DE2326943C3 - Xylostatsin Verfahren zu dessen Herstellung und Xylostatsin enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Xylostatsin Verfahren zu dessen Herstellung und Xylostatsin enthaltende Arzneimittel

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DE2326943C3
DE2326943C3 DE19732326943 DE2326943A DE2326943C3 DE 2326943 C3 DE2326943 C3 DE 2326943C3 DE 19732326943 DE19732326943 DE 19732326943 DE 2326943 A DE2326943 A DE 2326943A DE 2326943 C3 DE2326943 C3 DE 2326943C3
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Description

Die Erfindung betrifft ein als »Xylostasin« bezeichnetes neues Aminoglykosid-Antibiotikum, das nach der wissenschaftlichen Nomenklatur die Bezeichnung O-0-D-XyIofuranosyl-(l-+5)-O-(a-2,6-diamino-2,6-didesoxy-D-glucopyranosyl-il-^-a-desoxyfa-eptamin und die folgende Formel hat:
NH2
HO
HOH2C OH
NH2
Die Erfindung umfaßt ferner die pharmazeutisch unbedenklichen Salze von Xylostasin mit Säuren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Xylostasin und Xylostasin oder dessen Salze enthaltende Arzneimittel.
Gemäß der Erfindung erfolgt die Herstellung von Xylostasin nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Bacillus Sp. Y-399 (ATCC-21932) oder Bacillus Sp. V-7 (ATCC-21933) oder daraus durch bekannte Techniken erhältliche Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 15 bis 35° C bzw. 15 bis 45° C und in einem pH-Bereich von 6 bis 9 kultiviert und das Xylostasin aus dem Kulturmedium isoliert.
Die Mutanten können durch spontane und induzierte Mutation dieser Mikroorganismen erhalten werden. Um festzustellen, ob ein Mikroorganismus Xylostasin zu bilden vermag, kann beispielsweise die nachstehend beschriebene Auswahlmethode angewandt werden.
Ein GIucose-Bouillon-Medium wird mit Bacillus-Stämmen, die von den natürlichen Quellen dieser Stämme isoliert oder von Vorratskulturen dieser Stämme entnommen wurden, geimpft Die Kultivierung wird 3 bis 4 Tage unter Schütteln bei 28" C durchgeführt. Nachdem bestätigt worden ist daß das erhaltene Kulturmedium antibakterielle Wirkung gegen einen geeigneten Testmikroorganismus, z. B. Bacillus subtilis, Escherichia coli oder Staphylococcus aureus, zeigt werden etwa 20 ml des Kulturfiltrats mit Alkali auf pH 9 bis 10 eingestellt und dann durch eine Aktivkohlesäule (0,2 g) geleitet Die Säule wird mit etwa 10 ml Wasser gewaschen und dann mit 10 ml 0,1 N HCl eluiert Das Eluat wird neutralisiert und unter vermindertem Druck eingeengt Das Konzentrat wird durch Papierelektro-
phorese auf Filterpapier »Whatman« Nr. 1 in einem Boratpuffer (pH 93,0,025molar) bei einem Spannungsgradienten von 2 kV/36 cm für 90 Minuten analysiert. Der Flecken von Xylostasin kann durch Bioautographie gegen einen geeigneten Mikroorganismus, z. B. Bacillus subtilis, sowie auch durch eine Farbreaktion unter
Verwendung von Peptidreagens nachgewiesen werden. Das Xylostasin wird 5 bis 6 cm zur Kathode festgestellt Als Mikroorganismen eignen sich für das Verfahren
gemäß der Erfindung beispielsweise Bacillus sp. Y-399
so und Bacillus sp. V-7, die unter den folgenden Zu?angsnummern hinterlegt sind:
Tabelle 1
ATCC
IFO
Bacillus sp. Y-399 Bacillus sp. V-7
21932 21933
13321 13320
ATCC: »American Type Culture Collection«, Maryland,
USA. IFO: »Institute for Fermentation, Osaka«, Osaka, Japan.
Bacillus Sp. Y-399 wurde von der Anmelderin vom Boden in Kyoto, Japan, und Bacillus Sp. V-7 vom Boden in Tokyo, Japan, isoliert. Diese Mikroorganismen haben die nachstehend in Tabelle 2 genannten mikrobiologischen Eigenschaften.
Tabelle 2 ] 18) Wachstumstemperatur 23 26 943 4
3 Eigenschaft
a) Aussehen Bacillus sp, V-7
I) Form und Größe 19) 0,-Relation Bacillus sp. Y-399
Stäbchen, 0,8 X 2,4 bis 3,4 μ, mit
2) Pleomorphismus Stäbchen, 0,8 x 2,4 bis 3,4 μ, mit abgerundeten Enden
abgerundeten Enden tritt einzeln und gelegentlich paar
3) Beweglichkeit und tritt einzeln und paarweise auf weise auf
Flagellum beweglich, mit Peritricha
I 4) Sporogenese beweglich, mit Peritricha
Sporen eliptisch oder zylindrisch,
Sporen eliptisch oder zylindrisch, zentral bis subterminal, Sporangium
5) Grain-Färbung zentral bis subterminal, Sporangium gequollen und keulenförmig
6) Säurefestigkeit gequollen und keulenförmig unterschiedlich
p5 b) Wachstumsmcikmale unterschiedlich nicht säurefest
s 1) Bouillonagarplatte nicht säurefest
sich ausbreitend, glatte flache Ober
S sich ausbreitend, glatte flache Ober fläche, glänzend, geschlossen,
1 fläche, geschlossen, durchscheinend, durchscheinend, gräulich-weiß und
I 2) Bouillon-Schrägagar gelb und schleimig; Mikrokolonien schleimig; beweglich
sind beweglich mäßiges Wachstum, rhizoid, flach,
I mäßiges Wachstum, rhizoid, flach, glänzend, gräulich-weiß und sehr
I 3) Bouillon glänzend, durchscheinend und sehr schleimig
1 schleimig mäßiges Wachstum, kein Ober-
I mäßiges Wachstum, kein Ober- fläcnenwachstum, trübe; Zellen
I 4) Kartoffel Flächenwachstum, trübe; Zellen sind gräulich-weiß
I sind gelb gutes Wachstum, sich aus
I S) Lackmusmilch mäßiges Wachstum, sich aus breitend, gräulich-weiß
|| c) Physiologische Merkmale breitend, hellgelb reduziert
r< 1) Reduktion von Nitraten neutral, peptonisiert und reduziert
a 2) Denitrierung nicht reduziert
I 3) MR-Test nicht reduziert
I 4) VP-Test negativ negativ
if S) Indolbildung negativ negativ
* 6) Bildung von Schwefel- negativ nein
ί wasserstoff nein ja
7) Hydrolyse von Stärke ja
8) Verwertung von Citrat schwach hydrolysiert
9) Verwertung von Nitraten schwach hydrolysiert keine Verwertung
1 10) Verwertung von Ammoniak keine Verwertung keine Verwertung
11) Pigmentbildung keine Verwertung Verwertung
keine Verwertung keine Pigmentbildung
ein in unlösliches gelbes Pigment
1 12) Urease-Aktivität (carotinoid) wird intrazellulär
13) Cytochromoxydase gebildet negativ
14) Reduktion von negativ vorhanden
Methylenblau fehlt im wesentlichen reduziert
15) Casein-Hydrolyse reduziert
16) Verflüssigung von Gelatine negativ
!7) ρ,,-Wert Tür das Wachstum positiv verflüssigt
verflüssigt Wachstum bei P11 6 bis 9, optimales
Wachstum bei p„ 6 bis 9, optimales Wachstum bei Pn 8
Wachstum bei p„ 8 Wachstum bei 15 bis 45°C,
Wachstum bei 15 bis 35°C, optimales Wachstum bei 30 bis
optimales Wachstum bei 300C 37°C
aerob, kein anaerobes Wachstum in
aerob, kein anaerobes Wachstum in Glucosebouillon
Glucosebouillon
Fortsetzung 5 23 26 943 6 V-7
Eigenschaft Bacillus sp. Y-399 Bacillus sp.
c) Physiologische Merkmale
20) Beständigkeit gegen Natriumchlorid
kein Wachstum bei einer Konzentration von 5%
kein Wachstum bei einer Konzentration von 5%
21) 0-F-Test weder Säure noch Gas wird aus Gas weder Si
D-Glucose oder aus Maltose D-Glucc
gebildet -
22) Katalase schwach - schwach
d) Fermentation von Kohlen Säure - Säure
hydraten -
L-Arabinose - - -
D-Xylose - - -
D-Glucose - - +
D-Mannose + - ++
D-Fructose - - +
D-Galactose - - -
Maltose H- - ++
Saccharose - - +
Lactose - - -
Trehalose + - +
D-Sorbit - _ -
D-Mannit - _
Inosit - -
Glycerin - -
Stärke + ++
Gas
Ein Vergleich der vorstehend genannten mikrobiologischen Merkmale mit den entsprechenden Angaben in Berge/s Manual of Determinative Bacteriology (7. Auflage) läßt darauf schließen, daß Bacillus sp. V-7 entweder ru Bacillus circulans gehört oder ein Stamm ist, der mit Bacillus circulans eng verwandt ist Andererseits kann Bacillus Sp. Y-399 mit keinem der in der vorstehend genannten Literaturstelle beschriebenen Mikroorganismen identifiziert werden, vielmehr hat dieser Stamm eine große Ähnlichkeit mit dem in der japanischen Paten !Veröffentlichung Nr. 98875/1971 beschriebenen Stamm IFO-13296 und wird daher als zu Bacillus vitellinus gehörend angesehen.
Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durchgeführt, indem der Xylosfnsin bildende Stamm in einem geeigneten Medium gezüchtet wird. Geeignet sind Medien, die routinemäßig bei der Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Bacillus verwendet werden. So kann das Medium als Kohlenstoffqueilen Kohlenhydrate wie Glucose, Stärke, Dextrin usw. und als Stickstoffquellen verschiedene organische und anorganische Stickstoffverbindungen, ζ. Β. Ammoniumsulfat, Ammoniuimchlorid, Aminosäuren, Proteinmaterialien enthalten. Diese Bestandteile des Nährmediums können allein oder in geeigneter Kombination verwendet werden. Außer diesen Bestandteilen kann das Medium ferner anorganische Stoffe wie Kalium, Natrium, Magnesium, Eisen, Phosphorsäure und wachstumsfördernde Faktoren, z. B. Vitamine, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton und organische Säuren, enthalten. Der Mikroorganismus kann unter stationären Bedingungen gezüchtet werden, jedoch erfolgt die Kultivierung vorzugsweise unter Schütteln oder unter Belüftung und unter Rühren. Die Bebrütungstemperatur liegt im allgemeinen zwischen 20° und 370C. Die Bebrütungsdauer kann etwa 24 bis 90 Stunden betragen. Fs ist zu bemerken, daß die optimalen Bedingungen von den Merkmalen des jeweils zu verwendenden, Xylostasin badenden Stamms abhängen und unter Berücksichtigung dieser Eigenschaften zu wählen sind.
Wenn ein Xylostasin bildender Bzcillus-Stamm unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen gezüchtet wird, wird Xylostasin überwiegend im Kulturfiltrat gebildet. Wie die nachstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften zeigen, ist Xylostasin ein wasserlösliches basisches Antibiotikum und kann daher nach den allgemeinen Verfahren zur Isolierung
so von üblichen wasserlöslichen basischen Antibiotika einschließlich Neomycin, Paromomycin, Kanamycin u. dgl. isoliert werden.
Beispielsweise kann die Isolierung des Xylostasins vorgenommen werden, indem das Kulturmedium Ober ein Adsorptionsmittel geleitet und die a!;iive Verbindung mit einem geeigneten Elutionsmittel desorbiert wird, oder das Antibiotikum kann mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert werden. Zweckmäßiger ist das erstgenannte Verfahren. Insbesondere läßt sich das Xylostasin in Fällen, in denen das Kulturmedium unter Verwendung von Aktivkohle als Adsorptionsmittel gereinigt werden soll, leicht auf der alkalischen Seite adsorbieren. Als Elutionsmittel wird vorteilhaft eine wäßrige Lösung, die auf einen pH-Wert von weniger als 5, vorzugsweise von nicht mehr als 4, eingestellt worden ist, oder ein Lösungsmittel wie wäßriges Aceton oder wäßriger Alkohol verwendet. Xylostasin kann auch unter Verwendung eines Ionenaustauschers als Adsorn-
tionsmittel gereinigt werden. Als Ionenaustauscher können Kationenaustauschharze, z. B. Amberlite® IRC-50 verwendet werden. Als Elutionsmittel werden im allgemeinen wäßrige Lösungen einer Säure, eines Alkalis oder eines Salzes verwendet.
Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe pulverförmige Xylostasin kann durch lonenaustauschchromatographie beispielsweise am Harz Dowex· 1x2 (OH--Form), Amberlite® CG-50 (NH4 + Fettm) und CM-Sephadex® (NH4 +-Form), weiter gereinigt werden. Aus dem Eluat, das bei der Reinigung unter Verwendung eines solchen Adsorptionsmittels erhalten wird, wird Xylostasin beispielsweise durch Eindampfen des Eluats zur Trockene vorzugsweise bei niedriger Temperatur oder durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zum Eluat und Abtrennen der Fällung isoliert. Xylostasin wird in Form eines Salzes mit einer Säure isoliert, wenn das Eluat vor oder nach der Einengung mit einer Säure neutralisiert wird.
Xylostasin kann der biologischen Testung nach üblichen Methoden, beispielsweise nach der Papierscheibenmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als Testmikroorganismus, unterworfen werden.
Das Antibiotikum gemäß der Erfindung hat die folgenden physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften:
1. Xylostasin ist eine basische Substanz. Xylostasin, sein Hydrochloric! und Sulfat sind weiße kristalline Pulver. Xylostasin ist in neutraler oder alkalischer Lösung beständig, jedoch in saurer Lösung weniger beständig.
2. Xylostasin hat keinen scharfen Schmelzpunkt. Es zersetzt sich unter Schäumen im Bereich von etwa 150 bis 18O0C.
3. Xylostasin ist in Wasser leicht löslich, in Methanol wenig löslich und in organischen Lösungsmitteln wie Aceton, Butanol. Äthylacetat, Benzol, Hexan, Äther usw. unlöslich.
4. Das UV-Spektrum von Xylostasin zeigt keine cnaraKterisusche Absorption mit Ausnehme der Endabsorption.
5. Das Infrarotspektrum von Xylostasin in Kaliumbromid zeigt für Aminoglucosid-Antibiotika charakteristische Absorptionsbanden in der Nähe von 3320, 2920. 1590, 1465, KMO, 1100 und 1020cm-'. Da jedoch keine Absorption in der Nähe von 1652cm-' vorhanden ist, enthält das Molekül von Xylostasin offensichtlich keine Säureamidbindung.
6. Das NMR-Spektrum (in D2O) von Xylostasin zeigt die folgenden charakteristischen Maxima:
6-Werte: 136 (q, IH, axiaies Methylenproton), 2,13 (m, IH, äquatoriales Methylenproton), 5,44 (IH, J = < 1, anomerisches Xyloseproton), 5,70 (d, 1H. J = 3—4, anomerisches Proton von Neosamin C).
7. Optische Drehung von Xylostasin, gemessen in wäßriger Lösung:[α]Ό3 +34°.
8. Farbreaktionen: Xyiostasin ist positiv in der Ninhydrin-Reaktion, beim Molisch-, Anthron- und Greig-Leaback-Test und negativ beim Sakaguchi-Test Maltol-Test, Eisen(IH)-chloridtest, Bhiret-Test und Ehrlich-TesL
9. Die Elementaranalyse einer Xylostasinprobe, die 20 Stünden unter vermindertem Druck bei 5i0*C getrocknet worden ist, ergibt 44,18% C, 738% H und 1138% N. Das Molekulargewicht (Neutralisationsäquivalent) beträgt 451.
Strukturuntersuchungen ergeben die Bruttoformel C17H34N4Oi0 (berechnet: 44,93% C, 7,54% H, 1233% N, Molekulargewicht 454,49).
10. Xylostasin wandert bei der Papierelektrophorese etwa 5 bis 6 cm zur Kathode (Boratpuffer (pH 9,5, 0,025molar) auf Filterpapier Whatman Nr. 1 bei 2 kV/36 cm für 90 Minuten).
Wenn Xylostasin 6 Tage der Methanolyse mit 0,4 N HCI in Methanol bei 22° C unterworfen wird, werden Methyl-D-Xylosid und Neamin gebildet. Wenn Xylostasin 6 Stunden mit 0,5 N Schwefelsäure bei 90°C hydrolysiert wird, werden D-Xylose und Neamin im Hydrolysat nachgewiesen.
Das antibiotische Spektrum von Xylostasin ist nachstehend in Tabelle 3 genannt.
Tabelle 3
Hemmende Mindcstknnzentnitionen nnch der Agar-Verdünnungsmethodc
Testmikroorganismus hemmende Min-
destkonAentralion
Hg/ml
Eschcrichia coli IFO 3044 6,25
Shige!', flexneri EW-IO 12,5
Proteus vulgaris IFO 3045 50
Pseudomonas aeruginosa
IFO 3080		 >50
Staphylococcus aureus
FDA 209 P		 6,25
Bacillus subtilis PCI 219 3.125
Bacillus cereus IFO 3466 50
Bacillus brevis IFO 3331 25
Sarcina lutea IFO 3232 25
Mvcobactcrium avium
IFO 3153		 1.6
\Λ>.—ι 1~~: : 1 1 IC
(Streptomycin-resistent)
Mycobacterium avium >50
(Neomycin-resistent)
Mycobacterium phlei IFO 3158 1.6
Mycobacterium smegmatis 1,6
IFO 3083
FDA: »Food and Drug Administration«. Washington
DC. USA
PCI: »Penicillin Control and Immunology Section.
Food and Drug Administration«. Washington.
DC. USA.
Ais Medien für den Test werden Bouillonagar für die gewöhnlichen Bakterien und Glycerin-Bouillonagar für säurefeste Bakterien verwendet
13. Akute Toxizität: Die akute Toxizität von Xylostasin wurde an Mäusen bei intravenöser Injektion untersucht Der LDso-Wert für die freie Base beträgt etwa 100 mg/kg.
14. Anti-Infektionstest mit Mäusen: Wenn eine wäßrige Lösung von Xylostasin Mäusen unmittelbar nach einer Infektion mit Escherichia coli O-111 in einer Einzeldosis von 10 mg/kg subkutan verabreicht wurde, wurde der Tod der Mäuse vollständig verhindert.
Xylostasin und seine pharmazeutisch unbedenklichen Salze mit Säuren sind wirksam gegen Infektionen durch Bakterien. Ihre Toxiziiät bei Warmblütern (z. B. Mensch, Maus und Raue) ist äußerst gering. Die Verbindungen können daher unbedenklich und wirksam zur Behandlung von Infektionen durch Bakterien, z. B. Harnweginfektionen, Bronchopneumie, Pyelitis und Mandelentzündung verwendet werden. Die Antibiotika gemäß der Erfindung können im allgemeinen parenteral verabreicht werden, jedoch ist auch eine andere Verabreichung möglich. Die Dosierung wird zweckmäßig in Abhängigkeit von den Symptonen der zu behandelnden Krankheit bestimmt und liegt beispielsweise im Bereich von etwa 10 bis 40 mg/kg Körpergewicht bei jeder Gabe. Die erfindungsgemäßen Antibiotika können in Form von üblichen Arzneirnittelzubereitungen, z. B. Injektionslösungen. Tabletten und Salben, verabreicht werden.
Beispiel 1
Ein flüssiges Medium (pH 7,2), das 3% Polypepton, 1% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacillus sp. Y-399, der auf Glycerin-Bouillon-Agar gezüchtet worden war, geimpft. Die Bebrütung wurde 40 Stunden unter Schütteln bei 28°C durchgeführt Diese Impfkultur wurde dann in ein l'ermentationsmedium (301, pH 7,5), das 1% Glucose, 1% Polypepton, 0,7% Fleischextrakt und 0,5% Magnesiumchlorid enthielt, in einem 50-l-Tank bei einer Größe des Inoculums von 10% geimpft. Die Fermentation viirde 66 Stunden bei 88°C. 100% Belüftung und 200 UpM durchgeführt.
Das erhaltene Kulturmedium wurde mit einer gesättigten wäßrigen Oxalsäurelösung auf pH 1 bis 2 eingestellt und dann mit einem Filterhilfsmittel (300 g Hyflo-Super-Cel·, Hersteller Johns-Manville Products Co.) filtriert Das Filtrat wurde auf pH 7 eingestellt und durch eine Säule von 21 des Kationenaustauscherharzes Amberlite· IRC-50 (NH«+-Form) geleitet wobei das aktive Produkt am Ionenaustauscherharz adsorbiert wurde. Das Harz wurde zuerst mit Wasser gewaschen und dann mit 5%igem wäßrigem Ammoniak eluiert Die aktiven Fraktionen (2,51) wurden zusammengegossen und durch eine Säule von 600 ml Aktivkohle für Chromatographiezwecke geleitet wobei die aktive Verbindung adsorbiert wurde. Die Aktivkohlesäure wurde mit Wasser gewaschen und dann mit einer wäßrigen 03 N HCl-Lösung eluiert Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, mit dem Anionenaustauscherharz Amberlite* IR 45 (OH--Form) neutralisiert und unter vermindertem Druck eingeengt Abschließend wurde das Konzentrat gefriergetrocknet, wobei 5,6 g eines rohen Pulvers, das etwa 30% Xylostasin enthielt, erhalten wurden.
Reinigung
Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe Produkt (9,6 g) wurde in Wasser gelöst und an einer Säule von 150 ml des Kationenaustauscherharzes Amberlite· CG-50 (NH4 +-FoITn) adsorbiert Nach einer Wäsche mit Wasser wurde die Säule mit 0,2N Ammoniakwasser eluiert Die aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und unter vermindertem Drude eingeengt Dem Konzentrat wurde Aceton zugesetzt Die gebildete Fällung wurde abfütriert Hierbei wurden 3JO g eines hellbraunen Pulvers mit einem Xylostasingehalt von etwa 90% erhalten. Dieses Pulver wurde in Wasser gelöst and an einer Säule (3 cm χ 90 cm) des
Kationenaustauscherharzes CM-Sephadex® C-25, NH4 + -Form, adsorbiert. Die Säule wurde dann mit wäßrigem Ammoniak unter Anwendung der Gradienten-Elution (von 0 bis 1,7 N) eluiert. Die aktiven Fraktionen, die Xylostasin allein enthielten, wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei 2,4 g weißes pulverförmiges Xylostasin erhalten wurden.
Herstellung des Sulfats
Eine wäßrige Lösung des in der oben beschriebenen Weise erhaltenen Xylostasins (freie Base) wurde mit 2 N Schwefelsäure auf pH 4 bis 5 eingestellt und durch eine Aktivkohlesäule geleitet. Die Säule wurde mit 0,03 N Schwefelsäure eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, mit dem Anionenaustauscherharz Amberlite» IR-45 (OH -Form) auf pH 6,0 eingestellt und unter vermindertem Druck eingeengt. Dem ^'>n*"*nir2t wurds Acs'or« Zugesetzt Die «*«>Ktj*in»n Fällung wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Hierbei wurde Xylostasinsulfat als weißes Pulver erhalten.
Beispiel 2
Ein flüssiges Medium (pH 7,2), das 3% Polypepton, 1% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacillus sp. V-7 geimpft, der auf Glycerin-Bouillon-Schrägagar gezüchtet worden war, worauf 40
OT Minuten unter Schütteln bei 280C bebrütet wurde. Die erhaltene Impfkultur wurde dann in einen 50-l-Behälter geimpft, der 301 eines Fermentationsmediums (pH 8) enthielt, das 1% Glucose, 0,7% Polypepton, 0,5% Fleischextrakt und 03% Natriumchlorid bei einer Inoculumgröße von 10% enthielt. Die Fermentation wurde 66 Stunden bei 28° C mit 100% Belüftung bei 200 UpM durchgeführt.
Der erhaltenen Fermentationsbrühe wurden 150 ml einer 4%igen wäßrigen Lösung eines Agglutinations mittels (Primafloc* C-7, Hersteller Rohm and Haas Co.) und 300 g Filterhilfsmittel (Hyflo-Super-Cel·) zugesetzt Das Gemisch wurde mit einer gesättigten wäßrigen Oxalsäurelösung auf pH I bis 2 eingestellt und filtriert Das Filtrat (241) wurde auf pH 8,5 bis 9,5 eingestellt und 30 Minuten mit etwa 1 % Aktivkohle gerührt wodurch die aktive Substanz im Filtrat fast ausschließlich an der Kohle adsorbiert wurde. Die Aktivkohle wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen und in 3 I 70%igem wäßrigem Methanol suspendiert Die Suspension wurde
so zur Extraktion der aktiven Substanz mit 4 N Salzsäure auf pH 2 eingestellt Die Aktivkohle wurde abfiltriert Das Methanol wurde vom Filtrat unter vermindertem Druck abdestilliert, worauf das Filtrat mit dem Anionenaustauscherharz Amberlite· IR-45 (OH-- Form) neutralisiert wurde. Die Lösung wurde auf pH 7 eingestellt und dann durch eine Kationenaustauschersäule (Amberlite· CG-50, NH4 +-FoITn) geleitet wobei die aktive Substanz adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit wäßrigem Ammoniak unter Anwendung der Gradienten-Ehrtion (Konzentration von 0 bis 10%) ehiiert Die aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Aceton zugesetzt wurde. Hierbei wurden etwa 5,7 g rohes Xylostasin (Xyfostasingehalt etwa 30%) erhalten.
„ . .
Reinigung
Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe Produkt (9,6 g) wurde der in Beispiel 1 beschriebenen
Behandlung unterworfen, wobei 2,5 g Xylostasin als weißes Pulver erhalten wurden.
Beispiel 3
Ein flüssiges Kulturmedium (pH 7,2), das 3% Polypepton, 1% Fleischextrakt und 0,5% Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacillus sp. Y-399 geimpft, der auf Glucose-Bouillon-Schrägagar gezüchtet worden war, und 40Stunden bei 28°C unter Schütteln bebrütet.
Mit der ImpfkuMur wurden 301 eines Fermentationsmediums (pH 7,5) geimpft, das 2% Dextrin, 0,5% lösliche Stärke, 1,2% Polypepton, 0,7% Fleischextrakt und 0,5% Magnesiumsulfat in einem 50-1-Fermenter bei einer InoculumgröQe von 10% enthielt. Die Kultivierung wurde bei 28" C, 100% Belüftung und 200 UpM durchgeführt. Das erhaltene Kulturmedium wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 22,1 g eines rohen Pulvers, das etwa 70%
to Xylostasin enthielt, erhalten wurden.

Claims (1)

  1. Patentansprüche;
    1. Xylostasin und dessen pharmakologisch unbedenkliche Salze mit Säuren.
    2, Verfahren zur Herstellung von Xylostasin, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus sp. Y-399 (ATCC-21932) oder BacUlus Sp. V-7 (ATCC-21933) oder daraus durch bekannte Techniken erhältliche Mutanten in einem wäßrigen Nährmedium unter
    aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 15 bis 35" C bzw, 15 bis 45° C und in einem pH-Bereich von 6 bis 9 kultiviert und das Xylostasin aus dem Kulturmedium isoliert
    3. Arzneimittel, enthaltend Xylostasin oder dessen Salze zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfsstoffen und Trägern.
DE19732326943 1972-05-31 1973-05-26 Xylostatsin Verfahren zu dessen Herstellung und Xylostatsin enthaltende Arzneimittel Expired DE2326943C3 (de)

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