DE1795154C3 - Verfahren zur Herstellung eines neuen, Tuberactin genannten antibiotischen Wirkstoffes - Google Patents

Description

1. Die Kulturmerkmale sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengestellt:
Tabelle Ί

Medium

Czapek-Dox. Agar

Die Erfindung betrifft ejn Verfahren zur Herstellung eines neuen, gegen Tuberkelbazillen wirksamen Antibiotikums, das als Tuberactin bezeichnet wird.

Es sind eine große Anzahl Antibiotika bekannt, die aus Bodenmikroorganismen, speziell der Gattung Streptomyces, gewonnen werden. Einige dieser Anti- 35 biotika werden klinisch als Antituberkulosemittel eingesetzt, beispielsweise Streptomycin, Kanamycin. Cycloserin, und Viomycin. Es hat sich jedoch gezeigt, daß inzwischen häufig Stämme von Tuberkelbazillen auftreten, die gegen diese Antituberkulosemittel wider- 40 ^_süaragi_n Glukose standsfähig sind. Dadurch sind ernste Schwierigkeiten in der Therapie der Tuberkulose aufgetreten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, mit dem ein neues gegen Tuberkelbazillen wirksames Antibiotikum gewonnen wer- 45 den kann. Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung eines Tuberactin genannten, gegen Tuberkelbazillen wirksamen antibiotischen Wirkstoffes, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus mit 50 der Hinterlegungsnummer NRRL 3482 in einem assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und aus dem Kulturmedium den Wirkstoff Tuberactin als im wesentlichen kristallines Produkt mit einer Basizität von pKa, = 7,2 und pKa₂ = 10,3 isoliert, das als Hydrochlorid die Summenforme! C₁₆H₃₁N₉O₉ -2 HCl, einen Schmelzpunkt von 244 bis 264° C (unter Zersetzung), eine optische Drehung Bouillon Agar von [a]S⁵ = -31,5° (c = 1, H₂O) und folgende UV-Absorption hat:

k_max = 268 mm EU = 330 (in H₂O)

k_max = 268,5 πΐμ, EJl = 313 (in 0,1 n-HCl)

X_max = 285,5 τημ, E|* = 206,5 (in 0,1 n-NaOH)

und falls erwünscht, die freie Base mit Säuren in die Salze überführt.

Bennetts Agar

55

60 Calciumalat Agar

65 Merkmale

G: gut
AM: gut, weiß bis perlrosa

(3ca) oder hellrosa,

rosabeige (4ec)
SM: hell weizenfarben (2ea)

oder bambusfarben

(2gc)
SP: keines

G: mäßig

AM: mäßig, weiß bis rosafarben (5ba) oder (5ca)
hellrosa, viele Tröpfchen SM: manchmal in das

Medium eindringend,
perlfarben (3ca) bis
bisquitfarben (3ec)
SP: keines
G: gut

AM: gut, weiß bis hellrosa
(4ca) bis hellrosabeige
(4ec), baumwollartig,
Tröpfchen

SM: Bambusfarben (2gc) bis allmählich dunkelnd
zu hellbraun (4ng)
SP: keines
G: wenig
AM: keines
SM: nahezu farblos bis

SP: keines
G: mäßig

AM: weiß bis bisquit (3ec)
SM: wenig Wachstum, perlfarben bis tintig (3ba)
SP: keines

Fortsetzung

Medium

Medium

Merkmale

5 Harnstoff-Glycerin

elatin Medium
ikubiertbei 24° C)

r.fflers Serum

irke Agar

Cartoffelstück

Karottenstück

G: sehr wenig

AM: keines

SM: hellbraun (4ng) oder Kakaobraun (51g) leichte Verflüssigung keines

SP:

G:
AM:
SM:

SP:

mäßig
keines

leicht weizenfarben (2ea) oder bambusfarben (2gc), opalisierend, k^ine Hämolyse keines

Hafermehl Agar

3: mäßig

AM: gut, weiß bis hellrosa (4ca) — hellrosabeige (4ec)
SM: manchmal in das

Medium eindringend, hellrosa (4ca) — hellrosabeige (4ec) SP: keines

G: maßig

AM: seitlich mit weißem Myzelium bedeckt SM: gerunzeltes Wachstum, hell weizenfarben (2ea) SP: keines

G: mäßig

AM: seitlich mit weißem Myzelium bedeckt SM: glänzend farblos, leicht

weizenfarben (2ea) SP: keines

Kartoffelzucker
Agar

Glukose Bouillon

Merkmale

G: gut

AM: weiß bis hellbeige (4ec), baumwollartig, mit vielen Tröpchen bedeckt

SM: hell weizenfarben (2ea)

bis hellbraun (41g) SP: meist fehlend oder hellglasig (l^l/₂ ec) oder ekrü (2ec)

G: gut

AM: weiß bis hellrosabeige (4ec), Wassertröpfchen SM: perlrosa (3oa oder 4ca) SP: keines

G: gut
AM: hellrosabeige (4ec),

Wassertröpfchen SM: hell amberfarben (31c)

bis zimtfarben (3Ie)

35

	G:	gut
Eier-Medium	AM:	weiß bis perlfarben
		(2ba)
	SM:	—
	SP:	keines
Milch-Medium	G:	mäßig
	AM:	mäßig, weiß bis hell-
		weizenfarben (2ea)
		oder bisquitfarben (3ec]
	SM:	an der Oberfläche
		ringbildend, keine
		Koagulation und keine
		Peptonisation
	SP-	keines
Cellulose	G	keines
Tyrosin Agar	G	: mäßig
	AM	: sehr wenig
	SM	: hell weizenfarben (2ea]
		bis zinnfarben (3Ie)
	SP	: keines

G: gut
AM: keines SM: nahezu farblose

Mycelien-Lumpen am Boden SP: keines

Diese Merkmale wurden, mit Ausnahme des Versuchs mit Gelatine-Medium, durch Züchten bei 3O⁰C während 10 Tagen beobachtet.

Die Färbungsbezeichnungen mit den in Klammern stehenden Ziffern und Buchstaben entsprechen dem »Color Harmony Manual« (Container Corp. of America, 1958), wobei zur Bestimmung von Norden unter Tageslicht beobachtet wurde.

In der Tabelle I bedeutet G Wachstum, AM Luftmycelium, SM Substratmycelium und SP lösliches Pigment.

2. Struktur der sporentragenden Hyphen

Es wurde ein gutes Luftmycelium auf vielen Arten an Medien produziert, und dabei wurden viele primäre und sekundäre Schleifen mit geraden oder gebogenen Formen beobachtet.

3. Struktur der Sporen

Bei Untersuchungen unter dem Elektromikroskop zeigten die Sporen eine glatte Oberfläche und eine langgestreckte elliptische oder zylindrische Form, 0,8 bis 1,8 μ χ 0,5 bis 0,7 μ.

4. Färbung des Myceliums

Auf vielen verschiedenen Medien zeigten die Luft-Mycelien zunächst eine weiße Farbe, die sich allmiihlieh zu rosa oder beigen Färbungen änderte. Manchmal war das Mycelium mit Wassertropfen bedeckt. Die Färbung des Substrat-Myceliums war im allgemeinen gelblich-braun oder fahlbraun.

5. Lösliches Pigment

20

Es wurde in den untersuchten Medien keine Bildung von löslichem Pigment beobachtet, mit Ausnahme einer leicht glasigen oder bastfarbenen Färbung in Harnstoff-Glycerinmedium.

6. Physiologische Eigenschaften

a) Verflüssigung von Gelatine: Sehr schlechtes Wachstum, positive Verflüssigung,

b) Stärke-Hydrolyse: Positive Hydrolyse,

c) Nitrat-Preduktion: keine,

d) Peptonisation von Milch: kaum beobachtet,

e) Zellulose-2'ersetzung: keine,

f) Produktion von H₂S: keine,

g) Hämolyse: Negativ,

h) Melanin-Pigmentbildung: keine.

7. Als Kohlenstoffquellen konnten verwendet werden

Glukose, Sakarose, Laktose, Maltose, Stärke, Dextrin, Glyzerin, Mannose und Inositol.

8. Kolonie

Große Kolonien wiesen eine chrysanthemenartige Formgebung auf und waren mit baumwollartigen Mycelien bedeckt.

Wenn man die taxonomischen Merkmale dieses zuvor beschriebenen Streptomyces mit denjenigen von anderen bekannten Streptomyces-Arten vergleicht dann stellt man auf Grund der typischen Schleifenbildung und den Ähnlichkeiten der Kulturmerkmaie fest, daß Ähnlichkeiten bestehen mit folgenden Streptomyces-Arten: Streptomyces hachijoensis, Streptomyces mashuensis, Streptomyces albireticuli, Streptomyces griseoverticillatus und Streptomyces alboverticillatus.

Ein Vergleich zwischen den taxonomischen Eigenschaften dieses Streptomyces-Stamm B-386 und den anderen Antibiotika produzierenden Streptomyces, wie oben angegeben, ergibt daß offensichtlich folgende Unterschiede bestehen:

a) Streptomyces albiroticuli unterscheidet sich von dem Streptomyces Stamm B-386 dadurch, daß der erstere spiralförmige Sekundärschleifen, gelblich bis bräunlichweißes Luftmycelium auf GIukose-Asparagin Agar, positive Nitratreduktion und Schwefelwasserstoffbildung zeigt

b) Streptomyces mashuensis unterscheidet sich von so dem Streptomyces Stamm B-386 dadurch, daß ersterer auf Czapek Agar Medium gelblich bis gelblichgrünes Wachstum zeigt.

c) Streptomyces alboverticillatus zeigt farbloses oder weißgefärbtes Wachstum auf vielen Medium-Arten mit weißfarbenem Luftmycelium, wohingegen Streptomyces Stamm B-386 bräunliches Wachstum, mit weißlich- bis rosa- oder hellrotbraungefärbtem Luftmycelium zeigt

d) Streptomyces hachijoensis ähnelt Streptomyces Stamm B-386 hinsichtlich des rosa- bis heürfttlichbraungefärbten Wachstumsaufvielen Mediumarten, jedoch hat der erstgenannte Stamm ein weißfarbenes Luftmycelium, zeigt positive Hämalyse und dunkelfarbene Änderungen auf Blut Agar-Medium, gelb bis braunfarbenes Wachstum, rosa- bis orangefarbene lösliche Pigmentbildung und antifungale antibiotische »Trichomycin«- Produktioni wohingegen der letztgenannte Stamm kein Trichomycin produziert, e) Die folgende Tabelle zeigt die charakteristischen Unterschiede zwischen Streptomyces Stamm B-386 und Streptomyces griseoverticillatus.

	Streptomyces	Streptomyces
	Stamm B-386	griseoverticillatus
Erzeugte Antibiotika	Tuberactin	Takacidin
Harnstoff-Glycerin-	SP: keine oder	SP: hellbraun
Agar	hellglas-	oder hell
	farben oder	graubraun
	bastfarben
Milchmedium	Negative Pep	Positive Pep
	tonisation	tonisation
Organische Medien	AM: gut,	AM: nichts
(Bennets-,	baumwoll	nennens
Czapek-, Kar	artiges	wert beob
toffelzucker-,	Wachstum,	achtet
Hafermehl-, Harn-	viele Tröpf
stoff-Glycerin-	chen
Agar, usw.)

Diese beiden Stämme sind sehr stark ähnlich in bezug auf andere taxonomische Merkmale, wie physiologische Eigenschaften und morphologische Eigenschaften auf vielen Arten von Medien, und infolgedessen sind diese beiden Stämme als verschiedene Arten von Streptomyces nicht sonderlich differenziert.

In Japan ist dieser tuberactinproduzierende Stamm, Streptomyces B-386, der als Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus bezeichnet wurde, hinterlegt worden bei dem Fermentation Research Institut Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade & Industry, und der ständigen Kultursammlung unter der Hinterlegungs-Nr. Kohatsukenkinki No. 45 beigegeben worden. Unter der Hinterlegungs-Nr NRRL 3482 wurde dieser Stamm beim United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Nothern Utilization Research and Development Division hinterlegt. Der Mikroorganismenstamm ist von diesen Hinterlegungsstellen beziehbar.

Erfindungsgemäß wird Tuberactin durch Beimpfen eines geeigneten Nährmediums mit Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus, Züchten des Gemisches unter bei üblichen antibiotischen Herstellungsverfahren gebräuchlichen Bedingungen und Isolierung des gebildeten Antibiotikums aus dem Kulturmedium hergestellt.

Alle für die Herstellung von Tuberactin verwendeten Nährmedien sollen eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, wie beispielsweise Glukose, Saccharose, Lactose, Maltose, Stärke, Dextrin, Melasse oder Glycerin und eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, wie beispielsweise Getreideweichflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatöl, Glutin, Pepton, Fleischextrakt Hefeextrakt, Hefe, Caseinhydrolysat Ammoniumsalze oder anorganisches Nitrat enthalten. Die Medien sollen ferner Salze, wie Magnesium-, Calcium-, Kalium-, Natrium-, Zink- oder Manganphosphate, enthalten.

Man kann bei der Züchtung der Mikroorganismen für die Gewinnung von Tuberactin die Temperatur im allgemeinen in dem Temperaturbereich ändern,

io

in dem die Mikroorganismen zu wachsen vermögen, und vorzugsweise kann man das Tuberactin bei Temperaturen von 25 bis 35° C gewinnen.

Die Züchtungsdauer liegt im allgemeinen zwischen 2 und 10 Tagen und variiert je nach den verwendeten Bedingungen. In üblicher Weise sollte das Züchten beendet werden, wenn die Exponentialphase erreicht ist.

Das Tuberactin wird dann aus der Kulturbrühe entfernt Da es in Wasser leicht löslich ist, kann man es mit mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln extrahieren. Es ist zweckmäßig, bei der industriellen Herstellung, Isolierung und Reinigung von Tuberactin von dessen basischer Natur Gebrauch zu machen. Eine weitere vorteilhafte Arbeitsweise besteht darin, die gesamte Brühe zu filtrieren und das Tuberactin aus dem Filtrat durch Zugabe von Sulfonsäurefarbstoff, z. B. von Methyloraage, einem unter der Bezeichnung »Eriochrom Violett« im Handel befindlichen Farbstoff oder Alizarinsulfonsäure, von denen die beiden letztgenannten die Formeln

OH SO₃Na

N=N

O OH

haben, als Farbsalz auszufällen. Das so gebildete Tuberactin-Farbsalz wird dann in einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton, suspendiert, anschließend wird ein anorganisches Salz von Triethylamin, beispielsweise Triäthylamin-hydrochlorid oder -sulfat, zugegeben und das entsprechende anorganische Salz von Tuberactin ausgefällt. Alternativ kann man das Farbsalz des Tuberactins auch in wäßriger Salzsäure oder wäßriger Schwefelsäure lösen. Nachdem der Farbstoff durch Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel entfernt worden ist, wird die Wasserschicht konzentriert, dann wird ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol oder Aceton, zugegeben und dabei das anorganische Salz des Tuberactins ausgefällt.

Eine weitere für industrielle Verfahren besonders vorteilhafte Arbeitsweise besteht darin, daß man Kationenaustauscherharz zum Isolieren des Tuberactins aus der Kulturbrühe verwendet Man arbeitet dabei so, daß man das Tuberactin mit dem Kationenaustauscherharz zusammenbringt mit einer verdünnten Lösung von Sulfonsaure oder Salzsäure oder mit verdünnter alkalischer Lösung eluiert und die Tuberactin enthaltenden Fraktionen sammelt neutralisiert konzentriert, ein Lösungsmittel wie Methanol oder Aceton dazugibt und dann das Salz des Tuberactins 'daraus ausfäHt

Alternativ kann man die Kulturbrühe auch dialysieren oder durch Gel filtrieren, um die Substanzen mit hohem Molekulargewicht, beispielsweise Proteinsubstanzen und/oder Polysaccharide, die in der KuI-turbrühe vorhanden sind, zu entfernen. Dann konzentriert man unter Zusatz von Säure, fügt organisches Lösungsmittel dazu und fällt das Tuberactin als Säuresalz.
Das so hergestellte rohe Tuberactinsalz wird vor-

,0 teilhafterweise gereinigt. Dazu kann man es durch Auflösen in Wasser, Vermischen mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, beispielsweise Methanol, Äthanol, Aceton, Methylcellosolve, Dioxan oder Tetrahydrofuran, Umkristallisieren. Man kann es zum Reinigen auch auf eine chromatographische Säule aus beispielsweise Kationenaustauscherharz, Silicagel oder Cellulosepulver aufbringen, eluieren und danach die aktiven Fraktionen sammeln, wiederum konzentrieren, Lösungsmittel dazugeben und das Material in Form eines Salzes isolieren.

Eine weitere Art der Reinigung des Tuberactin-Salzes besteht darin, daß man eine konzentrierte wäßrige Lösung mit einem Überschuß an wäßrigem Triäthylaminsulfat vermischt und das Tuberactinsulfat bildet danach eine große Menge an mit Wasser mischbarem organischem Lösungsmittel, beispielsweise Methanol oder Aceton, hinzugibt und danach das Tuberactinsulfat abtrennt. Diese Behandlung kann zur Vervollständigung der Reinigung wiederholt werden.

Die am besten gereinigten Proben von Tuberactin konnten in der Weise gewonnen werden, daß das Produkt in Form des Hydrochloride auf eine mit Silicagel belegte Dünnschichtchromatographieplatte aufgebracht und mit einem Lösungsmittel-Gemisch aus 10^0/oigem wäßrigem Ammoniumacetat Aceton und 10%igem Ammoniakwasser im Volumenverhältnis von 9:10:0,5 entwickelt wurde. Nachdem die Entwicklung beendet war, wurde die dem Tuberactinhydrochlorid entsprechende Steile der Probe abgekratzt in Wasser gelöst und das Produkt wurde durch Ausfällen mit Methanol umkristallisiert.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften dieser hochgereinigten Tuberactinprobe, die in Form von weißem kristallinem Pulver vorlag, waren folgende:

1. Elementaranalyse (als Tuberactinhydrochlorid):

Berechnet: C 33.92, H 5,87. N 22^5, Cl 12,51% (3IsC₁₆H₃₁NgO₉^HCl).

Gefunden: C 33.95. H 5.66, N 22,69, CI 12.40%.

2. Molekulargewicht: 473 (cryoscopisch ermittelt), 486 (tetrimetisch bestimmt).

3. Summenformel als Hydrochlorid aus den berechneten und gefundenen Analysenwerten und dem Molekulargewicht: C₁₆H₃JN₉O₉-2HCl.

4. Schmelzpunkt: (als Tuberactm-Hydrochlorid 244 bis 264° C (zersetzt nicht klar zu beobachten) 5. Optische Drehung als Tuberactin-Hydrochlorid Ja]» = -31,5° (c = 1,H₂O).

6. Ultraviolettabsorptionsspektrum als Hydrochlorid: wie in F i g. 1 dargestellt

: 268 Γημ, EJl = 330 (in Wasser)
: 268,5 mti, Ej* = 313 (in 0,1 n-HCI)
: 285,5 mm EJ* = 206,5 (in 0,1 n-NaOH)

409 613-265

I 795

ίο

7. Infrarotabsorptionsspektrum (tablettiert in KBr) als Hydrochlorid: wiedergegeben in Fig. 2. Charakteristische Spitzen: 3250, 1660, 1495, 1225, 1154 und 1045 cm"¹.

8. Löslichkeit: (als Hydrochlorid)

Löslich: Wasser

Schwach löslich: Methanol, Dimethylformamid,

Glykolmonomethyläther.

Kaum löslich: Äther, Chloroform, N-Butanol, ¹⁰

Äthylacetat, Dioxan, Äthanol, Pyridin.

Unlöslich: Aceton, Benzol.

9. Farbreaktion:

Positiv: Ninhydrin, Sakaguchi, Piuret. Negativ: Isatin, Pauli, Molisch, Elson-Morgan. Ehrlich: gelb gefärbt.

10. Basizität: 20

pKa, = 7,2, pKa₂ = 10,3.

11. Aussehen: weißes kristallines Pulver.

Tuberactin ist ein Peptid-Antibiotikum, gibt eine positive Ninhydrin- und Sakaguchi-Reaktion und 15 bildet bei Hydrolyse Aminosäuren.

Von den bisher bekannten Antibiotika ähnelt dem Tuberactin in ihren Eigenschaften das Viomycin, das Phthiomycin [beschrieben von K. M aeda und Mitarbeitern, J. Antibiotics, Sor. A., 6 (4) (1953), 30 S. 183, japanische Patentveröffentlichung 3096/1955], Capreomycin (beschrieben von Earl B. H e r r jr., Antimicrob. Agents and Chomoth., 1962, S. 201), Vinactin (beschrieben in der USA. - Patentschrift 2 633 445) und Alboverticillin [K. M a e d a und 35 Mitarbeiter, J. Antibiotics, 11A (1958), S. 30]. Jedoch ist Tuberactin in folgender Hinsicht von diesen Antibiotika verschieden:

1. Vergleich mit Viomycin a) Dünnschicht Chromatography Tuberactin-Hydrochlorid, Viomycin-Hydrochlorid und ein Gemisch dieser beiden Substanzen wurde auf einer Silicagel beschichteten Dünnschicht-Chromatographie-Platte in einer Stärke von 0,25 mm aufgetupft. Die Platte wurde mit einem Lösungsmittelgemisch aus 10% dickem wäßrigem Ammoniumacetat, Aceton und 10% dickem Ammoniakwasser im Verhältnis von 9:10:0,5 (V/V) entwickelt und mit Ninhydrin-Reagenz gefärbt. Wie in F i g. 3 veranschaulicht, haben diese beiden Antibiotika verschiedene Rf-Werte.

b) Aminosäure-Analysen von Hydrolysaten des

Tuberactin-Hydrochlorids bzw. Viomycin-

Hydrochlorids

Eine Lösung von Tuberactin-Hydrochlorid (100mg), gelöst in 6 n-HCl (3 ml),wurde in einem verschlossenen Rohr bei 105⁰C 24 Stunden hydrolysiert. Das so hydrolysierte Tuberactin wurde getrocknet und mittels eines Aminosäure-Auto-Analysators (Technicon Chromatography Corp., New York, USA) analysiert, gefärbt mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäurit.

Viomycin-Hydrochlorid wurde in der gleichen Weise hydrolysiert und analysiert Wie in den F 1 g. 4 A für Tuberactin und 4 B für Viomycin veranschaulicht, bestehen diese beiden Antibiotika aus teilweise verschiedenen Aminosäuren. Aus der zuvor gegebenen Beschreibung erkennt man, daß Tuberactin verschieden von Viomycin ist

2. Vergleich mit Alboverticillin

Alboverticillin hat keine Ultraviolett-Absorptn ns-Maxima bei 220 bis 320 ηΐμ, wohingegen Tubcr.n;iin ein Maximum bei 268 πΐμ aufweist. Weitere I nlcrschiede ergeben sich wie folgt:

Molekular-Formel
LD₅₀ (Mäuse)

Albovenicillin

Q₃H₂₉O₅ _₆N₅

50 bis 100 mg/kg (i. v.)

Tuberactin

C₁₆H₃₁N₉O₉ ■ 2HCl 183 mg/kg (i.v.)

3. Vergleich mit Capreomycin Capreomycin zeigt negative Sakaguchi-Reaktion und eine Molekularformel von

-49N₁₃ -!

^25 - 27^Us -49N₁₃ -!4.O₉-J₀

wogegen Tuberactin eine positive Sakaguchi-Reaktion aufweist und die zuvor angegebene unterschiedliche Molekularformel hat

4. Vergleich mit Vinactin

Vinactin ergibt eine von Tuberactin verschiedene Elementaranalyse.

5. Vergleich mit Phthiomycin

Das Verhältnis von EJl in 0,1 n-HCl (= 171) und in 0,1 n-NeOH (=157) von Phthiomycin-Hydrochlorid beträgt 1,09, wohingegen das entsprechende Verhältnis von Tuberactin-Hydrochlorid 1,52 ist; daraus erkennt man die Verschiedenheit der beiden Antibiotika. Weitere Unterschiede ergeben sich wie folgt:

IXT
LD₅₀ (Mäuse)

Phthiomycin

-11"
600 mg/kg (i.v.)

Tuberactin

-31,5 183 mg/kg ('

Wie zuvor dargelegt handelt es sich bei Tuberactin um ein neues Antibiotikum, das verschieden ist von den bisher bekannten Antibiotika.

Die biologischen Eigenschaften des Tuberaclins sind folgende:

la) Akute Toxizität von Tuberactinsulfat

LD₅₀ = 185 bis 200 mg/kg ddY-Mäuse, i. p.

LD₅₀ = 183 mg/kg ddY-Mäuse, i. v.

LD₅₀ = 505 mg/kg ddY-Mäuse, i m.

(ddY-Mäuse = japanischer Mäusestamm. Abkömmlinge der dd-Mäuse, die von Dr. Sahachiro H a t a in Japan eingerührt worden sind und ursprünglich aus dem Laboratorium Dr. Paul Ehrlich stammen.

i. p. = intraperitoneal
i. ν. = intravenös

1. m. = intramuskulär)

Ib) Akute Toxizität anderer Antibiotika zum Vergleich

Streptomycin: LD₅₀ Mäuse 1440 mg/kg (s. c.) Viomycin: LD₅₀ Mäuse 240 mg/kg (i. v.) Cycloserine: LD₅₀ Mäuse 2,87 g/kg (i. p.) Cycloserine: LD₅₀ Mäuse 1,81 g/kg (i. v.) Capreomycin: LD₅₀ Mäuse 237,6 mg/kg (i. v.) Capreomycin: LD₅₀ Mäuse 513,9 mg/kg (s. c.) Capreomycin: LD₅₀ Mäuse 3,075 g/kg (p. o.) (s. c. = subcutan
p. o. = per os)

2. Antimikrobiologisches Spektrum, in

Agar-Verdünnungsmethode

Organismen

Aspergillus niger ATCC 6275
Panicillium crysogenum Q 176 Trichophyton asteroides
Trichophyton rubrum
Microsporum gypseum
Cryptococcus nooformans
Candida albicans ATCC 7491
Torula utilis

Trichodorma 1-1 ATCC 9645
Saccharomyces dreusiao
Sarcina lutoa ATCC 1001
Shigolla connoi
Shigolla floxinori
Salmonella paratyphi A
Salmonella paratyphi B
Shigella dysenteriae
Micrococcus Flavus
Vibro comma
Nocardia asteroides
Pseudomonas aeniginosa
Escherichia-coli NlHJ
Staphylococcus aureus FDA 209 P Staphylococcus albus
Staphylococcus citreus
Bacillus subtilis PCI 219
Mycobacterium tuberclosis H₃₇Rv Mycobacterium ATCC 607
Mycobacterium phlei

Geringste inhibitorische Konzentration

(mcg'ml)

200 200 200 100

50 200 200 200 200 200 100 100

12,5

25 100 100

25 >100

50

12,5

25

50 >100

50

12,5 4.0

12,5 3,2 Tag bzw. 4 mg/Maus/Tag bzw. 8 mg/Maus/Tag behandelt, wobei die Substanz 3 Tage nach der Infektion intramuskulär verabreicht wurde. Die Behandlung wurde 3 Wochen lang durchgeführt. Einer weiteren Gruppe von 10 Mäusen, die als Kontrollgruppe diente, wurde physiologische Salzlösung verabreicht.

Alle Tiere der Kontrollgruppe waren 22 bis 24 Tage nach der Infektion tot, wohingegen die Tiere der behandelten Gruppen 24 Tage nach der Infektion überlebten.

Die am 48. Tag nach der Infektion beobachteten Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben.

Dosis mg/Maus/Tag)

4
2
1
Kontrollgruppe

Anzahl der behandelten M fl ti se	Überlebens verhältnis lot/behandelt
10	010
10	0 10
10	4/10
10	5/10
10	10/10

Mittleres

Gewicht <1cr

Lungen

(mg)*)

616
662
777
869
1003

*) Biopsie am 48. Tag nach Infektion (bei überlebenden Mäusen) oder direkt nach dem Tod (bei nicht überlebenden Mäusen).

Es wurde weiter ermittelt, daß Tuberactin gegenüber antibiotikaresistenten Stämmen wirksam ist. Dazu wurde die jeweils niedrigste inhibierende Konzentration mit Stämmen von Mycobakterium tuberculosis H₃₇Rv, die gegenüber bestimmten angegebenen Antibiotika resistent sind, einmal für diese Antibiotika als Kontrollversuch und zum anderen für das erfindungsgemäß hergestellte Tuberactin ermittelt. Die ermittelten Werte für die niedrigste inhibierende Konzentration und die speziell verwendeten Stämme von Mycobakterium tuberculosis H₃₇Rv sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt

Stämme von

Mycobacterium tuberculosis H₃,Rv

M!C*) (meg ml)	Tuberactin
Kontrolle	• 2
80	30
80	2
300	12,5
100

3. Experimentelle chemotherapeutische Wirkung bei Mäusen

Vier Gruppen von ie zehn männlichen Mäusen des Stammes ddY. die ein Gewicht von 20 g hatten, wurden intravenös mit pathogenen Tuberkelbazillen des Stammes H₃₇Rv infiziert und dann mit Tuberactinhydrochlorid behandelt, und zwar wurden die Mäuse der vier Gruppen mit 1 mg Maus Tag, bzw. 2 mg Maus/ Streptomycin resistent
Viomycin resistent
Cycloserin resistent
Capreomycin resistent

*) MIC = niedrigste inhibierende Konzentration.

Der erfindungsgemäß erreichte technische Fortschritt ist offensichtlich. Zum Beispiel zeigt die Tabelle daß die niedrigste inhibierende Konzentration füi Streptomycin 80 mcg/ml, dagegen für Tuberactir 2 mcg/ml beträgt

In den nachfolgenden Beispielen sind alle Prozent angaben als Gewichtsprozente und alle anteiligei Mengen von Lösungsmittelgemischen als Volumen anteile zu verstehen, sofern nichts anderes gesagt ist

Beispiel 1

21 eines wäßrigen Mediums, das 3% Glukose 2% Stärke, 3% Sojabohnenmehl und 1,5% Natrium chlorid. enthielt, wurden in gleiche Teile aufgeteili

in 20 100-ml-Erlenmeyerkolben eingefüllt, der pH-Wert wurde auf 6 eingestellt, dann wurde 30 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert und anschließend mit Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus NRRL 3482 geimpft. Anschließend wurde unter rotierendem Schiitteln (Radius 25 cm, 330 UpM) bei 3O⁰C 7 Tage lang bebrütet, und es wurden 1,51 einer Kulturbrühe erhalten, die 1,140 mcg/ml Tuberactin enthielt.

Ke Kulturbrühe wurde filtriert, indem sie mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Min, durch eine Harzsäule (2,5 cm Durchmesser, 30 cm lang), die mit 150 ml einer schwach sauren Ionenaustauscherharze mit Carboxylgruppen auf Divinylbenzolbasis mit 5% Vernetzung in der Natrium-Form gefüllt war, hindurchgeleitet wurde. Die Säule wurde mit ,₅ Wasser gewaschen, mit 0,5 n-HCl mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,6 ml/Min, eluiert. Die Eluate wurden in je 10 ml Fraktionen gesammelt; in den Fraktionen Nr. 47 bis 67 wurde mittels Ultraviolett-Absorption und biologischen Tests Tuberactin-Aktivitat gefunden.

Die so in einer Menge von etwa 200 ml gewonnene aktive Fraktion wurde mit Natriumhydroxyd neutralisiert, auf etwa 10 ml im Vakuum eingedampft. Die abgeschiedenen anorganischen Salze wurden abgetrennt. Nach dem Entfärben mit Aktivkohle wurden 100 nil Methanol zugegeben. Nach Stehen über Nacht bei 5° C wurde der Niederschlag abfiltriert und gesammelt. Der Niederschlag wurde mit Methanol gewaschen, im Vakuum getrocknet, und es wurde das rohe Tuberactin-Hydrochlorid, Fp. = 222 bis 225°C unter Zersetzung erhalten (Ausbeute: 1,34 g; Reinheit: 70%, Rückgewinnung: 55%).

E ei s ρ i e 1 2

35

Es wurde wie im Beispiel 1 angegeben gearbeitet, jedoch wurde als wäßriges Medium ein solches mit 3% Glukose, 2% Stärke, 1,5% Melasse, 1,5% Sojabohnenmehl und 1,5% Natriumchlorid eingesetzt, das auf einen pH-Wert von 6 eingestellt war. Es wurden 1,5 1 Kulturbrühe gewonnen, die 1950 mcg/ml Tuberactin enthielten. Als Rohprodukt wurde Tuberactin-Hydrochlorid erhalten, Fp. = 218 bis 224°C unter Zersetzung (Ausbeute 2,34 g; Reinheit: 70,5%, Rückgewinnung: 56%). Das gewonnene Tuberactin-Hydrochlorid wurde in 5 ml Wasser gelöst, und dann wurde der pH-Wert mit 0,1 n-NaOH auf etwa 8 bis 10 eingestellt. Die Lösung wurde im Vakuum eingedampft, dann wurde das abgeschiedene Natriumchlorid entfernt, und das Tuberactin wurde durch Zugabe von Methanol als freie Base erhalten (Ausbeute: 1,5 g, Reinheit 75%).

Beispiel 3

Es wurde wie im Beispiel 1 angegeben gearbeitet, jedoch wurde ein wie folgt zusammengesetztes Medium verwendet: 2% Glukose, 3% Stärke, 1,4% Trockenhefe und 0,5% Natriumchlorid. Es wurde 1 1 an Kulturbrühe mit 1575 mcg/ml Tuberactin gewonnen, und die Ausbeute betrug 1,11 g an rohem Tuberactinhydrochlorid, Fp. -■ 224 bis 229° C unter Zersetzung (Reinheit 71%, Rückgewinnung 57%).

Beispiel 4

100 ml eines wäßrigen Mediums, das 1% Stärke, 1% Melasse, 1% Pepton, 1% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt, wurde in einen 500 ml Sakoguchi - Kolben (Kurzhals - Stehkolben) eingebracht auf einen pH 7,0 eingestellt, 30 Mmuten lang bei 120⁰C sterilisiert, mit Streptomyces gnseoverticillatus var. Tuberacticus NRRL 3482 beimpft und dann unter 7 cm Hin- und Herschütteln mit 130 Hin- und Hersängen je Minute 2 Tage lang bei 30⁰C bebrütet. Mit der fermentierten Brühe wurden "Ol eines wäßrigen Mediums, das 1% Stärke, 1% Melasse, 1% Pepton, 1% Fleischextrakt, 0,5% Natriumchlorid und 5 ml Antischaummittel enthielt, in einem 301 fassenden Rüttelbehälter beimpft und darin bei 30⁰C 24 Stunden lang unter Belüften mit 20 l/Min, und Rühren mit 200 UpM bebrütet Nach 24stündiger Fermentation wurde die Brühe zu 200 1 eines sterilisierten wäßrigen Mediums gegeben, welches 3% Stärke, 2% Glukose, 1,5% Melasse, 1,5% entfettetes SqjabohnenmehL 0,5% Natriumchlorid und 100 ml Antischaummittel enthielt (pH-Wert vor der Sterilisation 6,0) und das sich in einem 2501 Fermentationsbehälter aus rostfreiem Stahl befand Dann wurde bei 30^c C 90 Stunden lang unter Belüften mit 100 l/Min, und Rühren mit 300 UpM bebrütet, und es wurden 190' Kulturbrühe gewonnen, die 2,100 mcg/ml an Tuberactin enthielten.

Die Kulturbrühe wurde mit Chlorwasserstoff auf einen pH-Wert von 2,0eingestellt, es wurden 25 Volumprozent Diatomeenerde zugegeben, dann wurde bei vermindertem Druck filtriert, und es wurden 1601 filtrierte Brühe erhalten. Nach dem Neutralisieren wurde das Filtrat durch einen Harzturm, der 15 1 lonen-Austauscherharz in der Natriumform enthielt, mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 301 Std. hindurchgeleitet, und es wurde das darin vorhandene Tuberactin absorbiert. Das Harz wurde mit Wasser gewaschen, dann mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure in einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 1/Std. eluiert, wobei jeweils 25 1 als Einzelfraktion abgezogen wurden. Das Tuberactin wurde in den Fraktionen 7 bis 12 gefunden. Die aktiven Fraktionen wurden nach Neutralisieren mit Natriumhydroriyd im Vakuum auf etwa 500 ml konzentriert. Die so erhaltenen Konzentrate wurden mit aktiver Holzkohle entfärbt, dann wurde unter Rühren Methanol zugegeben. Nach Stehen über Nacht bei 5° C schied sich das Tuberactin ab. Das Tuberactin wurde mit Methanol gewaschen, über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet, und es wurde rohes Tuberactinhydrochlorid gewonnen, Fp. = 225 bis 23O°C unter Zersetzung (Ausbeute 320 g, Reinheit: 70,5%, Rückgewinnung: 67,3%).

Beispiel 5

Die Fermentation wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 2 angegeben durchgeführt, und es wurden 20! Kulturbrühe erhalten, in denen 1900 mcg/ml an Tuberactin enthalten waren.

Der pH-Wert der Brühe wurde mit Schwefelsäure auf 2,0 eingestellt, dann wurde nach Zugabe einer kleinen Menge an Filterhilfe filtriert, und es wurden 1,761 klares Filtrat gewonnen. Der pH-Wert des Piltrats wurde auf 5,5 eingestellt, dann wurden 15 g eines Sulfonsäurefarbstoffs mit der Formel

N=N

SO₃Na

SO₃Na

hinzugegeben, es wurde 1,5 Stunden lang dialysiert, und dann wurde der Niederschlag abfiltriert Das ausgefällte Farbsalz von Tuberactin wurde nach Waschen mit Wasser im Vakuum getrocknet. Das so hergestellte Farbsalz von Tuberactin wurde in 300 ml eines Gemisches aus 80% Aceton und 20% Methanol suspendiert, dann wurde eine 50%ige Methanollösung von Triäthylaminsulfat zugegeben, bis sich kein Niederschlag an Tuberactinsulfat mehr bildete. Die Mischung wurde 1,5 Stunden gerührt, und dann wurde der Niederschlag durch Filtration gesammelt, mit Aceton und Methanol zur Entfernung des Farbstoffs gewaschen, in einer kleinen Menge Wasser gelöst und das Tuberactinsulfat, Fp. =- 24! bis 246° C unter Zersetzung, durch Zugabe von Methanol ausgefällt. (Ausbeute: 2,97 g, Reinheit: 80%, Rückgewinnung: 60%).

Beispiel 6

100 mg wie im Beispiel 1 gewonnenen Tuberactinhydrochlorids wurden in 5 ml einer Lösung aus n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15 :10: 3 : 12) gelöst, und die Lösung wurde an einer Säule aus Celluiosepulver (1 χ 150 cm) in dem gleichen Lösungsmittelgemisch absorbiert. Anschließend wurde das gleiche Lösungsmittelgemisch mit einer Durchflußgeschwindigkeit von lOml/Std. durch die Säule hindurchgeleitet. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 3 ml gesammelt. Tuberactin wurde in den Fraktionen Nr. 41 bis 51 gefunden. Die aktiven Fraktionen wurden im Vakuum auf 1 ml konzentriert, dann wurden 5 ml Methanol zugegeben, und es wurden 60 mg Tuberactinsulfat, Fp. = 245 bis 248° C, gewonnen.

Beispiel 7

10 1 Ionenaustauscherharz in der Ammoniakform wurden in eine Säule (13 χ 70 cm) aus rostfreiem Stahl eingefüllt. Das Harz wurde über Nacht mit

: ο 0,6 m Ammoniumformitlösung, pH 9,0, gepuffert. 100 g der Tuberactinmasse, gelöst in 500 ml Ammoniumformitlösung, pH 9,0, wurden oben auf diese Säule aufgegeben, dann mit der gleichen Pufferlösung mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 6 bis 81/Std.

eluiert. Fraktionen von je 2 ml wurden unter Verwendung eines Fraktionskollektors gesammelt Aktive Substanz wurde in den Fraktionen Nr. 25 bis 36 geiunden, und diese Fraktionen wurden dann mit Chlorwasserstoffsäure neutralisiert, und die aktive'

Lösung wurde in einer Säule aus Ionenaustauscherharz in der Natriumform (4 χ 54 cm) chromatographiert und mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 350 ml/Std. eluiert. Die aktive Fraktion wurde gesammelt, mit Chlorwasserstoffsäure

neutralisiert, dann im Vakuum auf 200 ml konzentriert und 2 1 Methanol zugegeben, wobei das Tuberaclinhydrochlorid als weißes Pulver ausfiel.

Der Niederschlag wurde filtriert und im Vakuum getrocknet, und es wurden 50 g weißes kristallines

Pulver von Tuberactinhydrochlorid, Fp. = 240 bis 248° C unter Zersetzung, erhalten.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. I 795

   Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung eines neuen, Tuberactin genannten gegen Tuberkelbazillen wirksamen antibiotischen Wirkstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus mit der Hinterlegungsnummer NRRL 3482 in einem üblichen, assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthaltenden wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und aus dem Kulturmedium den Wirkstoff Tuberactin in üblicher Weise als im wesentlichen kristallines Produkt mit einer Basizität von PKa₁ = 7,2 und pKa₂ = 10,3 isoliert, das als Hydrochlorid die Summenformel Q₆H₃₁N₉O₉ · 2HCl, einen Schmelzpunkt von 244 bis 264° C (unter Zersetzung), eine optische Drehung von [α]? = -31,5° (c = 1, H₂O) und folgende UV-Absorption hat:

   '■max = 268 πΐμ, E₁ ¹* = 330 (in H₂O)

   Ä_m„ = 268,5 πΐμ, EJ* = 313 (in 0,1 n-HCl)

   ,._max = 285,5 ταμ, Ej* = 206,5 (in 0,1 n-NaOH)

   und, falls erwünscht, die freie Base mit Säuren in die Salze überführt.

   Es wurde überraschend gefunden, daß ein neues antibiotisches Antituberkuloseniittel durch einen Mikroorganismus, der zur Gattung Streptomyces gehört und der aus Bodenproben in Ohito-cho, Shizuoka-ken, Japan, abgetrennt wurde, hergestellt werden kann. Diese neue, als Tuberactin bezeichnete Antibiotikum ist ganz besonders aktiv gegen Tuberkelbazillen.

   Der neue antibiotische Wirkstoff läßt sich vorteilhaft in industriellem Maßstab gewinnen. Er entsteht

   ίο während der Züchtung von Tuberactin produzierenden Mikroorganismen des Stammes Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus NRRL 3482, der morphologisch verwandt ist mit Streptomyces griseoverticillatus (beschrieben bei S h i η ο b u und Mit-

   arbeitem, Bot. Mag. Tokio, 75 (1962) S. 170, jedoch

   unterschiedliche Züchtungsbedingungen benötigt und unterschiedliche physikalische Charakteristiken zeigt,

   wie sie nachstehend angegeben sind.

   Im folgenden wird eine Aufstellung der taxono-

   mischen Eigenschaften des Organismus Streptomyces griseoverticillatus var. tuberacticus NRRL 3482 (auch als Streptomyces Stamm B-386 bezeichnet) gegeben, die auf beobachteten diagnostischen Charakteristiken basiert.