl. aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit
verwendet.
Präparat 4
Eine verdünnte, wäßrige Watriumhydroxidlösung wird mit
1 mg der carcinostatischen Substanz TF-240 (Pulver) unter
Bildung einer Lösung mit einem pH von 7,0 bis 7,5 versetzt. Die Lösung wird in eine Ampulle gegeben und gefriergttrocknet.
Vor Gebrauch wird dieses Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer
0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. gelöst. Die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit verwendet.
0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. gelöst. Die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit verwendet.
Präparat 5
Eine verdünnte, wäßrige Natriumhydroxidlösung wird mit 1 mg der carcinostatischen Substanz TF-25O (Pulver)unter
Bildung einer Lösung mit einem pH von 7,0 bis 7,5 versetzt.
Die Lösung wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer
sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer O,59^igen
Lidocainlösung, einer 5$igen wäßrigen Glucoselösung oder
dergl. aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird als Injektionsflüssigkeit
verwendet.
Präparat 6
Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt
der carcinostatischen Substanz TF-31O-1 wird in eine
Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz
TF-310 erhält, und zwar als 0,5 mg Einheit oder
1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer
0,5%igen Lidocainlösung, einer 5#igen wäßrigen Glucoselösung
oder dergl. aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird
für Injektionszwecke verwendet.
Präparat 7
Eine wäßrige Lösung von pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-31O-2 wird in eine Ampulle
gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz
TF-31O, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten,
physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen .wäßrigen Glucoselösung
oder dergl. aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.
Präparat 8
Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-320 wird in eine Ampulle
gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz
TF-320, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten,
physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl.
aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke
verwendet.
Präparat 9
Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-330 wird in eine Ampulle
gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein ge-
friergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz
TF-33Ö, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten,
physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 5^igen wäßrigen Glucoselösung oder
dergl. aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke
verwendet.
Präparat 10
Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt
der carcinostatischen Substanz TF-340 wird in eine Ampulle
gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz
TF-34-0, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit.
Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisier ten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocain
lösung, einer 5!&Lgen wäßrigen Glucoselösung oder dergl.
aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.
Präparat 11
Eine wäßrige Lösung vom pH 7»0 bis 7,5 mit einem Gehalt
der carcinostatischen Substanz TF-350 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet. Man erhält ein gefriergetrocknetes
Präparat der carcinostatischen Substanz TF-350, und zwar als 0,5 mg Einheit oder 1 mg Einheit.
Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocain
lösung, einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgenommen. Die erhaltene Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.
Claims (56)
- Patentansprüche
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den TF-2 erzeugenden Bakterienstamm der Gattung Fusobacterium kultiviert, ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zur erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit gibt und die careinostatische Substanz TF-2 aus dem gebildeten Niederschlag isoliert.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen TF-2 erzeugenden Bakterienstamm der Gattung Fusobacterium kultiviert, ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zur erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit gibt und den gebildeten Niederschlag abtrennt und in Abhängigkeit vom pH fraktioniert und die verschiedenen, carcinostatischen Substanzen abtrennt.
- 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, den gebildeten Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert und eine bei pH 3,5 bis 4,5 in.Wasser" unlösliche Fraktion abtrennt.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren, bei dem der Niederschlag in Abhängigkeit vom pH-Wert fraktioniert wird, derart durchführt, daß man Wasser zum Niederschlag gibt, den pH-Wert auf 3,5 bis 4,5 einstellt und den gebildeten, wasserunlöslichen Anteil isoliert.
- 6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, den gebildeten Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert und eine bei pH 5,5 bis 6,5 in Wasser unlösliche Fraktion isoliert.
- 7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, den gebildeten Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert und eine bei pH 5»5 bis 6,5 in Wasser lösliche, jedoch bei pH 3,5 bis 4,5 in Wasser unlösliche Fraktion isoliert.
- 8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, den gebildeten Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert und eine bei pH 3,5 bis 4,5 in Wasser lösliche, jedoch bei pH 1,5 bis 2,5 in Wasser unlösliche Fraktion isoliert.
- 9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, den gebildeten Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert und eine bei pH 1,5 bis 2,5 in Wasser lösliche Fraktion isoliert.
- 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Deproteinisierungsbehandlung durchführt mit der Fraktion mit carcinostatischer Aktivität, welche aus der Kulturmasse oder überstehenden Flüssigkeit gewonnen wurde, die durch Kultivierung einer die carcinostatische Substanz TF-2 erzeugenden Bakterienart der Gattung Fusobacterium gewonnen wurde.-J. ■
- 11. Verfahren nach Anspruch 2 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, die durch Kultivierung eines TF-2 erzeugenden Bakterienstamms der Gattung Fusobacterium erhalten wurde, worauf man den gebildeten Niederschlag oder eine darauf gewonnene Fraktion mit carcinostatischer Aktivität einer Deproteinisierungsbehandlung unterzieht.
- 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Deproteinisierungsbehandlung als Enzymbehandlung mit einem proteoIytischen Enzym durchführt.
- 13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit gibt, welche erhalten wird bei Kultivierung des TF-2 erzeugenden Bakterienstamms der Gattung Fusobacterium, worauf man die erhaltene Fraktion mit carcinostatischer Aktivität, welche vom gebildeten Niederschlag gewonnen wurde, einer Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym unterwirft.
- 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man einen TF-2 erzeugenden Bakterienstamm der Gattung Fusobacterium kultiviert, das hydrophile, organische Lösungsmittel der gebildeten, überstehenden Flüssigkeit zusetzt, den gebildeten Niederschlag in Abhängigkeit vom pH fraktioniert, eine Fraktion mit carcinostatischer Aktivität einer Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym unterwirft und nachfolgend die Fraktion der carcinostatischen Substanz isoliert.
- 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fraktion mit carcinostatischer Aktivität, welche der Enzymbehandlung mit dem proteolytischen Enzymzu unterwerfen ist, eine Fraktion verwendet, welche in Wasser bei pH 3,5 bis 4,5 unlöslich ist.
- 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit careinostatischer Aktivität, welche erhalten wurde durch Zusatz des hydrophilen, organischen Lösungsmittels zur überstehenden Flüssigkeit und nachfolgende Fraktionierung des gebildeten Niederschlags in Abhängigkeit vom pH, ein wasserunlöslicher Anteil ist, welcher erhalten wurde durch Zusatz von Wasser zum Niederschlag und nachfolgende Einstellung des pH-Werts auf 3,5 bis 4,5.
- 17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit carcinostatischer Aktivität, welche der Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym zu unterwerfen ist, eine in Wasser bei 5,5 bis 6,5 unlösliche Fraktion ist.
- 18. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit careinostatischer Aktivität, welche der Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym zu unterwerfen ist, eine in Wasser bei pH 5,5 bis 6,5 löslich, jedoch in Wasser bei pH 3,5 bis 4,5 unlösliche Fraktion ist,
- 19. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit carcinostatischer Aktivität, welche der Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym zu unterwerfen ist, eine in Wasser bei pH 3,5 bis 4,5 löslich, jedoch in Wasser bei pH 1,5 bis 2,5 unlösliche Fraktion ist.
- 20. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktion mit carcinostatischer Aktivität,:?-■■welche der Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym zu unterwerfen ist, eine in Wasser bei pH 1,5 bis 2,5 lösliche Fraktion ist.
- 21. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß das proteolytische Enzym Pronase oder Trypsin ist»
- 22. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung der Fraktionen der carcinostatischen Substanz nach der Enzymbehandlung nach mindestens einem der folgenden Verfahren durchführt: Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH, gesonderte Ausfällung aus einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel, Ultrafiltrationsverfahren, Fraktionieren mit einem Ionenaustauscher, und daß man sodann die Fraktionen der carcinostatischen Substanz isoliert.
- 23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Gewinnung der Fraktionen der carcinostatischen Substanz nach der Enzymbehandlung durchführt durch Fraktionierung des wasserlöslichen Anteils nach der Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym, Einstellung des pH-Werts des wasserlöslichen Anteils auf 2,5 oder weniger, Zusatz des hydrophilen, organischen Lösungsmittels zum wasserlöslichen Anteil, Behandlung des gebildeten Niederschlags mit einem Ionenaustauscher und Abtrennung der nichtadsorbierten Fraktion.
- 24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abtrennung der Fraktionen der carcinostatischen Substanz nach der Enzymbehandlung derart durchführt, daß man den in Wasser löslichen Anteil nach der Enzymbehandlung in Abhängigkeit vom pH fraktioniert, den pH auf 2,5 oder weniger einstellt, ein hydrophiles,organisches Lösungsmittel zu einer effektiven Menge des so erhaltenen, wasserlöslichen Anteils gibt, den gebildeten Niederschlag mit einem Ionenaustauscher behandelt und sodann die nichtadsorbierte Fraktion einer Ultrafiltration unterwirft.
- 25. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man das hydrophile, organische Lösungsmittel zur überstehenden Flüssigkeit einer auf pH 1,5 bis 2,5 eingestellten Kultur gibt.
- 26. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile, organische Lösungsmittel, welches der überstehenden Flüssigkeit der Kultur zugesetzt wird, ein Alkohol ist.
- 27. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile, organische Lösungsmittel, welches der überstehenden Flüssigkeit der Kultur zugesetzt wird, zu einer Konzentration des Lösungsmittels in der gebildeten Lösung von 30 bis 80 Vol-% führt.
- 28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium für die Kultivierung des Bakterienstamms Stickstoffquellen, Kohlenstoff quellen, Vitaminquellen, Reduktionsmittel und anorganische Salze sowie gegebenenfalls Agar enthält.
- 29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium für die Kultivierung des Bakterienstamms Trypticasepepton, Hlrn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Gluocse, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält oder die obigen acht Komponenten und Agar oder die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteose-pepton und L-Cystin oder die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar.
- 30. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei 30 bis 420C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium mit einem pH von 6,0 bis 8,5 durchführt.
- 31. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung bei 32 bis 37°C während 1 bis 4 Tagen in einem Kulturmedium mit einem pH von 6,5 bis 7,5 durchführt.
- 32. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31» dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterienstamm der Gattung Fusobacterium einen Bakterienstamm der Species Fusobacterium nucleatum verwendet.
- 33. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 420C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, welches Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält,oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar ent hält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kultur brühe entnimmt, den pH derselben auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß die Konzentration desselben in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-?6 beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zumNiederschlag gibt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 3,5 bis 4,5 einstellt und den gebildeten Niederschlag abtrennt und, falls erforderlich, nochmals in Abhängigkeit vom pH fraktioniert, wobei man eine carcinostatische Substanz erhält.
- 34. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 420C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, welches Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin oder Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH derselben auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß die Konzentration desselben in der gebildeten Lösiing 50 bis 70 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zum Niederschlag gibt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 5»5 bis 6,5 einstellt und den gebildeten Niederschlag abtrennt und, falls erforderlich, nochmals in Abhängigkeit vom pH fraktioniert, wobei man eine carcinostatische Substanz erhält.
- 35. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 420C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, welches Trypticasepepton, Hirn-Ilerz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat. - se -S-enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, welches die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH derselben auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß die Konzentration desselben in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vo1-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zum Niederschlag gibt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 5,5 bis 6,5 einstellt, die überstehende Flüssigkeit sammelt, den pH der überstehenden Flüssigkeit auf 3,5 bis 4,5 einstellt, den gebildeten Niederschlag abtrennt und, falls erforderlich, nochmals in Abhängigkeit vom pH fraktioniert, wobei man eine carcinostatische Substanz erhält.
- 36. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42°C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystein und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH derselben auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß die Konzentration desselben in der gebildeten Lösung 50S205074bis 70 Vol-?6 beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, V/asser zum Niederschlag gibt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 3,5 bis 4,5 einstellt, die überstehende Flüssigkeit entnimmt, deren pH auf 1,5 bis 2,5 einstellt, den gebildeten Niederschlag abtrennt und, falls erforderlich, nochmals in Abhängigkeit vom pH fraktionier ti wobei man eine carcinostatische Substanz erhält.
- 37. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42°C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfat und Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH derselben auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß die Konzentration desselben in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, V/asser zu dem Niederschlag gibt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 1,5 bis 2,5 einstellt, die überstehende Flüssigkeit entnimmt, einen Alkohol zu der überstehenden Flüssigkeit zusetzt, so daß seine Konzentration in der gebildeten Lösung 20 bis 80 Vol-% beträgt, und den gebildeten Niederschlag abtrennt, wobei die carcinostatische Substanz erhalten wird.
- 38. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Be-■■--82 -dingungen bei 30 bis 420C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticaeepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH der überstehenden Flüssigkeit auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß seine Konzentration in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zu dem Präzipitat zusetzt, den pH des Gemisches auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 3,5 bis 4,5 einstellt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, falls erforderlich, nochmals in Abhängigkeit vom pH fraktioniert, Wasser zu dem erhaltenen Niederschlag zusetzt, den pH auf 7 bis 8 einstellt, danach Pronase oder Trypsin zugibt, das Gemisch 1 bis 72 Stunden bei 30 bis 400C einer Enzymbehandlung unterwirft, den pH der behandelten Mischung auf 2,5 oder weniger einstellt, die erhaltene, überstehende Flüssigkeit abtrennt, einen Alkohol zu der überstehenden Flüssigkeit zusetzt, so daß die Alkoholkonzentration in der kombinierten Lösung 30 bis 80 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag gewinnt oder, falls erforderlich, das obige Präziptat mit einem starken Anionenaustauscherharz behandelt, die nichtadsorbierte Fraktion einer Ultrafiltration unterwirft, diese Ultrafiltration erforderlichenfalls wiederholt, das Produkt über ein Millipore-Filter filtriert und gefriertrocknet, wobei man die carcinostatische Substanz erhält.
- 39. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 420C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, La c to ce, Na briumsul.Cit und Tliioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium,das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, den pH der überstehenden Flüssigkeit auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß seine Konzentration in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zu diesem Niederschlag zusetzt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 5,5 bis 6,5 einstellt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, erforderlichenfalls diese Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH wiederholt, Wasser zu dem erhaltenen Niederschlag zugibt, den pH auf 7 bis 8 einstellt, Pronase oder Trypsin zusetzt, die Mischung einer Enzymbehandlung bei 30 bis 400C während 1 bis 72 Stunden unterwirft, den pH der behandelten Mischung auf 2,5 oder weniger einstellt, die erhaltene, überstehende Flüssigkeit abtrennt, einen Alkohol zu dieser überstehenden Flüssigkeit zusetzt, so daß die Alkoholkonzentration in der kombinierten Lösung 30 bis 80 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt oder, falls erforderlich den vorerwähnten Niederschlag mit einem starken Anionenaustauscherharz behandelt, seine nichtadsorbierte Fraktion der Ultrafiltration unterzieht, wobei diese Ultrafiltration erforderlichenfalls wiederholt werden kann, dann über ein Millipore--/Sk -Filter filtriert und gefriertrocknet, wobei man die carcinostatische Substanz erhält.
- 40. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42°C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticasepepton, Hirn-Herzinfusion (oder Herzinfusion) , Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entimmt, den pH der überstehenden Flüssigkeit auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß seine Konzentration in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-96 beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zu diesem Niederschlag zusetzt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 5,5 bis 6,5 einstellt, die überstehende Flüssigkeit abtrennt, deren pH auf 3,5 bis 4,5 einstellt, das gebildete Präzipitat abtrennt, diese Fraktionierung erforderlichenfalls in Abhängigkeit vom pH wiederholt, Wasser zu dem erhaltenen Niederschlag zugibt, den pH auf 7 bis 8 einstellt, Pronase oder Trypsin zusetzt, das Gemisch einer Enzymbehandlung während 1 bis 72 Stunden bei 30 bis 40°C unterzieht, die behandelte Mischung auf einen pH von 2,5 oder weniger einstellt, die erhaltene, überstehende Flüssigkeit abtrennt, einen Alkohol zu der überstehenden Flüssigkeit zusetzt, so daß die Alkoholkonzentration in der kombinierten Lösung 30 bis 80 Vol-?6 beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt oder, falls erforderlich, den obigen Niederschlag mit einem starkenAnionenaustauscherharz behandelt, seine nichtadsorbierte Fraktion der Ultrafiltration unterwirft, wobei diese Ultrafiltration erforderlichenfalls wiederholt werden kann, das Produkt über Millipore-Filter filtriert und gefriertrocknet, wobei man die carcinostatische Substanz erhält.
- 41. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 420C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticasepepton, Hirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit und Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der Kulturbrühe entnimmt, deren pH auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß seine Konzentration in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-?6 beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zu diesem Niederschlag zusetzt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 3»5 bis 4,5 einstellt, die überstehende Flüssigkeit gewinnt, deren pH auf 1,5 bis 2,5 einstellt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, diese Fraktionierung erforderlichenfalls in Abhängigkeit vom pH wiederholt, Wasser zu dem erhaltenen Niederschlag zusetzt, den pH auf 7 bis 8 einstellt, dann Pronase oder Trypsin zugibt, die Mischung einer Enzymbehandlung bei 30 bis 400C während 1 bis 72 Stunden unterwirft, den pH der behandelten Mischung auf 2,5 oder weniger einstellt, die erhaltene, überstehende Flüssigkeit abtrennt, einen Alkohol zu der überstehenden Flüssigkeit zugibt, so daß die- ββ -Alkoholkonzentration in der kombinierten Lösung 30 bis 80 VoI-^ beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt oder erforderlichenfalls den vorerwähnten Niederschlag mit einem starken Anionenaustauscherharz behandelt, seine nichtadsorbierte Fraktion der Ultrafiltration unterwirft, wobei diese Ultrafiltration erforderlichenfalls wiederholt werden kann, denn durch Millipore-Filter filtriert und das Produkt gefriertrocknet, wobei man eine carcinostatische Substanz erhält.
- 42. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man Fusobacterium nucleatum unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 42°C während 1 bis 5 Tagen in einem Kulturmedium kultiviert, das Trypticase, Ilirn-Herz-Infusion (oder Herzinfusion), Hefeextrakt, Natriumchlorid, Glucose, Lactose, Natriumsulfit oder Thioglykolat enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten und Agar enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton und L-Cystin enthält, oder in einem Kulturmedium, das die obigen acht Komponenten, Phytonpepton, Proteosepepton, L-Cystin und Agar enthält, worauf man die überstehende Flüssigkeit der"Kulturbrühe entnimmt, den pH der überstehenden Flüssigkeit auf 1,5 bis 2,5 einstellt, einen Alkohol zusetzt, so daß seine Konzentration in der gebildeten Lösung 50 bis 70 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, Wasser zu diesem Niederschlag zugibt, den pH der Mischung auf 7,5 bis 8,0 einstellt, danach den pH auf 1,5 bis 2,5 einstellt, die überstehende Flüssigkeit entnimmt, einen Alkohol zu dieser überstehenden Flüssigkeit zusetzt, so daß die Alkoholkonzentration in der gebildeten Lösung 20 bis 80 VoI-^ beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt, erforderlichenfalls diese Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH wiederholt, Wasser zu dem erhaltenen Niederschlag zugibt, den pH auf 7 biseinstellt, Pronase oder Trypsin zufügt, die Mischung bei 30 bis 400C während 1 bis 72 Stunden einer Enzymbehandlung unterwirft, den pH der behandelten Mischung auf 2,5 oder weniger einstellt, die erhaltene, überstehende Flüssigkeit abtrennt, einen Alkohol zu der überstehenden Flüssigkeit zusetzt, so daß die Alkoholkonzentration in der kombinierten Lösung 30 bis 80 Vol-% beträgt, den gebildeten Niederschlag abtrennt oder erforderlichenfalls den vorerwähnten Niederschlag mit einem starken Anionenaustauscherharz behandelt, seine nichtadsorbierte Fraktion einer Ultrafiltration unterzieht, wobei diese Ultrafiltration erforderlichenfalls wiederholt werden kann, und das Produkt über Millipore-Filter filtriert und gefriertrocknet, wobei man die carcinostatische Substanz erhält.
- 43.) Carcinostatische Substanz TF-210 mit den folgenden Eigenschaften oder Salze derselben:(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich's solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;(c) es ist unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;(d) es hat keinen deutlichen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 16O bis 2350C;(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 und 1120-1020 cm"1;(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7,0 zeigt eine starke Absorption bei der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 248 bis 265 nm;- -65 ■-(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin-Reaktion;(h) Elementaranalyse:C 40-43% II 5-T/o N 9-10%;(i) der Saccharidgehalt der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode, beträgt etwa 5 bis 25 Gew.%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin-Methode, beträgt etwa 20 bis 50 Gew.%, ausgedrückt als Rinderserumalbumin.
- 44. Careinostatische Substanz TF-220 mit den folgenden Eigenschaften oder Salze derselben:(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich's solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;(c) es ist unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;(d) es hat keinen deutlichen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 160 bis 2400C;(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1630-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 und 1120-1020 cm""1;(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7,0 zeigt eine starke Absorption bei der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 248 bis 266 nm;(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin-Reaktion;(h) Elementaranalyse: C 40-42% H 5-7% N 7-9%;(i) der Saccharidgehalt der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode, beträgt etwa 5 bis 20 Gew.%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin-Methode, beträgt etwa 10 Gew.% oder weniger, ausgedrückt als Rinderserumalbumin.
- 45. Carcinostatische Substanz TF-230 mit den folgenden Eigenschaften oder Salze derselben:(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich's solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;(c) es ist unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;(d) es hat keinen deutlichen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 185 bis 225°C;(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1440, 1380, 1240-1220 und 1120-1020 cm"1;(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7,0 zeigt eine starke Absorption bei der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 249 bis 264 nm;(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin-Reaktion;(h) Elementaranalyse:C 42-45% H 5-7% N 10-11%;3205Q74- 90—(i) der Saccharidgehalt der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode, beträgt etwa 5 bis 25 Gew.^, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin-Methode, beträgt etwa 30 bis 60 Gew.%, ausgedrückt als Rinderserumalbumin.
- 46. Carcinostatische Substanz TF-240 mit den folgenden Eigenschaften oder Salze derselben:(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich's solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;(c) es ist unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;(d) es hat keinen deutlichen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 200 bis 2150C;(e) das Infrarot-AbsOrptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1520, 1410-1360, 1280-1210, 1060, 96O und 820 cm"1;(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung der wasserlöslichen Fraktion bei pH 7,0 zeigt eine starke Absorption bei der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 250 bis 265 nm;(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin-Reaktion;(h) Elementaranalyse:C3r)-3B% H 4-5% N 12-1490;(i) der Saccharidgehalt, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode, beträgt etwa 15 bis 35 Gew.%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt~ 20-nach der Lowry-Folin-Methode, beträgt etwa 20 bis 30 Gew.%, ausgedrückt als Rinderserumalbumin.
- 47. Carcinostatische Substanz TF-250 mit den folgenden Eigenschaften oder Salze derselben:(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich's solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;(c) es ist löslich in Wasser, aber unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;(d) es zeigt keinen deutlichen Schmelzpunkt und zersetzt sich bei 165 bis 2100C;(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3600-3200, 2950-2920, 1680-1620, 1550-1510, 1410-1380, 1240-1210, 1150-1120, 1080-1020, 980 und810 cm""1;(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung mit pH 7,0 zeigt eine starke Absorption bei der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 248 bis 269 nm;(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin-Reaktion;(h) Elementaranalyse: C 3O-33?£ Η 3-59ί Ν 3-5%;(i) der Saccharidgehalt, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode, beträgt etwa 60 bis 80 Gew.?£, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin -Methode, beträgt etwa 5 bis 20 Gew.%, ausgedrückt als Rinderserumalbumin.- 2Λ-
- 48. Carcinostatische Substanz TF-3OO (TF-310, TF-320 und TF-330) mit den folgenden Eigenschaften oder Salze derselben:(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor, Ehrlich's solidem Tumor, Sarcoma 180 und B-16 Melanom bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;(c) es ist löslich in Wasser, aber unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthyläther;(d) es hat keinen deutlichen Schmelzpunkt und beginnt sich bei etwa 1800C und stark bei nicht unterhalb 195°C zu zersetzen;(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3500-330, 2920, 2850, 1660-1620, 1580-1540, 1460-1400, 1380-1360, 1120, 1080-1020, 970 und 820 bis 800 cm""1;(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung mit pH 7,0 zeigt eine starke Absorption bei der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 246 bis 280 nm;(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol-Schwefelsäure-Reaktion , die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin-Reaktion; negativ ist jedoch die Ninhydrin-Reaktion;(h) Elementaranalyse: C 38-47^ H 5-7#. N 1-4%;(i) der Saccharidgehalt, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode, beträgt etwa 16 bis 60 Gew.?£, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin-Methode, beträgt etwa 10 Gew.?o oder weniger, ausgedrückt als Rinderserumalbumin.
- 49. Carcinostatische Substanz TF-300 (TF-31O, TF-32O, TF-330) oder Salze derselben nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß der Saccharidgehalt, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode, etwa 16 bis 30 Gew.%, ausgedrückt als Glucose, beträgt.
- 50. Carcinostatische Substanz TF-3OO (TF-31O, TF-32O, TF-330) oder Salze derselben nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß der Saccharidgehalt, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode, etwa 20 bis 60 Gew.%, ausgedrückt als Glucose, beträgt.
- 51. Carcinostatische Substanz TF-340 mit den folgenden Eigenschaften oder Salze derselben:(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung; |(c) es ist löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthylather;(d) es zeigt keinen klaren Schmelzpunkt,beginnt sich bei etwa 14O0C zu zersetzen und zersetzt sich stark bei 20O0C oder darüber;(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3500-3300, 2920, 2850, 1660-1640, 1480-1520, 1460-1440, 1410-1340, 1250-1220, 1120-1030, 970 und835 cm"1;(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung vom pH 7,0 zeigt eine starke Absorption au der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 250 bis 265 nm;(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, diePhenol-Schwefelsäure-Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin-Reaktion; die Ninhydrin-Reaktion ist jedoch negativ;(h) Elementaranalyse: C 32-34% H 4-6% N 3-5%;(i) der Saccharidgehalt, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode, beträgt etwa 20 bis 50 Gew.%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin-Methode, beträgt etwa 10 Gew.% oder weniger, ausgedrückt als Rinderserumalbumin..
- 52. Careinostatische Substanz TF-350 mit den folgenden Eigenschaften oder Salze derselben:(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;(b) es verhindert die Proliferation von Ehrlich Ascites-Tumor bei Mäusen und hat eine immunostimulierende Wirkung;(c) es ist löslich in Wasser, Jedoch unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Äthylacetat und Diäthylather;(d) es hat keinen deutlichen Schmelzpunkt und betinnt sich bei etwa 1100C zu zersetzen und zersetzt sich stark bei 1800C und darüber;(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten mit der KBr-Tablettenmethode, hat Absorptionsbanden in der Nähe von 3500-3300, 2920-2900, 1660-1630, 1580-1520, 1460-1340, 1140-1100, 1080-1020,, 970 und 820-800 cm"1;(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung vom pH 7,0 zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und einen Absorptionspeak in der Nähe von 245 bis 264 nm;(g) positiv ist die Molisch-Reaktion, die Phenol-Schwefelsäure -Reaktion, die Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, die Indol-Salzsäure-Reaktion und die Lowry-Folin-Reaktion; negativ ist jedoch die Ninhydrin-Reaktion;- 99 -(h) Elementaranalyse: C 34-37% H 5-6% N 1-2%;(i) der Saccharidgehalt, bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode, beträgt etwa 80 bis 95 Gew.%, ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Folin-Methode, beträgt etwa 10 Gew.% oder weniger, ausgedrückt als Rinderserumalbumin.
- 53. Carcinostatisches Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer carcinostatischen Substanz TF-2 [TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-300 (TF-310, TF-320 oder TF-330), TF-340 oder TF-350] oder eines Salzes derselben nach einem der vorhergehenden Ansprüche 43 bis 5?
- 54. Carcinostatisches Mittel nach Anspruch 53, gekennzeichnet durch einen Gehalt der carcinostatischen Substanz TF-300 (TF-310, TF-320 oder TF-330) oder eines Salzes derselben.
- 55. Verfahren zur Behandlung von Krebserkrankungen bei Säugetieren einschließlich Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine effektive Menge einer carcinostatischen Substanz TF-2 [TF-210, TF-220, TF-230, TF-240, TF-250, TF-300 (TF-310, TF-320 oder TF-330), TF-340 oder TF-350] oder eines Salzes derselben nach einem der Ansprüche 43 bis 52 verabreicht.
- 56. Verfahren zur Behandlung von Krebserkrankungen bei Säugetieren und Menschen nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, daß man eine effektive Menge der carcinostatischen Substanz TF-300 oder eines Salzes derselben vor?) br eicht.
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