DE1218660B - Herstellung der neuen Antibiotica Gentamycin sowie Begleitantibiotica BA-3 - Google Patents

Description

• Herstellung der neuen Antibiotica Gentamycin sowie Begleitantibiotica BA-3 Die Erfindung betrifft die Verwendung von Mikroorganismen zur Herstellung der neuen Antibiotica Gentamysin sowie Begleitantibiotica BA-3 auf mikrobiologischem Wege sowie deren Anreicherung, Iso-Lerung, Reinigung und Aufarbeitung.
• Die neuen Antibiotica werden hergestellt, indem man gewisse Arten der Gattung Micromonospora (Ordnung .ctinomycetales), insbesondere die Art Micromonospora purpurea und M. echinospora züchtet, bis sich antibiotisch aktive Substanzen gebildet haben, und aus der Kultur das Antibioticum isoliert, gegebenenfalls in seine Komponenten zerlegt und aufarbeitet.
• Die erfindungsgemäß durch Bebrütung geeigneter Micromonosporaarten gewonnenen neuen basischen Antibiotica werden als »Gentamicyn«' und »Begleitantibiotica des Gentamycins« bezeichnet.
• Kulturen der erfindungsgemäß vorzugsweise verwendeten Mikroorganismen wurden in der Kulturensammlung des Landwirtschaftsministeriums (Department of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research an Development Division, Peoria, Illinois, hinterlegt, wo sie unter ihren NRRL-Nummern allgemein erhältlich sind.
• Ein Stamm der Art Micromonospora purpurea n.sp. hat die NRRL-Nummer 2953 und wurde ursprünglich aus einer Parkerde-Bodenprobe aus Syracuse, NX., USA., isoliert. - M. purpurea zeichnet sich durch ein feines Mycel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,5 #L aus. Sie bildet kein echtes Luftmycel, bildet Einzelsporen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 1,0 #t an den Enden einfacher Sporophoren. Sie ist nicht säurefest, grampositiv, nährt sich von gewissen Protein- und Stärkesorten. Sie ist aerob und gedeiht gut im Bereich von 22 bis 37°C, aber nicht bei 46°C oder darüber. Die Form und orange Farbe ihrer Kolonien auf den meisten reichen Agarmedien sind typisch. Auf andern, stickstoffarmen Agarmedien ist die Farbe der Kolonien rötlichpurpur bis purpur. Dieses Rötlichpurpurpigment ist charakteristisch für frisch aus dem Boden isolierte Stämme. Es kann jedoch vorübergehend oder dauernd verlorengehen, wenn Stämme wiederholt isoliert und übertragen werden.
• Ein Stamm der Art Micromonospora echinospora n.sp. hat die NRRL-Nummer 2985 erhalten und wurde aus einer Schlammprobe in Jamesville, NX., USA., isoliert. M. echinospora zeichnet sich, wenn man sie in einem aus 0,05 °/o Hefeextrakt (Difco), 10/, Dextrose und 0,10/, Calciumcarbonat in destilliertem Wasser bestehenden Medium unter 30tägiger Bebrütung bei 28'C auf einer rotierenden Schüttelmaschine kultiviert, durch ein langes, verzweigtes, regelmäßiges, wandloses (= ohne Septum, »non-septate(t) Mycel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,5 p. aus. Sie ist purpurfarben und bildet reichlich Einzelsporen in Form endständiger Verbreitungen der Hyphenspitzen. Sowohl die Sporen als auch die Sporophoren sind charakteristisch keulenförmig (»clavate«). Die reifen Sporen sind annähernd kugelförmig und haben einen Durchmesser von etwa 1,0 bis 1,5 #t. Phasenkontrastmikroskopisch (bei tausendfacher Vergrößerung) betrachtet, erscheinen die Sporen rauhwandig. Elektromikrographien zeigen, daß die Rauheit auf Windungen zurückzuführen ist, die in regelmäßiger Anordnung aus der Sporenoberfläche hervorragen und gelegentlich eine Länge von 0,2 #t erreichen. (In diesem Medium und unter den genannten Bedingungen bildet M. purpurea anscheinend überhaupt keine Sporen.) M. echinospora nährt sich von gewissen Protein- und Stärkearten, ist aerob und gedeiht ebenfalls gut im Bereich von 22 bis 37°C, aber nicht oberhalb etwa 50°C. Wenn der genannte Mikroorganismus in ein Medium aus 0,30/, Rindfleischextrakt, 0,501, Tryptose, 0,10/0 Dextrose, 2,40/, löslicher Stärke, 0,5010 Hefeextrakt, 0,10/, Calciumcarrbonat und 1,50/0 Agar, das Ganze in Leitungswasser, unter 30tägigem Schütteln bei 28'C kultiviert wird, so kann er ein purpurfarbenes diffundierbares Pigment bilden. Die Eigenschaft, ein solches diffundierbares. Pigment zu bilden, kann. bei Stämmen, . die wiederholt . isoliert und übertragen wurden, vorübergehend Verlörengehen. (M. purpureä bildet in dem letztgenannten Medium im allgemeinen kein solches difiundierbares Pigment.) Zur Isolierung der genannten Mikroorganismen wird etwas von der betreffenden Boden- bzw. getrockneten Schlammprobe in sterilem destilliertem Wasser geschüttelt, und nach Herstellung geeigneter Verdünnungen wird die Suspension auf ein Agarmedium aufgestrichen. Das Medium enthält zweckmäßig 10/0 Glycerin, 0,2b/, Natriumnitrat, 0,1°/o Dikaliumhydrogenphosphat, 0,05 °/, Magnesiumsulfat, 0,05 °/, Kaliumchlorid, 0,0010/0 Ferrosulfat und 1,5 °/, Agar; vorzugsweise enthält es 0,5 °/, Tryptose, 2,0 °/, lösliche Stärke, .0,30/0 Calciumpropionat und 2,00/, Agar; alles in destilliertem Wasser.
• Die Kulturen werden auf antibiotische Aktivität geprüft, indem man sie zunächst bis zu 60 Tagen bei 26°C in dem folgenden Medium wachsen läßt: 0,3 °/, Rindfleischextrakt, 0,5010 Tryptose, 0,10/0 Dextrose, 2,4°.1o lösliche Stärke, 0,5°/o Hefeextrakt, 1,5 °/, Agar, alles in Leitungswasser. Dann extrahiert man den ganzen wäßrigen Ägar mit Butanol und engt den Butanol-Wasser-Extrakt ein. Durch das Butanol-Wasser-Gemisch wird genügend Antibioticum extrahiert, um ein Konzentrat zu liefern, das in einem Scheibentest das Wachstum von Staphylococcus aureus und Bachlus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aerugiriosaKlebsiella pneumoniae und Mycobacterium smegmatis verhindert. Eine antibiotische Aktivität gegen die gleichen Organismen läßt sich beobachten, wenn man 96 Stunden in - einem wäßrigen Medium submers bebrütet, das geeignete Nährstoffe enthält; z. B. ein Nährmedium, das 10/, Hefeextrakt, 10/, . Cerelose und 0,10/, Calciumcarbonat enthält, oder das in diesem Absatz weiter oben definierte Medium.
• - Tabellen I und 1I verglichen die vorstehend beschriebenen neuen mit gewissen bekannten Micromonosporaarten. Sofern sich in einzelnen Tabellenfeldern Striche befinden, bedeutet dies, daß entsprechende Daten entweder fehlen oder nicht in die Tabellen aufgenommen wurden.
• Die in Tabelle I aufgenommenen Koloniebeobachtungen wurden nach 14tägiger Bebrütung der betreffenden Medien bei 24 bis 26°C angestellt. Die gewählten Farbbezeichnungen beziehen sich auf die folgenden Systeme: Die jeweils erste Farbbezeichnung besteht aus einem Farbnamen gemäß dem »Descriptive Color Name Dictionary« von T a y 1 o r, K n o c h e und G r a n v i 11 e, herausgegeben durch die Container Corporation of America, 1950, in Verbindung mit einer diesem Namen entsprechenden Nummer, welche dem »Color Harmony Manual», 4. Auflage (1958), herausgegeben ebenfalls von der Container Corporation of America, entnommen ist; die zweite Bezeichnung besteht aus einem Farbnamen und einer Nummer gleicher Bedeutung, gemäß National Bureau of Standards (USA.), Circular 553 vom 1. November 1955.
• Tabelle II vergleicht die charakteristischen Eigenschaften. von Kolonien der erfindungsgemäß bevorzugt verwendeten und einiger bekannter Arten der Gattung Micromonospora bei Verwendung verschiedener Medien nach 14tägiger Bebrütung bei 26° C. Die Daten füi die bekannten Arten, mit denen die erfindungsgemäß verwendeten verglichen werden, sind aus Bergey's »Manual of Determinative Baeteriology«, 7. Auflage, 1957, herausgegeben von der Williams & Willcins Compäny, Baltimore; entnommen.
• Beispiele von Varianten, die sich von den oben beschriebenen Arten in untergeordneter Weise, z. B. morphologisch oder biochemisch, unterscheiden, sind zwei Varianten von M. echinospora, die als M. echinosDorav_ar. ferrugineaund M. echinospora vor. pallida bezeichnet wurden. Kulturen davon wurden ebenfalls in der Kulturensammlung des Landwirtschaftsministeriums (Department of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerka,. Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, USA., hinterlegt und sind dort unter ihren NRRL-Nummern 2995 und 2996 verfügbär. Diese Varianten wurden ebenfalls ursprünglich aus Schlammproben nahe Jamesville, NX., isoliert und sind taxonomisch gleich mit _M. echinospora mit den folgenden Unterschieden; M. echinospora vär. ferrugineä reduziert Nitrate nicht; gedeiht bei Verwendung von `Ribose als Kohlenstoff= quelle gut (sowohl M. echinospora- als auch M. echinospora vor. pallida gedeihen bei. Verwendung dieser . Pentose nur schlecht) : ihre Kolonien sind gewöhnlich rötlich- bis gelblichbraun gefärbt (mitunter werden sie bei zunehmendem Alter rötlich- bis purpurbraun), mitunter findet man auch kastanienbraunes Pigment im Mycel. Die Sporulation ist gewöhnlich gering, doch werden in manchen Medien (beispielsweise Tomatenmark-Hafermehl-Agar mit Zusatz von 0,10/, Natriumcarbonat) in alten Kulturen sowohl Sporen als auch Sporophoren mit der charakteristischen aufgerauhten .Wand gefunden. In dem letztgenannten Medium und auf Bennetts Agar ist das Wachstum gut; die Kolonie "ist faltig, und die Farbe ist mahagonirot-g6 1/z PI, tiefrotbraun-41.
• M. echinospora vor. pallida bildet auf Agarmedien kein dunkelpurpurnes Mycelpigment. Die Koloniefarbe auf den meisten Agarmedien bewegt sich in einem Bereich zwischen blaßorange und hellbraun (milchkaffeefarben). Auf Bennetts Agar und Tomatenmark-Hafermehl-Agar mit 0,1°/,igem Natriumcarbonatgehalt ist das Wachstum gut; die Kolonie faltig, Die Koloniefarbe auf dem erstgenannten Medium ist aprikosenfarben-g4GA, hellorange-52; im letztgenannten Medium zeigt die Peripherie .die gleiche Farbe; diejenige des Zentrums geht gegen schwarz.
• Die erfindungsgemäß verwendbaren Mikroorga. nismen liefern mit Hilfe der im folgenden beschriebenen Fermentationsverfahren antibiotisch aktive Sub. stanzen. Nach der Züchtung finden sich diese sowoh im Mycel als auch in der Brühe; nach Abtrennung des Mycels von der Brühe wird als Quelle zu ihre Gewinnung vorzugsweise das Mycel verwendet. Mai erhält zunächst Mischungen von Antibiotica.
• Aus papierchromatographischen Untersuchungei hat sich ergeben, daß die durch M. purpureä uni M. echinospora und deren Äquivalente gebildeter antibiotischen Substanzen aus mindestens drei Kor ponenten bestehen. Die Hauptkomponente wurdE »Gentamycin« genannt. Die andern isolierten Kompo nervten werden im folgenden als BA-3 (Fraktion A und BA-3 (Fraktion B) bezeichnet. Zur Bildung der antibiotischen Substanzen werden die Mikroorganismen in üblicher Weise bei einer Temperatur- von etwa 25 bis 40°C unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert, das eine assimilierbare Kohlen-Stoff- und Stickstoffquelle enthält. Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie Stärke, - Dextrin,' gewisse Zucker u. dgl.
• Geeignete Stickstoffquellen können sowohl organischer als auch anorganischer Natur sein, vorzugsweise sind es aber organische Produkte, wie Sojabohnenmehl, Peptone u. dgl.
• Die Bebrütung erfolgt bei einem pH im Bereich von etwa 6 bis 8 über einen Zeitraum von etwa 24 bis 48 Stunden. Gegen Ende dieser betreffenden Zeitspanne ist maximale Antibioticabildung erreicht.
• Das Mycel, das die Hauptmenge antibiotisch aktiver Substanzen enthält, wird abfiltriert und das Filtrat verworfen. Die gebildeten Antibiotica, die im Hinblick auf die quantitativen Verhältnisse kurz »rohes Gentamycin« genannt werden können, werden aus dem Mycel durch Extraktion mit einer Mineralsäure bei einem pH von etwa 2 abgetrennt. Die sauren Extrakte werden anschließend auf ein pH von etwa 6 gebracht und dann entweder durch ein Ionenaustauschharz, vorzugsweise vom Typ des Amberlit-IRC-50, geschickt,. oder sie werden in Form eines unlöslichen Salzes, z. B. des Helianthats, Reineckats oder Dodecylbenzolsulfonats (Santomerse-S-Salzes) ausgefällt. Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Amberlitharze - sowohl Anionenaustauscher als auch Kationenaustauscher - sind dem »Handbook of Chemistry and Physics«, 42. Auflage; Chemical Rubber Publishing Company, Cleveland, Ohio (1960), zu entnehmen.
• Wenn das »Harzverfahrenic angewandt wird, so schickt man die obenerwähnte Lösung des »rohen Gentamycins« bei -einem pH von 6 durch das Ionenaustauschharz und eluiert dann das rohe Gentamycin aus dem Harz mittels verdünnter Schwefelsäure. Das Eluat wird dann mit Natriumhydroxyd auf ein pH von etwa 10 gebracht. Durch Zugabe 'von Aceton werden anorganische Salze ausgefällt. Die überstehende Flüssigkeit wird auf ein pH von 4,5 gebracht und im Vakuum zu einer konzentrierten Lösung von rohem Gentamycinsulfat eingeengt. Dann versetzt man mit Methanol, wobei das rohe Gentamycinsulfat ausfällt.
• Wenn man das »Salzfällverfahren« anwendet, so behandelt man den neutralisierten (pH = 6) Mycelextrakt mit beispielsweise Santomerse-S und trennt die ausfallenden Salze durch Filtration ab. Der Niederschlag wird mit Wasser gewaschen und in Methanol gelöst. Die methanolische Lösung wird filtriert und dann durch ein Anionenaustauschharz, beispielsweise des Typs Amberlit-IRA-401 S, geschickt. Das Eluat wird konzentriert, mit Schwefelsäure auf ein pH von 4,5 gebracht und aus der so erhaltenen konzentrierten Lösung von Gentamycinsulfat dieses durch Zusatz von Methanol und Abfiltrieren des ausfallenden Niederschlags isoliert. Es kann durch Umfällen als unlösliches Salz und Regenerieren weitergereinigt werden.
• Das rohe Gentamycin, wie es bei dem Harzverfahren anfällt, kann entweder verwendet werden, wie es ist, oder man kann es in Gentamycin selbst und die »Begleitantibiotica« auftrennen. Wenn man nur das Gentamycin selbst herstellen will, so geschieht dies vorzugsweise durch fraktioniertes Ausfällen seines Santomerse-S-Salzes: Wenn auch die Begleitantibiotica BA-3 (Fraktionen A und B) isoliert werden sollen, so trennt man sie vorzugsweise aus einer konzentrierten methanöhschen Lösung des rohen Gentamycins durch Zusatz von Aceton ab (fraktionierte Fällung). [Hierbei macht man von der, verglichen mit BA-3 (Fraktion A) und BA-3 (Fraktion B), besseren Löslichkeit des Gentamycins in einer Mischung von Aceton und Methanol Gebrauch.] Nach Waschen des Niederschlags mit- Aceton und Trocknen besteht dieser im wesentlichen aus einer Mischung von BA-3 (Fraktionen A und B). - Eine andere Methode zum Abtrennen dieser Mischung von Gentamycin macht von der besseren Löslichkeit der Dodecylbenzolsulfonate dieser beiden Komponenten, verglichen mit dem entsprechenden Salz des Gentamycins, Gebrauch. Das Dodecylbenzolsulfonat des Gentamycins wird duröh Zusatz einer Santomerse-S-Lösung zu einer Lösung des rohen Gentamycinsulfats ausgefällt. Nach Abfiltrieren und Waschen des Filterkuchens (der zur Gewinnung gereinigten Gentamycins oder eines von dessen Salzen aufgearbeitet werden kann) werden die Filtrate vereinigt, die nun aus einer Lösung der Dodecylbenzolsulfonate von BA-3 (Fraktion A) und BA-3 (Fraktion B) bestehen, aus der diese beiden Komponenten isoliert werden können.
• -Aus- ihrer nach einer der beiden vorstehend beschriebenen Methoden erhaltenen Mischung können BA-3 (Fraktion A) und BA-3 (Fraktion B) einzeln papierchromatogräphisch isoliert werden: Die isolierten Antibiotica können in üblicher Weise aufgearbeitet z. B. in ihre Derivate, wie Salze und Umsetzungsprodukte mit Bisulfit-Additionsverbindungen von Aldehyden und Ketonen, übergeführt werden.
• Es ist bereits bekannt, ein-Antibioticum unter dem Namen' Mikromonosporin durch Züchtung' eines Mikroorganismus der Gattung Mikromonospora herzustellen. Die Eigenschaften des Mikromonosporin sind von den Erfindern W a k s m a n n- et ä1. in Soil Science, 54, S.281 bis 296 (1942), und Journal of Bacteriology, 53., S. 355 bis 357 (1947), beschrieben worden... Diese Beschreibung zeigt, daß das Mikromonosporin sich in allen Eigenschaften weitgehend von den neuen basischen Antibiotica (Gentamycin und Begleitantibiotica BA-3) unterscheidet. Zum Beispiel ist Mikromonosporin nicht basisch und über einem pH-Wert von 9 nicht stabil.
• In den folgenden Beispielen sind geeignete Verfahren zum Bebrüten der erfindungsgemäß bevorzugten Mikroorganismen, zum Extrahieren der antibiotischen Substanzen aus Mycel und zum Auftrennen dieser Substanzen in ihre Hauptkomponenten erläutert. In den folgenden Beispielen sind Prüfwerte der betreffenden antibiotischen Substanzen, ausgedrückt in Einheiten pro Milligramm, als Maßstab ihrer Aktivität angegeben, wobei als Einheit eine solche Menge Testsubstanz gilt, die erforderlich ist, um bei einer Scheibe von 13,5 mm Durchmesser eine Inhibitionszone von 18 mm zu bilden. Die Prüfung erfolgt mikrobiologisch nach einem. standardisierten Agar-Diffusionsprüfverfahren [»dic type«; vgl. Donald C. G r o v e und William A. R a n d e 11, »Assay Methods of Antibiotics - A Laboratory Manual«, New York (1955)] unter Verwendung von Staphylococcus aureus (ATCC 6538P) als Testorganismus.
• Es wird eine Kurve aufgenommen, indem man die erzielte Wirkung gegen die Dosierung der betreffenden antibiotischen Substanz (verdünnt in Phosphatpuffer bei pH = 8) in dem folgenden Medium aufträgt. Pepton ............................. 0,6°/o Pankreatisches Caseinhydrolysat ....... 0,40/0 Hefeextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,3% Rindfleischextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,15010 Dextrose ........................... 0,15% Agar ............................... 1,5% pH ................................ 6,6 Die verwendete Suspension des Testorganismus (Staphyloccos aureus) wird derart standardisiert, daß sie in einem Kolorimeter Licht mit einer Wellenlänge von 660 m#t zu 20 % durchläßt. Beispiel 1 Gewinnung von Gentamycin durch Bebrütung von M. purpurea im Laboratoriumsmaßstab A. Keimung Man fügt eine lyophilisierte Kultur von M. purpurea zu einem 300-ml-Schüttelkolben, der 100m1 des folgenden sterilen Mediums enthält: Bacto-Rindfleischextrakt . . . . . . . . . . . 3 g Tryptose ......................... 5 g Dextrose ........................ 1 g lösliche Stärke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 g Hefeextrakt ...................... 5 g Leitungswasser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ml*) *) In diesem und in ähnlichen Rezepten durch die ganze Beschreibung hindurch ist das Lösungsmittel (meist Wasser) einmal als absolute Menge, ein andermal mit dem Vorsatz »ad« angegeben. Obwohl dies, genau genommen, unterschiedliche Angaben sind, so können doch im Rahmen der für diese Rezepte erforderlichen Genauigkeit diese beiden Ausdrücke beliebig gegeneinander ausgetauscht werden. Man bebrütet den Kolben samt Inhalt 5 Tage bei 37°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280Touren pro Minute, 5 cm Rüttelbewegung).
• B. Fermentation (Bebrütung) Man überträgt je 25 ml des durch vorstehende Keimung erhaltenen Inoculums auf vier 2-1-Kolben, deren jeder 500 ml des folgenden Mediums enthält: Hefeextrakt ...................... 10 g Dextrose ........................ 10 g Calciumcarbonat . . :. . . . . . . . . . . . . . 1 g Leitungswasser ................... 1000 ml Man bebrütet die Kolben samt Inhalt 5 Tage bei 26°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine, sammelt die Kolbeninhalte, bringt eine aliquote Menge des Substrats mit 6n-Schwefelsäure auf ein pH von 2 und zentrifugiert. Dann sammelt man die überstehende Brühe, neutralisiert sie mit. 6n-Natriumhydroxydlösung und prüft die so erhaltene neutrale ahquote Probemenge nach der Agardiffusionsmethode auf ihre Aktivität gegen Staphyloccos aureus. Sie weist einen Präfwert von 15 bis 20 Einheiten pro Millimeter auf.
• C. Isolierung des rohen Gentamycins° in Form seines Sulfats aus dem Fermentationssubstrat Man stellt das pH des nach Teil B dieses Beispiels vorliegenden Substrats (etwa 21) mit 6n-Schwefelsäure auf 2 ein und filtriert unter Rühren und Verwendung einer Filterhilfe. Das pH des Filtrats stellt man mit 6n-Natriumhydroxydlösung auf 7,0 ein, schickt die so erhaltene neutrale Brühe durch eine mit 1 bis 10 g Amberlit-IRC-50 pro Liter Brühe beschickte Kationenaustauschersäule und verwirft das Eluat. Dann eluiert man die Säule mit Schwefelsäure bei einem pH von 2,0, bringt das dabei anfallende Eluat mit 6n-Natriumhydroxylösung auf ein pH von 7 und engt die so erhaltene Lösung im Vakuum auf etwa ein Zehntel ihres Volumens ein. Nun bringt man das pH mit 6n-Natriumhydroxydlösung auf 10,0 und fügt unter Rühren das vierfache Volumen an Aceton zu. Man kühlt die Mischung und filtriert. Das Filtrat bringt man mit 6n-Schwefelsäure auf ein pH von 5,0 und konzentriert es bei Zimmertemperatur im Vakuum bis zu einer Aktivität des Konzentrats von etwa 20000 Einheiten pro Millimeter. Dann fügt man unter Rühren das zehnfache Volumen an Methanol zu und filtriert das ausfallende Gentamycinsulfat ab. Es wird im V4kuum getrocknet. Gesamtausbeute etwa 100 mg mit einem Prüfwert von 343 Einheiten pro Milligramm im Agardiffusionstest gegen Staphylococcus aureus.
• D. Reinigung des isolierten rohen Gentamycins Man löst 15 g des vorstehend erhaltenen rohen Salzes (Prüfwert etwa 340 bis 450 Einheiten pro Milligramm) in 50 ml Wasser und schickt die Lösung durch eine Anionenaustauschersäule (Amberlit-IRA-400, OH-Form) von 38 mm Durchmesser und 61 cm Höhe. Dann wäscht man die Säule mit 21 Wasser, dampft das Eluat im Vakuum zur Trockne ein und löst den Rückstand in 50 ml Methanol. Die so erhaltene Lösung fügt man unter Rühren zu 11 Aceton hinzu, filtriert und wäscht den gebildeten Niederschlag mit Aceton. Das Filtrat dampft man zur Trockne ein, nimmt es in 50 ml Methanol auf, fügt die methanohsche Lösung unter Rühren zu 500 ml Äther, filtriert den entstehenden Niederschlag ab und wäscht mit Äther. Das Filtrat wird eingedampft, wobei als Rückstand etwa 3 g gereinigtes Gentamycin mit einem Prüfwert von 961 Einheiten pro Milligramm hinterbleiben.
• Gewinnung von BA-3 (Mischung von Fraktionen A und B) im Laboratoriumsmaßstab Man arbeitet nach den Teilen A bis C dieses Beispiels und folgt weiter dem Teil D des Beispiels bis zur Zugabe des Acetons zur methanolischen Lösung des konzentrierten Eluats. Der durch diese Zugabe entstehende Niederschlag besteht aus BA-3 (Mischung der Fraktionen A und B). Nach Waschen mit Aceton und Trocknen ist er für die vorliegenden Zwecke hinreichend rein.
• Die lyophilisierte Kultur von M. purpurea gemäß Teil A dieses Beispiels kann durch eine entsprechende Kultur von M. echinospora (oder von einer der Varianten M. echinospora var. ferruginea und M. echinospora var. pallida) ersetzt werden.
• Beispiel 2 Gewinnung von Gentamycin durch Bebrütung von M. purpurea in technischem Maßstab A. Keimung Die Keimung wird durchgeführt, wie im Beispiel 1 (Teil A) beschrieben.
• B. Bereitung des Inoculums' Man überträgt je 25 ml des durch vorstehende Keimung gewonnenen ersten Inoculums auf vier 2-1-Kolben, deren jeder 500 ml des für die Keimung verwendeten sterilen Mediums enthält. Man bebrütet die Kolben samt Inhalt 5 Tage bei 28'C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Touren pro Minute, 5 cm Rüttelbewegung), vereinigt die Kolbeninhalte und fügt je 25 ml des durch diese Vereinigung erhaltenen zweiten Inoculums zu zwanzig 2-1-Kolben, deren jeder 500 ml des folgenden sterilen Mediums enthält: Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 g Dextrose (Cerelose) .... . . . . . . . . . . . 40 g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 g Leitungswasser ................... 1000 ml Diese Kolben samt Inhalt bebrütet man 3 bis 5 Tage bei 28°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Touren, 5 cm Rüttelbewegung), vereinigt die Inhalte und überträgt die Brühe aseptisch in einen sterilen Inoculumkolben mit seitlichem Ansatzrohr (Gesamtvolumen: etwa 101).
• C. Tankfermentation Man überträgt die, wie vorstehend beschrieben, erhaltenen 101 Inoculum aseptisch in einen etwa 2401 fassenden Fermentationstank, der etwa 1851 eines nach dem folgenden Rezept bereiteten sterilen Mediums enthält: Bacto-Rindfleischextrakt . . . . . . . . . . . 600 g Bacto-Tryptose ................... 1000 g Dextrose (Cerelose) . . . . . . . . . . . . . . . 200 g lösliche Stärke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4800 g Hefeextrakt ...................... 1000 g Entschäumungsmittel auf Siliconbasis*) ........................ 100 ml Leitungswasser ................ ad 2001 Verwendet wurde das Handelsprodukt »Antifoamer GE 60« der General Electric Company, doch sind auch andere Entschäumungsmittel brauchbar. Vor dem Sterilisieren bringt man das pH auf 6,9 bis 7,0. Nun bebrütet man 20 bis 30 Stunden lang aerob (bis das kompakte Zellvolumen etwa 10 bis 15 % des Gesamtvolumens beträgt) unter den folgenden Bedingungen: Temperatur ................. 37°C Zufuhr an steriler Luft ....... etwa 1501 pro Minute Druck ...................... etwa 0,5 atü Bewegung .................. 180 Umdrehungen pro Minute Dann überträgt man den Inhalt des Fermenters aseptisch in einen etwa 25001 fassenden Fermentationstank, in dem sich etwa 1665l eines nach dem folgenden Rezept bereiteten sterilen Mediums befinden: Hefeextrakt ...................... 17 kg Dextrose ........................ 17 kg Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . 1,7 kg Entschäumungsmittel . . . . . . . . . . . . . . 400 ml Wasser ....................... ad 16651 Man bebrütet nun 24 bis 31 Stunden bei 35°C und 120 Umdrehungen pro Minute,. während man Luft mit einem Druck von etwa 0,5 atü in einer Menge von etwa 4251 pro Minute einführt.
• Gegen Ende dieser Behandlung erreicht die Wirksamkeit der gebildeten antibiotischen Substanzen ein Maximum, das im wesentlichen konstant bleibt. Das pH bleibt während der Bebrütung im wesentlichen im Bereich von 6,6 bis 7,4. Das kompakte Zellvoluinen erreicht einen konstanten Wert von 2 bis 2,5 ml. Der Prüfwert der gebildeten antibiotischen Substanz beträgt etwa 25 Einheiten pro Milliliter.
• D. Isolierung des rohen Gentamycins (als Sulfat) aus der Tankfermentation Man fügt 251:g Filterhilfe (Celite) zu den etwa 18501 Fermentationssubstrat, die nach Teil C dieses Beispiels vorliegen, und filtriert. Dann suspendiert man die Filterhilfe mit dem anhaftenden Mycel in etwa 3701 Wasser, stellt das pH mit 6n-Schwefelsäure auf 2 ein, rührt 15 Minuten lang, filtriert neuerlich und verwirft nun den Mycelkuchen. Das Filtrat wird durch Zusatz von 4n-Natriumhydroxydlösung auf ein pH von 7,0 gebracht und nach erfolgter Neutralisation durch eine 18 bis 201 Amberlit-IRC-50 in der Natriumsalzform enthaltende Kationenaustauschersäule geschickt. Das Eluat wird verworfen und das Harz mit Wasser gewaschen. Dann eluiert man mit 2n-Schwefelsäure und vereinigt die sauren Eluate. Man setzt das Efuieren fort, bis das pH des Eluats einen Wert von etwa 0,5 erreicht, und versetzt dann die vereinigten Eluate mit 2 n-Natriumhydroxyd, bis ein pH von etwa 7,5 erreicht ist. Darauf engt man im Vakuum bei einer Temperatur unterhalb 45'C auf ein Volumen von etwa 3,71 ein, bringt das pH des. Konzentrats mit 2n-Natriumhydroxydlösung auf 10,5, versetzt mit dem fünffachen Volumen Aceton, kühlt, filtriert die ausfallenden Salze ab und wäscht sie mit Aceton. Filtrat und Waschflüssigkeit werden vereinigt, mit 2n-Schwefelsäure auf ein pH von 4,5 gebracht und im Vakuum unterhalb 45°C auf 100 ml eingeengt. Dann versetzt man mit 11 Methanol, filtriert den gebildeten Niederschlag ab und verwirft das Filtrat. Der angefallene Niederschlag (rohes Gentamycinsulfat) wird in einer ausreichenden Wassermenge (100 ml) zu einer 20 °/oigen Lösung gelöst, das pH der Lösung mit 2n-Natriumhydroxydlösung auf 10,5 eingestellt und das fünffache Volumen Aceton hinzugefügt. Dann kühlt man, filtriert den gebildeten Niederschlag ab und verwirft ihn. Das pH des Filtrats wird mit 2n-Schwefelsäure auf 4,5 gebracht und im Vakuum auf 50 ml eingeengt. Dann setzt man 500 nml Methanol zu, filtriert den gebildeten Niederschlag ab, wäscht ihn mit kaltem Methanol und trocknet im Vakuum über Phosphorpentoxyd, wonach etwa 20 bis 30 g rohes Gentamycinsulfat mit einer Aktivität von etwa 500 Einheiten pro Milligramm erhalten werden, das im wesentlichen aus Gentamycinsulfat und den Sulfaten von BA-3 (Fraktion A) und BA-3 (Fraktion B) besteht.
• E. Alternativverfahren zur Isolierung des rohen Gentamycins (als Sulfat) Das Substrat von Teil C dieses Beispiels wird filtriert und das abfiltrierte Mycel in 3501 Wasser suspendiert. Dazu fügt man unter Rühren 6n-Schwefelsäure, bis das pH einen Wert von 2 erreicht hat. Dann filtriert man, wäscht das Mycel mit Wasser, vereinigt Filtrat und Waschflüssigkeit und bringt deren pH durch Zusatz von 4n-Natriumhydroxydlösung auf 6,5. Nun versetzt man mit 2 kg Diatomeenerde als Filterhilfe und mit 750 ml einer 30 °/oigen wäßrigen Lösung von Santomerse-S (Natriumdodecylbenzolsulfonat). Nach 15 Minuten langem heftigem Rühren filtriert man, wäscht den Filterkuchen mit Wasser, trocknet ihn teilweise an der Luft und suspendiert ihn dann in 401 Methanol. Nach 10 Minuten langem Rühren filtriert man ab, extrahiert den Filterkuchen neuerlich mit 401 Methanol, vereinigt die methanolischen Extrakte (Gesamtvolumen etwa 1,001) und schickt sie durch eine mit 5,01 Amberlit 401 S in Methanol (Harz in der Hydroxyform) bepackte Anionenaustauschersäule. Man wäscht die Säule mit 201 Methanol, vereinigt die Eluate, engt sie im Vakuum auf etwa 101 ein, filtriert, bringt das pH des Filtrats mit 2n-Schwefelsäure auf 7,0, engt dann weiter auf 400 ml ein und filtriert neuerlich. Das pH des Filtrats wird mit 2n-Schwefelsäure auf 4,5 eingestellt, dann versetzt man mit dem fünf- bis zehnfachen Volumen Methanol, filtriert das dabei ausfallende rohe Gentamycinsulfat ab, wäscht es mit Methanol und trocknet es bei 40 bis 60°C im Vakuum. Ausbeute: etwa 56 g (Prüfwert: 625 Einheiten pro Milligramm). F. Reinigung des isolierten rohen Gentamycinsulfats Man löst 55 g des gemäß Teil D oder E dieses Beispiels erhaltenen rohen Gentamycinsulfats in 101 Wasser, stellt das pH der Lösung mit 2n-Natriumhydroxydlösung auf 6,5 ein, versetzt mit 300 g Diatomeenerde als Filterhilfe und fügt dann unter Rühren 250 ml einer 30 °/pigen wäßrigen Lösung von Santomerse-S zu. Dann filtriert man, wäscht den Filterkuchen mit Wasser, trocknet ihn an der Luft, suspendiert ihn dann in 101 Methanol, rührt und filtriert ihn wieder ab. Man wiederholt die Methanolextraktion des Filterkuchens, vereinigt die Filtrate und schickt sie mit einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 500 ml pro Minute durch eine Anionenaus= tauschersäule, die 51 Amberlit-IRA-401 S (OH-Form) in Methanol enthält. Man wäscht die Säule mit 101 Methanol, vereinigt die Eluate, engt sie im Vakuum auf 11 ein und versetzt mit verdünnter Schwefelsäure, bis kein weiterer Niederschlag mehr ausfällt. (Nach einer vorteilhaften Modifikation kann man auch von der Schwefelsäure zufügen, bis ein pH von 4,5 erreicht ist, setzt dann unter Rühren 18 g Aktivkohlepulver zu, rührt weitere 15 Minuten, filtriert, wäscht den aus der Aktivkohle bestehenden Filterkuchen mit Wasser, vereinigt Filtrat und Waschflüssigkeit und fügt das Ganze zwecks Ausfällung des Gentamycinsulfats zu dem zehnfachen Volumen Methanol.) Das ausgefallene Gentamycinsulfat wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute etwa 37 g; Prüfwert etwa 780 Einheiten pro Milligramm.
• G. Herstellung von Gentamycin aus dem Gentamycinsulfat Man löst 10 g des gereinigten Gentamycinsulfats (aus Teil F dieses Beispiels) in 1500 ml Wasser und schickt die Lösung durch eine Anionenaustauschersäule, die 100 ml Amberlit-IRA-400 (OH-Form) enthält. Das Eluat wird eingeengt und lyophilisiert, wobei man etwa 6,7 g reines Gentamycin mit einem Prüfwert von etwa 1120 Einheiten pro Milligramm erhält.
• Gewinnung von BA-3 (Mischung von Fraktionen A und B) in technischem Maßstab Man arbeitet nach den Angaben der Teile A bis C, sodann des Teiles D oder E dieses Beispiels. Weiter folgt man dem Teil F dieses Beispiels bis zur Ausfällung des Niederschlags durch Zugabe der Santoinerse-S-Lösung. Das Filtrat von diesem Niederschlag wird mit dem Waschwasser vereinigt und durch eine Säule geschickt, die mit einem frisch regenerierten Anionenaustauscherharz (vorzugsweise Amberlit IRA-401 S, OH-Form) gefüllt ist. Das Eluat wird auf 150 ml eingeengt und tropfenweise unter Rühren zu dem zehnfachen Volumen Aceton zugefügt, wobei Salze ausfallen, die abfiltriert, mit Aceton gewaschen und verworfen werden. Das vereinigte Filtrat wird durch Einengen vom Aceton befreit, so daß eine wäßrige Lösung von BA-3 (Fraktion A) und BA-3 (Fraktion B) hinterbleibt. Die Lösung wird mit 2n-Schwefelsäure auf ein pH von 4,0 gebracht, filtriert, mit dem zehnfachen Volumen Methanol versetzt und der ausfallende Niederschlag abfiltriert, mit Methanol gewaschen und getrocknet. Die getrocknete, amorphe Substanz besteht im wesentlichen aus den Sulfaten von BA-3 (Fraktion A) und BA-3 (Fraktion B).
• Gewinnung von Gentamycin und BA-3 (Fraktionen A und B) durch Bebrütung von M. echinospora oder deren Varianten in technischem Maßstab Indem man die im Teil A dieses Beispiels erwähnte Keimung mit einer lyophilisierten Kultur von M. echinospora (oder einer von deren Varianten M. echinospora var. ferruginea und M. echinospora var. pallida) an Stelle von M. purpurea durchführt und sonst im wesentlichen den Verfahren dieses Beispiels folgt, gelangt man gleichermaßen zu Gentamycin bzw. BA-3 (Fraktionen A und B).
• Beispiel 3 Herstellung von Gentamycin-hydrochlorid Man löst 10 g gereinigtes Gentamycinsulfat (hergestellt nach Teil F von Beispiel 2) in 1500 ml Wasser, adsorbiert den gelösten Stoff, wie im Teil G des Beispiels 2 beschrieben, und stellt das pH des Eluats mit Chlorwasserstoffsäure auf 4,5 ein. Dann verdampft man die Lösung im Vakuum zur Trockne, löst den Rückstand in 125 ml Methanol und fügt 750 ml Aceton hinzu. Das hierbei ausfallende Gentamycin-hydrochlorid wird auf einem Filter gesammelt, mit Aceton gewaschen und im Vakuum bei 40 bis 60°C getrocknet. Ausbeute etwa 8,9 g; Prüfwert etwa 820 Einheiten pro Milligramm.
• Beispiel 4 Herstellung von Gentamycinhelianthat Man löst 6,4 g rohes Gentamycinsulfat (hergestellt nach Teil D oder E des Beispiels 2) in 65 ml Wasser und versetzt die Lösung mit einer 75'C warmen Lösung von 32 g Methylorange in etwa 300 bis 350 ml Wasser. Die Mischung wird unter Rühren auf 75°C erhitzt, heiß filtriert, das ausgefallene Hehanthat mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Es läßt sich aus heißem wäßrigem Methanol umkristallisieren, wobei man etwa 12,4 g rötlichbraune Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 265'C (Zersetzung) erhält.
• Analyse C 52,740/0, H 6,430/0, N 13,610/0, O 19,420/0, S 7,640/0.
• Das derart aus rohem Gentamycinsulfat hergestellte Helianthat kann untergeordnete Mengen der entsprechenden Salze der Begleitantibiotica BA-3 (Fraktion A) und BA-3 (Fraktion B) enthalten, doch ist die Herstellung des Helianthats in der angegebenen Weise immerhin als Reinigungsverfahren anzusprechen, da nach Umwandlung in das Hydrochlorid (durch Auflösen in 2n-Chlorwasserstoffsäure, Filtrieren durch Aktivkohle, Eindampfen des Filtrates, Hinzugabe des sechsfachen Volumens Aceton und Filtrieren sowie Trocknen des dabei ausfallenden Hydrochlorids) ein Produkt mit einem Prüfwert von 760 Einheiten pro Milligramm anfällt.
• Beispiel s Herstellung von Gentamycinreineckat Man löst 2,2 g rohes Gentamycinsulfat (hergestellt gemäß Teil D oder E von Beispiel 2) in 22 ml Wasser und fügt unter Rühren 82 ml einer gesättigten wäßrigen Reineckesalzlösung zu. Man rührt die Mischung 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur und läßt sie dann bei etwa 5°C über Nacht stehen. Dann wird der Niederschlag abfiltriert, mit Eiswasser gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Durch Umkristallisieren des Reineckats aus heißem wäßrigem Methanol gelangt man zu purpurfarbenen Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 270°C (Zersetzung).
• Analyse C 24,500/0, H 4,49°/0, N 22,10°/0, S 27,92°/o, Cr 9,520/0.
• Das so hergestellte Reineckat kann untergeordnete Mengen der entsprechenden Salze der Begleitantibiotica des Gentamycins enthalten, doch ist seine Herstellung immerhin ein Reinigungsschritt, da man bei Rückverwandlung in das Sulfat (durch Auflösen des . Reineckats in wäßrigem Methanol, Adsorbieren an einem stark basischen Anionenaustauscherharz, wie Amberlit IRA-401 S, Einengen des Eluats, Einstellen von dessen pH mit verdünnter Schwefelsäure auf 4,5, Zugabe des fünffachen Volumens Methanol und Abfiltrieren des Niederschlages) zu einem Produkt mit einem Prüfwert von etwa 700 Einheiten pro Milligramm gelangt.
• Beispiel 6 Herstellung des Natriumsalzes der Gentamycin-poly-N-methylen-sulfonsäure Man löst 16,4 g Gentamycinsulfat (erhalten gemäß Teil F von Beispiel 2) in 108 ml Wasser, fügt 30 g Natriumformaldehyd-bisulfit in Portionen von 100 bis 200 mg zu, rührt 30 Minuten lang, versetzt dann mit Triäthylamin, bis das pH auf 6,8 angestiegen ist, und setzt das Rühren noch 18 Stunden lang fort. Die so erhaltene Reaktionsmischung fügt man zu dem fünffachen Volumen Methanol und kühlt auf 5°C. Der ausfallende Niederschlag wird abfiltriert und zuerst mit Methanol, dann mit Äther gewaschen sowie an der Luft getrocknet, wobei man ein farbloses amorphes Pulver erhält.
• Zu einem noch reineren Produkt gelangt man folgendermaßen: Man löst 200 g Gentamycinsulfat [erhalten nach Beispiel 2, (F)] in 1,31 Wasser, fügt im Laufe von 20 Minuten 366 g Natriumformaldehydbisulfit in kleinen Portionen zu, stellt das pH mit 135 ml Triäthylamin auf 6,7 ein und rührt 16 Stunden bei Zimmertemperatur. Dann gießt man die Lösung unter Rühren in 7,51 Methanol, filtriert den Niederschlag ab und wäscht ihn mit Methanol. Filtrat und Waschflüssigkeit werden vereinigt und unter Rühren zu 9,81 Aceton gefügt; der sich bildende Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 178 g eines amorphen weißen Pulvers; Aktivität: 580 Einheiten pro Milligramm.
• Analyse C 26,440/0, H 6,180/0, N 5,540/0, S 14,660/0, Na 7,49 0/0.
• Gesamtaschegehalt: 22,2 0/0: Physikalische und chemische Eigenschaften der nach den Beispielen gewonnenen Antibiotica Gentamycin, hergestellt wie oben angegeben, ist ein amorphes weißes Pulver mit den folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften: I. Schmelzpunkt (im Kofler-Block) Erweicht bei 102°C; vollständig geschmolzen bei 1080c. II. Analysenergebnisse a) Elementaranalyse C 50,20, H 8,52, N 13,47, O 27,810/, (Differenzwert); keine anderen Elemente enthalten.
• b) Qualitative und quantitative Gruppenbestimmung 1. Methoxygruppen ... keine 2. N-Methylgruppen... 2,750/, 3. `C-Methylgruppen ... 2,970/" 4. Van Slyke-Stickstoff 10,180/, 5. Ninhydrintest ...... positiv 6. Elson-Morgan-Test (Aminozucker) ..... positiv 7. Maltoltest .. . . .. . . . negativ (keine Maltolbildung nach Erhitzen mit Alkali) B. Furfuroltest ....... negativ (keine flüchtigen ultraviolettabsorbierenden Produkte bei Erhitzen mit 40 °/jger wäßriger Schwefelsäure auf 100°C) 9. Sakaguchitest (auf Guanidine) .... negativ III. Molekulargewicht Berechnet (Voraussetzung: 1 N-CH, pro Molekül) 545 Gefunden (ebullioskopisch in Methanol) . . . . . . . . 543 IV. Optische Drehung (1"/, in Wasser). V. Löslichkeit Äußerst gut löslich in Wasser, löslich in polaren Flüssigkeiten, wie Pyridin und Dimethylformamid, sowie in sauren Flüssigkeiten unter Salzbildung; mäßig löslich in Methanol, Äthanol und Aceton; unlöslich in Äther, Benzol und Halogenkohlenwasserstoffen.
• VI. Ultraviolettspektrum Vollständig durchlässig im Bereich von 220 bis 400 m#x.
• VII. Infrarotspektrum F i g. 1 der Zeichnungen stellt das Spektrum in Nujol (Nujol. ist eine Handelsmarke für ein Mineralöl auf Kohlenwasserstoffbasis, hinreichend rein für die Infrarotspektroskopie) dar, wobei Z die Wellenlänge in p,, v die Frequenz in cm-1 und A die Absorption bedeutet. Die Absorptionsmaxima (sches = schwach, m = mittel, m-st = mittel bis stark, st = stark, sst = sehr stark, Sch = Schulter) befinden sich bei den folgenden Wellenlängen:

  A (#t) Intensität

  3,00 m-st

  3,10 Sch

  3,25 Sch

  3,42 st

  4,30 sches

  6,35 m

  6,85 st

  7,25 in-st

  7,50 Sch (breit)

  7,80 Sch

  8,77 sches

  9,06 m (breit)

  9.,52 st

  9,78 st

  10,45 in-st

  11,58 sches

  VHL Salzbildung Gentamycin ist eine mäßig starke Base, die mit allen starken organischen und anorganischen Säuren Salze bildet. Die Mineralsäuresalze sind im allgemeinen vollkommen wasserlöslich. (Man erhält die Salze durch Einengen ihrer wäßrigen Lösungen und Ausfällen durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, vorzugsweise eines aliphatischen Alkohols oder Ketons.) A. Hydrochlorid Schmelzpunkt 194 bis 209'C (Zersetzung) Optische Drehung (10/, in Wasser) Elementaranalyse C 35,47 0/0, H 7,27 %, N 9,69 0/0, 0 22,46 0/0, Cl 24,90 °/o.
• Löslichkeit sehr gut löslich in Wasser und Methanol; etwas löslich in Äthanol; unlöslich in anderen üblichen organischen Lösungsmitteln

  Infrarotspektrum (in Nujol)

  (s. F i g. 2 der Zeichnungen):

  A (#4) 1 Intensität

  3,00 in-st

  3,45 st

  4,27 geh

  4,95 sches

  6,27 m-st

  6,64 Sch

  6,54 st

  7,27 st

  7,58 sches

  7,95 Sch

  8,27 sches

  8,95 sches (breit)

  9,20 m (breit)

  10,25 Sch (breit)

  10,98 sches

  11,49 sches (breit)

  13,90 m

  B. Sulfat Schmelzpunkt 218 bis 237°C (Zersetzung) Elementaranalyse C 31,220/" H 6,57-/" N 8,469/" O 41,630/" S04 31,22 °/o.
• Optische Drehung (10/, in Wasser)

  Infrarotspektrum (in Nujol)

  (s. F i g. 3 der Zeichnungen):

  Stärke

  2,95 -> 3,25 st (breit)

  3,45 sst

  4,27 Sch

  4,80 schw (breit)

  6,14 m-st

  6,55 m-st

  6,86 st

  7,26 st

  7,45 Sch

  7,77 schw

  8,70 -@ 9,75 sst (breit)

  10,27 m

  11,38 schw

  13,88 m

  C. Sonstige Salze Gentamycin kann durch Einwirkung entsprechender Säuren (oder deren löslicher Salze) in wäßrigem Milieu in unlösliche oder schwerlösliche Säureadditionssalze übergeführt werden. Wenn das betreffende Säureanion pharmazeutisch tragbar ist, so wird durch eine solche Salzbildung das Gentamycin für die therapeutische Verabreichung in Form wäßriger oder öliger Suspensionen geeignet. Derartige Zubereitungen haben infolge der langsamen Freigabe des Antibioticums bei parenteraler Verabreichung eine Depotwirkung. Im allgemeinen bilden Fettsäuren mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen derartige Gentamycinsalze mit verminderter Löslichkeit. Beispiele solcher Säuren sind Laurinsäure, Stearinsäure, Palmitinsäure, Ölsäure u. dgl. Auch andere Säuren verhalten sich jedoch ähnlich, indem sie mit dem Gentamycin Salze bilden, in denen dessen hydrophile Eigenschaften durch die hydrophoben Eigenschaften des betreffenden Säureanions ganz oder teilweise kompensiert sind; solche andere Säuren sind z. B. arylsubstituierte Fettsäuren, wie Phenylbuttersäure; aromatische Carbonsäuren, wie Naphthalin-l-carbonsäure; substituierte Schwefelsäuren und Sulfonsäuren, wie Laurylschwefelsäure bzw. Dodecylbenzolsulfonsäure; ferner Cholsäure, Fernholzsäure und verwandte Verbindungen, wie Tannin (Y)tannic acid«).
• IX. Verschiedene Eigenschaften 1. Keine Reaktion mit 1,8normaler methanolischer Chlorwasserstoffsäure bei 2stündigem Rückfließenlassen; Ausgangsmaterial unverändert rückgewonnen.
• 2. Durch Hydrolyse mit 6 n-Chlorwasserstoffsäure (15 Minuten bei 140°C) geht die antibiotische Aktivitat des Gentamycins vollständig verloren; bei Verwendung von 2 n-Chlorwasserstoffsäure ist hierfür 7stündiges Erhitzen auf 100°C erforderlich.
• 3. Stabilität: Die Aktivität des Gentamycins ändert sich nicht wesentlich, wenn man es im pH-Bereich von 2 bis 12 in wäßriger Lösung 30 Minuten auf 100° C erhitzt.
• 4. Sonstige Derivate: Gentamycin wird wie andere primäre Aminogruppen enthaltende Antibiotica durch Einwirkung von Natriumformaldehyd-bisulfit (vorzugsweise auf Gentamycinsulfat )in N-Methylensulfonsäurederivate übergeführt. 7e nach dem p11 des Mediums, aus dem das Derivat isoliert wird, ist es die betreffende freie Methansulfonsäure oder ein Salz von dieser. Das Ausmaß, in dem die primären Aminogruppen des Gentamycins hierbei substituiert werden, hängt von der Menge angewandter Formaldehyd-Natriumbisulfit-Additionsverbindung ab. Die Herstellung desjenigen Derivats von Gentamycin, in dem seine primären Aminogruppen vollständig durch N-Methylensulfonsäurereste substituiert zu sein scheinen, ist im Beispiel 6 beschrieben. Die Eigenschaften dieses Derivates sind wie folgt: löslich in Wasser, unlöslich in Methanol; (1 °/o in Wasser); Infrarotabsorptionsbanden bei 2,90 #L (st), 6,08 #t (m-st), 6,50 u (Sch), 8,72 a (sst) und 9;62 #t (st).-Analoge Sulfonatderivate erhält man durch Einwirkung von Bisulfit-Additionsverbindungen aliphatischer oder aromatischer Ketone oder Aldehyde auf das Gentamycin. Alle diese Derivate weisen, verglichen mit dem Antibioticum selbst, unterschiedliche theräpeutische Indizes auf.
• X. Papierchromatographische Daten Papierchromatographische Untersuchungen haben gezeigt, daß das Gentamycin von allen anderen be:. kannten basischen Antibiotica verschieden ist. Die Untersuchungsergebnisse mit sieben verschiedenen Lösungsmittelsystemen, aufsteigend, sind in Tabelle III an Hand der ermittelten RT-Werte festgehalten. (Zwei Zahlenwerte innerhalb eines Tabellenfeldes bedeuten, wenn sie durch einen Bindestrich verbunden sind, einen zusammenhängenden Strich; ohne einen solchen bedeuten sie getrennte Flecken.) Die durch bekannte Mikrömonosporaarten gebildeten Antibiotica unterscheiden sich vom Gentamycin dadurch, daß sie keine Basen sind, keine antibiotische Breitspektrumwirkung haben und sich nicht mit Hilfe eines Harzes vom Typ Amberlit IRC-50 extrahieren lassen.
• BA-3 (Mischung der Fraktionen A und B), hergestellt wie oben beschrieben, zeigt die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften: . I. Analysenwerte a) Qualitative Elementaranalyse C, H, N, O; keine anderen Elemente. b) Qualitative Gruppenbestimmungen 1. Ninhydrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . positiv 2. Elson-Morgan ............... positiv 3. Maltol ...................... negativ 4. Furfurol..................... negativ 5. Sakaguchi ................... negativ 6. Methoxygruppen . . ..... ....... negativ II. Löslichkeit Ähnlich der von Gentamycin.
• III. Ultraviolettspektrum Durchlässig im Bereich von 220 bis 400 m#t. IV. Salzbildung Sulfat: weißes amorphes Pulver; löslich in Wasser, unlöslich in Äthanol, Methanol, Aceton und anderen üblichen organischen Lösungsmitteln.
• V. Papierchromatische Daten Zeigt die gleichen RF-Werte wie Gentamycin in den Systemen A, B, C, D, F und G (s. Tabelle III). Im Lösungsmittelsystem E erfolgt eine Auftrennung, wobei BA-3 (Fraktion A) einen RF-Wert von 0,15 und BA-3 (Fraktion B) einen solchen von 0,23 hat (gegenüber einem RF-Wert des Gentamycins von 0,45). Biologische Eigenschaften der nach obigen Beispielen erhaltenen Antibiotica Gentamycin hat ein breites antibakterielles und antirickettsielles Wirkungsspektrum. Es ist als antiinfektiöses Mittel brauchbar und verhindert gewisse Krankheitserscheinungen, die durch Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae und andere pathogene Organismen verursacht werden. Es ist auch zur Behandlung von Rindermastitis verwendbar.
• Besonders wirksam ist es für die Bekämpfung von Infektionen der Harnwege, die durch gramnegative Organismen, wie gewisse Proteus- und Pseudomonasarten, verursacht werden. Bekanntlich ist die Anzahl von Krankenhausinfektionen durch gramnegative Organismen im Steigen begriffen. Gentamycin scheint besonders zur Behandlung solcher chronischer gramnegativer Infektionen der Nieren und Blase geeignet zu sein, und zwar auch in hartnäckigen Fällen. Die hohe antibiotische Aktivität von Gentamycin gegen Proteus- und Pseudomonasinfektionen macht es leicht klinisch verwendbar. Beispielsweise wurde Gentamycin erfolgreich zur Behandlung einer chronischen Pseudomonas-Niereninfektion bei einer Dosis von 1 mg pro Kilogramm, dreimal täglich,- verwendet. Diese Infektion, die auf andere Therapiearten nicht gut ansprach, wurde aus dem Urin schon nach 1tägiger Behandlung vollständig beseitigt, ohne innerhalb von 10 Tagen wieder aufzutreten. Ähnliche Ergebnisse wurden bei mehreren Proteusinfektionen erzielt. Ersichtlich vereinigt Gentamycin in vorteilhafter Weise verschiedene Arten von Aktivität auf sich, was in Verbindung mit geringer Toxizität bewirkt, daß es in manchen Fällen anderen Antibiotica vorzuziehen ist.
• Die antibiotische Aktivität von Gentamycin beträgt 1120 Einheiten pro Milligramm, diejenige seines Hydrochlorids 820, diejenige seines Sulfats 800 Einheiten pro Milligramm.
• Tabelle IV vergleicht die In-vitro-Aktivität von Gentamycin gegen eine Anzahl grampositiver, gramnegativer und säurefester Organismen mit der Wirksamkeit zweier bekannter Antibiotica, nämlich Kanamycin und Neomycin. Die Anfälligkeit der Mikroorganismen gegen die Antibiotica wurde nach normierten Rohrverdünnungsverfahren ermittelt: Als Inoculum wurden durchweg Verdünnungen auf 10-s von 24 Stunden alten Brühekulturen verwendet, wobei die Endprodukte nach 24stündiger Bebrütung bei 37°C aufgenommen wurden. Wo nicht anders angegeben, besteht das Nährmedium aus Hirn-Herz-Infusionsbrühe (Difco). In den Tests wurden die Sulfate der betreffenden Antibiotica verwendet, doch ist die minimale Inhibitionskonzentration umgerechnet auf die entsprechende Menge reinen basischen Antibioticums.
• Es wurde auch die In-vivo-Aktivität gegen gewisse bakterielle Infektionen von Mäusen geprüft. Die Mäuse wurden mit einem Inoculum der betreffenden Bakterien durch intraperitoneale Injektion infiziert und wurden dann zweimal täglich mit subkutanen Injektionen von Gentamycinsulfat (724 Einheiten pro Milligramm), gelöst in Wasser, behandelt. Tabelle V zeigt, welche Dosis jeweils erforderlich ist, um einen bestimmten Prozentsatz so behandelter Tiere zu schützen.
• Die akute Toxizität des Gentamycins wurde an Mäusen nach verschiedenen normierten Verfahren geprüft. Bei Verwendung des obigen Gentamycinsulfatpräparates an Mäusen mit einem Gewicht von 18 bis 20 g wurden die folgenden Ergebnisse erzielt:

  Verabreichungsweise LD5o (mg/kg Maus)

  subkutan................. 675

  intraperitoneal . . . . . . . . . . . 550

  intravenös................ 75

  oral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . > 10 000

  Gentamycin zeigt außerdem bei In-vivo-Versuchen eine antivirale Aktivität gegen Rickettsia akari. Gruppen 6 Tage alter befruchteter Hühnereier wurden je mit der 50fachen LDSO-Dosis Rickettsia akari infiziert. Eine einfache Gabe von 3,0 mg Gentamycin, 3 Stunden vor der Infektion verabreicht, gewährleistet einen 50 °/oigen Schutz (PDSO). Ein 20 °/oiger Schutz wird erreicht, wenn die Gentamycinbehandlung 2 Stunden nach der Infektion beginnt. - In Mäusen, die intracerebral mit etwa der 450fachen LD5o-Dosis von Rickettsia akari infiziert wurden, wird ein 100 °/oiger Schutz bei subkutaner Verabreichung von 5 mg Gentamycin 4 Stunden vor der Infektion, gefolgt von 2 # 2,5 mg pro Tag, verabreicht durch 4 Tage hindurch, erzielt. Wenn man mit der Gentamycinbehandlung bis 48 Stunden nach der intracerebralen Infektion wartet, so erreicht man noch einen 100 °/oigen Schutz bei subkutaner Verabreichung von zweimal 5 mg täglich durch 5 Tage hindurch.
• Gentamycin und seine Salze sind ferner in Mäusen gegen den Stamm H 37 RV von Mycobacterium tuberculosis therapeutisch wirksam.
• BA-3: An der gelösten Mischung mit einem Prüfwert von 10 Einheiten pro Milliliter (Prüfwert ermittelt wie bei Gentamycin) läßt sich eine antibiotische Aktivität gegen Staphylococcus aureus, Streptococcus fecalis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Sahnonella schottmuelleri, Pseudomonas aeruhinosa und Klebsiella pneumoniae feststellen; die Mischung scheint jedoch gegen Rickettsia akari in Mäusen bei einer täglichen Dosis von 10 mg inaktiv zu sein. Ihre antibiotische Aktivität (bestimmt wie die des Gentamycins) beträgt etwa 200 Einheiten pro Milligramm.

  Tabelle III

  Vergleich der RF-Werte des Gentamycins mit denjenigen anderer basischer Antibiotica in verschiedenen

  Lösungsmittelsystemen

  Antibioticum R.-Werte bei Anwendung von Lösungsmittelsystemen'@` . . .

  A I B C I D I E I F G

  Gentamycin............. 0,59 0,26 0,1 j 0,3 0,45 0,0-0,25 0,0-0,48

  Neomycin . . . . . . . . . . . . . . 0,22 0,12 0,29 0,0 0,05 0,0-0,13 0,0-0,50

  0,20

  Kanamycin . . . . . . . . . . . . . 0,30 0,18 0,25 0,0-0,35 0,15 0,02 0,76

  i 0,25

  Neamin ................ 0,30 - - - 0,30 0,05 0,75

  Streptomycin............ 0,57 0,40 0,21 0,06 0,03 0,0 0,0-0,33

  0,19

  Streptothricin . . . . . . . . . . . 0,36 0,30 0,27 0,27 0,09 0,0 0,18

  Paromomycin . . . . . . . . . . . 0,33 0,11 0,38 0,0 0,03-0,29 0,03 0,25

  Viomycin . . . . . . . . . . . . . . . 0,27 0,19 0,51 - 0,0 -0,25 0,0 0,43-0,65

  Dihydrostreptomycin..... 0,53 0,36 0,18 - 0,03-0,3 0,0 0,22

  0,45

  Systeme:

  A: 80II/o wäßriges Methanol -h 3 % NaCl, Papier mit Sulfat-bisulfat auf ein pH von 2,3 gepuffert.

  B: Propanol-Pyridin-Essigsäure -Wasser(15:10:3:12).

  C: Propanol-Wasser-Essigsäure (50:40:5).

  D: 80o/oiges wäßriges Phenol.

  E: Wassergesättigtes n-Butanol mit 2o/oigem Gehalt an p-Toluolsulfonsäure.

  F: Butanol -Wasser (84:16) -f- 2 % Piperidin.

  G: Wasser -Butanol(94:6) -h 0,25o/op-Toluolsulfonsäure.

  Tabelle IV

  Antibiotisches Spektrum (In-vitro-Aktivität) von Gentamycin, verglichen mit Kanamycin und Neomycin

  Behandelter Mikroorganismus Gentamycin I Kanamycin I Neomycin

  Minimale Inhibitionskonzentration

  Systematischer Name Stammbezeichnung * inug/ml

  Grampositive Organismen

  Bacillus cereus var. mycoides.................... . DA 30 0,5 8,0 0,5

  Bacillus cereus var. mycoides.................... DA 34 0,5 1,5 0,5

  Bacillus cereus var. mycoides.................... ATCC 7064 0,75 3,0 2,0

  Bacillus megatherium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 31 0,075 0,25 0,075

  Bacillus subtilis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... ATCC 6633 0,015 0,035 0,015

  Bacillus sphaericus .......... ......... ...... . .. DA 32 0,11** 0,75 0,25

  Bacillus sphaericus . , . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . DA 33 0,05** 0,75 0,075

  Brucella abortus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 70 0,25 0,75 0,5

  Staphylococcus aureus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 6538 P 0,075 0,75 0,1

  Staphylococcus aureus ......................... ATCC 12715 0,035 0,5 0,035

  Staphylococcus aureus ......................... ATCC 6538 0,175 0,75 0,375

  Staphylococcus aureus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 9996 .0,25 1,5 0,75

  Staphylococcus aureus......................... ATCC 1163 0,175 0,75 0,375

  Staphylococcus aureus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gray 0,375 1,5 0,25

  Staphylococcus aureus . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . Smith 0,25 0,75 0,375

  Staphylococcus aureus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 40 0,25 1,5 0,25

  Staphylococcusepidermidis .................... 0,375 0,25 0,25

  Sarcina lutea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 9341 A 0,25 0,75 0,25

  Sarcina lutea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 9341 0,25 3,0 0,25

  Streptococcus pyogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 21 6,0*** 32,0 16,0

  Streptococcus fecalis . . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 20 12,0 100,0 16,0

  Streptococcus fecalis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 10541 12,0 100,0 48,0

  Micrococcus flavus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 60 0,075 6,0 0,75

  Corynebacterium simplex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 80 20,5 - 0,25

  DA bezieht sich auf die Nummern der Sammlung der Schering Corporation, Bloomfield, N.7., USA.

  *" Medium: 1% Hefeextrakt, 1% Dextrose.

  *** Zusatz von 5 % menschlichem Serum zum Nährmedium.

  Tabelle IV (Fortsetzung)

  Behandelter Mikroorganismus Gentamycin 1 Kanamycin 1 Neomycin

  Minimale Inhibitionskonzentration

  Systematischer Name Stammbezeichnung * inug/ml

  Gramnegative Organismen

  Aerobacter aerogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 90 0,75 94,0 24,0

  Aeromonas salmonicida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 100 0,25 3,0 0,25

  Alkahgenessp. ............................... ATCC 10153 0,025 0,5 0,75

  Alkaligenes fecalis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 8750 1,5 3,0 1,5

  Escherichia coli............................... DA 110 1,25 12,0 3,0

  Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 10586 1,5 12,0 6,0

  Escherichiaintermedia ........................ DA 111 0,375 1,5 1,5

  Klebsiella pneumoniae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 1 0,35 0,75 0,375

  Proteus hydrophila ............................ DA 120 0,5 12,0 12,0

  Proteus vulgaris .............................. DA 121 6,0 16,0 12,0

  Pseudomonas aeruginosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 10197 0,1 0,25 0,25

  Pseudomonas aeruginosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 9027 0,25 12,0 1,5

  Pseudomonas aeruginosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 9721 - 0,25 6,0 1,0

  Pseudomonas aeruginosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 10145 0,25 12,0 3,0

  Pseudomonas aeruginosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 8709 0,25 12,0 1,5

  Salmonella schottmuelleri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 10 1,5 12,0 1,5

  Salmonella typhimurium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 11 6,0 12,0 12,0

  Salmonella typhimurium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ATCC 9187 3,0 12,0 12,0

  Säurefeste Organismen

  Mycobacterium smegmatis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . DA 150 0,15 ** - -

  Mycobacterium tuberculosis .................... H 37 RV 0,20*** - -

  * DA bezieht sich auf die Nummern der Sammlung der Schering Corporation, Bloomfield, N. J., USA.

  ** Hefe-Rindfleisch-Brühe (Difco).

  *** Dubos` Medium mit Zusatz von Poly-oxyäthylen-sorbitan-monooleat (Handelsprodukt »tween 80«).

  Tabelle V

  In-vivo-Aktivität von Gentamycin

  Infizierender Gentamycindosis in ,ug Prozentsatz

  Mikroorganismus pro Maus und Tag überlebender

  Mäuse

  0 (Salzlösung als Kontrollversuch) 0

  20 20

  Klebsiella pneumoniae 30 50

  40 80

  50 100

  Staphylococcusaureus 40 40

  (Gray) 60 50

  80 100

  Salmonella 80 50

  schottmuelleri

Claims (2)

1. Patentansprüche 1. Die Verwendung von Microorganismen der Gattung Micromonospora, insbesondere der Art M. purpurea (NRRL 2953) und M. echinospora (NRRL 2985), zur Herstellung neuer basischer Antibiotica, Gentamycin sowie Begleitantibiotica BA-3 durch Züchtung, Isolierung aus der Kultur, gegebenenfalls Zerlegung in seine Komponenten und Aufarbeitung in üblicher Weise.
2. 2. Die Verwendung von M. echinospora var. ferruginea (NRRL 2995) und M. echinospora var. pallida (NRRL 2996) als Mikroorganismen nach Anspruch 1.