DE2326943A1 - Neues aminoglykosid-antibiotikum - Google Patents

Description

PATENTANWALTc

DR.-ING. VON KREiSiER DR.-ING. SCHÖNWALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL.-CHEM. AtEK VON KREISLER DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-iNG. KLCiPSCH DIPL-ING. SELTiNG

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 21.$.1973 Kl/Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27* Doshomachi 2-chome, Higashi-ku., Osaka (Japan).

Neues Aminoglykosid-Antibiotikum

Die Erfindung betrifft ein als "XyT-ostasin¹¹ bezeichnetes neues Aminoglykosid-Antibiotikum, das nach der wissenschaftlichen Nomenklatur die Bezeichnung O-ß-D-Xylofuranosyl-(1-»» 5)-0-(a-2,6-diamino-2,6-didesoxy-D-glucopyra- , nosyl-(1 -*4-))-2-desoxystreptamin und die folgende Formel hat ϊ " '

CH₂NH₂

-0
HO

(V OH A 0

■ ^JH

HOH₂C

OH

Die Erfindung umfaßt ferner die pharmazeutisch unbedenklichen Salze von Xyloatasin mit Säuren sowie ein Vorfahren

,salzen

zur Herstellung von Xylostasin und seinen Säuren/duroh Kultivierung eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus·

Gemäß der Erfindung erfolgt die Herstellung der neuen Antibiotika nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der Xylostasin zu bilden vermag, in einem Kult-urmedium, das Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff, Quellen von verwertbarem Stickstoff und andere Nährstoffaktoren, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind, enthält, bebrütet, bis das Xylostasin¹ sich im Kulturmedium angehäuft hat, und das angehäufte : Xylostasin aus dem Kulturmedium isoliert.

Als Xylostasin bildende Stämme eignen sich für die Zwecke der Erfindung alle Stämme der Gattung Bacillus, die das gewünschte Antibiotikum zu bilden vermögen, und durch spontane und induzierte Mutation dieser Mikroorganismen erhaltene Mutanten. Um festzustellen, ob ein Mikroorganismus Xylostasin zu bilden vermag, kann beispielsweise die nachstehend beschriebene Auswahlmethode angewandt werden. . :

Sin Glucose-Bouillon-Medium wird mit Bacillus-Stämmen, die von den natürlichen Quellen dieser Stämme isoliert oder von Vorratskulturen dieser Stämme entnommen wurden, geimpft. Die Kultivierung wird 3 bis 4 Tage unter Schütteln bei 28⁰C durchgeführt« Nachdem bestätigt worden ist, daß das erhaltene Kulturmedium antibakterielle . Wirkung gegen einen geeigneten Testmikroorganismus, z.B. _; Bacillus subtilis, Escherichia coli oder Staphylococcus i

ι aureus, zeigt, werden etwa 20 ml des KuIturfiItrats mit Alkali auf ρττ 9 bis 10 eingestellt und dann durch eine , Aktivkohlesäule (0,2 g) geleitet. Die Säule wird mit etwa ΙΟ ml Wasser gewaschen und dann mit 10 ml O,1N HCl eluiert. Das Eluat wird neutralisiert und unter vermin- | dertem Druck eingeengt, Das Konzentrat wird durch Papier-! elektrophorese auf Filterpapier "Whatman" Nr. 1 (W. & R. Baiston Co., USA) in einem Boratpuffer (p_H 9,5, 0,025- ^: molar) bei einem Spannungsgradienten von 2 KV/56 cm für

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90 Minuten analysiert. Der Flecken von Xylostasin kann durch Bioautographic gegen einen geeigneten Mikroorganismus, z.B. Bacillus subtilis, sowie auch durch eine Farbreaktion unter Verwendung von Peptidreagens nachge-. wiesen werden. Das Xylostasin wird 5 bis 6 cm zur Kathode festgestellt.

Als Mikroorganismen eignen sich für das Verfahren gemäß der Erfindung beispielsweise Bacillus sp. Y-399 und Bacillus sp. V-7? die unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt sind:

Tabelle 1

	sp.	X-599	ATCG	IFO
Bacillus	sp.	V-7	21932	13321
Bacillus		21933	13320

ATCGs "American Type Culture Collection¹¹, Maryland, USA IFO: "Institute for Fermentation, Osaka", Osaka, Japan

Bacillus sp. Y-399 wurde von der Anmelderin vom Boden in Kyoto, Japan, und Bacillus sp. V-7 vom Boden in Tokyo, 'Japan, isoliert. Diese Mikroorganismen haben die nachstehend in Tabelle 2 genannten mikrobiologischen Eigenschaften.

Tabelle 2 ·

Eigenschaft " Bacillus sp. Bacillus sp. Y-399 V-7

a) Aussehen . ■ ;

1) Form und Größe Stäbchen, 0,8x2,A Stäbchen, 0,8x2,4

bis 3)4-^, mit abge- bis 3·,4 μ, mit i rundeten Enden abgerundeten j

End en ,

2) Pleomorphismus tritt einzeln und tritt einzeln

und paarweise auf und gelegentlich I

paarweise aur. !

309882/1368 ^!

Eigenschaft

Bacillus sp, 1-399

Bacillus sp« V-7

3) Beweglichkeit
und Flagellum·

4) Sporogeaese

5) ©ram-färbtmg

6) Säurefestig—
keit

beweglich, mit Peritricha

Sporen eliptisch oder zylindrisch, zentral bis subterminal. Sporangium gequollen und keulenförmig

unterschiedlich Bicirfe säurefest beweglich, mit Peritricha

Sporen eliptisch oder zylindrisch, zentral bis subterminal, Sporangium gequollen und keulenförmig

unterschiedlich nicht"säurefest

Ib) Wachstumsmerkmale

1) Bouillonagarplatte

2) Bouilion-Schrägagar

3) Bouillon

4) Kartoffel

5) Lackmusmilch

sich ausbreitend,

glatte flache Oberfläche, geschlossen durchscheinend, gelb und schleimig; Mikrokolonien sind beweglich«

mäßiges Wachstum, rhizoid, flach, glänzend, durchscheinend und sehr schleimig

mäßiges Wachstum, kein Oberflächenwachstum, trübe; Zellen sind gelb.

mäßiges Wachstum, sich ausbreitend, hellgelb

sich ausbreitend, glatte flache Oberfläche, glänzend,. geschlossen, durchscheinend, gräulichweiß und schleimig; bewegliche

mäßiges Wachstum, rhisoid, flach, glänzendj gräulichweiß und sehr schleimig

mäßiges Wachstum, kein Oberflächenwachstum, trübe 5 Zellen sind gräulich-weiß,

gutes Wachstum, sich ausbreitend, gräulich-weiß

neutral, peptoni- reduziert siert und reduziert

c) Physiologische Merkmale

1).Reduktion von nicht reduziert Nitraten

nicht reduziert

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Eigenschaft	Denitrierung	Bacillus spe Ϊ-399	schwach hydro- lysiert :	Bacillus ep. ; V-7 ■. .■.-■""...■■
2)	MR-Test	negativ	... keine Verwertung
5)	VP-Test '	negativ	keine Verwertung	negativ ■-"--■-.-
4)	Indo!bildung	negativ	negativ . .-..;
5)	nein	nein |
6)	Bildung von ja . Schwefelwasser stoff . ■.;:	i*;■■-;■ \\ : ;
7)	Hydrolyse von Stärke	schwach hydrolysiert
8)	Verwertung von Citrat	keine Verwertung
9)	Verwertung von Nitraten	- ■. - ■. ■ - - ι keine Verwertung ':i

10) Verwertung von
Ammoniak

11) Pigmentbildung

keine Verwertung Verwertung

12) tlrease-Aktivi-

tät ■:■-■■

15) Oytochromoxydase

Eeduktion von
Methylenblau

15) Casein-Hydrolyse

16) Verflüssigung
von Gelatine

17) P_H-Wert für .·■;
das Wachstum

Ein in Wasser unlösliches gelbes Pigment (carotinoid) wird intrazellulär gebildet«

negativ

fehlt im
wesentlichen

reduziert

positiv

verflüssigt

Wachstum bei ?„ 6 bis 9? optimales Wachstum bei pjj 8

keine Pigmentbildung

negativ vorhanden reduziert negativ verflüssigt

Wachstum bei pubis 9, optimales Wachstum bei pg

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Eigenschaft

Bacillus s.p. Y-399 Bacillus
1-7

sp,

18) Wachstumstemperatur

19) O₂-ReIation

Wachstum bei 15 bis Wachstum bei 15 bis 35 C, optimales 45 C, optimales Wachstum bei 30 O Wachstum bei 30 bis

37⁰C

aerob/ kein anaerobes Wachstum in Glücosebouillon aerob* kein anaerobes Wachstum in Glücosebouillon

20) Beständigkeit kein Wachstum bei kein Wachstum bei gegen Natrium- einer Konzentration einer Konsentration Chlorid von 5 % von 5 %

21) O-F-Test

22) Katalase

d) Fermentation von Kohlenhydraten

L-Arabinose D-XyIose D-Glucose D-Mannose D-Fructose D-Galactose Maltose Saccharose Lactose Trehalose D-Sorbit D-Mannit Inosit Glycerin Stärke

Weder Säure noch Gas wird aus D-Glucose oder aus Maltose gebildet«

schwach

Säure

Gas Weder Säure noch Gas wird aus D-Glucose gebildet«

schwach

Säure

Gas

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""⁷V -■ 2328943

Bin Vergleich der vorstehend genannten mikrobiologischen Merkmale mit den entsprechenden Angaben in Sergey's Manual of Determinative Bacteriology (7g Auflage) läßt darauf schließen, daß Bacillus sp» T-7 entweder zu Bacillus circulans gehört oder ein Stamm ist_? der mit Bacillus circulans eng verwandt ist«, Andererseits kann Bacillus sp. X-399 mit keinem der in der vorstehend genannten Literaturstelle beschriebenen Mikroorganismen identifiziert werden, vielmehr hat dieser Stamm eine groß© Ihnlichkeit mit dem in'der japanischen Patentveröffentlichung Fr₀ 98875/1971 beschriebenen Stamm IFG-13296 imd wird daher als au Bacillus vltellinus gehörend

Das ITe^fahren gemäß der Erfindung wird .-durchgeführt, indem des? Ijlostasin bildende Stamm in einem -geeigneten MediiÄ gebuchtet wirdo Geeignet sind Medien₉ die routinemäßig "bei der Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Bacillus verwendet werden. -So kann, das Medium als Kohlenstoff quellen Kohlenhydrate wie Glucose, Stärke_f Dextrin usw. und als Stickstoffquellen verschiedene organische und anorganische Stickstoffverbindungen, ζ,B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid_? Aminosäuren, Pröteinmaterialien usw.», enthalten. Diese Bestandteile des Nährmediums können allein oder in geeigneter Kombination verwendet werden. Außer diesen Bestandteilen kann das Medium ferner anorganische Stoffe wie Kalium, Natrium, Magnesium, Bisen, Phosphorsäure usw. und wachstumsfördernde Faktoren, z.B. Vitamine, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton und organische Säuren, enthalten. Der Mikroorganismus kann unter stationären Bedingungen gezüchtet werden, jedoch erfolgt die Kultivierung vorzugsweise unter Schütteln oder unter Belüftung und unter Rühren. Die Bebrütungstemperatur liegt im allgemeinen zwischen 20° und 37⁰C. Die Bebrütungsdauer kann etwa 24 bis 90 Stunden betragen. Es ist zu bemerken, daß die optimalen

Bedingungen von den Merkmalen des jeweils zu verwenden-3Q9882/13S3

den, Xylostasin bildenden Stamms abhängen und unter Berücksichtigung dieser Eigenschaften zu wählen sind.

Wenn ein Xylostasin bildender Bacillus-Stamm unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen gezüchtet wird, wird Xylostasin überwiegend im Kulturfiltrat gebildet. Wie die nachstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften zeigen, ist Xylostasin ein wasserlösliches . basisches Antibiotikum und kann daher nach den allge-. ; meinen Verfahren zur Isolierung von üblichen wasserlö's- '. liehen basischen Antibiotika einschließlich Neomycin, Paromomycin, Kanamycin u.dgl. isoliert werden.

Beispielsweise kann die Isolierung des Xylostasins vorge-^; noramen werden, indem das Kulturmedium über ein Adsorptionsmittel geleitet und die aktive Verbindung mit einem ^; geeigneten Elutionsmittel desorbiert wird, oder das Antibiotikum kann mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert werden. Zweckmäßiger ist das erstgenannte ; Verfahren. Insbesondere läßt sich das Xylostasin in Fällen, in denen das Kulturmedium unter Verwendung von Aktivkohle als Adsorptionsmittel gereinigt werden soll, leicht auf der alkalischen Seite adsorbieren. Als ; Elutionsmittel wird vorteilhaft eine wässrige Lösung, die auf einen p_H-Wert von weniger als 5', vorzugsweise von nicht mehr als 4-, eingestellt worden ist, oder ein ■ Lösungsmittel wie wässriges Aceton oder wässriger Alkohol; verwendet. Xylostasin kann auch unter Verwendung eines Ionenaustauschers als Adsorptionsmittel gereinigt werden. Als I onenaustauscher können Kationenaustauschharze, z.B. Amberlite IRC-50 (Rohm and Haas Co.) verwendet werden. Als Elutionsmittel werden im allgemeinen wässrige Lösungen einer Säure, eines Alkalis oder eines Salzes verwendet.

Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe pulverförmige Xylostasin kann durch Ionenaustauschchroma-

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tographie beispielsweise am Harz Dowex 1x2 (OH~-Forra)
(Dow Chemical Co.), Amberlite CG-5O (NH^-Form, Hersteller Rohm and Haas Co.) und CM-Sephadex (NH^-Form,
Hersteller Pharmacia Fine Chemicals, Schweden), weiter
gereinigt werden. Aus dem Eluat, das bei der Reinigung
unter Verwendung eines solchen Adsorptionsmittels
erhalten wird, wird Xylostasin beispielsweise durch
Eindampfen des Eluats zur Trockene vorzugsweise bei i niedriger Temperatur oder durch Zusatz eines mit Wasser,
mischbaren organischen Lösungsmittels zum Eluat und j Abtrennen der Fällung isoliert* Xylostasin wird in Form j eines Salzes mit einer Säure isoliert, wenn das Eluat j vor oder nach der Einengung mit einer Säure neutralisiert wird.

Xylostasin kann der biologischen Testung nach üblichen ;

Methoden, beispielsweise nach der Papierscheibenmethode :

unter Verwendung von Bacillus subtilis PCI 219 als ^[

Testmikroorganismus, unterworfen werden. ;

Das Antibiotikum gemäß der Erfindung hat die folgenden j physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaf- j ten: j

1. Xylostasin ist eine basische Substanz. Xylostasin,
sein Hydrochlorid und Sulfat sind weiße kristalline
Pulver. Xylostasin ist in neutraler oder alkalischer '

Lösung beständig, jedoch in saurer Lösung weniger
beständig. - ■ ~~\·

2. Xylostasin hat keinen scharfen Schmelzpunkt. Es i zersetzt sich unter Schäumen im Bereich von etwa I50 ! bis 180°C. j

3. Xylostasin ist in Wasser leicht löslich, in Methanol
wenig löslich und in organischen Lösungsmitteln wie
Aceton, Butanol, Äthylacetat, Benzol, Hexan, Äther
usw. unlöslich. - j

309882/1368 '

4. Das UV-Spektrum von Xylostasin zeigt keine charakteristische Absorption mit Ausnahme der Endabsorption.

5. Das InfrarotSpektrum von Xylostasin in Kaliumbromid zeigt für Aminoglucosid-Antibiotika charakteristische Absorptionsbanden in der Nähe von 3320, 2920, 1590,

—1 ^:

1465, I34O, 1100 und 1020 cm . Da jedoch keine

—1 ■

Absorption in der Nähe von 1652 cm - vorhanden ist, enthält das Molekül von Xylostasin offensichtlich keine Säureamidbindung.

6« Das NMR-Spektrum (in Dp^) ^von Xyl⁰⁸*⁹-³!*¹ zeigt die

folgenden charakteristischen Maxima: '

<J-Werte: 1,36 (q, 1H, axiales Methylenproton), 2,13 (m, 1H, äquatoriales Methylenproton), 5,44 (1H, J= </1, anomerisches Xyloseproton), 5»70 (d, 1H, J=3 4, anomerisches Proton von Neosamin C).

7« Optische Drehung von Xylostasin, gemessen in wässriger_: Lösung: /a/²^+ 34°.

8» Farbreaktionen: Xylostasin ist positiv in der Ninhy- = drin-Reaktion, beim Molisch-, Anthron- und Greig-Leaback-Test und negativ beim Sakaguchi-Test, Maltol-Test, Eisen(Ill)-chloridtest, Biuret-Test und Ehrlich-Test.

9. Die Elementaranalyse einer Xylostasinprobe, die 20 Stunden unter vermindertem Druck bei 110⁰O getrocknet worden ist, ergibt 44,18 % 0, 7,58 % H und 11,98 % N. Das Molekulargewicht (Neutralisations- \ .äquivalent) beträgt 451. ·

Strukturuntersuchungen ergeben die Bruttoformel G₁₇H₃₄N₄O₁₀ (berechnet: 44,93 % C, 7,54 % H, 12,33 % N, Molekulargewicht 454,49).

10. Xylostasin wandert bei der Papierelektrophorese etwa 5 bis 6 cm zur Kathode (Boratpuffer (p„ 9,5, 0,025-309882/1368

molar) auf Filterpapier Whatman Nr. 1 bei 2 kV/3.6 cm für 90 Minuten). , ·

11. Wenn Xylostasin 6 Tage der Methanolyse mit 0,4NHCl ■ in Methanol bei 22⁰C unterworfen wird, werden Methy1-D-Xylosid und Neamin gebildet. Wenn Xylostasin 6 Stunden mit 0,5N Schwefelsäure bei 90⁰C hydrolysiert wird, werden D-Xylose und Neamin im Hydrolysat nachgewiesen.

12. Das antibiotische Spektrum von Xylostasin ist nachstehend in Tabelle 3 genannt.

Tabelle

Hemmende Mindestkonzentrationen nach der Agar-Verdünnungsmethode ~~ - . -

Testmikroorganismus ■ hemmende Mindest

konzentration, pig/ml

Bscherichia coli IFO 304-4-Shigella flexneri EW-10 Proteus vulgaris IFO 304-5 Pseudomonas aeruginosa IFO 3080 Staphylococcus aureus FDA 209P Bacillus subtilis PCI 219 Bacillus cereus IFO 34-66

Bacillus brevis IFO 3331 c^ _s

Sarcina lutea IFO 3232 Mycobacterium avium IFO 3153 Mycobacterium avium (Streptomyciii-resistent) Mycobacterium avium (Neomycin-resistentj Mycobacterium phlei IFO 3158

Mycobacterium smegmatis IFO 3083 1,6 * ^!'

FDA: "Food and Drug Administration", Washington,

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6,	25·
12,	5
50
>50
6,	25
3,	125
50
25
	6
3,	125
>50
1,	6
%	6

- Ϊ2 -

PCI: "Penicillin Control and Immunology Section, Pood and Drug Administration", Washington, D.C, USA

Als Medien für den Test werden Boüillonagar für die gewöhnlichen Bakterien und Glycerin-Bouillonagar für säurefeste Bakterien verwendet.

13» Akute Toxizität: Die akute Toxizität von Xylostasin wurde an Mäusen bei intravenöser Injektion untersucht. Der LD|-Q-Wert für die freie Base beträgt etwa 1000 mg/kg.

14. Anti-Infektionstest mit Mäusen: Wenn eine wässrige Lösung von XyIostasin Mäusen unmittelbar nach einer Infektion mit Escherichia coli 0-111 in einer Einzeldosis von 10 mg/kg subkutan verabreicht wurde, wurde der Tod der Mäuse vollständig verhindert.

Xylostasin und seine pharmazeutisch unbedenklichen Salzemit Säuren sind wirksam gegen Infektionen durch Bakterien. Ihre Toxizität bei Warmblütern (z.B. Mensch, Maus und Ratte) ist äußerst gering. Die Verbindungen können daher unbedenklich und wirksam zur Behandlung von Infektionen durch Bakterien, z.B. Harnweginfektionen·, Bronchopneumie, Pyelitis und Mandelentzündung verwendet werden. Die Antibiotika gemäß der Erfindung können im allgemeinen parenteral verabreicht werden, jedoch ist auch eine

andere Verabreichung möglich. Die Dosierung wird zweckig
maß/in Abhängigkeit von den Symptomen der zu behandelnden Krankheit bestimmt und liegt beispielsweise im Bereich von etwa 10 bis 40 mg/kg Körpergewicht bei jeder Gabe. Die erfindungsgemäßen Antibiotika können in Form von üblichen Arzneimittelzubereitungen, z.B. Injektionslösungen* Tabletten und Salben, verabreicht werden.

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.Beispiel Λ

Ein flüssiges Medium (p_H 7,2), das 3 % Polypepton, j Λ % Fleischextrakt und 0,5 % Natriumchlorid enthielt, ί wurde mit Bacillus sp. 1-399, der auf- Glycerin-Bouillon- j Agar gezüchtet worden war, geimpft. Die Bebrütung wurde ! 40 Stunden unter Schütteln bei 28⁰G durchgeführt. Diese ^! Hinpfkultur wurde dann in ein Fermentationsmedium (30 1, '■ _P_H Ί>5) > das 1% Glucose, l'}o Polypepton, 0,7$ Fleischextrakt iitid 0,5^ Magnesiumchlorid enthielt, in einem'
!.)() i-Tatilc bei einer Größe des Inpculums von 1O#! geimpft.
Die Fermentation wurde 66 Stunuen bei 88°C, 100$ Belüftung und 200 UpM durchgeführt.

i Das erhaltene Kulturmedium wurde mit einer gesättigten

wässrigen Oxalsäurelösung auf p_H Ί bis 2 eingestellt
und dann mit einem Filterhilfsmittel (300 g Hyflo-Super-Cel, Hersteller Johns-Manville Products Go.) ! filtriert. Das Filtrat wurde auf p„ 7 eingestellt und i durch eine Säule von 2 1 des Kationenaustauscherharzes I "Amberlite IRG-50" (NH^-Form) geleitet, wobei das aktive! Produkt am Ionenaustauscherharz adsorbiert würde. Das j Harz wurde zuerst mit Wasser gewaschen und dann mit j 5%igem wässrigem Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen (2,5 1) wurden zusammengegossen und durch eine Säule von j 600 ml Aktivkohle für Chromatographiezwecke geleitet,
wobei die aktive Verbindung adsorbiert wurde. Die Aktivkohlesäule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit einer
wässrigen 0,3N HCl-Lösung eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegossen, mit dem Anionenaustauscherharz "Amberlite IR 4-5" (Hersteller Rohm and Haas Co.,
OH~-Form) neutralisiert und unter vermindertem Druck i eingeengt. Abschließend wurde das Konzentrat gefriergetrocknet ί wobei 5j6 g eines rohen Pulvere, das etwa
30 % Xylostasin enthielt, erhalten wurden.

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• Reinigung

Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe
Produkt (9,6 g) wurde in Wasser gelöst und an einer
Säule von I50 ml des Kationenaustauscherharzes "Amberlite CG-50" (Hersteller Rohm and Haas Co., NH^-Form)
adsorbiert. Nach einer Wäsche mit Wasser wurde die Säule
mit 0,2N Ammoniakwasser eluiert. Die aktiven Fraktionen
wurden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt. Dem Konzentrat wurde Aceton zugesetzt. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert. Hierbei wurden 5,0 g
eines hellbraunen Pulvers mit einem Xylostasingehalt von
etwa 90 % erhalten. Dieses Pulver wurde in Wasser gelöst
und an einer Säule (3 cm χ 90 cm) des Kationenaustauscherharzes "CM-Sephadex C-25, NH^-Form, adsorbiert. Die
Säule wurde dann mit wässrigem Ammoniak unter Anwendung ! der Gradienten-Blution (von 0 bis 1,7N) eluiert. Die
aktiven Fraktionen, die Xylostasin allein enthielten,
wurden zusammengegossen und unter vermindertem Druck ■■_ zur Trockene eingedampft, wobei 2,4 g weißes pulverförmig ges Xylostasin erhalten wurden*

Herstellung des Sulfats \

Eine wässrige Lösung des in der oben beschriebenen Weise ;

erhaltenen Xylostasins (freie Base) wurde mit 2N Schwe- |

feisäure auf ρ_Η 4 bis 5 eingestellt und durch eine ι

Aktivkohlesäule geleitet. Die Säule wurde mit 0,0j5N j

Schwefelsäure eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden !

zusammengegossen, mit dem Anionenaustauscherharz "Amber- ''

lite IE-45" (OH~-Form) auf p_H 6,0 eingestellt und unter |

vermindertem Druck eingeengt. Dem Konzentrat wurde ; Aceton zugesetzt. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert·

und unter vermindertem Druck getrocknet. Hierbei wurde \ Xylostasinsulfat als weißes Pulver erhalten.

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Beispiel 2 .

Ein flüssiges Medium (p_H 7,2), das 3 % Polypepton, 1 %

Fleischextrakt und 0,5 % Natriumchlorid enthielt, wurde · mit Bacillus sp. V-7 geimpft, der auf Glycerin-Bouillon-

Schrägagar gezüchtet worden war, worauf 4-0 Minuten unter '

Schütteln bei 28⁰C bebrütet wurde« Die erhaltene Impf- '

kultur wurde dann in einen 50 !-Behälter geimpft, der . 50 1 eines Fermentationsmediums (ph 8) enthielt, das 1%

Glucose, 0,7 % Polypepton', 0,5 % Fleischextrakt und ι

0,5 % Natriumchlorid bei einer Inoculumgröße von 10 % j

enthielt. Die Fermentation wurde 66 Stunden bei 28 0 mit '.

100 % Belüftung bei 200 UpM durchgeführt. !

Der erhaltenen Fermentationsbrühe wurden 150 ml einer - _:

4%igen wässrigen Lösung eines Agglutinationsmittels ;

(Primafloc C-7, Hersteller Rohm and Haas Co.) und 300 g i

FilteThilfsmittel (Hyflo-Super-Cel, Hersteller Johns- j

Manville Products Co.) zugesetzt. Das Gemisch wurde mit =

einer gesättigten wässrigen Oxalsäurelosung auf ρ_Η 1 bis !

2 eingestellt und filtriert. Das Filtrat (24 1) wurde !

auf P₁₁ 8,5 his 9»5 eingestellt und 30 Minuten mit etwa " ■

1 % Aktivkohle gerührt, wodurch die aktive Substanz im >

Filtrat fast ausschließlich an der Kohle adsorbiert ·

wurde. Die Aktivkohle wurde abgetrennt, mit Wasser gewä- j

sehen und in 3 1 70%igem wässrigem Methanol suspendiert. >

Die Suspension wurde zur Extraktion der aktiven Substanz ■

mit 4-N Salzsäure auf p_H .2 eingestellt. Die Aktivkohle '

wurde abfiltriert. Das Methanol wurde vom Filtrat unter !

vermindertem Druck abdestilliert, worauf das Filtrat mit ϊ

dem Anionenaustauscherharz "Amberlite IR-45"(0H~-Form) i

neutralisiert wurde. Die Lösung wurde auf p_H 7 einge- |

stellt und dann durch.eine Kationenaustauschersäule j

(Amberlite CG-50, NH^-Form) geleitet, wobei die aktive j

Substanz adsorbiert wurde. Die Säule wurde mit wässrigem !

Ammoniak unter Anwendung der Gradientsen-Elution (Konzen- ί tration von 0 bis 10 %) eluiert. Die aktiven Fraktionen

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wurden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt, worauf Aceton zugesetzt wurde. Hierbei wurden etwa 5,7 g rohes Xylostasin (Xylostasingehalt etwa 30 %) erhalten.

Reinigung

Das in der oben beschriebenen Weise erhaltene rohe Produkt (9,6 g) wurde der in Beispiel 1 beschriebenen Behandlung unterworfen, wobei 2,5 g Xylostasin als weißes Pulver erhalten wurden.

Beispiel 3

Ein flüssiges Kulturmedium (ρττ 7,2), das 3 % Polypepton, 1 % Fleischextrakt und 0,5 % Natriumchlorid enthielt, wurde mit Bacillus sp. Y-399 geimpft, der auf Glucose-Bouillon-Schrägagar gezüchtet worden war, und 40 Stunden bei 28 0 unter Schütteln bebrütet.

Mit der Impfkultur wurden 30 1 eines Fermentationsmediums (p_H 7,5) geimpft, das 2 % Dextrin, 0,5 % lösliche Stärke, 1,2 % Polypepton, 0,7 % Fleischextrakt und 0,5 % Magnesiumsulfat in einem 50 1-Fermenter bei einer Inoculumgröße von 10 % enthielt„ Die Kultivierung wurde bei 28⁰G, 100 % Belüftung und 200 UpM durchgeführt. Das erhaltene Kulturmedium wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 22,1 g eines rohen Pulvers, das etwa 70 % Xylostasin enthielt, erhalten wurden.

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Claims (2)

Patentansprüche

1. O-ß-D-Xylofuranosyl-(1 -r» 5)-0-/a-2,6-diamino-2_v6-didesoxy-D-glucopyranosyl--(1 -* 4}/-2-desoxystreptamin und seine pharmazeutisch unbedenklichen Salze mit Säuren.

2. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach Anspruch 1,· dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Gattung Bacillus, der das Antibiotikum zu bilden vermag, in einem Kulturmedium züchtet, das Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff, Quellen von verwertbarem Stickstoff und andere für das Wachstum des Mikroorganismus notwendige Nährstoffquellen enthält, bis das Antibiotikum sich angehäuft hat, und das Antibiotikum vom Kulturmedium isoliert.

J. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Bacillus sp. Y-399 (ATCG-21932) verwendet wird.

4-, Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Bacillus sp. V-7 (ATGG-21933) verwendet wird. .

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