BE624816A - - Google Patents

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BE624816A
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/22—Cyclohexane rings, substituted by nitrogen atoms
    • C07H15/222—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms
    • C07H15/226—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms with at least two saccharide radicals directly attached to the cyclohexane rings
    • C07H15/234—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms with at least two saccharide radicals directly attached to the cyclohexane rings attached to non-adjacent ring carbon atoms of the cyclohexane rings, e.g. kanamycins, tobramycin, nebramycin, gentamicin A2
    • C07H15/236—Cyclohexane rings substituted by at least two nitrogen atoms with at least two saccharide radicals directly attached to the cyclohexane rings attached to non-adjacent ring carbon atoms of the cyclohexane rings, e.g. kanamycins, tobramycin, nebramycin, gentamicin A2 a saccharide radical being substituted by an alkylamino radical in position 3 and by two substituents different from hydrogen in position 4, e.g. gentamicin complex, sisomicin, verdamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin
    • C12P19/48—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin the cyclohexyl radical being substituted by two or more nitrogen atoms, e.g. destomycin, neamin
    • C12P19/485—Having two saccharide radicals bound through only oxygen to non-adjacent ring carbons of the cyclohexyl radical, e.g. gentamycin, kanamycin, sisomycin, verdamycin, mutamycin, tobramycin, nebramycin, antibiotics 66-40B, 66-40D, XK-62-2, 66-40, G-418, G-52
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
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Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 
 EMI1.1 
 loa oowaetfcanta viennent d'hoir l'attention &ttir4o sur une erreur Matérielle intervenue à la page 62 du .4111011'. descriptif, à la ligne 10 (point 11) où le pourcentage 40 B doit et  lu 8152 % et non 9,2 cette erreur toit ttro Qon.i4'i. 00." évidents étant donné que le total de tous les pourcentapel . pa.rUiI\1.U.H...t lorsque le pcturothttgw de 11027ent a été dQ.m1n' *par différence" ooame dans le Ces présents -  oit 4tre ac)nl$ 100.00 % alors qu..1, l'on fait la total des pourcentage  tels que mentionnée primitivement, l'on arrive à IOI.QO % , Noue voue priant donc do bien vouloir 40indre cette lettre au dossier du broiret pour valoir oogme do droit et afin quiz copie en soit annexée à tout exemplaire ee brevet qui o*r4 
 EMI1.2 
 délivré aux litre, 
 EMI1.3 
 Nous Vous pr1cn.

   ba outre 4* noua a4r....r la duplicata de cette lettre de correction (Idatin4 â 8tre joint au Titre Otfio1el. 
 EMI1.4 
 



  Vous trouverait, ci-joint, ? 15 en un timbre fiscal, montât de la taxe officielle. 
 EMI1.5 
 Juillet agréer) MeNaKMy<f) non Blttt&tiORB'. diatj /f -< '*'* <'3t' 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 
 EMI2.1 
 lift présente învelltioxi concert* des procédé  ,rl Y VpiwrY de préparer par voit micic-blologiquo do nouveaux antibiotiques, jpy pa y(,i$ Miorobiologj.quo d<t nottveau otjhtibi&tiquea, et do concentrer, d'isoler ot de purifier ou* produite. 



  Suivant l'invention  les nouveaux antibiotiques sont obte- nus par fermentation de certaines espèces du genre MiAïaQnos ZM (ordre don ltinotarotxes) prinolpaleaent y.g1.Sfflffft.oia..Fytt ! ci!ur9. et y ha,Ho.|>hy.tlfta. (y oottpris leurs mutante et variants, étant entendu que le tome "mutants" en- globe les mutants naturels et artificiels, par ecomple ceux qu'on obtient à partir des ptècités par de$ 

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 EMI3.1 
 agents de mutation tolu qu'une Radiation haute fréquence 
 EMI3.2 
 (r,uybhg-x# ultraviolet )   des aetihophagee et de  moutarde% dlâzoto# où de mioforgünQmè. 4qu1val.nts juoqu'à ce qu'il ot f6rme des produits anti1Qt1u.ment actifs  et par isolation du substrat ainsi obtenu des fractions antlbiotiquoment activés. 



  Ces fractions peuvent 4tr..nuui séparées  et les ant1b1ot1- ques ainui obtenue peuvent Sire transformé a  n leurs dérivés habituels tels que leurs sels avec des acidego leurs dérivé$ t- et/du 0<*aoyl<S6 et leurs produits de réaction de composés d'addition bisUltit1qU.1 dlaldébyde, et de cétôtest En partioulier, l'invention ooricortié la préparation d'an- tibiotiques bas1qued & partir d'onpêcei convenables de "1oro- ,p,r,prai léo plus 1mport.ts de dob antibiotiques étant dé- 1gnéQ dans iâ nuit. "dontamyoihi*  t iiht1b1Gt1qu.. produit. 



  . nved la Gn1amYQ1bbH en plus de 00 qui .et'appelé dans la nuit* "antibiotiques du groupe H*-45lM et ktntibïotîqüea du groupe Sî'-30"t bas culturee des ViVante ont été déposées et font partie de la Collection dé cultures du Département américain de l'A1Óutur., "Northern Utilisation Bonotreh and Development 1YisiOrt", roortal 1111n011, USA, où elle$ sont dispëtliblea sous leuM identifications ttRftl respectives. 



  Patml les qui Ü, dont tèvdldo utilisables pour préparer la GsntY1n. et eau ed-prûduiltt antibiotique., liuh dbëhtto eu* à itê désigné p&r tè.isitâmii{iÈP,QX.& noupe Ufpôlê dana 4a 8Ui âxpgtga) t a fOU 1 le lit NRRL 2953 et a été ïdelè à librigine à partir d'un échantillon de terre gras ue à Syracuse dans l'Etat de liow otki USA* Ki est caractérisé pài' uh mrc91i.fin ayant en moyenne un diamètre de 0,5 micron} il ne produit pas un ael1 aérien vrai; 11 produit des apoeen séparés dont le diamètre est an moyenne 1,0 

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 EMI4.1 
 micron, aux extrémités de sporophores #implesi est non aoido*      résistant; gram-positif; digère certains types de protéines et d'amidon; est aérobie; croît   ben     entre 22   et 37 C mais pas à 46 C ou au-dessus.

   La   forme et   la couleur orangée de la colonie      sur les milieux d'agar-agar organiques les plus riches sont 
 EMI4.2 
 typiques. Sur d'autres milieux d'agaragar faible teneur ua azote, la couleur de la colonie varie du pourpre rougeâtre au pourpre. Alors que ce pigment pourpre rougeâtre est caractéris- tique du produit fraîchement isolé, il peut   disparaître   tempo- rairement ou définitivement dans les touches obtenues par iso- lation répétée et transfert.. 
 EMI4.3 
 



  Une autre espèce, essentiellement équivalente à 1,,urp"reA ! dans la préparation dés antibiotiques a r-jçu la désignation . cromon08tA lobincerori .8p. (appelée dans ena suite H. na,"^,, ra}. Cette espèce a été isoler à partir . d'un échantillon de boue ptélevio à Jamei3T:1.11C\, Etat du Heur Yor)ç, USA et a reçu le NO NRRt 2985; p q ta,'.t croître dans un milieu constitué par 3,05 d'extrait de levure ( Itac)o 1 fe de dextrose et 0,1 de carbonate de calcium dans de l'eau distillée et qu'on l'a fait incuber doua un 4,gîtQteut tournant- à z0 pendant 30 jours, est caractérisa par un ttyoeiua long, | ramifié, régulier, sans septao d'environ De5 micron de diamètre.' *-*').' '"'' La culture est pourpre  Les spores sont pjo()4Ùi:±',' .:q<ib4.aIiinî"nt séparément sous la tome d'extrém1t4.rP11é,,:)Lt.t cen- Irai.

   Les spores et les sont enîbâtonnets faraeté- , "te rustiques. Le opcre aur est à peu près sphérique avec Ùk d:1.- j tre d'environ 1,0 à le5 microns. Par ioroBope contras t de 1 phase (x 1000) t\1E1 spores apparaissent cooiae 6tan' "t\1U'u. Les { micrographies étwctronlques indiquent que la rugoaé est due à des épines qui font régulièrement   saillie,  de la   surface     des   
 EMI4.4 
 spores en atteignant occasionnellement une longueur'"1 |e 0,2 mi- '' crono (Dans ce bouillon de culture dans ,1eJ-Oontn 1nd1- 

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 EMI5.1 
 quées plus haut, K.purpureti ne parait pas produire de sports)* .

   echinoapore, digère certaine types de protéines et d'amidon, est aérobie et croît également bien dans la gamme de températu- 
 EMI5.2 
 res allant de 22 à 37*C mais pas au-dessus de 5000 environ. 



  Lorsqu'on l'a fait croître dans un milieu constitué par   0,3   
 EMI5.3 
 d'extrait de boeuf, 0,5 de tryptose, U,1 K de dextrose, z d'amidon soluble, 0,5 d'extrait de levure, 0,1 de carbonate de calcium et   1,5     d'agar-agar,   tous dans de l'eau du robinet, en secouant à 28 C pendant 30 jours, on peut produire un pig- 
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 ment pourpre diffusible. Ce pigment diffusible caractéristique peut   disparaître   momentanément dans les souches obtenues par isolation et transfert répétés.   (M.   purpurea dans le milieu qui vient juste d'être décrit ne produit généralement pas un tel 
 EMI5.5 
 picment diffuoible). 



   Un micro-organisme qui s'est révélé utilisable pour   prépa-   rer les antibiotiques du groupe E-451 a reçu la   désignation   
 EMI5.6 
 Microcionospora carbonabea n.sp. (appelé dans la suite M  oarbonacea). a reçu le Zd  NRRL 2972 et a été isolé primitivement h partir d'un échantillon de sol prélevé à Olean dans l'Etat de New York, USA. M. carbonacea est caractérisé par le développe- ment de zones noir-charbon d'accumulation de spores sur une colonie de mycélium végétatifqui est, sinon orange, lorsqu'on 
 EMI5.7 
 l'a fait croître dans 0,5 ?S d'extrait de levure, lu de dextro- se, 0,1 de CaCa" 1,5 % d'agar-agar et qu'on l'a fait incuber pendant 20 jours à 2800.

   Les spores de M. oarbonaoea ont une forme qui varie de la forme oblongue à la forme ellipsoïdale et la dimension moyenne du spore mûr est de 1,0 par   1,5   microns, Lorsqu'on examine les spores complètement mars au microscope er lumière directe, on constate qu'ils sont noirs. Les   sporophorea   apparaissent en grandes concentrations dans des zones partiou- lières du mycélium   végétatif   plutôt que d'être répartis au ha- 
 EMI5.8 
 eard sur toute la longil4r du mycelium. Normalement, le lI2,foel:l.-- 

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 EMI6.1 
 um végétatif ueffsemble pas se fragnenter en éléments polymor- 1 Il phea (fragment mais conserve son intégrité jusque ce qu'il y ait une autose éventuel le Il a un diamètre moyen de z 1 micron} il est non aoidoréaiatant et est gram-positif.

   Ltorgal"%4   nisnre   digère certains types de protéines et   d'amidon,   est 
 EMI6.2 
 #aérobie et croît bien entre 16 et 37"Ci mais pas à 50"0 ou au-dessus. Aïar,ue--li'cr¯aré et la couleur orangée (avec de 9 ! marbrures noir-brunâtre) de la colonie sont tyiquea ê-1: produit ; ! fraîchement isolé du colt ces caractéristiques peuvent dispa- traître momentanément ou en permanence dans les eouohtts obtenues par isolation et transfert répétés. 
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 . Un micro-organisme qui s'est révélé utilisable bout 'pr - j rer les antibiotiques du groupe SP-30 a reçu la désignation M1oromonoDPora halopt1o n.sp.

   (appelé dans la culte . phyt1o), a reçu le N  NRRL 2998 et a été.isolé primitivement      ; à partir d'une boue au fond   d'une     mare   salée 4   Syracuse   dans 
 EMI6.4 
 l'Etat de New York, US. M. lohyti9a est caractérisa par un long mycélium ramifié d'environ 0,5 micron de diamètre et une abondante sporulation. Les spores ont une forme variant entre celle d'un ellipsoïde et celle d'une sphère et ont un grand diamètre égal en moyenne à 1,2 micron. Dans les cultures anciennes, ils apparaissent avec des parois lisses et une   colo-   ration noire.

   Il apparaît que les spores sont portées au hasard le long du mycélium sur des   sporophores   courts ou longs; éven- tuellement, ils sont   sessiles.   Le mycélium végétatif ne se fragments normalement pas en éléments polymorphes mais paraît 
 EMI6.5 
 garder son intégrité. Le mycélium est non acidorésiotant et gram-positif. 



  Pour isoler les   micro-organismes,   on secoue une portion du sol ou de l'échantillon de boue séchée respectivement   dans*   
 EMI6.6 
 de l'eau distillée stérile et, aprèa avoir fait une dilution convenable, on dépose la suspension sur un milieu d'agar-agar. j 

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 EMI7.1 
 Il convient que le milieu contienne 1 ;b de glycérol, 0,2 ?6 de nitrate de sodium, 0,1 de phosphate diPOtaBOIqUOP 0,05 % de sulfate de magnésium, 0005-e de chlorure de potassium, 0,001 f> de sulfate ferreux et 1,5 % d'aear-agari il contient de préfé- rence 0,5 de tryptose, z d'amidon soluble, 0,5 je de propio- nate de calcium et 2,0 % dfagnr-agar, tous ces constituante étant dans de l'eau distillée. 



   On essaie les cultures pour déterminer leur activité anti- biotique en les faisant d'abord croître dans le milieu suivant pendant une période atteignant 60 jours à   26*Ci     0,3   d'extrait 
 EMI7.2 
 de boeuf, 0,5 de tryptoeé, 0,1 de dextrose, 2,4 d'amidon soluble, z,5 fui d'extrait de levure, 1,5 % d'agar-agar, tous les constituants étant dans   de'l'eau   du robinet.

   On extrait ensuite la totalité de la solution aqueuse   d'acar-agar   aveo du butanol et on concentre l'extrait butanol-eau* On extrait suffisamment d'antibiotique par le mélange   butanol-eau   pour obtenir un con- 
 EMI7.3 
 centré qui, au test sur disque, empêche la croissance de sert - ,phyloCQCC1!S aureue, et de Doillu8 subtilleo et dans oertaine cas aussi d 'Eschercha eoli, Peeu9mona$ aeruinosa. lebaie7.- la rnaumonix$ et :,yaobzoterium pmegmntis.

   On observe 1* activité antibiotique contre les mêmes organismes après croissance dane une fermentation submergée pendant 96 heures dans un milieu 
 EMI7.4 
 aqueux cor-tenant des agents nutritifs oonvenablea, -telwnue #-= dans le cas de M. purpurea et M. eguinosp-orlo un milieu conte- nant 1 d'extrait de levure, lu de cérélose et 0,1 de car- bonate de calcium ou un milieu contenant lea constituant* dé- crits plus haut dans ce paragraphe; dans le cas de M.   carbona-   
 EMI7.5 
 esea, un milieu contenant 0,5 tf d'extrait de levure, 0,1 x de produite solubles de poisson,   0,1   de carbonate de calcium,   0,1   de liqueur de macération de mais séché par pulvérisation 
 EMI7.6 
 et 3 de lactose;

   et dans-le cas de!. halopht1o,. un milieu contenant 1 d'aminé NZ type z (qui est une peptone résultant 

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 EMI8.1 
 #i de 1er digestion pancréatique de caséine, et que l'on villit et .procure? à la Sheffield Chemicàl Cor Norwict;, New York, OSA) #et 5 y d'amidon soluble, Difco Lborator1e8 Ine.1, Détroit, Michigan). - Les tableaux 1 a 5 ci-dessous comparent les nouvel-lie 
 EMI8.2 
 espèces mentionnées plus haut avec certaines espèces connut. 
 EMI8.3 
 de Mcromon9sor. Aux endroits où il m'y a qu'un tiret les. 
 EMI8.4 
 
 EMI8.5 
 valeurs manquent ou n'ont pas été reportées dana les tableaux* #- lioe observations sur les colonies données 4B la tableau 1 ont été faites Apreia 14 jours d'incubation e-24-2E"C ûaa - ¯ les milieux indiquas.

   Dans lit, description des :Coma'U.Q.na des colorationa OIl utilisa lea références et le système suivant Il la première désignation est un nom de couleur t;Lr4 de l'ouvrage "Descriptive Colour Name ictipnary", par Teylor, 4och.., . GAnvl11e, publia par la Container Corporation or  9rla, 1950 ' vec un numéro de teinte correspondant au nom de çoului1 tiré de l'ouvrage "Colour Harmony Kanual", 4 édition, 1958, 4ga- liement publié. par la Container Corporation et Amer:L*4; la 9 - ? conde désignation.est constituée par un r-om'de. couleur et un ! numéro de même signification que colle qui Se trouve, dana la .Circulaire 533 41,{ National Bureau of Standard* {u.> 8?, ne- wrruàrq .955.. - " - ;;,,:' c1.t''tt' :""'t.", .

   En ce qui concerne j. b&3,fiytlpla * .."i !1.",pi04"4i tableau 1, ûeluioi est caractérisé ,ps.y , le *4bleai4 l, ceu1.Oto1 eat octér14 per 'P\. bI' . i .. dans la gamme de Pji allant de 6,8 à 7 Qau PftjEt . 4 J nombreux milieux d - 'r. ftitwjw . sont in,t a, 3 f t s r'' " '! ..',-*' 6' i" 1t r--ù 'i r mais virent en prenant une teinte brune Avec le - r,t . .tl, .¯ i le brun léger., (tan), le bf 4rape et, le lywd '#<?!& Uiitri ' ations de couleur courantes*, ,La colonie devient. %n,tt sfftt6-'.'.-; foncé, elle ne devient, jamais noire t' Se ml0rO-Or$);pêi- te une sporulation abondante , .particulièrement d:'t laa ' f ôo-r v , nies anciennes colorées en br\Ú\- Qn obtient hab;l.1u'\,!J.et\. .! ty3, s e ..

   T..'. i S r s 

 <Desc/Clms Page number 9> 

   placent     diffuaible   brun rougeâtre sur un milieu d'agar-agar compose de   0,5   d'extrait de levure et de 1% de   l'un   quel-   conque des sucres suivants : galactose, lactose, lévulose,   mannose, raffinose et tréhalose. 



   Le tableau 2 donne des renseignements relatifs   à   des colonies qu'on a fait incuber pendant 14   jours à   26 C dans di- vers milieux. Les   renseignements   concernant les espèces connues, avec lesquelles celles de l'invention sont comparées, ont été tirée de l'ouvrage de Bergey "Manuel of Determinative Bacterio- logy", 7ème édition, 1957, publié par The Williams and   Wilkine   
Company,   Baltimore,     Maryland,   USA. 



   Dans lec tableau 3A et 3B, la   croiaaance   et la couleur des colonies des nouvelles espèces selon l'invention dans divers milieux sont comparées avec celles présentées par   troia   espèces de Micromonospora actuellement disponibles. Les milieux employ- és sont ceux qui sont couramment utilisés pour les détermina- tions de Streptomyces. La couleur de la colonie est identifiée par les deux systèmes utilisés pour les renseignements du ta- bleau 1.

   En plus de ce qui est indiqué dans le tableau 3A, on a fait une observation sur des colonies de M. halophytica dana un milieu de Waksman glucose-extrait de levure -agar-agar, aveo le résultat suivant t croissance bonne; colonie : 
Couleurs rouge brique-g5NG, marron   Intense-55,   
Les   micro-organismes   selon l'invention sont capables   d'uti-   liser diverses sources de carbone et d'azote. 



   Dans le tableau 4,leur utilisation du carbone est   compa-     rée à   celle de certaines espèces connuea de Micromonospora par une estimation visuelle de la croissance aur des plaquée   d'aga   agar dans des milieux constitués par   0,5   d'extrait de levure   "Difeo"   (produit de   Difco   Laboratories Inc.).   1,5     d'agar-agar   et 1 % du carbohydrate du test correspondant, tous   ces   consti- tuants étant kans de   l'eau     distillée.   

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 EMI10.1 
 pin plue-de ce qui est contenu dans le tableau 4't i'utili- #' \ ;

   cation du carbone du M.. hnlp2)iXli2.% est déterminée d'une manie- re identique, ayeo les oona Situants -oarbohydratéa  Vivants mélibioae, tréhalose, adonH-ol, duloitol et ribosotte bonne oroi-aeance étant obaerv,b.e 'vea les deux premiers cet uan- etituanto alors qu'avec les trois déliera la. aro,sant6r est 
 EMI10.2 
 médiocre; 
 EMI10.3 
 Dans le tableàtt 5 on a comparé L'utilisation d-O ots 'don*. 



  Nicro-orgaîtiaceajaelo.n l'invention avec celle d'autres espèces de Kîcromort2U2rg par estimation visuelle de la crolvoance Our, des claques d'agar-agar dans un milieu constitué de 1 % de . glucroae, 1,5 d'agar-agar et, la source particulière d'azote . ! utilisée (suivant la concentration indiquée), tous ces cotgti tuants étant dans de l'eau dlatillée.

   Le code de couleurs utJ-' - liaé dans le tableau 5 est conforme a celui qui a été indiqua 
 EMI10.4 
 pourrie tableau 1, ' On a indiqué plus haut que l'invention englobe l'utilisa- tion des Mutants des nouvelles espèces selon l'invention pour préparer des antibiotiques ainsi que l'utilisation de loure variante* Comme exemples de tels variante$ qui différent des eapooes décrites sur un. point secondaire tel que par une pro- 
 EMI10.5 
 priété morphologique ou biochimique, on peut citer t deux varl- ante du M. echitiospo-1 appelé M. echinosjpora r. ;

  ,u,,,i et M. echinoapora var. 2allida# et un variant de ï. o.arb-ona.c..a.t appelé M. carbonecea var. aur tiae". l'es cultures de ces va-* 
 EMI10.6 
 riante ont aussi été déposées et font partie de la collection - du Département américain de l'Agriculture, Northern Utilisation 
 EMI10.7 
 Research and Development Division, où elles sont disponibles sous- leurs identifications respectives, à savoir ?RN '299r NRRL 2996 et NRRL 2997, 'respectivement.

   Ces variante ont euisi 
 EMI10.8 
 été.isolés à l'origine à partir d'échantillons de boue près de . 
 EMI10.9 
 Jameaville, New York et à partir du sol a 0aa, New 'Or,' tJBA", ! 

 <Desc/Clms Page number 11> 

 
 EMI11.1 
 respectivement et sont taorxom3.quenont les memea que X, ecuno- gpora. ou 1J  ft%rMbnpn1aol.efo  respectivement mais avec lea différence! suivantes 9 *& il  e,chino8,û.ra. var. ferrufrinfra ne réduit pas les nitrates croit bien sur le ribose eollînbs2gè et M. eohinoapora var.

   ont tous deux une croissance médiocre sur ce pantoae), ces colonies ont tendance à avoir une couleur rougeâtre ou brun 
 EMI11.2 
 jaunâtre (virant éventuellement du rougeâtre au brun pourpre en vieilliscant) et on rencontre occasionnellement dans le myoe- 
 EMI11.3 
 lims des pigmenta marron* Toutefois, la sporulation ont généra- 
 EMI11.4 
 lèvent médiocre dans certaine milieux (par exemple pâte de 
 EMI11.5 
 #tomatu-f urine d'avoine-agar-agar plue Otl %¯de carbonate de sodium) dana des cultures, anciennes on trouve que les spore  
 EMI11.6 
 et lea sporophores possèdent la paroi .rugueuse caractéristique* 
 EMI11.7 
 Dans ce dernier milieu et -sur un agar-agar de Bennett la crois- sanca est bonne; 3 a colonie est plicate;

   et la couleur est rou- Ce acajôu-g6 1/2 el, brun rougeâtre soutenu-41* . eat;3noc,zo, vax* rallicla ne produit pas de pigmentation pourpre foncé du mycélium sur des milieux d'agar-agar. La cou- 
 EMI11.8 
 leur de sa colonie sur la plupart des milieux d'agar-agar varie 
 EMI11.9 
 de l'orange p51e au tan clair ("café au lait*). Sur un agar- acar de Bennett et avec de, la pète de tociate-farine d'avoine - :a.araar z+ 0)1 % de carbonate de sodium, la croissance est bonne et la colonie plicate. ta couleur de la colonie aur le premier milieu est abricot-s4GAf orange clair'*52; dans le deu- xilne milieu la pr3phkt.a a. la couleur indiquée ci-deasua 
 EMI11.10 
 tandis que le centre devient plus foncé. 
 EMI11.11 
 



  S c,a,7bonac.aa¯ vair. agrantigoa ne réduit paa le nitrate produit oecauionnellenent tut, picaont diffueible jaune ïnxaqu'.7. cro,ft dans un milieu de cerbohydrate à base de taannose ou de X3, IoÈe; et présente une production limitée de spores* La cou- leur dela colonie sur la plupart des Milieux d#agar4--aear est 

 <Desc/Clms Page number 12> 

 
 EMI12.1 
 ,orange vivant au brun orange avec le ' temps, La eurfaoe orant 
 EMI12.2 
 , présente occasionnellement de petites,zones noires, constituée) 
 EMI12.3 
 presqllentiérement eo spores oolor'. en *'" o1rt et 1 est prlnoipa- , lemeniT formée de Mycélium végétatif. Sur de ligar,;-agar.de Be=e^tti la croiB8nnO du variant est bonne, la QQ10he '1evéi la couleur de cette dernière étant orange brûle<"g5NC!, orange rougeêtre intense-35.

   Sur un milieu 4'agar-agar  de pâte de toaate et de farine d'avoine avec 0#1 0 de carbonate de 8odiltm la croiscance est assez bonne; la colonie élevée! la couleur ###* de cette dernière mhre-0TG, orange outen53.' '*# . 



  Les variante énumérée oqnt équivalents aux tspèoen décri- tee ci-deoeus pour produire des antbÓt1qùea en général et de la Gentamyoine ou du R"451t rea11ot1 v-eIIHmt. en particulier. 
 EMI12.4 
 

 <Desc/Clms Page number 13> 

 
 EMI13.1 
 TABLEAU-1 
 EMI13.2 
 Taxonomie comparative des espèces 14icromonoopora Partie A Milieu contenant 0,1 aminé NZ type 1, 1 dextrose, - .57 agar-acar Organisme 1 Observations 
 EMI13.3 
 aorù3cop1que Microscopique M ur42 r¯ea, Pas de mycélium aérien;

   Mycélium long, ramifia, ¯".¯ïrZ 2953 colonie égarement élevée, en recul* sans septa diamètre zaza '"" **7? chaînes, cireuse! asse bonne 0,5 /uni peu de eoropliorte ¯ 
 EMI13.4 
 
<tb> croissance; <SEP> pas <SEP> de <SEP> pigment <SEP> et <SEP> de <SEP> scores; <SEP> spores <SEP> de <SEP> 1,0
<tb> 
<tb> diff. <SEP> produit. <SEP> Couleur: <SEP> sur- <SEP> microns <SEP> de <SEP> diamètre,
<tb> 
 
 EMI13.5 
 1'ace:vin foncé-C7PI, brun rtucoâtre foncé-44; inverse vin-C7PG, rouge foncé-16. 



  M. cr'orlCeEJ, Pas de Mycélium aérien; Mycélium long, ramifié, lRf 2972 colonie plate, humide; crois- r6ful., aa.ns septa, diamètre wuu  &(± aanaa assez bonne; pua de 0,6 u, couleur sombre; spores pilent diff. produit. Cou- abondantes oblongues à ellipa leur:surface: périphérie old. 1,0 x 1,5 Jx, portées orange clair-c41iA, orange sur anaez de aporophoroe. vit-48, centre noir-brunâtre Inver3e: périphérie orange clair-4I:A, oranpe vif-48, 
 EMI13.6 
 
<tb> contre <SEP> noir <SEP> brunâtre.
<tb> 
 
 EMI13.7 
 



  M.chai ce a Pas de mycélium aérien; Mycélium long, ramifié - AXCC 12452 colonie lénùrenent élevée on ré;ul., sans septa, très fin, ''""''. ,252 chaînes, cireuse; assez bonne mo.Lna de 0,5 de diamètre; 
 EMI13.8 
 
<tb> croissance, <SEP> pas <SEP> do <SEP> pilent <SEP> spores <SEP> abondantes, <SEP> aphériquee
<tb> 
 
 EMI13.9 
 diff. Droduit. Cou1eur:aurfa- à ellipsoïdales, brunes, ce: caf6-C3PU, brun olive 1,0 y de diamètre, spores fonc-96; inverse: caYé-3PN, surtout libres mais quelques brun olive foncé-96. unes lides isolement à aporo- 
 EMI13.10 
 
<tb> phorea <SEP> longs.
<tb> 
 
 EMI13.11 
 



  I,i.fuaca Pas de mycélium aérien; mycélium court, irrégulier, .. " ,.., n qa colonie légèrement élevée, produiaant nombreux éléments NIUIL B'9'3 colonie légèrement élev4a, produisant nombreux éléments ''""" û-yp humide, cranulaire-en chai- polymorphes, J 0 ,U-2 ,0 )l de nes; assez bonne croissance; diamètre; spores 1,01 de dia- trea léiai, pigment diff. mètre, difficiles à trouver 
 EMI13.12 
 
<tb> brun <SEP> jaunâtre <SEP> produit, <SEP> parmi <SEP> nombreuses <SEP> formes <SEP> poly-
<tb> 
 
 EMI13.13 
 Couleur: surface: orange rou- inorphen (brun olive) à paroi 83âtre-g4PC, orange soutenu- foncée. 
 EMI13.14 
 
<tb> 51 <SEP> ; <SEP> inverse: <SEP> peau <SEP> tannée-
<tb> 
 
 EMI13.15 
 C4H:::, brun intense-55. 



  '±2. Pas de mycélium aérien; Mycélium long, ramifié, "" fp-p ir\MC colonie Incrément élevée, régul., sans septa, 0#5¯u de v 1.OG126 che,Bl,ranulairetencha2nea; diamètre; spores très abon- pas de pigment diff. produit. dantea, en amas et portées Couleur:aur:face: périphérie séparément; zut de diamè- 
 EMI13.16 
 
<tb> café-g3PN, <SEP> brun <SEP> olive <SEP> foncé- <SEP> tre, <SEP> quelques <SEP> formes <SEP> polymor-
<tb> 
<tb> 96, <SEP> centre <SEP> roussâtre <SEP> orange- <SEP> phes, <SEP> lea <SEP> spores <SEP> et <SEP> les <SEP> for-
<tb> 
 
 EMI13.17 
 g4PC# orange soutenu-51;

   mes polymorphes sont à paroi inverse:périphérie cafd-g32N, foncés. 
 EMI13.18 
 
<tb> brun <SEP> olive <SEP> foncé-96, <SEP> centre
<tb> 
 
 EMI13.19 
 orange mussâtre-g4PU, oran- ge soutar..u-51. 

 <Desc/Clms Page number 14> 

 
 EMI14.1 
 1 Mtt 4 
 EMI14.2 
 8urt Uilim #lnt*nàfti fPJP** * #2 A# if * t y*  
 EMI14.3 
 Ob..n-a1::f..M8 OrJ8Sl1'.8, " ( Il 1' '1 J" ,- 1 ,..!, ,.. '"''''''''''''''''\-''''''Iii..lü. eBMBMaBJ*BaaBBBMBàa>aaàBaaaa*Ba Blikkeaie âaKNisttâi&ettiteiNB*aaafeaasttiJaBSaBa ''..l'.'! Iflltt'oo,1cru- aérien;

   NealitM 1<M 1 #mnr 2" OOlonia élevée, courbe, nD4"" mstm pê&tiikji $.0 J* *m '?''*' '' cireuse* croissance aboïïdw Aiaxib <i'ee,ia5& tef pas de joignent 4i±f# arpurdlr icr ïeis' ttjjfM' foM!<< C'Mly<euyfee< s t wr  rr à  IligtiiéiiiiàiM cuita-g5Ê*. t.ptm-55! lnr r  i 1#O  a dls dlBïtt ;t**# ' µ5* rou *âtî'e'*5Kt, brun inte *   ¯ ¯t,>t , 1 55. 



  M. ohlno pora fac 4. Y.O"li.U8 .'rien, 1 ¯Ol 1¯ tfaafilfté- colonie 1.",., oJ!'éntl'.... riDJ1ier,  saia  #t , 0#5j  ; ! courba 4ir.u.., bonne 40 e;, #$&* êm *$smt  ro1.sance.. lje'!" pie;8ent il 41tt., ambrth Ooul,1U"ulU"taO" brun rouge4tr..outem. 



  $$l/2Blt bruxt roug âtr  fofwè** 44} lu variai vougo4t.... 1'0li4l- ru.., 1u;;::;r.cet, M.carbûMaoet Pas de NyoelitMt aérien; Myêêlim lon # 5 krpt 0OT9 colonie élevée, en chaîne , régul. , n&r  mmêi *6j , KRRL 2972 }'lé. de 810e11,118 a'ncm; p ¯6.11.- 1", \ifIt lU ment diff. produit. Couleur* isolément -  ii*rç#fe i-   eurfce terre cttite-g5tE, laolia, oUi'Ionott àwUAxM" brun intense-55; inverse 1 14&1'8. 1*0 * 10 Ai timmêmêâ î terre cui te-s5D, brun intenee-99* ...mm,, f 1(,a,t"i.r,,, Pas de 810611ua aérien; U1ceUu long, :ttllldt4.t J,'lCO 12452 colonlo élevée, en chaînée, régul..; sans a.irtJ.; 0 5 J  mv/V a :*34 cireuse; croissance assez de ci1aatre;  |N * * n bonne; pas da pigment 41ft. tes, po:t1;'.. 8t gts Couleur t surface brun cuivra- en aima, ephii *lli|iéoî- g5.PI, brun intense-55; invar- daleet 1,0 m <te' 4iâliitn. 



   #  brun rouèâtro-g4PI, ; brun in*e'lflll"55* , M.fuaoa Pdi de myc.l1ua sér1. , . MYc.l1ua 1r' gaz B-9.' colonie élevée, granulai!'. éléments :p01: ;;Itw ,- BSRï< B-945 roaeier, terne! bonne croie- 0,5-j!,0 de 'Ui ,"1'" . i gazlC., t1'&' léger pilent diff. olive ,por.. -fJJIat.jt 1.0. 



  Ir brun jaunâtre. Couleurs eurtot- de 41am..tr.; .. 411t..' <w ce< terre cuit -g5±±, brun formes polynorphea de 0* intenD -55j invars s brun' 2,0ju da 4iaâaff*t tga-çggg, btUn 1I1t nl.-"..J' j...........u.tjt.u..ir'.:-..'--!-r-.--rT----.'.-..rL.-.!'L.L-..''r---'--i'-'-'-'".'-"-'- (..;,u.. '''' de 1rI1.c.lium .41'1' ' dyos.;t de 2 types  un long 4100 lo 2S Colonie élevée, granulaire et régp1., l'autre court et ATOO icoze dense, ..c.. croïe tnce bon* 1n''" pi?ôdtti# uii **# * . 



  1 fi ne. Couleur! surface p4r1pbé. ,br.wc: éléments bo\1*orph.... rie rouge rou0B&tre-g4M, 0,8 2,0 ju de a1t'" orange intense-50, o.ntr...pore..j1e' ttbôMtea, brun akaaolat.g4Pt, brun gri- port'.. en ameié 1.O aA . 



  ; sâtre foneé-62} inverse i diamètre, iphéfia.ttejràr *# brun épice tont-±..iL1....run ellipsoïdales  "" -r- ....#)#.#..#.# lPIr J l' t. ..... 11...i"'t"Aoo.""r,,.......................&uL'M 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 
 EMI15.1 
 ut ' & . e.. 



  .Ehi ië!/! 
 EMI15.2 
 !'1: :leu I:';rrurell Cttl"bonE!A iftàloDhrlja .ChA'tOI& K.tJ,t.Ì 11.rXi "ltttl211 ,,(iflit1lâ ;:r-:Hj' ,?¯L ," :;,JG, 7,. J, ' j Glucose ?a de myce- Croissances Croi..&ncel ra6 de myc²- Cro1.ac'J Oro1;o&nc" CrQ1gSfio'J iijafiO li aérien id1ocr. e8ez bonne lium aii.: T1òuru., m'41ocr. mtd1o,r8 '41ocr. cr..: i 3SaI\ce: 1:<":4ref ria8r.cas :71ont assez bonne .couleitrs vive. 8 (t.lub-1e, pas de pir- ;eran:::;e-c;4L.1 Pio:rent Couleur* Eî soluble ornnc" vi!- SJoIu1>le: oran,. pa.- 
 EMI15.3 
 
<tb> Couleur: <SEP> Couleurs: <SEP> gant' <SEP> brun
<tb> 
 
 EMI15.4 
 f&1e ,.clair- colonie rose plI.- 1. onc. aT. g51Aoran&8 plate orange foncé couche 4. rougeâtre avee couche spores noir z:odéré-J-1. de spores .cri.(tre 1. 



  Pas de CG11- r..oir nn!- brun!tr. ches de. spo- tre 1. ur-&!res eosbrea ue ¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯ ""él t1ne Liquefacton Uaaé!'actien Lic14é:f1iction Liquéfac'tionlL1.qué!ac'tiOD L1t"act:1oD L1...u':t&et1onIL2.qu-ae:1o. 



  \.f a :ni01e JU.. 1"aible 1:"ible- #imsr t-.:;-#< LCO&±1Ü .1.1'..... 



  Lai't e.ee l.n'te::tent })'i. coaculé occa- teI::ent pa...uC sne.. p.pton1.' coa S##Utili .) Utiliaé Utilisé 3SSSL# 1J1y.raé Pas tnT.rai InTersé fo1EAmidon l!y4rolysé .) Hydrolyse Hydrolyse Hydrolyse S.:drolY15é Hydroly Hydrolysé 1!7 tWofml ïl Décoposé .b.spide:aeI!''t..Attaqué Pa8 décora- pas 4'com- Pa# ûâmamCellulose auell1ue 1'eU BéeeEpos d EÍ,c Ot:ln 0 s1! ouelcge eu"o8é 'Dosé êS-### Réduct1.on Vari ble J;i'tri'te.. l;itr:i:tea :atr1tea Variable .Pas d8 ..1tnt.a l'as du nitrate a -rrodui:ts rodui 'ta 'Crodu1 'ta rductlon 'Drodu1:te :rédudtIiIID #"##### .3onne Bonne étonne - Croissance . ïecpérature crotOT8nce 2 croissccce à croissance à op't1muD .,... 



  22-5T'C,pse I6 ''Cs pas 18-40'S, pas entre' 4e croinsan- de crciessn- de croisuan- JO-5-c ee A 47*C ce à 50'C ce à 50'C ######### ######### ###'##### #######- :Cro1scsance Aérobl. Aérobi. Aérobi. Aérobie Aérobie Aérobie [Aérobie [Aérobi* aérob1e- ou Aérob1e A&ob:1e Aérob1e Aérobie Aérobie Aérobie Aérobie .1érob1e anaérobie ¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯## 
 EMI15.5 
 vJ ai Les propriétés de !- ech1nospora sont identiques par rapport à ces Bilieux. 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 
 EMI16.1 
 



  .<-,4). ¯..,......, ,,"....,.............¯ - .. ... 1 1 - . - - - -, .1 -- 1- . iJiiL 3A 
 EMI16.2 
 Ki1ieu "U,.MUE2urea .ecàinosnora 1!. l!. ha10'Dbvtica M. cbe.1.cea M.fusea lt.8'O.., Hiu 11ffi -KRRL 2985 -lr.RRL 297 b-xCdL 298 ATCC 12452 -b1rRL -94J -èc 10026 Agar""'agar Croissance.- Croissance: Croissance: Croissance: Croissance': Cro'issançe';' Cxo1$sanee:b.onne, de bonne; bonne; bonne; assez bonne; bonne; bonne; ' Couleurs péripher:Èe Bennett Couleur: Couleur: colonie élue- colonie pli- Couleur:

   Couleur: terre intense-55. terre cuite marron soute- vée et en cate, incur- périfhirie terre cuite- brun intense-55, -m5PE, nu-g71f2Py, chaînes. vée, Couleur: terre cuite- g5PE, brun -centre: brun clou orange bru- brun roe- Couleur: cuivre-g5LC, SP brxzn intense-55 de glTo'f1!-3PL; tna-54 tre grisatre orange orange bru- intnse-55MJ brun jaunâtre foncé--47 95rtA, orange nâtre-54 centre brun foncé-78 vif-48 (mar- chocp1at- - bré noir g4Pll, b' ,;. brunâtre) :foncé-59', .:' . 



  AagaT Croissa'ncet Oroissancte: Croissance: Crci.ce: Croissance.-- croissance; Croisnance: bOI1.D;e è. :::ersoD bOn!1e-; bonnet' assez bonne; 1 bo.nn.e; 'bonne; borne; C oul'êur: brun' Couleur-. couleur: colonie éle- colonie plus Couleur:doux Couleur: câne4i, ûran orange rouge tuile- v6e.Cou"Leur: plicate. amer-85pc" tangerine- intense-55 lé-g51lCt s5Ï#, brun terre cuite- Couleur; orange g53.A, -8""ôU- : Sne-55. g51!E. br.ln ouivre-e5LC, soutenu-51 orange vif 'gâtr.e -intense...S,5 orange bru- , "i:n:tense-35 .¯¯¯¯¯ nitre-54 . , " ....' :1 q 4bzz iï.P.l .v.8$$'''.eti f4.#331G?B sr0'i$3,±'CY.: riüipt.tci -.<# -n. 3" 1.$$aTiC$:8ro$s$nL'e: assez alît-e de .Srûtssance. pr..sanq.:; Croissant, ..rc.. ¯ce< -onne. Couleur: tomate- onne;' assez bonne; . 'ïar.e; bonne, bonne; .-...'" bonne.

   Couleur: farine Cou1.eur: Couleur: (':::10n10 en' oolcnie pli- Couleur: couleur* pêche arin.enta '.avoine- #:'àJir,e orange pous- rnaines. cate.Couleur., périphérie 'che bxi1.- g5là, orange rou- -azar-agar brna.e-1J.t . 18t:r.ux-g4LC; Couleur-. pé:::ipnér1e te1"re cui!.e. lant-8511, gfâtre modéré-37 - ange ,u- 'o.e ¯ ériphrie terre cuite- g5P$., brun , :orange rou- -- zstàtre,   c1!.fté-t' :...: wa.nge-g5U g5PE,brun intense-,55.) 4eàt--e "'. "   ite-¯ rlan-ge intmiae-55, centre brun modéré-37 ,"---.h; 'te:lèe-5().. centre brun.. ehQcalt-4TS """".' '; centre noir c1air-g4!HJ, brun foncé-59 . " t' , y ' " r hzaua,tre brun 55 intense- , w . ....<-¯¯¯ ##. - # 

 <Desc/Clms Page number 17> 

 
 EMI17.1 
 TAMT-EA,-,' 3A (suite) 
 EMI17.2 
 Kilieu K.purpurea M.echinosrora L:.carbonacea .haloytica .chalcea M.fusca BD. 



  -1;RliL 2953 -!#...'iL 2b -? it-FaL 2972 KEEL 2;,D8 ATCC 12452 - p.K±L 3-943 ATCC 10026 
 EMI17.3 
 
<tb> Glucose- <SEP> Croissance* <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance:
<tb> 
 
 EMI17.4 
 aspara- assez bonne; médiocre médiocre assez bonne à bonne; assez bonne, médiocre gine- Couleur: médiocre; Couleur: Couleur: far- -nêcixe clair- colonie plate, terre cuite- orange soleil Sar poche orange Couleur: s5PE, brun -s5LA, orange aear rougeâtre orange-g4LA intense-55. intense-50 , nodéré-37 - orange 
 EMI17.5 
 
<tb> modéré-37 <SEP> intense-50.
<tb> 



  Glucose- <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance <SEP> : <SEP> Croissance <SEP> : <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance:bonne;
<tb> extrait <SEP> bonne; <SEP> bonne; <SEP> assez <SEP> bonne; <SEP> bonne <SEP> ; <SEP> bonne <SEP> ; <SEP> bonne; <SEP> Couleur: <SEP> brun
<tb> 
 
 EMI17.6 
 de Couleur: Colonie crié- colonie en cclonie pli- Couleur: . Couleur: chêne-g4PI, brun 
 EMI17.7 
 
<tb> levure <SEP> brun <SEP> soute- <SEP> nelée-granu- <SEP> chaînes, <SEP> cate. <SEP> brun <SEP> intense <SEP> terre <SEP> cuite- <SEP> intense-55
<tb> 
 
 EMI17.8 
 agar- nu-g5PL, laire.

   Couleur: Coule;:r: cr., -g4PL, brun aspe, brun . agar brun foncé-59 Couleur : orange rous- épice clair- foncé-59 intense-55 érable-e4lE, sâtre-4ï:C, g4LG, brun brun clair-57 orange sou- soderé-58. 
 EMI17.9 
 
<tb> tenu-51.
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 18> 

 
 EMI18.1 
 mTi.':'x.4..4.-x.E. :.xas. V -s.AtrfCI. A'r,-W' 4WH S^ ' x.rtW' w.as" .is3'Y"S '' Y., awlti""' y''.rurMfr' w .r^v79wf4YIY^W ec^AAfM!'lRIiY.Y'X5' .'. -.-....1-.*..-. 



  .il v 7  - fTtftTT 38 ¯. ¯ ,..¯ 
 EMI18.2 
 milieu L ' ..' ta r958 Â.zCv .. 4 26 Tranche d. Croissance, Croire.: Croire.: '0 83âKS S? pommes de médiocre assez bonne médiocre tabie-g6PG,b aÈre-g5s amère-95n terre rougeâtre orange foncé-51 orange foncé-51 ér-43 Tranche de ssasr- Croissance: croissance: G pissancs:bonne 0roissance: Croissa'ucs: aese earotta médiocre médiocre médiocre uleur: ciocolat médiocre bo=e.

   Couleur carotte médiocre nëdiccre médiocre - ir=-g4PN, brun orange brûlé-g5EC, ¯,.. f cé-59 orange rougeâtre Sucro8e- Croissancet Croissance* Croissance: Croissance: nulle Croissance  mile Croissance -.nulle 
 EMI18.3 
 
<tb> nitrate <SEP> médiocre <SEP> nulle <SEP> assez <SEP> bonne
<tb> 
 
 EMI18.4 
 agar-agar à médiocre (agar-agar (plate). de Czapek) Couleur : Czapek) brun chêne- 94PI, brun Vif -55 p 

 <Desc/Clms Page number 19> 

 
 EMI19.1 
 TABLEAU }B (suite} .. 
 EMI19.2 
 



  Kilieu l:.l'mrpurea 31) J.cll1"bonllcea K.halorhytica .chalcea### E: fusca ...# 2. sr. 



  -lairlL G55 :a:ia< ,1.,)"{2 -l.I#L 2;)')e -ATvG 12452 -l;;tiL B-::4} AC lúÚ6 
 EMI19.3 
 
<tb> Tyrosine <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance <SEP> : <SEP> Croissance: <SEP> Croissance.
<tb> 
 
 EMI19.4 
 acrr-agar assez bonne. assez bryrille. assez 1or:e bonnei assez conne. assez bonne. 



  (observations Couleur: Couleur : t.r .r.. Couleur: pas de Couleur: pas de à 2. 7 & 14 pa àe r3- pas de pil,,- (1v6e et en diffusible noir. ES" diffu- KS- difi'ujours; ::lent âiffu- r:.ent diffyi- chaines). siLle sible. 



  Gordon&SEith.sible sible Couleur: J. Bact 14 pas de réac- 1 tion. 
 EMI19.5 
 
<tb> 



  Peptone-fer <SEP> Croissance: <SEP> Croissance <SEP> : <SEP> Croissance: <SEP> Croissance.*bonne <SEP> Croissance <SEP> : <SEP> Croissance:
<tb> 
 
 EMI19.6 
 agar-aga-- , - bonne-, assez bonrte. assez bonne. Couleur: pas de assez bonne. assez bonne. 



  (ôbservationa ;Couleur;" Couleur : ' Couleur : réaction. ,.ouleur. de Couleur.- pas d'a 2, 1 . pas; ¯de pas de pas de réaction, réactif. 
 EMI19.7 
 
<tb> jours) <SEP> réaction. <SEP> réaction. <SEP> réaction.
<tb> 



  Pourpre <SEP> de <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance:bonne <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> bonne
<tb> 
 
 EMI19.8 
 bromocrésol- bonne. bonne. Dieestion. assez bonne. Digestion. lait ' D!.gestion. D4.gestion Couleur: pas de Dicestion. Couleur: pas de -Couleur.* partielle. chanCement du pH Couleur: pas de changement du pRe pas de chan- chancenent du . gênent du pH PU. 

 <Desc/Clms Page number 20> 

 
 EMI20.1 
 



  TJLEESAÏÏ 4 
 EMI20.2 
 Test au ...Durrurea Lv.echîros2cra K. carbonaeea M.halonh7tica M.chalcea ::.uraa 1I.bp  carbohydra- li , 7 I:5 11LRL 2 72 -1;R3.L 298 iTcc 12452 mua. B-S45 1ÏCC 10026 te utilisé #####-#### Arabinosg bonne bonne bonne bonne bonne bonne tonne'. l 
 EMI20.3 
 
<tb> Cellulose <SEP> médiocre <SEP> médiocre <SEP> médiocre <SEP> médiocre <SEP> médiocre <SEP> médiocre
<tb> Glucose <SEP> bonne <SEP> bonne <SEP> bonne <SEP> bonne <SEP> bonne <SEP> bonne <SEP> bonne
<tb> Galactose <SEP> moyenne <SEP> moyenne <SEP> bonne <SEP> bonne <SEP> bonne <SEP> bonne <SEP> moyenne
<tb> 
 
 EMI20.4 
 Lactose tlé4.1.& uédicuu'. bonne bonne moyenne médiocre médiocre Lévulose médiocre médiocre bonne bonne moyenne '. médiocre tnédiocre Kannose moyenne moyenne bonne bonne bonne .

   bonne bonne"' Raffinose médiocre médiocre médiocre semble croître médiocre médiocre 1\léiiiocre -Rhamnos8 médiocre bonae médiocre médiocre médiocre médiocre \é#iocre 1. 



  . Amidon .. bonne ' ',bonne- bonne bonne .bonne - benne onne' - sucrose bonne 'tsonne bonne bonne bornât bonne - bteane Xylose bonne benne bonne bonne bonne- médiocre médiocre -Inosi't9. ] 1méì'oer*; -mdtocn médiocre médiocre médiocre médiocre médiocre - .^a1 .. :;; .re" 'médiocre. médiocre médiocre médiocre bonne bonne Sorbitol médiocre médiocre   médiocre médiocre 'médiocre médiocre médiocre o .-'5 extrait " # . ¯ # 
 EMI20.5 
 
<tb> de <SEP> levure <SEP> médiocre <SEP> médiocre <SEP> médiocre <SEP> médiocre <SEP> médiocre <SEP> médiocre <SEP> médiocre
<tb> 
 
 EMI20.6 
 témoin ' " 1'. -. - ' 

 <Desc/Clms Page number 21> 

 
 EMI21.1 
 TABISAU 5 . 
 EMI21.2 
 



  Source d'azote i..7.,r,J.rurea' *' 3.i.carbor.scea H. halprhytica :Z. chalce3, 1,.fusca :t!.81'1. 



  ,a.lra1 2953 j-fcRKI 572 -l;:-'i..qt 2Y98 ATOC lr'¯4 l5: 13-943 -ATCO 10026 
 EMI21.3 
 
<tb> 0,5 <SEP> extrait <SEP> Croissance: <SEP> Croissanse; <SEP> Croissance* <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> bonne
<tb> de <SEP> levure <SEP> bonne. <SEP> assez <SEP> bonne; <SEP> bonne <SEP> ; <SEP> plica- <SEP> bonne <SEP> ; <SEP> Couleur; <SEP> bonne;Couleur: <SEP> Couleur: <SEP> douce-
<tb> 
 
 EMI21.4 
 Difco Couleur:tuile colonie te.

   Couleur:, 1 rouGe étable- orange roux- azre-C5PC, -rouge¯g5**S, élevée et brun épice ,j'±6PG' brun 4PC, orange orange foncé-51 brun vif-55 en chaînes. clair-4ZG, rougeâtre vif-50 
 EMI21.5 
 
<tb> Couleur <SEP> : <SEP> brun <SEP> modéré- <SEP> modéré-43
<tb> périphérie <SEP> 58.
<tb> 
 
 EMI21.6 
 orange-,-,5LÀ, orange-vif-50, i 
 EMI21.7 
 
<tb> centre:noir
<tb> brunâtre
<tb> 
 
 EMI21.8 
 carburez ###.¯¯¯¯¯¯ ###.### ###### ¯- ¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ . ^ 'i 1 ! # 1 # - t # ... 
 EMI21.9 
 
<tb> 



  1,0 <SEP> % <SEP> amine <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance:bonne <SEP> Croissance: <SEP> bonne
<tb> NZ <SEP> type <SEP> A <SEP> bonne; <SEP> assez <SEP> bonne <SEP> assez <SEP> bonne, <SEP> bonne; <SEP> Couleur: <SEP> henné- <SEP> Couleur <SEP> : <SEP> terre
<tb> Couleur: <SEP> colonie <SEP> éle- <SEP> colonie <SEP> éle- <SEP> Couleur: <SEP> g5PG, <SEP> brun <SEP> vif-55 <SEP> cuite-g5PE, <SEP> brun
<tb> 
 
 EMI21.10 
 bourgogne-g7 vée et en vée et en her.né-f5PG, vif-55 1%2P, brun chaînes.'ou- cha1nes.Cou- brun vif-55 foncé rou- leur:

   orange leur:orange geâtre gri- roux--g.FC, bralé-g5lTC, 
 EMI21.11 
 
<tb> sâtre-47 <SEP> orange <SEP> foncé- <SEP> orange <SEP> vif
<tb> 51(légre <SEP> rougeâtremarbrure <SEP> 35.
<tb> noir-brunâtre
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 22> 

 
 EMI22.1 
 *" -''-' "'Sf*''--"'"-f-.t--!*-!-#**--<.###f.<##-.t-####.---.'t< ..-.'#.-.,. ,,-.-., . - - -11 , 1 ,, -- ,.r..,,.,¯.,-##<-.. - '1............,.,............, -:t.,.... . 



    TABLEAU 5 (suite)   
 EMI22.2 
 Source d'azote X42urnurea 3e) b?1e& M.halophvtica M.Chalcea K.fuaea 3d.s . 



  KERL 295T '''i''T2 - "TSEHL 29yµ A2CC Ï2452 "'.4?ç  *"ÀïcÔ""10'Ô2ê 1 aspa:rag.1ne Croissance: .Croissance: Cro'1ssance:" Croissance':' ' Croïssance: ' Coissâne' : 
 EMI22.3 
 
<tb> assez <SEP> bonne; <SEP> médiocre <SEP> médiocre <SEP> assez <SEP> bonne. <SEP> médiocre <SEP> médiocre
<tb> Couleur: <SEP> Couleur:brun
<tb> 
 
 EMI22.4 
 bourgogne-g? clou de giro- 1/2PL, brun fle-g3PLlbrun 
 EMI22.5 
 
<tb> foncé <SEP> rougeâ- <SEP> foncé <SEP> jaunâtre <SEP> grisâtre- <SEP> tre-78
<tb> 47
<tb> 1% <SEP> acide <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance; <SEP> Croissance <SEP> : <SEP> 
<tb> glutsaique <SEP> assez <SEP> bonne. <SEP> médiocre <SEP> médiocre <SEP> assez <SEP> bonne. <SEP> médiocre <SEP> médiocre
<tb> 
 
 EMI22.6 
 Cou3eur:ôeur- .-=#-, Couleur:

   brun gogne-ST 1/2 clou de giro<gogne-g'i 1/2' clou de giro- PZ, brun foncé le-3FZ, brun 
 EMI22.7 
 
<tb> rougeâtre <SEP> jaunâtre
<tb> grisâtre-47 <SEP> foncé-78
<tb> 1% <SEP> nitrate <SEP> Croissance: <SEP> Croissance <SEP> : <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance <SEP> : <SEP> ' <SEP> 
<tb> de <SEP> sodium <SEP> médiocre <SEP> à <SEP> nulle <SEP> médiocre <SEP> nulle <SEP> nulle <SEP> nulle
<tb> nulle
<tb> 1% <SEP> nitrate <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance: <SEP> Croissance
<tb> d'ammonium <SEP> médiocre <SEP> à <SEP> nulle <SEP> médiocre <SEP> nulle <SEP> nulle <SEP> nulle
<tb> nulle
<tb> 
 
 EMI22.8 
 JE) les résultats pour H. e,chinospora sont identiques à ceux-ci. 

 <Desc/Clms Page number 23> 

 



    FORMATION   ET ISOLATION DES ANTIBIOTIQUES. 
 EMI23.1 
 les nouveaux mioro-oreaniamea décrits oi-desaua et les autres raicro-orcanismes envisagés d'une manière générale par l'invention, produisent des substances antibiotiques par les procédés de fermentation essentiellement tels que ceux qui vont être décrits. Après fermentation (incubation), les produits 
 EMI23.2 
 antibiotiques se trouvent 3. 1a fcia dana le mycélium et dans le bouillon;   à   la suite de la séparation du bouillon du mycélium, il est préférable d'utiliser, comme source de produite antibio- 
 EMI23.3 
 tiques, le mycélium dans le cas de M.purpurea. de M'eohinoapora, et de leurs variante, le bouillon dans le cas de Nocarbpnooea et de ses variante, et de !.'halophyti E!-. Dans tous ces cas, on obtient au début des mélangea d'antibiotiques. 



  Sn particulier, d'après des études ohromatographiquee sur parier, il apparaît que les substances antibiotiques produitee par xi. purpurea et par M. ech1nosora et leurs équivalents  com- prennent au coins trois constituants. On a appelé   Gentamyoine   le constituant principal et on a appelé les autres constituante qui ont été isolés par les références BA-3 (fraction A) et 3A-3 (fraction B), respectivement. 
 EMI23.4 
 



  Les substances antibiotiques produites par t.,rbon,Ecea et ses équivalents comprennent .au moins cinq, constituants, identi- 
 EMI23.5 
 fiés dans la suite par R-45Ïko R-451B, R-451C, R-451D et R-4513# respectivement, dent la séparation dépend du procédé employé, Dans un système de chromatographie de partage, lea constituante dont la vitesse de migration est analogue à celle de A, B, 0 et   D sont   isolés en un croupe qui est antibiotique et qui est   iden-   tifié sous la dénomination R-451.   R-451D   se révèle être un des principaux constituants de ce groupe. 



   Enfin, il apparaît   que.les   substances antibiotiques pro- 
 EMI23.6 
 duites par il,hdlorhztîca et ;ses équivalents comprennent au moins quatre constituants. Le produit composite des substances anti- 

 <Desc/Clms Page number 24> 

 
 EMI24.1 
 biotiqùea produites par . h .a ,h est identifia par le code SP-30 et chacun des quatre constituants précités par SP--30ILt 8'-308,' SP-300 et SP-30D. 



   Pour former les substances antibiotiques, on fait   croîtra   les micro-organismes à une température d'environ 25  à 40 C, 
 EMI24.2 
 dans des conditions aérobies submergées dans un m.l,e, wutx.; . aqueux .contenant une source d'azote et de carbone assimilables. 



  Les oarbohydrates tels que l'amidon, la dextrine, certains sucres et analogues constituent des   sources   de carbone convena- bles. Des sources d'azote convenables peuvent être organiques ou minérales, en donnant la préférence aux premières   telles.que   des farines de soja, des peptones, etc. 
 EMI24.3 
 



  La fermentation est effectuée a un pH compris entre envi- ron 6   et.   8, pendant environ 24 à   48   heures dans le cas de      
 EMI24.4 
 !1*2urpurea et de M.echinoo2or± pendttnt environ 60 à 72 heures dans le cas de M. ca.r:, g, et pendant environ 96 à 120 heures ; dans le cas de M, halophytiCm Vers la fin des périodes respects-j ves, on atteint un maximum de production do substance a,ut3,bioti-  que. On sépare alors le mycélium du bouillon, et on isole les antibiotiques qui se révèlent avoir été enrichis* 
 EMI24.5 
 Ainsi, dans le cas de M4,Uurtiurea et da'.e"ahi,s*o, ooatme la plus grande partie de l'activité   réside     dans   le mycélium, on   sépare- ce   dernier par filtration et on   élimine   le filtrat.

   Les      
 EMI24.6 
 antibiotiques produits (qui, compte tenu dos conditions quanti- < tatives, peuvent être simplement appelée "tîentamyoiM brute'*) , sont   séparés   du mycélium par extraction à   laide   d'un acide minéral à un pH égal à   2 environ.     Les   extraits   par.l'acide   sont neutralisés à un pH   égal à   6 environ et peuvent être   envoyés   à travers une   résina   d'échange   d'ions,   de préférence du type 
 EMI24.7 
 Jtjmberlito IRC-50$ ou être précipitée par formation d'un Bel ' , insoluble, par exemple un   hélianthate,   un reineckate, un dodé- 
 EMI24.8 
 cylbenzènesulfonate (sel santomerse-S).

   Des exemples' dé résines ' 

 <Desc/Clms Page number 25> 

 du type Amberlite susceptibles d'être utilisées ici, à la fois pour l'échange   d'anions   et pour l'échange de cations, se trou- 
 EMI25.1 
 vent dans l' ouvrace "handboek of Chem1atry and Physici3l',, 42 sème édition,   Cheaical   Rubber   Publiahing     Co.,   Cleveland, Ohio, USA   (I960).   



   Lorsqu'on utilise la "technique par résine", on fait passer la solution précitée de   "Gentamycine   brute"   au.pH   6   à   travera la résine   échanceuoe   d'ions et on élue la   Gentamycine   brute de la résine en utilisant de l'acide sulfurique dilué.   L'éluat   eat rendu alcalin à un pH   égal b,   10 environ avec de la soude. Lors de l'addition d'acétone, les sels minéraux précipitent. La li- queur qui surnage est ajustée au pH 4,5 et concentrée sous vide pour donner une solution concentrée de sulfate de   Gentamycine   brute.

   On ajoute du méthanol à cette solution, ot le sulfate de 
 EMI25.2 
 Gentarnycine brute précipite. , lorsqu'on utilise la "méthode du sel insoluble", on traite l'extrait de mycélium neutralisé (pH = 6) par exemple avec du 
 EMI25.3 
 Santomeras-S ex on retire par filtration les sels précipitée,   On   lave le précipité à l'eau et on le dissout dans du méthanol, On filtre la solution   méthanolique ,   puis on la fait passer à travers une résine échangeuse d'aniona, par exemple du type Amberlite IRA-401 S. On concentre   l'éluat   et on ajuste son pH à 4,5 avec de l'acide sulfurique ce qui donna une solution con- centrée comprenant essentiellement du sulfate de Gentamyoine. 



  On obtient ce sulfate en ajoutant du méthanol à la solution et on séparant par filtration le sel précipitéOn peut encore le purifier par   reprécipitation   soue-la forme d'un sel insoluble suivie d'une régénération. 
 EMI25.4 
 



  La Ce4twnycine brute telle qu'elle est isolée par la teo- nique par résine peut être utilisée telle quelle ou peut être encore divisée en   Gentamycine   proprement dite et en ses oo-pro- duits antibiotiques. Si l'on ne désire préparer que de la Genta- 

 <Desc/Clms Page number 26> 

 
 EMI26.1 
 myoinop-on obtient ce résultat de préférence par précipitation fractionna de son sol Bantomerse-S (dodécylbenzenesulfonate de   sodium).   



   Si.l'on doit aussi isoler les constituants   antibiotique'   BA-3 (fractions A et B) produits en même temps, on les sépare 
 EMI26.2 
 de préférence d'une solution méthanoliqua concentrée de otnta, mycine brute en   ajoutant   de l'acétone   (précipitation     fraction-   née).   (On   met à profit la plus grande solubilité de la Ganta- 
 EMI26.3 
 Myoine dans le mélange acétone-méthanol, par rapport à telle de la fraction A et b celle de la fraction B du BA"3)t Apris lavage? avec de l'acétone, on sèche le précipité qui est constitué es- sentiellement par un mélange de BA-3 (fractions JL et 3).

   Sui- vant une variante  pour isoler ce mélange de la Gentaaycine on met à profit la plue grande solubilité des sels dodéoyibenzene- culfonatee de ces deux constituante, par rapport à celle du sel ; correspondant de Gentamyoine. On précipite le dad6or,teard- aulfonate de Gentamyoine en ajoutant une solution de Santomersoe S à   une solution   de sulfate de   Gentamycine   brute.

   Après   filtre-   ge et lavage du gâteau restant sur le filtre (gâteau qui peut être traité pour donner de la Gentamyoine purifiée ou un ael de   celle-ci),   on combine les filtrats qui représentent une solu- 
 EMI26.4 
 tien des sole doddoylbonzèteoalfonates de BA-3 (fraction A) et de BA-3 (fraction B)   et;   on peut   isoler   ces   constituants   de la   solution.    



   Du mélange obtenu suivant l'une ou l'autre des méthodes précédentes, on peut séparer la fraction A et la fraction B l'une de l'autre en utilisant des procédés par chromatographie sur papier. 
 EMI26.5 
 



  Dans le cas de .cart'inacea et; de . y , halop-hy ti oa, comme la plus grande partie de l'activité réside dans le bouillon, on sépare le mycélium par filtration et on   l'élimine.     Les     substan-   ces antibiotiques sont séparées du bouillon par extraction à 

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   l'aide   d'un solvant de la Maniera décrits ci-dessous. La sépara- tion en constituante est effectuée par chromatographie de par- tage, essentiellement comme décrit ci-après. 



   On isole d'abord les   substances   antibiotiques de l'extrait obtenu à partir du bouillon par évaporation du solvant   jusqu'à   ce qu'il reste un résidu.   On   examine le résidu par   uhromatogra-   phie sur papier, ce qui permet de guider la chromatographie de partage. Les chromatogrammes sur papier sont réalisée dans   dit**     férents   systèmes de solvants et les valeurs de RF des constitu- ants   oint   déterminées par des procédés   bioautographiques   stan- dards qui consistent à développer et à sécher un chromatogramme sur papier qui est ensuite déposé sur une plaque d'agar-agar ensemencée avec du Staphylococcus aureus.

   Après une durée de contact de quinze minutes, on retire le papier de la plaque que   l'on   fait ensuite incuber à 37 C pendant seize à vingt   heure**   En   oh&ervant   l'emplacement des zones   d'inhibition   on peut déter- miner les valeurs de   Rp   des composés antibiotiquement actifs* 
Les tableaux 6 et 7   ci-dessous   indiquent les divers systè- mes de solvants employés et les valeurs de RF   déterminées   pour les constituants* Dans chacun des systèmes du tableau 6, on a utilisé un solvant descendant; dans les systèmes du tableau 7, on a utilisé des solvant  descendants et ascendante comme indi- qué. 

 <Desc/Clms Page number 28> 

 
 EMI28.1 
 



  , LJ}Au 6, ',,' ( ! Etude cAro#atograph1u. 4es jeb4tAnco an;1b1otiqued :. ; produite par fe1'll1.X),taton de 1S! , . .... lim ,,.....!'f)L'. ' ; Systèll1e de solvants Valeur de r 
 EMI28.2 
 Imm - çolo zoo1 Benzène- 10 pr v. V' ' ? ,-ri. ther pètroit CI*14 tr,i'.!';,',i'' )'P.ï. 0. 0' -'.; aétozi 5 p.v. ,,4,, , y'$|f "| '.b'j4 '" Tetapa $a dév7,opPana' #  ,. °,,, , ,,;:.A'.4 . 1,5 heure "i..L.. ..."''' ' cyon t,oiubat 20 P.V. * J # *fj n-fetttB 0l I|5 ffV  > Eau distillée 7oO p.tr.. n,';/ # ;;j Bthey de pétrole n-to 042 'ûA* "0,71 ' ('tt,6t . I) 195 peyo. 019 0,42 0 iti I. .. 



  Temps '*;> Af-. t1 -1 495 heures izth pd+tr5. OIP**'ig ' "';,r,. ; ;F4. ' méthanol 8 POT* ' f. , 9 i, #.. ,., ; .'" ; Aoet&ted'etbyle5p... , # r.: ."'V'Vt/*\' 4%- 4 - '*lvcA.;-i.r-* i > i, Eau distillée 2 1.'r. ¯ . ,# # '"?# '-%'.<*- 'T*  Tempo de aéveioppezer4t f;; ,,,..ti, '/-'" 2 # ###"., # ju>ki '. 
 EMI28.3 
 w) p.v. partite 621 al,,xra; - rr: t'r d I"> x''. '; s 1 p.v, 0,S68 .it , . ¯ ;l';.V bzz ces tottpdrat%i-res ilidiquent dis ,ft.- ,, -t. .. 

 <Desc/Clms Page number 29> 

 



    TABLEAU   7. 
 EMI29.1 
 



  Etude chromatographique des substances antibiotiques produites par la fermentation de M. halophytica 
 EMI29.2 
 
<tb> système <SEP> Valeur <SEP> 'de <SEP> des <SEP> taches <SEP> principales
<tb> 
 
 EMI29.3 
 A-descendant 0,0 , : 0,35 . 0,60 , 0,72 -ascendant 0,02 0,11 , 0,95 O-ascendant Oi95 ' D-ascendant 0,95 ' B-aecendant 1,0 
 EMI29.4 
 
<tb> ?-ascendant <SEP> 1,0
<tb> 
 
 EMI29.5 
 agoendant 1,0 11-desoendant 0,01 / 0,'(4 , 0,65 , 0,83 
 EMI29.6 
 
<tb> Systèmes
<tb> 
 A -   Benzène  chloroforme (95.  : 7 en volume) saturé avec du 
 EMI29.7 
 formamide. Le papier ohrotnatographique, avant utilisation, est trempé dans du torm1de mdtbanolque à 25 , et séché 4 l'air pend4nt 5 minutes pour éliminer le méthanol. 



  B '- Benzène méthane,! (9 s 1) o - Méthanol. eau 80 < 20) tontenant 3 % de chlorure d..od1. 



  Le papier   est   tamponné avec   une   solution de sulfate de 
 EMI29.8 
 sodium 0,95 m z bisulfate de sodium 005 X et est adébé avant développement. 



  D - Propanol'aQide acétique!eau, (50 s 5 t 40) Butanolgaçi4o acétique (eau (4 1 1 i 5) y <- Propnnol.pyr1dine.acide, aoétique.eau (15 s 10 s 3 s 12) G - Phénol! eau (80 g 20 QM3) H - Chlorure de   méthylène.tétrachlorure   de carbone (80 t 20) saturé avec du formamide. Le papier   chromatographique,   avant 
 EMI29.9 
 utilisation, est trempé dans du forcamide methanolique a 
50 % et   séché   à l'air pendant 5 minutes pour   éliminer   le   méthanol .    



   La valeur de RF   observée     différencie   le SF-30 de   tous     le*   
 EMI29.10 
 antibiotiques connue y OQmp"1B Ilolégn4pi4yoitet la novobloolnes la pénicilline Q et l'6ryt4 oyo1nt. 

 <Desc/Clms Page number 30> 

 



   Les exemples suivante illustrent des   procédé$   convenables pour faire fermenter   les   micro-organismes   utilises   de préféren- ce, pour extraire   les substances   antibiotiques du   mycélium   ou du bouillon de culture,   respectivement,   et pour les séparer en   leurs constituants     principaux.   Dans   certains   des   exemple,

     une indication de l'activité de   l'antibiotique   produit est donnée par une valeur exprimée en unités par   milligramme.   La   détermi-   nation est   effectuée   par voit   aicrobiologique     selon   une techni- que   de diffusion   dans de l'agar-agar   (et*   Donald C.Grove et 
William   A.Bandell:

       "Assay   Méthode of Antibiotics - A Laboratory 
Manual", New York - 1955) par un test standard du type sur dis- que (dans le cas de la Oentamyoine et de ses co-produits anti- biotiqueset des antibiotiques du groupe SP-30) ou du type sur coupelle (dans le   cas   des antibiotiques du groupe R-451), en utilisant du Staphylococcus   aureus   (ATCC 6538P) comme   organisme !     d'essai.   On prépare une courbe de référence en reportant les   valeurs   de dosage et de réponse de l'antibiotique dilue dans un tampon de phosphate au   pH   8 dans un milieu comprenant :

   
 EMI30.1 
 
<tb> peptone <SEP> 0,6 <SEP> %
<tb> 
<tb> 
<tb> produit <SEP> de <SEP> direction <SEP> pancréatique
<tb> 
<tb> de <SEP> caséine <SEP> 0,4 <SEP> %
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 0,3 <SEP> %
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> 0,15%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> dextrose <SEP> 0,15%
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> ' <SEP> agar-agar <SEP> 0,5 <SEP> %
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> pli <SEP> 6,6
<tb> 
 
La suspension utilisée de 1'organisme d'essai (Staphylo- coccus   aureua)

     est   standardisé*   pour assurer 20% de   transmission     lA 1   660 m  dans un   colorimètre.   La puissance de   l'échantillon     tout     déterminée   à partir de la courbe de référence ot est   expri-   mée en unités par   milligramme}   en définissant   l'unité,  dans le teet du type sur disque  comte   étant la quantité de substance 

 <Desc/Clms Page number 31> 

 d'essai nécessaire pour produire une zone   d'inhibition   de 18 mm avec un disque de 13,

  5 mm ou   dans   le oae du test   type-ooupelle   comme étant la quantité   nécessaire   pour produire une zone d'in-   hibition   de 15 mm avec un cylindre en acier de 6,5 mm de   diamè-   tre extérieur. 



   EXEMPLE 1 - Préparation de Gentamycine par fermentation de 
M. purpurea au laboratoire 
A. Stade de germination 
On ajoute une culture lyophilisée de M. purpurea à un ballon de 300 cm3 soumis à une agitation et contenant   100   cm3 du milieu stérile suivant t 
 EMI31.1 
 
<tb> extrait <SEP> de <SEP> bacto-boeuf <SEP> 3 <SEP> g
<tb> 
<tb> tryptose <SEP> 5 <SEP> g
<tb> dextrose <SEP> 1 <SEP> g
<tb> 
<tb> amidon <SEP> soluble <SEP> 24 <SEP> g
<tb> 
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 5 <SEP> g
<tb> 
<tb> eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> 1000 <SEP> cm3 <SEP> m)
<tb> 
 m) Dans cette composition et dans les compositions   de l'eau)   données dans la suite, le solvant (habituellement de   l'eau)   est quelquefois indiqué en quantités absolues; il cet   par*-   fois suivi de l'expression "q.s.".

   Alors que ces deux   indi-   cations sont en fait différentes, elles peuvent être substi- tuées l'une à   l'autre, à   volonté, dans les limites de préci- sion nécessaire pour ces compositions    On   fait incuber le ballon et son contenu pendant 5 jours à   37*0   sur un agitateur rotatif (280 tours/minute, 5 cm de course). 



  B. Stade de fermentation 
On fait passer un inoculum de 25 cm3 obtenu à la suit. du stade de   geraination   ci-dessus dans 4 ballons de 2 litres,   *on..,   tenant chacun 500 cm3 du milieu suivant : 
 EMI31.2 
 
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 10 <SEP> g
<tb> dextrose <SEP> 10 <SEP> g
<tb> 
<tb> carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 1 <SEP> g
<tb> 
<tb> eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> 1000 <SEP> on?
<tb> 
 On fait incuber les ballons et leurs contenue pendant 5 jours à 26 C sur un agitateur rotatif.

   On rassemble les contenue des 

 <Desc/Clms Page number 32> 

   ballons.    On acidifie au pH 2 une partie aliquote du bouillon 
 EMI32.1 
 total, .en utilisant- &-c*t¯efè¯t de l'acide sulfurique 6N. et on   centrifuge.   On recueille le bouillon qui surnage et on   neutra- ,     lise   avec de la soude 6N. On essaye l'activité de la partie 
 EMI32.2 
 aliquote du bouillon neutre à l'égard du µtad)iv ocoo ui S.U.ER341 par la technique de diffusion dans de Ilagar-agate Les détoriu-" nations faîtes sur les bouillons obtenus de* la manière récrite¯ ¯ donnent 15 - 20 un1t4e/c 3 d'antibiotique. 



  C. Isolation de Gentamyoine brute   (soue   forme de   sulfater   à partir du substrat de fermentation 
Le pH de tout le bouillon provenant du stade   8 de   cet exemple (environ 2 litres) est ajusté à 2 avec de   l'acide   sul- 
 EMI32.3 
 tU1"'fhi 6N. On agite et on filtre. On ajusta le pli du filtrat t 7eO avec de la soude 6N. On fait passer le bouillon neutre à travers une colonne de résine échangouee de cations (¯1I,):'111t8 IRC-50, 1 - 10 g de résine/litre de bouillon).   On élimine     l'éluat.   On élue la colonne avec de   l'acide   sulfurique au pH 
 EMI32.4 
 2#0.

   Cn neutralise l'éluat avec de la soude 6N au VU 7t On con- centre la solution dans le vide au dixième environ du   *plume*   
 EMI32.5 
 On ajuste le PH 1 10,0 avec une solution de soude 6N et on ajou-j te 4 volumes   d'acétone   tout en agitant. On refroidit le   mélange '   et on filtre. On ajuste le pH du filtrat à 5,0 avec de   l'acide   sulfurique 6N et on   concentre   dans le vide   &   la température 
 EMI32.6 
 ambiante jusqu'à ee que l'activité du concentré soit voisine do 20 000 untt'8/om', On ajoute 10 volumes de méthanol tout en agitant et on filtre le sulfate de   Gentamyoine     précipité.   On sèche dans le vide.

   Rendement total : environ 100 mg, titrant   à   343 unités/mg par diffusion dans de l'agar-agar contre   le -   
 EMI32.7 
 tIPhllo.co90u ffus  D. S!:E:2âii25-S-SSÊ5&ëX2BËES.Ë S33;â* On dissout 15 g du sel brut obtenu comme décrit c1.d'DeU8, (titrant environ '40 ... 450 unitéa/#g) dans 50 om3 d'ea ,On fait 

 <Desc/Clms Page number 33> 

 passer la solution à travers-une résine échangeuee   d'anion.   



   (Amberlite   IRA-400,   forme   OH)   dans une colonne de 38 mm de dia- mètre et de 61 cm de hauteur, On lave la colonne avec 2 litron d'eau. On concentre l'éluat à siccité dans le vide et on dis- sout le résidu dans 50 cm3 dé méthanol. Tout en agitant, on ajoute la solution à 1 litre d'acétone. On filtre et on lave le précipité avec de l'acétone. On évapore.le filtrat à sicoité et on reprend dans 50 cm3 de méthanol. On ajoute la solution à 
500 cm3 d'éther tout en agitant. Ou filtre et on lave le préci- pité à l'éther. On évapore le filtrat ce qui donne un résidu constitué par de la Gentamyoine purifiée, environ 3 g, titrant 961   unités/mg. '     EXELTLE   2 - Préparation de BA-3   (nélanga   de fractions A et   B)   au laboratoire. 



   On procède comme dans l'exemple   1   (parties A à C). En sui- vant ensuite la partie D de cet exemple   1,   l'addition d'acétone à la solution   méthanolique   de   l'éluat   concentré provoque la précipitation de BA-3 (mélange de fractions A et B). Le   précipi-   .té, après lavage à l'acétone et   séchage,   est suffisamment pur pour être utilisé. 



  EXEMPLE 3 - Préparation de Gentamycine et de BA-3 (fractions 
A et B) par fermentation de   M.echinospora   ou de   ses   variants au laboratoire. 



   En remplaçant la culture lyophilisée de M. purpurea utili- sée dans l'exemple 1   (partie-1)   par une culture correspondante de   M.     echinoapora   (ou l'un de ses variante M.   echinospor@     va?    ferruginea et M.   echinospora   var. pallida), et en   suivant   essen- tiellement le processus des exemples 1 et/ou 2, on peut obtenir de la même manière de la Gentamyoine et/ou du   BA-3     (fractions     A   et B) , respectivement. 

 <Desc/Clms Page number 34> 

 
 EMI34.1 
 



  EXEMPLE 4 - Préparation industrielle de Gentamyoine pu* fermentation de M.purpurea 1. !!!¯6!E!!!!!!!]!2!! 
On effectue la germination de la manière indiquée dans l'exemple 1 (partie A). 
 EMI34.2 
 



  8. !!!ç!!¯!!¯E2E!I!]!m¯211¯!!!Lt1! -On fait passer 25 em3 du premier inoculum obtenu à la suite du stade préalable de germination, dans quatre ballon* de 2 litres   contenant     chacun   500 cm3 du milieu   stérile     utilisé   pour la germination.

   On fait incuber les   ballons   et leur con- tenu pendant cinq jours à 28 C sur un agitateur rotatif (280 tours/minute, 5 cm de course).   On   rassemble les contenus des   ballona.     On   ajoute 25 cm3 du second inoculum ainsi obtenu à chacun des ballons d'une série de vingt ballons de 2   litres    contenant chacun 500 cm3 du milieu suivant farine de soja 30 g dextrose   (oérélose)     40   g carbonate de calcium 1 g eau du robinet   1000   cm3 
 EMI34.3 
 On fait incuber les ballons et leurs contenus pendant 3 a 5 jour.:

  à 2800 sur un agitateur rotatif (280 tours/minute, 5'on de course).   On   rassemble et on fait passer aaeptiquement le bouillon dans un ballon à inoculum stérile comportant une tubulure latérale (volume total : 10 litres environ). 
 EMI34.4 
 



  Ce 8tada de fermentation en réservoir 1 On tait passer eaoptiq,usment les 10 litres d'inoculdm .dans un fermenteur de   240   litres contenant environ   185   litre*.   du milieu stérile suivant :   
 EMI34.5 
 extrait de bacto-boeuf 600 g bacto-tryptout 1000 g 
 EMI34.6 
 
<tb> dextrose <SEP> (cérélose) <SEP> 200 <SEP> g
<tb> 
<tb> amidon <SEP> soluble <SEP> 4800 <SEP> g
<tb> 
<tb> 
<tb> extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 1000 <SEP> g <SEP> 
<tb> 
<tb> agent <SEP> anti-mouase <SEP> à <SEP> base
<tb> 
<tb> de <SEP> silicone <SEP> 100 <SEP> cm3 <SEP> /
<tb> 
<tb> 
<tb> eau <SEP> du <SEP> robinet <SEP> que* <SEP> 200 <SEP> litres
<tb> 
<tb> 
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 35> 

 On ajuste le pH à 6,9 - 7,0 avant stérilisation.

   On effectue une fermentation aérobie pendant 20   à   30   heures     (jusqu'à   ce que le volume des cellules tassées aoit d'environ 10 à 15%) dans les conditions suivantes : température 37 C admission d'air stérile environ   150   litre%/minute pression environ 0,5 atm. au-dessus de la 
 EMI35.1 
 pression ata.norma7:

  a agitation   180   tours,/Minute 
 EMI35.2 
 On fait passer aaept1quement le contenu du fermenteur dans une cave de fermentation de   2500   litres contenant environ   1665   litres d'un milieu.stérile ayant la composition suivantes extrait de levure 17 kg dextrose 17 kg carbonate de calcium 1,7 kg agent   anti-mousse   400 cm3 eau q.s. 1665 litres 
 EMI35.3 
 n on a utilisé le produit du commerce ",Anti-foamer (HE 60" de la General Electric Co., mais d'autres agents anti-mousse conviennent également. 



  On fait fermenter   à   35*0 tout en agitant à 120   tours/minute   et en introduisant de l'air à environ 0,5 atmosphère au-dessus de la pression atmosphérique normale à raison d'environ 425 litres/minute, pendant   24 à   31 heures. 



   A la fin de cette période, la puissance des antibiotique* produits atteint un maximum qui reste pratiquement constant. 



  Au cours de la fermentation, le   pH   reste pratiquement comprit entre 6,6 et 7,4. Le volume des cellules tassées atteint une valeur constante comprise entre 2 et 2,5 cm3. La puissance de   l'antibiotique.produit   est approximativement égale à 25 uni- tés/cm3. 
 EMI35.4 
 



  D. !22!!!2nw!-!!!-Z2!¯1!¯1!.!2!¯!¯!gt!!) ravenant d9 la auve de .termentatio 
On ajoute 25 kg de matière de filtrage (Colite) aux 1850 litres environ du bouillon de fermentation obtenu suivant 

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 la partie C de cet exemple, et on filtre. On met en   suspension   la matière de filtrage et le mycélium qui y adhère dans 370 li- 
 EMI36.1 
 très d' eau environ, on a juste le pH 4 2 avec de l'acide etu7,i-   rique   6N et on agite pendant 15 minutée. On filtre   et   on éli- mine le gâteau de mycélium. On règle le pH du filtrat a 7,0 en ajoutant de la soude 4N. On charge le filtrat   neutralise   dans une colonne d'adsorption échangeuse de cations qui   contient     18   
 EMI36.2 
 à 20 litres d'Amberllte Ire-50, sous forme sodique.

   On élimine   l'éluat,   on lave la résine à   l'eau   et on élue   avec   de   l'acide   
 EMI36.3 
 sulfurique 2N, en rassemblant les 3.uata acides. On poursuit 1'élut,on jusqu'à ce que le pH de l'eluat soit d'environ 0.5. 



  On neutralise les éluata rassembles à un pH ége 4 7,$ environ avec de la soude 2N. On concentre à environ 3,7 'litre* dix$ le vide à une température inférieure à <t5*C. On r,,a le e du   concentré à     10,5   avec une solution de soude 2N. On ajoute 5   va*     lûmes   d'acétone, on refroidit, on filtre les   cela     précipitée-   et on les lave avec de l'acétone, puis on combine le filtrat et les liquides de   lavages.   On ajuste la pH dufiltrat   combina   à 4,5 avec de l'acide sulfurique 2N, on   concentre   dans le vide 
 EMI36.4 
 au-dessous de 4500 à 100 cw3. On ajoute 1 litre de métuax%olp on filtre et on élimine lo filtrat.

   On dissout le précipite (sulfate de Genteayoliae brut*) danj une quantité suffisante d'eau (100 cm3) pour réaliser une iolution à 20jt-, On ajuste le pH à 10,5 avec de la soude 2N et on ajoute 5 volumes   d'acétone.   



  On refroidit, on filtre et on   élimine     les     sels     précipités,   On 
 EMI36.5 
 règle le pH du filtrat à 4,5 avec de l'acide suif uri que 2X# et on concentre dans le vt-de à 50 em3* On ajoute, 500 em3 de méthmi-4 non, on filtre et on lave le précipité avec du mé-ctianol froid. 



  On sèche le solide dans le Vide o t du pentoxyde de- phosphore,' pour obtenir environ 20 à 30 g de sulfate de Gentamyeine brut (activité ! t approximativement 500 unités/mg) constitue; pr,t. quement par du sulfate de Gentaayeine en mélange avec les' sul- 

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 EMI37.1 
 fates de BA-3 (fraction A) 'et de BA-3 (fraction B). 



  E. Autre (22Lze¯forme de-sulfate). 



   On filtre le bouillon obtenu selon la partie C de cet exemple et on met le mycélium en suspension dans 350 litre  d'eau. Tout en agitant, on ajoute de l'acide   sulfurique   6N pour ajuster le pH à 2. On filtre et on lave le mycélium avec de l'eau. On combine le filtrat et les eaux de lavage.   On   règle le pH à 6,5 avec de la soude 4N. On ajoute alors 2 kg de   matiè-   re de filtrage en terre de diatomées et 750 cm3 d'une solution 
 EMI37.2 
 aqueuse à z de Santomerae-S (iodéoylbenxènesulcnate de so- dium). On agite vigoureusement Fendant 15 minutes et on lave le gâteau du filtre avec de   l'eau.   On sèche partiellement à l'air ce gâteau puis on le met en suspension dans 40 litres de méthanol.

   On agite pendant 10 minutes et on filtre.   On   extrait de nouveau le gâteau avec 40 litres de méthanol et on combine 
 EMI37.3 
 les extraits méthanoïiques. On fait passer la solution méthano- lique (environ 100 litres) à travers une colonne d'absorption échangeuse d'anions qui contient 5,0 litres   d'Amberlite   4018 dans du méthanol (résine sous forme hydroxy). On lave la colon- ne avec 20 litres de méthanol. On combine les   éluats,   on con- centre dans le vide à 10 litres environ et on filtre. On ajuste 
 EMI37.4 
 le pH du filtrat à 7,0 aver, de l'acide sulfurique 2N, on coin- centre à 400 cm3 et on filtre.

   On ajuste le pH du filtrat à 4,5 avec de l'acide sulfurique 2N et on ajoute 5 à 10 volumes de méthanol.   On   filtre le sulfate de Gentamyoine brute   précipi-   té, on lave avec du méthanol et on sèche à 40 - 60 C dans le 
 EMI37.5 
 vide. Rendement : 56 g environ (titre 625 unités/mg). 



  F. !!!2!!2¯¯!!!2...±2¯g!2!l2!!¯È±!!¯!!2!t On dissout 55 g de sulfate de Gentamyoine brute. tll qu' obtenu en suivant la partie D ou E de cet exemple, dans 10   li-   tres d'eau, on règle le pH à 6,5 avec de la soude 2N et on 

 <Desc/Clms Page number 38> 

 ajoute 300 g de matière de filtration en terre de diatomées. 
 EMI38.1 
 



  Tout en agitant, on ajouta 250 cm3 d'une solution aqueuse à t? 9 de Santomerae-S. On filtre, on lave le précipité à l'eau   . et   on sèche à   l'air.     On     .et   le gâteau de filtre en suspension   dans   10 litre. de méthanol, on agite et on filtre* On   répète   l'extraction par le méthanol du gâteau et on combine   les   fil-   trata.   On fait passer les filtrats travers une colonne 
 EMI38.2 
 d'échange d'anions contenant 5 litre. 4'jmberl,t. tR1.OlS (forme hydroxy) dans du aéthanol, suivant un débit d'environ 500 cm3; rai,aute. On lave la colonne avec 10 litres de méthanol et on combine les dZua.te.

   On concentre dans le vide à 1 litre      les éluats combinée, et on ajoute de l'acide sulfurique dilué jusqu'à précipitation complète.   (Suivant   une variante   avanta-   
 EMI38.3 
 geune, on ajoute de l'acide sulfurique jusqu'à ce iu'on attela- ne le pH   4,5,   puis, tout en agitant,, on ajoute   18 g   de charbon de bois pulvérisé activé, on continue d'agiter pendant   15   minu- tes, on filtre, on lave le gâteau de charbon avec de l'eau, on combine le filtrat et les eaux de lavage et on ajoute   cette   combinaison à   10   volumes de méthanol),On filtre le sulfate   de.   



    ,   Gentamyoine ainsi formé et on sèche. Rendement : 37g   environ!   totre t environ 780   unités/mg.   
 EMI38.4 
 



  '' 3. BËl2525ÊB5B2iSR-Bl3Lt&âS<.ËSS3Sï2' 
On dissout 10 g de sulfate de   Gentamycine   purifié (prove- nant-de la partie ? de cet exemple) dans   1500   cm3 d'eau et on fait, passer la   solution   à travers una colonne d'échange d'ani- 
 EMI38.5 
 one contenant 100 cm3 d'Amberlite IRA-400 (forme OU). On con-        ' centre   l'éluat et on   lyophilise   pour obtenir   environ   6,7 g de Gentamycine titrant environ   1120     unités/mg.   
 EMI38.6 
 



  ;' !nLR - 4iuotrielle de BA-'3 (mélange de fractions A et B) 
On opère comme dans les parties A à C puis D ou E   dw   l'exemple 4, En suivant ensuite la partie ? de l'exemple   4,   on 

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        conbine   le filtrat provenant du précipité obtenu par addition de la solution de Santomerse-S, avec l'eau de lavage provenant du gâteau de filtre et on fait passer le tout à travers une colonne d'une résine échangeuse d'anions fraîchement régénéré* (de préférence de   l'Amberlite     IRA-401S,   forme OH). On concentre   l'éluat   à 150 cm3 et on l'ajoute goutte à goutte à 10 volumes d'acétone tout en agitant de sorte que les sels   précipitent.   



  On sépare ces sels par filtration, on les lave aveo de l'acéto- ne et on les élimine. On concentre le filtrat combiné de façon à éliminer l'acétone, ce-qui donne une solution aqueuse de BA-3 (fraction A) et de BA-3 (fraction B). On règle le pH de la solution à 4,0 avec de l'acide sulfurique 2N et on filtre. 



  On ajoute 10 volumes de méthanol et on filtre le précipité résultant, on lave avec du méthanol et on sèche. La matière amorphe séchée est constituée essentiellement par les sulfatée de BA-3 (fraction A) et de BA-3 (fraction B). 



  EXEMPLE 6 - Préparation industrielle de Gentamycine et de BA-3 (fractions A et E) par fermentation de M. echinospo- ra ou de see variante 
En effectuant la germination décrite dans la partie A de l'exemple 4 avec une culture lyophilisée de M. echinospora (ou d'un des variants   M.   echinospora var. ferrugines et   M. echinospora,   var.   pallida)   au lieu de M.   purpurea.   et en suivant ensuite essentiellement le processus des exemples 4 et/ou 5, on peut obtenir d'une manière analogue de la Gentamyci- ne   et/ou   du   BA-3   (fractions A et   B),   respectivement. 



  EXEMPLE 7 - Préparation de chlorhydrate de Gentamycine 
On dissout 10 g de sulfate de Gentamyoine purifié (prove- nant de la partie   F   de   l'exemple   4) dans 1500 cm3 d'eau, on effectue une adsorption   comme   décrit dans la partie G de l'ex-   emple   4 et on règle le   pH   de l'éluat   à   4,5 avec de l'acide chlorhydrique. On concentre la solution à siccité dans le vide. 

 <Desc/Clms Page number 40> 

 



    On   dissout le résidu dans 125 cm3 de méthanol et on ajoute 
 EMI40.1 
 750 ca3 d'acétone. On recueille sur un filtre le chlorhydrate j de   Geataaycine   précipité, on le lave avec de l'acétone et on 
 EMI40.2 
 le sèche dans le vide à 40 - 6000. Rendement s 8#9 g environ; titre   environ 820 unités/mg. 



  F=!'-PLE 8 - Préparation d'hélianthate de Oentamycine   On   dissout 6,4 g de sulfate de   Gentamycine   brute   (obten@   conformément à   l'une   ou   l'autre   des parties D   et 3   de   l'exem-     ple   4) dans 65 cm3   d'eau.   On ajoute une solution chaude   (75*0)   de 32 g d'hélianthine dans environ 300 à 350 cm3   d'eau.   On agite et   on   chauffe le mélange à 75 C, et on filtre à   chaud.'     On   lave l'hélianthate précipité avec de   l'eau   et   on     sèche   dans 
 EMI40.3 
 le vide sur du pentoxyde de phosphore.

   En faisant rroi,,,i.. ser dans du méthanol -aqueux chaud, on obtient environ 12,4 d'aiguilles brun rougeâtre; point de fusion ! 26! Ci (a!at décomposition). 



  Aneli0.2 - c 1 52,74, H s 6943%, X 8 13 6l,<, 0 1 19420# bzz a 7,64%. 



  L'hélienthate ainsi formé à partir de sulfate de Centa- myolne brute peut contenir de faibles quantités des sels reapeo- tifs des co-produite antibiotiques BA-3 (fraction A)  t Bi-3 - (fraction B). Toutefois# la préparation de l'helianthate de la. manière décrite ci-deseus représente effactivenent une purifi- cation, étant donné que lors de la conversion a ilitat'de chlor- hydrate (en dissolvant dans de l'acide chlorhydrique est-on fil-   trant &   travers un lit de charbon de   bois,   en   concentrant   le filtrat, en ajoutant 6 volumes   d'acétone,   en séparant par  fil-     tration   le chlorhydrate ainsi précipité, et en séchant),  on   
 EMI40.4 
 peut obtenir un produit titrant approximativement 760 .I/.. 



  R""w i 9 - Préparation de Roiriockate de Gentaayoine On dissout 2,2 g de sulfate de Gentamyoine. brute (prévenant de l'une ou l'autre des parties D   et 2   de l'exemple 4)   dans   

 <Desc/Clms Page number 41> 

 22 cm3 d'eau. On ajoute 82 cm3 d'une solution aqueuse saturés de sel de Reinecke, tout en agitant. On agite le mélange à la température ambiante pendant 1 heure, puis on le laisse reposer à 5 C environ pendant une nuit. On filtre le précipité, on le lave avec de l'eau glacée et on sèche dans le vide sur du pentoxyde de phosphore.   On   fait recristalliser le Reineckate dans du méthanol aqueux chaud, ce qui donne des aiguilles pour- pre; point de fusion : 270 C (avec décomposition). 
 EMI41.1 
 



  Analyse. 0 t 24,5; fi t 4t49; R : 22,.Q; 8 r 27,92, --   Cr : 9,52.   



   Le   Reineckate   ainsi obtenu peut contenir de faibles   quan-   tités des sels correspondants d'antibiotiques produits en même temps, mais peut être utilisé sans autre purification, étant donné que par reconversion à   l'état   du sulfate   -en   dissolvant le   Reineckate   dans du méthane! aqueux; en l'adsorbant sur une résine échangeuse   d'aniona   fortement basique (Amberlite IRA-   401S)   en concentrant   l'éluat;   en ajustant le pH à 4,5 avec de l'acide sulfurique dilué; en ajoutant 5 volumes de méthanol et en filtrant le sulfate de Gentamyoine purifié   précipiter,   on peut obtenir un produit titrant environ 700   unités/mg.   



  EXEMPLE 10 - Préparation du sel sodique d'acide   poly-N-méthyl-   ène sulfonique de   Gentamyoine   
On dissout 16,4 g de sulfate de Gentamyoine (provenant de la partie ? de l'exemple 4) dans   108   cm3   4*eau*   On ajoute 30 g de   formaldéhyde-bisulfite   de sodium par portion de   100-200   mg. 
 EMI41.2 
 On agite pendant 30 minutes, on ajoute de la triéthyl,m.ne Jua  qu'à ce que le pH   s'élève à   6,8 et on continue d'agiter pendant 18 heures. On ajoute le mélange de réaction à 5 volumes de méthanol et on refroidit à 5 C.   On   filtre et on lave le préoi- pité avec du méthanol, puis avec de l'éther.   On   sèche à   l'air.   



  On obtient une poudre amorphe incolore. 



   On peut obtenir un,produit de qualité supérieure en opé- 

 <Desc/Clms Page number 42> 

 
 EMI42.1 
 j. ra.n't comme suit t on dissout 200 g do sulfate de Gantamyo3.ua j (obtenu conformément a l'exemple 4 ?) dans 1.5 litre d'eau. 



  On ajoute   366 g   de formaldéhyde-bisulfite de sodium par petites portions au   cours     d'une     période   de 20 minutes.   On   ajuste le pH 
 EMI42.2 
 ! lA 6,7 avec 135 es3 de triéthylamine et on agite pendant 16 heu* res .-1a température ambiante. On ajoute la .solution à 7,5 li- très de methsnol tout en agitant. On filtre le précipité et on lave avec du méthanol. On combine le filtrat et les liquidée de lavage méthano11qu., et on ajoute le tout t 9,8 livres   d'acétone,   tout. en agitant. On filtre le   précipite,   on lave 
 EMI42.3 
 , avec de l'acétone et on sèche.

   Rendement 1 178 g d'wh. poudre   blanche   amorphe; activité ;  s 580   unités/mg. 
 EMI42.4 
 t Analyse - 0 1 26,44o; S < 6,18%; N : 5,54! S t 14e6t%î Na 1 7#49JÊJ 
Teneur en cendre totale : 22,2 %. 



    ' EXEMPLE   11 - Préparation de R-451 par   fermentation   de 
 EMI42.5 
 LE, aarbonacea au laboratoire #A. !!!Q!¯S!I!..i!2!!!2!! On ajoute aaeptiqueaent une culture lyophilisée de 1i. obonl}cel dans un ballon de 300 aza'3 agité contenant 100 aa3      du milieu décrit dans l'exemple 1 A.   On   fait incuber le ballon 
 EMI42.6 
 et Son sontenu-penda...oar 3?'C sur un agitateur rotatif (280 tours/minute, 5 cm de course).      



   B.   Stade de fermentation   
 EMI42.7 
 ! On fait passer 25 cm3 de l'inoculum obtenu à la suite du i stade de germination ci-dessus, dans quatre ballons de 2 litres i contenant chacun 500--0=' du milieu suivant - - ------      levure 5 g produits solubles de poisson 1 g 
 EMI42.8 
 e - liqueur de macération de maie (sec) 1 g , carbonate de calcium 1 g - lactose 30 g eau du robinet   1000   cm3 . 

 <Desc/Clms Page number 43> 

 



  On fait incuber les ballon. et leur oontenu pendant 2 à 3 jours   à   26 C sur un agitateur rotatif. On rassemble les contenue des ballons. 
 EMI43.1 
 



  C. !!g!!2e¯!!¯!!!B2!!.!e!!!!2!!!! 
Aux fermenta rassemblés provenant de la   partie B   ci-dessus, on ajoute une matière aidant la filtration (terre de diatomées) et on filtre. On extrait le filtrat avec de l'acétate d'éthyle ou du   chloroforme,   en maintenant le pH de la phase   aqueuse   à 
7 ou au-dessus, mais de préférence   aussi     près   que possible de 
7. On concentre l'extrait jusqu'à ce qu'il rente une huile résiduelle en évaporant le solvant dans le vide. On dissout le résidu dans un excès de chloroforme et on clarifie la solution par filtration.

   On concentre dans le vide la solution dans le chloroforme à un faible volume et, tout en agitant, on ajoute la solution du concentra à 10 volumes d'éther de pétrole (gamme   d'ébullition :  30 - 60 C). On élimine le précipité par filtra- tion (il peut être nécessaire d'effectuer des précipitations . répétéesdans du chloroforme s'il se forme d'abord une huile plutôt qu'une matière solide filtrable), ce précipité contenant la majeure partie des substances antibiotiques. Cette matière 
 EMI43.2 
 est active contre le StarhLioc3ceus auroue lorsque des soluti- ons contenant des proportions aussi faibles que 10  g/cm3 sont essayées dans l'épreuve de diffusion sur disque. 
 EMI43.3 
 



  D. Pur3.içAtion de la eubetanee antiriatfg,ue brute abtenue -!!¯2¯!2E±!!±-g¯±!:!g! Cette opération utilise une purification par chromatogra- phie en colonne sur de l'alumine. Le principal éluat est défini comme étant du   R-451,   et il apparaît qu'il ne comporta pas de 
 EMI43.4 
 constituant R-451E.

   La purification sur alurrine rend le B-451 soluble dans l'eau et permet donc la préparation de formes aqueuses ou de formes plus .solubles de l'antibiotique. 
 EMI43.5 
 On prépare une colonne d'adsorption chromatogrph1qu. à i 

 <Desc/Clms Page number 44> 

 l'alumine que l'on garnit en versant une suspension   d'alumine   de qualité   ohromatographique   (produit du commerce portant le N    71   707 de Merck & Co.)dans un mélange de chloroforme et de méthanol   (3  : 1) dans une colonne en verre ayant un diamètre intérieur de 51 mm environ, de manière que la hauteur d'alumine soit égale à   61   cm environ. 



   On dissout   10   g de la matière antibiotique brute obtenue comme indiqué   ci-dessus   dans 50 cm3 de   chloroforme     et on     int @-   duit lentement la solution dans le-colonne. On élue cette der- nière avec un mélange chloroforme-méthanol (3 :   1)   en   recueil-%'   lant 12 fractions de 500 om3 chacune, puis on continue l'éluti- on avec   un     mél&rge   méthanol-chloroforme (3 :

   1) en   recueillant   37   fractions   supplémentaires de 500 cm3   chacune.     On     essaie     les   fractions en   émanant   à l'air de petite   échantillons   et   en   les mettant à l'épreuve du Staphylococcusaureus.   On     rassemble   les   fractions   d'après leur activité à l'égard du Staphylococcus aureus. Il apparaît que la majeure partie de la matière   élue*   et le maximum d'activité se trouvent dans les   fraction*     13   à 30.

   On rassemble ces fractions, on   concentre   dans le vide et on effectue une précipitation en introduisant le concentré dans de l'éther de pétrole.   On   filtre et on sèche à   l'air   l'antibio- tique R-451   précipite;     rendement  : 1,7 g; activité menifestée par au moins 1  g/cm3 contre le Staphylococcus aureus   (essai   de diffusion   sur     disque).   



   Le tableau 8   ci-dessous   donne les valeurs qui montrent   les   fractions particulières   rassemblées,   indique la   manière   dont la matière antibiotique solide est isolée de l'éluat,   donne   les résultats de   l'essai   sur disque contre le Staphylococcus aureus et les   valeurs   de RF -pour   les   fractions rassemblées dans le système particulier utilisé. las valeurs de RF   sont calculées   de la manière habituelle en suivant la bioautographie   contre -   le Staphylococcus aureus du chromatogramme sur papier   dévelop-   pé. 

 <Desc/Clms Page number 45> 

 



    TABLEAU 8   
 EMI45.1 
 
<tb> Antibiotiques <SEP> E-451 <SEP> : <SEP> Chromatographie <SEP> sur <SEP> alumine
<tb> Fractions <SEP> Traitement <SEP> et <SEP> rendement <SEP> Zone <SEP> d'inhibition <SEP> Système <SEP> bioautographiues <SEP> sur
<tb> rassemblées <SEP> Traitement <SEP> et <SEP> rendement <SEP> (mm) <SEP> ., <SEP> papier
<tb> contre <SEP> S.aureus <SEP> à <SEP> valeurs <SEP> de <SEP> R
<tb> diverses <SEP> concentra- <SEP> valeurs <SEP> de <SEP> RF
<tb> tions <SEP> ( g/cm3)
<tb> 
 
 EMI45.2 
 ] 1G00 100 10 ....a ere 
 EMI45.3 
 
<tb> départ <SEP> 20 <SEP> 14 <SEP> 8 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> , <SEP> 0,15 <SEP> , <SEP> 0,29 <SEP> , <SEP> 0,60, <SEP> 0,74
<tb> inactif <SEP> ¯¯¯¯ <SEP> 0 <SEP> O <SEP> O <SEP> -
<tb> 2 <SEP> résidu <SEP> dissous <SEP> dans <SEP> chloroforme, <SEP> précipité <SEP> 23 <SEP> 17 <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0,0 <SEP> ,

   <SEP> 0,12 <SEP> (trace), <SEP> 0,62, <SEP> 0,74
<tb> avec <SEP> 10 <SEP> vol. <SEP> d'éther <SEP> de <SEP> pétrole.
<tb> 
 
 EMI45.4 
 



  Rendement : 102 mg ¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ 
 EMI45.5 
 
<tb> 3-4 <SEP> traité <SEP> comme <SEP> dans <SEP> 2. <SEP> Rendement <SEP> : <SEP> 725 <SEP> mg <SEP> 15 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0,0
<tb> 
 
 EMI45.6 
 5-8 traité comme dans 2. Rendement : 541 mg 18 11 0 fil 0,0 , 0,18 (trace), 0,62 (trace) ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ # # i '* ......##,, !t ...... 



  9-12 inactif 0 0 16 o Î 8-..--u....,ü- , 0,14 t .- 0,2F3 , ¯ 0,64 
 EMI45.7 
 
<tb> 13-30 <SEP> traité <SEP> comme <SEP> dans <SEP> 2. <SEP> Rendement <SEP> 1,73 <SEP> g <SEP> 26 <SEP> 22 <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> 0,0 <SEP> , <SEP> 0,14 <SEP> , <SEP> 0,28 <SEP> , <SEP> 0,64
<tb> 31-34 <SEP> 1 <SEP> traité <SEP> comme <SEP> dans <SEP> 2. <SEP> Rendement <SEP> : <SEP> 32,5 <SEP> mg <SEP> 25 <SEP> 22 <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> 0,0 <SEP> , <SEP> 0,15 <SEP> , <SEP> 0,29 <SEP> , <SEP> 0,60
<tb> 
 
 EMI45.8 
 35..2 dissous dans l'eau, lyophilisé. 22 17 11 0 0,0 , fl,13 (faibli, 
 EMI45.9 
 
<tb> Rendement <SEP> : <SEP> 111 <SEP> mg <SEP> 0,24 <SEP> (faible), <SEP> 0,59
<tb> 43-49 <SEP> traité <SEP> comme <SEP> dans <SEP> 35-42. <SEP> 22 <SEP> 16 <SEP> 9 <SEP> 8 <SEP> 0,0 <SEP> , <SEP> 0,13 <SEP> , <SEP> 0,25 <SEP> , <SEP> 0,58
<tb> Rendement <SEP> :

   <SEP> 67,5 <SEP> mg
<tb> 
   *) disque de papier-filtre de 6,35 mm de diamètre. 



  **) système benzène-éther de pétrole-acétone (10 : 2,5 : 5), descendant;   
 EMI45.10 
 papier Q1II.atographiqu. (llhatmen B- 1); tempe de développement, 1,5 heures. 

 <Desc/Clms Page number 46> 

 
 EMI46.1 
 



  LEtiE 12 - Préparation de R-451 par fermentation de Ë* ,c",rbonacea var. 2urU.ti&c.% au laboratoire En remplaçant la culture lyophilisée de M. carbonacea 4ane la parti. j, 4.- l i.piu 11 par une culture correspondante de Me 2arbonaoe& var. fturantiaea, et en suivant essentiellement le processus de cet exemple, on peut obtenir de manière analo-   gue     du  R-451. 
 EMI46.2 
 



  EXEMPLE là - Préparation Industrielle de R-:451 par fermentation de Xi, carbonate a -- .¯...... 



  µ1µ1!-41-gormination - - µSâ2-S-.EEBi5S25 !!!¯!¯S!t!i!2 On introduit aseptiquemsnt une culture lyophilisée'Ce M. carbon2c2A dans un ballon de 300 cm3 agité contenant 100 0=3 du milieu de culture stérile suivant t 
 EMI46.3 
 extrait de baato.-boeut 3 g   tryptoae   5 g dextrose 1 g amidon   soluble   24 g extrait de levure carbonate de   çaiaiuas   1 g eau du robinet 1000 cm3   On   fait incuber le ballon et son contenu pendant quatre jours à 35 C (ou jusqu'à ce qu'on obtienne une bonne germination) sur un agitateur rotatif (280 tours/minute, 5 cm de course). 
 EMI46.4 
 



  B. SSÊS-S-EEiS55S.BSBS252S 
Dans chacun des ballons d'une série de trois ballons de 300 cm3 agitée, contenant chacun 100 cm3 du milieu de culture stérile précité, on introduit 5 cm3 du premier   inoculum   obtenu à la suite du stade de germination décrit   ci-dessus.   On fait incuber les ballons et leur contenu pendant 72 heures à 30 C sur l'agitateur rotatif. 
 EMI46.5 
 



  3. !!¯Ut!a:!:!2U!¯!!2g!a!!!! 
On fait passer 25 cm3 du second inoculum obtenu à la suite du stade de pré-ensemencement ci-dessus dans chacun des ballons d'une série de dix ballons de 2 litres, contenant chacun 

 <Desc/Clms Page number 47> 

 500 cm3 du milieu de culture stérile utilisé pour la   germina-   tion. On fait inouber les ballons et leur contenu pendant 72 heures à 30 C sur un agitateur rotatif (280 tours/minute, 5 oa de course). On rassemble les contenus des ballons et on fait passer aseptiquement le bouillon dans un ballon à inoculum stérile comportant une tubulure latérale (volume total : 5   li-   tres environ). 



  D. Stade de fermentation en cuve 
On fait passer aseptiquement les 5 litres   d'inooulum   dans un fermenteur de 130 litres contenant 90 litres du milieu de culture   stérile   employé dans le stade de germination. On fait fermenter de manière aérobie pendant   20 à   30 heures (jusqu'à ce que le volume de cellules tassées soit d'environ 20 à 30 %, tel que déterminé par centrifugation d'un échantillon de 10 om3 à 2800 tours/minute pendant 5 minutes)   dans   les condition  suivantes température 35 C admission d'air stérile environ 153 litres/minute pression environ   0,

  5   atm.au-dessus de la pression   atm.normal@   agitation 160 tours/minute Lorsque le volume des cellules tassées atteint au moins 2   on?    on fait passer aseptiquement le contenu du fermenteur dana une cuve de fermentation de   2500 litres   contenant environ 1665 li- très du milieu stérile suivant :

   extrait de levure 8,5 kg produits solubles de poisson 1,7 kg liqueur de macération de   male(sec)     1,7   kg carbonate de calcium 1,7 kg lactose 51,0 kg agent anti-mousse 500 cm3 eau douce environ 1665   titrée   On fait fermenter à 35 C tout en agitant   à   120 tours/minute et en introduisant de l'air à environ 0,5 atmosphère au-dessus de la pression atmosphérique normale à raison d'environ   425   litre* 

 <Desc/Clms Page number 48> 

 /minute, pendant 50 à 70 heures. A la fin de cette période, la puissance de l'antibiotique produit atteint   un     maximum   qui rente pratiquement constant, comme le montrent un   échantillonnage   et un essai contre le Staphylococcus   aureus.   



   Pendant la fermentation, le pH reste pratiquement comprit entre 7,0 et 7,3. Le volume des cellules tassées atteint une valeur constante égale à environ 2,0 om3. 



  E. Isolation des aubstances antibiotiques après fermentation   en-cuve     On   ajoute 25 kg de matière filtrante (Colite) aux   1850   li- très environ du bouillon de fermentation provenant de la. partie D. de cet exemple, on agite et on filtre. On   élimine   le gâteau de mycélium.   On   extrait le filtrat deux foisavec un volume égal de toluène.

   On combine les extraits par le   toluène-et     .on   concentre dans le vide à   sicoité,   de telle sorte qu'on obtient un résidu huileux brun foncé.   On   met en suspension le résidu dans 1000 cm3 de chloroforme, on filtre et, tout en agitant vigoureusement, on ajoute cette solution dans le chloroforme à 10 volumes d'éther de pétrole.   On   continue l'agiter   pondant   5 minutes.

   On sépare par décantation le précipité   huileux   anti- solide du liquide qui surnage.   On   redissout le précipité   dans   600 cm3 de   chloroforme   et on ajoutela solution à 5   volume    d'éther de pétrole tout en agitant vigoureusement.   On   filtre et   on   ajoute la solution dans le chloroforme, en agitant éner-   giquement, à   10   volumes   d'éther de pétrole.

   On continue   d'agité   pendant 5   minutes.   On sépare par décantation le précipité hui- leux semi-solide du liquide qui surnage, on redissout le   précis     pité   dans   600   om3 de   chloroforme   et on ajoute la solution à 5 volumes d'éther de pétrole tout en agitant   vigoureusement. On   filtre le   mélange ,   on lave le précipité amorphe avec de l'éther de pétrole et on sèche à l'air.   Rendement !  12,6 g; conoentra- tion Inhibitrice minimale contre leStaphylococcus aureus : 1 - 5  g/cm3. 

 <Desc/Clms Page number 49> 

 
 EMI49.1 
 



  Y. lES-3É2â2-âiiS23;5Ï2S-'&-EX5âRS.S.li2il3S*5 !22¯!!!!!!2E¯!.!! 
Au lieu de la méthode décrite dans la partie E. ci-dessus, on peut aussi employer la méthode d'extraction décrite dans la partie C. de l'exemple 11. De cette manière, on obtient environ 125 g de matière solide ayant une activité comparable à celle du produit de l'exemple 11 C. 
 EMI49.2 
 



  C. SéèrLtII2-2¯des substances antibiotiques-en leurs conatitu an t C. êE!!!!!2¯2¯!!-2!!!±!2!!g!!¯-1r¯g!:!:-!! 
Ce processus utilise une chromatographie dans une colonne sur de la terre de diatomées, qui sépare effectivement les sub- stances antibiotiques et permet d'isoler lea constituante R-451A, R-451B, R-451D, R-451E, et ensuite du constituant R-451C1. 



   La séparation des substances antibiotiques obtenues sui- vant la partie E ou, d'une manière moins préférable, suivant la partie F de cet exemple, est effectuée par ohromatographie de partage utilisant un système de solvants à deux phases et une terre de diatomées purifiée (produit du commerce   "Chromoaorb   W", Johns Manville and Company, lavé non acide, dimension partiou- laire 0,25 - 0,15 mm) comme support inerte pour la phase plus lourde comme suit 
On prépare un système de solvants à deux phases ayant la composition suivante :

   éther de pétrole 
 EMI49.3 
 (intervalle débul11t1on 60-9000) 25 parti.. acétate   d'éthyle '   75   parti..   méthanol 70 parties eau distillée 30 parties On équilibre 1,9 kg du support inerte avec 950 cm3 de la phase plus lourde du mélange de solvants à deux phases   ci-dessus   et on verse lentement le mélange dans une colonne en verre de 9 cm de diamètre munie d'un disque fritte à sa partie inférieure, cette colonne ayant été préalablement remplie aux trois quarts de sa longueur de la phase légère.

     On   laisse la terre de diato- 

 <Desc/Clms Page number 50> 

 nées se déposer dans la colonne en formant un lit compact,   Puis     on comprime   sous une pression d'azote   d'environ   0,07 à 0,15   atmosphère au-dessus   de la pression   atmosphérique   normale. 



     (la hauteur   de la colonne   ainsi   préparée est de 137 cm). 



     On   dissout ensuite 7,0 g du mélange amorphe obtenu à la suite du   processus     décrit   dans l'une ou l'autre des   parties B '   . et,? de cet exemple, dans 38 cm3 de la phase lourde du   système '   de solvants à deux   phases.     On   ajoute 19 g de la terre de diato- mées à la solution et   on   introduit le   mélange   solide à la par- tie   supérieure   du lit de la colonne et on   comprima   fortement*   On   élue avec la phase légère du système de   solvants   à   deux,     phases.   



   On recueille les éluats à raison de 50 cm3/minute. Le nom-   bre de     fractions   individuelles est facultatif mais est lié au   volume   "d'arrêt"   (HOV)   de la colonne.   (Le   HUV est défini comme étant le volume qui est occupé par la phase légère du système à deux phases dans le volume total du lit de la colonne).

   Dans cette colonne, le   HUV   est d'environ 3500 om3   On   élimine le premier   HUV   recueilli.   Ensuite,   on effectue une chromatographie sur papier d'un échantillon de chaque fraction recueillie, en utilisant le système de solvants I (tableau 6) et une bioauto- graphie des chromatogrammes développée et séchés, à l'égaré du 
Staphylococcus aureus.On combine les fractions, suivant leur   système   chromatographique sur papier, en   groupes   qui sont en- suite concentrés à siccité dans le vide, les résidus étant pesée et de nouveau chromatographiés sur papier et bioautogra- phiés pour déterminer la composition relative du groupe parti- culier de fractions.

   On obtient ainsi les résultats rapportés dans le tableau 9 ci-dessous, 

 <Desc/Clms Page number 51> 

   TABLEAU   9. 
 EMI51.1 
 
<tb> 



  Chromatographie <SEP> sur <SEP> terre <SEP> de <SEP> diatomées
<tb> 
<tb> des <SEP> antibiotiques <SEP> du <SEP> groupe <SEP> R-451
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> HUV <SEP> Eluant <SEP> Poids <SEP> du <SEP> résidu <SEP> Système <SEP> bioautographique
<tb> 
<tb> 
<tb> cm3 <SEP> mg <SEP> sur <SEP> papier <SEP> ; <SEP> RF
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 1 <SEP> 3500
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 2 <SEP> 3500 <SEP> 4300 <SEP> 0,77
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 2,1-2,9 <SEP> 2600 <SEP> 190 <SEP> 0,79
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 3-10 <SEP> 24500 <SEP> 2200 <SEP> 0,3 <SEP> ; <SEP> 0,65; <SEP> 0,75
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 11-13 <SEP> 7000 <SEP> 100 <SEP> 0,14; <SEP> 0,28;

   <SEP> 0,64
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 14-16 <SEP> 7000 <SEP> 100 <SEP> 0
<tb> 
 
On chromatographie 1 g de la matière obtenue à partir de HUV 3-10 en utilisant le support inerte (Chromosorb W) pour la phase lourde du système de solvants à deux phases suivant : éther de   pétrole (intervalle   d'ébulli.30-60 C) 10   parti..   toluène 200 parties alcool n-butylique 15 parties alcool éthylique 15 parties eau distillée 70   partie    On équilibre au début 600   g. du   support de la terre de diatomées avec 300 cm3 de la phase lourde du mélange de solvants à deux phases ci-dessus et on verse lentement dans une colonne en verre de 5 cm de diamètre partiellement remplie de la phase légère du système de solvants précité.

   On laisse le support se déposer par gravité en formant un lit compact et on comprise par une pression d'azote d'environ   0,07 à     0,15   atmosphère   eu**   dessus de la pression atmosphérique normale. La hauteur de la colonne ainsi-préparée est de 107 cm, et son HUY est de 900 cm3. 



   On dissout ensuite la   tiatière   à chromatographier dans 10 cm3 de la phase lourde du système de solvant précité, on ajoute 5 g du support inerte et on mélange. On introduit le mélange solide à la partie supérieure du lit de la colonne et on comprime fortement vers le bas. On effectue une élution avec 

 <Desc/Clms Page number 52> 

 la phase légère du système de solvants à deux phases précité,   suivant   un débit de 100 cm3 par minute. On recueille continuel- 
 EMI52.1 
 lement' des fractions de 50 à 900 em3 (correspondant a 1/8 #* 1 fois le HUV du lit de la colonne). On élimine le premier HUV obtenu immédiatement après avoir appliqué la matière   d'essai et   on   commence   à recueillir les fractions avec le second HUV. 



     On   effectue immédiatement une chromatographie sur papier   d'un   échantillon de chaque fraction recueillie, en utilisant le 
 EMI52.2 
 système de solvants 1 (tableau 6) et une bloautographie du ohro" matogramme développé et séché, à l'égard du 8,th oeat, aureus (on donne la préférence au système I car c'est celui qui disparaît le plus rapidement). On combine les. fractions selon leur diagramme ou système chromatographique' sur papier, et on concentre à siccité dans le vide les fractions :rascembldeo. On pèse les résidus et on effectue une nouvelle chrcmatographie sur papier suivie d'une bioautographie pour obtenir uM oeï,.. , mation de la composition.

   Le résultat de 1 a4:ps,rkt3,o4 chroma,    tographique   dans la colonne,ainsi opérée est   donné   dans le 
 EMI52.3 
 tableau 10 oi-dsnsauis. 



  TBBEAtr 10 .. 



  Chromatographie du IIUV 3-10 dea   antibiotiques   du groupe R-451 
 EMI52.4 
 Huy Eiuant Poids du résida Système bloautoggaphi4uW 
 EMI52.5 
 
<tb> mg <SEP> sur <SEP> papier <SEP> RF
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 900-
<tb> 
<tb> 
<tb> 1-1,5 <SEP> 450 <SEP> 320 <SEP> 0,78
<tb> 
 
 EMI52.6 
 1,5-14 11000 (580 Q,6* , a 0974   EXEMPT   14 - Préparation industrielle de R-451 Par 
 EMI52.7 
 fermentation de M. earfrûflaeea Q..U<,... 



  On remplaça la. culture 1YQph111'1ée de 11. aart)oa.t 'utili*. a±* dans la partie 1 de l'exemple 13 par une dulturo <!!9ri'eapaaf danta de gs 2 ¯arb2neepa var  tlitrantiaca et on suit par ailleurs 

 <Desc/Clms Page number 53> 

 le processus de l'exemple 13 (parties A à D, E   ou ?   et G). On obtient d'une manière analogue du   R-451.   



  EXEMPLE 15 - Séparation   du constituant   R-451D du   R-451   
On met en suspension 100 mg du résidu obtenu   à   partir des HUV 1,5 à 14 suivant le tableau 10 (exemple 13 G), ou de la fraction correspondants de l'exemple   14,   dans 40 cm3 d'éther      tout en agitant énergiquement à la température ambiante.   On   fil- tre et on refroidit le filtrat pendant une nuit, On filtre le précipité qui se forme et on le lave avec do l'éther refroidi à la glace.

   On sèche à l'air, ce qui donne environ 81 mg d'une poudre presque incolore, titrant 1155 unités par mg représen- tant du   R-451D   très purifié 
Lorsqu'il est essayé quantitativement contre du   Staphyl-     occccua   aureus, le R-451D purifia ainsi obtenu apparaît comme      étant biologiquement homogène. Quand il est chromatographié sur une couche mince de gel de silice suivant la technique de Stahl en utilisant un mélange d'acétone et de benzène (1: 1) comme agent d'élution, suivie d'un traitement à l'acide sulfurique   de      la plaque développée, séchée, aucune substance autre que le   R-451D n'est détectable. 



  EXEMPLE   16 -   Préparation d'acétate de R-451D 
On dissout 25 mg de   R-451D   dans 1 om3 de pyridine.   On     ajou-   te 0,4 cm3 d'anhydride acétique et on laisse reposer le mélange pendant une nuit. On filtre le précipité, on le lave & l'eau pour éliminer la pyridine et l'acide acétique, et on sèche   sur   du pentoxyde de phosphore sous vide poussé pendant une nuit. 



  Rendement : 11 mg d'une poudre amorphe incolore; point de fu-   sion  135 -   136"C.   On peut isoler une seconde récolte de la liqueur   mèro   du précipité mentionné plus haut en   refroidissant   pendant une nuit dans un réfrigérateur   (5 C),   en filtrant le précipité, en le lavant pour le débarrasser de la pyridine et de l'anhydride acétique et en le séchant comme plus haut. 

 <Desc/Clms Page number 54> 

 



    Rendement  : 6 mg   d'une   poudre   amorphe   Incolore*   Lorsqu'on   effectue une   ohromatographie   sur   couche   minse, 
 EMI54.1 
 en utilisant un gel de silice (marque "Silikagel 00 de 3. ÎIIfs1.11. Ai, Go darastadt, Allemagne) comme adsorbant et un mélange rra6.- ton#-"benzène (1 < 1) comme système d'élution et qu'on puivéri- eo de 1  acide sulfurique sur la plaque développé  et eeehee, On obtient un seul constituant ayant une valeur de % égal  à 0,87* (Dans les mimes conditionne   E-451D a une valeur de flp 'pttlw à j 0949Y,, lors d'une b,rdrol; re alcaline dans du rdtrisrol, le a-51i! est régénéré à partir de l'acétate de t .451Tr. 



  SXEMPBE 17 - Séparation du constituant R*451E 
Ce constituant non polaire du mélange antibiotique   se   trouve habituellement en fortes concentrations   dans   la   liqueur   qui surnage lors de la précipitation   dans   le chloroforme et 
 EMI54.2 
 loéther de pétrole décrite dans la partie 3 de l'exemple 13 # #% dans la fraction correspondante obtenue suivant   l'exemple     14.   



   Il est aussi présent, à un degré moindre,dans les   substance*   antibiotiques précipitées   d'où   on peut le récupérer en   utilisant]   
 EMI54.3 
 le procédé chromatographique de partage en colonne décrit dans la partie G de l'exemple 13. 



  Pour obtenir du R-451B, on concentre les HuV 1 à 1#5 -* (tableau   10) à   siccité   dans   le vide et on sèche à   l'air*   On ob- tient 320 mg environ d'une matière ambrée qui est encore puri- fiée par précipitation dans un mélange d'éther et d'hexane, don- 
 EMI54.4 
 nant 280 mg d'une poudre amorphe presque incolore reptiogntant du R-451E purifié. lors d'une chromatographie sur papier   dans   le système I (tableau 6) et d'une   bioautographie   contre le 
 EMI54.5 
 ptaphylooocoua aureus et le Bacillus subtilis. l'antibiotique R-451E ainsi obtenu apparaît comme étant   biologiquement     homogène.   



    EXEMPLE 18 -   Séparation des constituants   R-451B,,   R-451C1 et 
 EMI54.6 
 R'451A¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ Première ---- tion de rw.w 

 <Desc/Clms Page number 55> 

 
On amorce une   séparation   de   ce*     constituent*   des substan- ces antibiotiques brutes par une   chromatographie   de partage analogue à celle qui a été décrite dans la partie G de l'exem- ple   13 en     utilisant   un système de solvant à deux phase% et une terre de diatomées purifiée (produit vendu sous la marque "Chromosorb W" par johna Manville and Company, lavé non acide, dimension particulaire :

     0,25 -   0,15 mm) comme support Inerte   pour la phase lourde, comme suit :   
On prépare d'abord lesystème à deux phases (éther de pétrole, acétate d'éthyle, méthanol  eau) décrit dans l'exemple   13   G.   On   équilibre   2,5   kg du support Inerte avec   1250   cm3 de la phase lourde du   Qélange   de solvants à deux phases et on prépare le lit de la colonne comme décrit dans l'exemple 13 G. Le HUV de cette colonne est d'environ   8000   cm3. 



   On dissout 7,4 g du mélange amorphe obtenu   comme   décrit dans l'exemple 13 E, ou déla fraction correspondant* obtenue conformément à l'exemple 14, dans 40 cm3 de la phase lourde du système de solvants à deux phases. On ajoute 20 g de la terre de diatomées et on introduit le mélange solide à la partie supérieure du lit de la colonne, puis on comprime fortement* On élue avec   le.   phase légère du système de solvants à deux   pliante*   En suivant le processus de séparation chromatographique en colonne décrit dans l'exemple 13 G, on obtient les résultats donnés dans le tableau 11   ci-dessous.   Il est à noter que les constituants R-451B et R-451C1 ont été enrichis dans le groupe de fractions HUY 1,9 à 2,8 , alors que le constituant R-451A a été enrichi dans.

   le croupe de fractions HUY 4,0   à   5,0. 

 <Desc/Clms Page number 56> 

    



  TABLEAU 11. 



  TABLEAV Première séparation des substances antibiotiques du groupe R-451 par chromatographie sur de la terre de diatomées   
 EMI56.1 
 HUY Eluant Poids du résidu Système bioautographique 
 EMI56.2 
 
<tb> cm3 <SEP> mg <SEP> sur <SEP> papier <SEP> RF
<tb> 
<tb> 0,9 <SEP> 7000
<tb> 
<tb> 1 <SEP> -1,1 <SEP> 800 <SEP> 186 <SEP> 0,8 <SEP> ; <SEP> 0,55
<tb> 
<tb> 1,2-1,8 <SEP> 5000 <SEP> 900 <SEP> 0,56 <SEP> 0,43
<tb> 
 
 EMI56.3 
 199-218 7200 5700 z.6 0,23; 0,433 '.'5 2,9-3,9 8000 100 0 0,16 0923; 0,55 4,0-5,0 8000 120 0 (tràc) *)   élution   par de l'acétone 
 EMI56.4 
 mu) 50 % d'acétone dans une élution de méthwiol B, 8 aration çtu R 4 13 et du xMjj'Çj1C l'vn de l'autre On chromatographie 1,8 g du résidu obtenu à parti* du HtI#' . 



  1,9 à 2,8 de la séparation chromatographlqub précédant , sur 1800 g de poudre de cel.uloue (produit vendu sous 1$ marque "Ihatman", lavé non acide$ qualité fine) garnissant une colonne de 7,5 cm de diamètre   aux-   une hauteur de 150 cet, en utilisant le mélange de solvantsà une phase   suivent     acétone ¯¯   1 partie 
 EMI56.5 
 #¯&mèr depetroleihtervalle d'ebullition trole 3O-60eO) dtêbullition 25 parties benzène i 50 partie  On dissout la matière à ohroaatographiey dans 68 <!n3 du.

   mélange de solvants, on mélange 50 g de cellulose avec la solution et 
 EMI56.6 
 on charge la mélange h la partie supérieure du lit â ia 0005   ne*     On   effectue une   caution   à un   débit   de   50     on?   par   Minute .   On recueille   continuellement   des tractions de   100   cm3. Le HUV de 
 EMI56.7 
 cette colonne est d'environ 6000 am3. On combine les éluata comme indiqué dans le tableau 12 ci-desaoue. Il est à noter que le constituant R-451B a été enrichi dans le groupe de j!frae.tio4e 

 <Desc/Clms Page number 57> 

 t HUV 17,7 à 27,7, alors que le constituant R-451C1 a été enrichi dans le HUV   1,7 à   17,6. 



   TABI-EAU 12. 



     Chromatographie   du   HUV   1,9 à 2,8 du tableau 11 
 EMI57.1 
 
<tb> HUY <SEP> Eluant <SEP> Poids <SEP> du <SEP> résidu <SEP> Système <SEP> bioautographique
<tb> 
<tb> 
<tb> cm3 <SEP> mg <SEP> sur <SEP> papier <SEP> RF
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 0,7 <SEP> 4200
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 0,8 <SEP> - <SEP> 1,6 <SEP> 4800 <SEP> 1100 <SEP> 0,55
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 1,7-17,6 <SEP> 96000 <SEP> 300 <SEP> 0,43
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 17,7-27,7 <SEP> 60000 <SEP> 200 <SEP> 0,16 <SEP> ; <SEP> 0,23
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> .27,7-28,1 <SEP> 2400 <SEP> 70 <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0,15
<tb> 
 C. Purification du R-451B 
On dissout 200 mg du résidu   obtenu   du   HUY   17,7 à 27,7 (tableau 12) dans 5 cm3 d'acétone.

   Tout en agitant énergique- ment, on ajoute la solution ci-dessus à 50 cm3 d'hexane.   On   filtre le précipité qui se forme et on lave avec de l'hexane. 



  On   sèche   à la température ambiante dans le vide sur du   pentoxy-   de de phosphore, ce qui donne environ 120 mg d'une poudre d'un blanc légèrement sale. 



   Le   R-451B   ainsi obtenu peut être souillé par des   tracée   d'autres constituants. Toutefois, lorsqu'il est chromatographié suivant la technique de Stahl sur une couche mince de gel de silice en utilisant un mélange d'acétone et de benzène (1 : 1) comme agent d'élution, en faisant suivre cette opération d'un traitement à l'acide sulfurique de la plaque développée et   sé-   chée. On ne détecte qu'une substance ce qui supprime la nécessi- té d'avoir recours à une autre purification. 



  D. Purification du R-451C1 
On dissout 100 mg du résidu obtenu du   HUV   1,7 à 17,6 (tableau 12) dans 5 cm3 d'acétone. Tout en agitant énergiquement, on ajoute cette solution   à   50 cm3 d'éther   isopropylique.   On fil- 

 <Desc/Clms Page number 58> 

 tre le précipité qui se forme et on lave avec de l'éther iso- 
 EMI58.1 
 pro,l1qu. On sèche à la température ambiante dans le vide sur du pentoxyde de phosphore, ce qui donne environ   70   mg d'une poudre d'un blanc légèrement sale constituée par du R-451C1. 



  Le   R-4510   purifié ainsi obtenu est essentiellement biologique* ment homogène comme cela apparaît d'une détermination quantita- 
 EMI58.2 
 t1v centre le 0aphdloc coue ua reue. v E. Purification du .R-451A On fait une bouillie du résidu obtenu du groupe de frac- tisons HUY 490 à 5,0 de la colonne de terre de diatomées (ta- bleau Il) avec 10 ami de dichlorométhane. On filtre et on lave le résidu solide avec du   dlohlorométhane .     On   sèche à la   tempéra-   
 EMI58.3 
 ture ambiante dans le.vide sur du pent5xyde-ds phosphore. ce qui.donne environ 70 mg d'une poudre blancnâtre   constituée  par du R-451A. 



    EXEMPLE   19 - Préparation de SP-30 brut par fermentation de 
 EMI58.4 
 halo2hytica au laboratoire A.   Stade de   germination 
 EMI58.5 
 On introduit une culture lyophilisée de M. halophytica      dans un   ballon,de   300 om3   secoua'contenant   100 cm3 du milieu décrit dans la partie A de l'exemple 1. On fait incuber sur un agitateur rotatif   (280     taure/minute;   5 cm de course) pendant cinq jours à 37 C. 
 EMI58.6 
 



  Stade de fementationï "'--"'-""""""'''''IQ U4- n On fait passer 25 cm3 de l'1noculum obtenu à la suite du stade de germination ci-dessus dans chacun des ballon$ d'une série de quatre ballons de 2 litres, contenant chacun 500 cm3   du milieu suivant :   
 EMI58.7 
 am.dsa eo3uble amidonsoluble   50   g aminé NZ   type.!   10 g eau douce q.s. 1 litre 
 EMI58.8 
 '.' pH après etdrélisation 7i45 . 



  *On fait incuber les ballons et leurs contenus pendant 96 à   120   

 <Desc/Clms Page number 59> 

 heures à 28 C sur un agitateur rotatif. 
 EMI59.1 
 0. Isolation du SP-30 du substrat de fermentation 
A 3,5 litres du substrat rassemblé provenant de la partie B ci-dessus on ajoute une Matière de filtration (terre de dia- tomées) et on filtre. On lave le gâteau de filtre aveo   plusi-   eurs centaines de cm3 d'eau et on ajoute les eaux de lavage au filtrat (volume total d'environ 3600 cm3). On ajoute ensuite un volume égal d'acétate d'éthyle et on agite pendant 30 Minutée. 



  On sépare la couche d'acétate d'éthyle et on extrait de nouveau la couche aqueuse avec un volume égal d'acétate d'éthyle.   On   rassemble les extraits et-on concentre sur un évaporateur à pellicules dans le vide pour obtenir un résidu. Le résidu pèse environ 4 g et, sur des plaquée d'agar-agar, présente une acti- vité antibiotique contre le   Staphylococcus   aureus ATCC 209P qui descend jusqu'à 1  g/cm3. 



    EXEMPLE   20 - Préparation industrielle du SP-30 par fermentation de M.   halophytica.   
 EMI59.2 
 



  A. !!¯1¯!U!i2 Comne décrit dans l'exemple 19 A. 



  B. !H!¯;crlJi2!!¯!.1:2culW! On fait passer 25 cm3 du premier inoeulum obtenu' la suite du stade de germination précédent dans chacun des ballons d'une série de 4 ballons de 2 litres, contenant chacun 500 cm3 du milieu stérile utilisé pour la germination. On fait incuber les ballons et leur contenu pendant 5 jours à 28 C, sur un agi- tateur rotatif (280 tours/minute, 5 cm de course). On rassemble les contenus des ballons. On ajoute 25 cm3 du second inoculum ainsi obtenu à chacun des ballons d'une série de 10 ballon* de 2 litres, contenant chacun 500 cm3 du milieu stérile   précédem-   ment décrit. On fait incuber les ballons et leur contenu pen- dant 3 à 5 jours à 28 C sur un agitateur rotatif (280 tours/ minute, 5 cm de course).

   On rassemble les contenus des   ballone   

 <Desc/Clms Page number 60> 

 
 EMI60.1 
 et on- 4tment le bouillon dans un.ballon à I linoeulua stérile comportait une tubulure latérale (volume total d'environ 5 litres). 
 EMI60.2 
 0* 3tede de ermentation en auve On fait passer   aeeptiquement   les 5 litres de l'inoculum 
 EMI60.3 
 obtenu à la suite de la partie S ci-dessus, dans un fevaente'r*" de 130 litres$ contenant 90 litres environ du   Milieu   stérile suivant .      amidon soluble 4500 g 
Aminé NZ type A   900 g   
 EMI60.4 
 agent anti-mous ce 100 om3 eau douce q.s.

   90 litrea On fait fermenter dans des conditions   aérobies   pendant 55 à 65 heures (jusqu'à ce que le volume des cellules tassées   toit.   
 EMI60.5 
 d'environ 4#5 à 5,0 tel qu'il est détaxu:.né lorsqu'on contre fuge un échantillon de 10 om3 à   2800     tours/minute   pendent 5   ni*   nutes) dans les conditions suivantes :   température   26 C   admission   d'air stérile environ   76-80 litres/minute   
 EMI60.6 
 pression environ 0,5..,Q,g natta. aut-deeeua pression ait , nortaale agitation 1#O-J65 tours/Minute 'Les renseignements c.L-dessous sont ax"aa'x.etiqtea d'une, telle opération de fermentation : 
 EMI60.7 
 Crois- Kemp.

   Admission Pression t/m pH Volume 1>'to1na.t1or1 aanoe 00 air atm. au- cellu- .U'dt8qU. 
 EMI60.8 
 
<tb> heures <SEP> l'minute <SEP> dessus <SEP> les <SEP> contre
<tb> 
 
 EMI60.9 
 normale tassées Statih. ï'us 
 EMI60.10 
 
<tb> 0 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0,49 <SEP> 160 <SEP> 6,80
<tb> 8 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0,55 <SEP> 160 <SEP> 6,95 <SEP> 1,0
<tb> 
 
 EMI60.11 
 16 26 7Ci 0,53 160 6le5 ito 23 26 76 0,52 160 7*10 1,5 <ion  de 14 ma 
 EMI60.12 
 
<tb> 31 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0,53 <SEP> 160 <SEP> 7,35 <SEP> 1,5
<tb> 
<tb> 
<tb> 38 <SEP> 26 <SEP> 79 <SEP> 0,49 <SEP> 165 <SEP> 7,60 <SEP> 2,5 <SEP> -
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 46 <SEP> 26 <SEP> 7? <SEP> 0,54 <SEP> 165 <SEP> 7,75 <SEP> 2,5 <SEP> zone <SEP> de.

   <SEP> 21 <SEP> mm
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 54 <SEP> 26 <SEP> 79 <SEP> 0,52 <SEP> 165 <SEP> 7,90 <SEP> 4,5
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 65 <SEP> 26 <SEP> 79 <SEP> 0,51 <SEP> 165 <SEP> 7,80 <SEP> 5,0 <SEP> zone <SEP> de <SEP> 25 <SEP> mm
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 61> 

 D. Isolation du SP-30 de la cuve de fermentation 
On sépare par filtration le mycélium du bouillon,    en   uti- lisant une matière aidant la filtration. On extrait 90 litres du bouillon avec 2 volumes d'acétate d'éthyle après avoir au préalable ajusté le   pH   à 7,0. On concentre l'extrait à 3   litres   dans le vide. On élimine la couche d'eau qui se sépare après repos, et on concentre encore à 200 cm3 environ. On refroidit le concentré pendant une nuit et on filtre.

   On ajoute le fil- trat à 10 volumes d'un mélange d'éther de pétrole et d'éther éthylique (1 :1) et on filtre. On lave le précipité avec plu- sieurs portions du mélange 'de solvants et   ,on   ajoute les   liqui.-.   des de lavage au filtrat. On concentre le filtrat plus les liquides de lavage contenant les antibiotiques dans le vide et on obtient un-réaidu constitué par une huile marron foncé   pe-   sant 18 g. Ce SP-30 brut   empoche   la   croissance   de Staphylococ- cus aureus 209P sur un milieu d'agar-agar à des dilutions aussi faibles que 1  g/cm3. 



  EXEMPLE 21 - Séparation du SP-30 en ses constituants 
La séparation du SP-30, tel qu'il est obtenu suivant   l'un   ou l'autre des exemples 19 et 20, est effectuée par   ohromatogra-   phie en colonne à l'aide d'une terre de diatomées purifiée (marque "Chromosorb W", de Johns Manville and Company, lave non acide, dimension particulaire   0,25-0,15   mm) comme support inerte. 



   On prépare d'abord   une colonne   de verre d'environ   le,7   mm de diamètre et d'environ  305     mm   de hauteur en la   garnissant   d'une suspension de   "Chromosorb   W" dans du formamide. On mélange une petite portion de "Chromosorb W" avec 1 om3 d'une solution   méthanolique   contenant   408   mg de SP-30 (obtenu en suivant le processus décrit dans l'exemple 20 D). On sèche le mélange   sous   vide pour éliminer le méthanol, puis on garnit   soigneusement   la partie supérieure de la colonne préparée. 

 <Desc/Clms Page number 62> 

 



   On élue la colonne tour à tour avec   100   cm3 des mélanges de solvants suivants : 
 EMI62.1 
 -a. benzène-chloroforme (95 t 5 saturé de foncamidej ^'br benzène-chloroforme (90 t 10) saturé de '011iatlde; Ja. benzène-chloroforme (75 4 25) saturé de formaoidei . d. bonténe-chloroforme (50 t 50) sature de formaraidef j! - e. benzène-chloroforme bzz t@15) saturé de formaeide. 



  ^,On élue ensuite la colonne avec 600 cm3 de Chloroforme et =aemexu avec 1000 cm3 de méthanol. On obtient un total de j 84 fractions en portions de 25 cm?. On effectue une bioautogra- t phie -de chaque portion de 25 om3 contre le 0 .aureua ! À20C -6538P et OR rassemble les portions qui présentent une actio vite antibiotique similaire et lea constituants On concentre | . chaque ensemble dans le vide, on ajoute de l'eau et on extrait chaque ensemble avec du chloroforme. On concentre   chaque   ex- 
 EMI62.2 
 tra.t.uparément à siccité. Les résidus obtenus provenant de chaque ensemble sont bioautographiée comme précédemment contre      
 EMI62.3 
 , le taphylococoua aureua et les constituants sont identifiée .par position.

   L'activité est déterminée par un procédé   normal!-     ; se   sur disque utilisant un disque de 6,3 mm de   diamètre   imprég- 
 EMI62.4 
 a,né de Staphylococcus aureus. Les résultats de cette recherche   , eont   donnés dans le tableau 13   ci-dessous    
TABLEAU 13. 



   Chromatographie sur terre de diatomées des antibiotiques du groupe SP-30 
 EMI62.5 
 portion d'3.ut Ensemble N* T eneur.....eno0j9 a tenant 
 EMI62.6 
 
<tb> 1 <SEP> néant
<tb> 
<tb> 2-5 <SEP> B <SEP> D <SEP> (trace)
<tb> 
<tb> 
<tb> 6-16 <SEP> C <SEP> D, <SEP> C <SEP> (trace)
<tb> 
 
 EMI62.7 
 17*23 C, D (trace) 
 EMI62.8 
 
<tb> 24-43 <SEP> E <SEP> C
<tb> 
 
 EMI62.9 
 bzz6 F , 6, B 
 EMI62.10 
 
<tb> 47-57 <SEP> G <SEP> B, <SEP> C <SEP> (tï-aoe)
<tb> 58-80 <SEP> H <SEP> néant
<tb> 
 
 EMI62.11 
 i, 81-84 A, B (trace), 0 (traee) 

 <Desc/Clms Page number 63> 

   PROPRIETES  PHYSIQUES   ET     CHIMIQUES   DES   ANTIBIOTIQUEµ     PREPARES   
 EMI63.1 
 A PARTIR DES MIpO-ORGANIS#S PREFERES INIQUES PLUS HAUT. 



  La G?:iWAr'YCI:,1, telle qu'elle est préparée par le procédé oi- dessus, est une poudre amorphe blanche ayant les ara,atrit.- ques physiques et chimiques suivantes : I. ]Point de fusion (bloc Kofler):   Ramollissement   à   102*Ci   fusion complète   à   108 C.      



  II. Analyse 
 EMI63.2 
 s) !E!g!-!!!!! a s 50,20'; H 8 9*52%1 N 1 13r'i 1 27,81 (par diffé- renoe) aucun autre élément. 
 EMI63.3 
 b) Te8ta¯qualitatifBet¯uantitatfe¯deB¯groupos 
 EMI63.4 
 
<tb> 1) <SEP> groupes <SEP> méthoxy <SEP> aucun
<tb> 
<tb> 2) <SEP> groupes <SEP> N-méthyle <SEP> 2,75 <SEP> % <SEP> 
<tb> 
 
 EMI63.5 
 3) groupes a-méthyle 2,97 ?t 
 EMI63.6 
 
<tb> 4) <SEP> azote <SEP> Van <SEP> Slyke <SEP> 10,18 <SEP> %
<tb> 
<tb> 5) <SEP> test <SEP> de <SEP> la <SEP> ninhydrine <SEP> positif
<tb> 
 
 EMI63.7 
 6) test de Ëlaon-Morgan (sucrée aminée) positif 7) test de réaction aur maltol négatif 
 EMI63.8 
 
<tb> (pas <SEP> de <SEP> formation <SEP> de <SEP> maltol <SEP> après
<tb> chauffage <SEP> avec <SEP> de <SEP> l'alcali)
<tb> 
<tb> 8)

   <SEP> test <SEP> du <SEP> furfural <SEP> négatif
<tb> 
<tb> (aucun <SEP> produit <SEP> volatil <SEP> absorbant <SEP> les <SEP> ultra-violets
<tb> formé <SEP> après <SEP> chauffage <SEP> avec <SEP> de <SEP> l'acide <SEP> sulfurique
<tb> 
 
 EMI63.9 
 aqueux à 40 ; à 10Q C) 
 EMI63.10 
 
<tb> 9) <SEP> test <SEP> de <SEP> Sakaguchi <SEP> (pour <SEP> les <SEP> guanidinea) <SEP> négatif
<tb> 
 III. Poids moléculaire 
Calculé (dans l'hypothèse d'l groupe 
 EMI63.11 
 u-ciéthyle par molécule) 545 Trouvé (car ébullioacopio dans Le méthanol) 543 IY. l'ovo,ir rotatoire, spécifique {o<)5= + 1468 (1 % dune l'eau) V.

   Solubilité Extï'Smement soluble dans l'eau; soluble dans les milieux polai- res tels que la pyridine   etle     diméthylformamide,   ainsi que 

 <Desc/Clms Page number 64> 

 dans les milieux acides avec formation de sels}modérément soluble dans le méthanol,   l'éthanol   et   l'acétone!  insoluble dans l'éther, le benzène et les hydrocarbures halogénée. 



  VI. Spectre dans l'ultra-violet Complètement transparent dans la gamme comprise entre 200 et   400   m  VII.   Spectre     drins   l'infra-rouge La figure 1 du dessin montre le spectre dans du   Nujol   (Nujol étant la marque qui désigne une huile minérale à base d'hydro- carbures suffisamment pure pour la spectroscopie aux infra- rouges, produit par Plough Inc.,   Memphis,   Tennessee, USA) sur laquelle   # représente   la longueur d'onde on microns, repré-   se@te   la fréquence en cm-1 et A indique l'absorption. 



  Les pics d'absorption (w = faible, m = modéré, m-s = modéré à " fort, s = fort,   va     très fort, sh = palier) sont situés aux   longueurs d'onde suivantes :   
 EMI64.1 
 
<tb> @ <SEP> microns <SEP> Intensité <SEP> dos <SEP> pics
<tb> 
<tb> 3,00 <SEP> m-s
<tb> 3,10 <SEP> six
<tb> 3,25 <SEP> ah
<tb> 3,42 <SEP> s
<tb> 4,30 <SEP> w
<tb> 6,35
<tb> 6,85
<tb> 7,25 <SEP> m-s
<tb> 7,50 <SEP> sh <SEP> (large)
<tb> 7,80 <SEP> sh
<tb> 8,77 <SEP> w
<tb> 9,06 <SEP> m <SEP> (large)
<tb> 9,52 <SEP> s
<tb> 9,78 <SEP> s
<tb> 10,45 <SEP> m-s
<tb> 11,58 <SEP> w
<tb> 
 VIII. Formation de sala La Gentamycine est une base modérément forte qui forme facile- ment des sels avec n'importe quel acide fort organique ou miné- 

 <Desc/Clms Page number 65> 

 ral.

   En général, les sels diacides minéraux sont   complètement   solubles dans l'eau. (Les sels sont obtenus par concentration de leurs solutions aqueuses et par précipitation avec un sol- vant organique miscible à l'eau, de préférence un alcool ali- phatique inférieur ou une cétone). 
 EMI65.1 
 A. 2l2XâIS Point   de   fusion   194-209*0(avec   décomposition) Pouvoir rotatoire spécifique   ([alpha])D25=   +   1130     (1%   dans l'eau) 
 EMI65.2 
 Analyse élémentaire; C s 35,47/'; li s 7p27%i   s 9,69?Sf 0 22,4h; Cl j t 2.,9Uy, Solubilité très soluble dans l'eau et le   méthanol;   légèrement soluble dans   l'éthanol;   insoluble dans les autres   solvants   organiques courante. 



  Spectre dans   l'infra-rouge    (Nujol) -   (voir la figure 2 du 
 EMI65.3 
 ce a s in) . 
 EMI65.4 
 
<tb> (Microns) <SEP> Intensité <SEP> des <SEP> pics
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 3,00 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 3,45 <SEP> a
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 4,27 <SEP> ah
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 4,95 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,27 <SEP> m-a
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,64 <SEP> eh
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,85 <SEP> s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 7,27 <SEP> a
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 7,58 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 7,95 <SEP> ah
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 8,27 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 8,95 <SEP> w <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 9,20 <SEP> m <SEP> (large)

  
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10,25 <SEP> sh <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10,98 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 11,49 <SEP> w <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 13,90 <SEP> m
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 66> 

   Sulfate   
Point de fusion 218-237 C (avec décomposition) 
 EMI66.1 
 Analyse élémentaire s 0 i 31,22#? H ! 1 6f,71 N t Sf465*j 0 s 41$63%1 80 4 < 31,22%. 



  Pouvoir rotatoire spécifique 1 (o(}5"102.(1 dans Iteau)   Spectre dans l'infra-rouge (dans la Nujol) - (voir la figure 3 du dessin) ;    
 EMI66.2 
 
<tb> /\, <SEP> (microns) <SEP> - <SEP> Intensité <SEP> des <SEP> pics
<tb> 
 
 EMI66.3 
 z,95 3,25 s (large) 
 EMI66.4 
 
<tb> 3,45 <SEP> va
<tb> 
<tb> 4,27 <SEP> eh
<tb> 
<tb> 4,80 <SEP> w <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 6,14 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 6,55 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 6,86 <SEP> s
<tb> 
<tb> 7,26
<tb> 
<tb> 7,45 <SEP> sh
<tb> 
<tb> 7,77 <SEP> w
<tb> 
 
 EMI66.5 
 8,70 ..r9 t "15 va (large) 
 EMI66.6 
 
<tb> 10,27 <SEP> m
<tb> 
<tb> 11,38 <SEP> w <SEP> (large)
<tb> 
    C. Autres sels La Gentamyoine par l'action des acides approprias (ou de    
 EMI66.7 
 , sels solubles de ces acid a) dans des milieux aqueux peut 4tre j transformée en sels d'audition insolubles'ou légèrement -aolu-- # blea.

   Lorsque l'anion acide est pharmaeeutiquement acceptable, le sel formé avec la Gentamyc1ne devient apte à être incorpore bzz une composition de suspension aqueuse ou dans l'huile1. 'De telles préparations, administrées par voie parentérale t proou- rent des effets de dépôt avec libération lente de l'an1b10t1- ;   - que.   En   général,     les   acide.   grée   ayant 8   atomes   de carbone ou 
 EMI66.8 
 . plus donnent de tels sels de Gentamyo1n' ayant une solubilité , réduite.   A   titre d'exemples de tels   acides   on peut citer les 
 EMI66.9 
 acides laurique, stéarique, palmitique, oléique,. etc.

   En tait;' . 

 <Desc/Clms Page number 67> 

 d'autres acides se comportent d'une façon analogue pour donner avec la Gentamyoine dee sels dans lesquels leu propriétés hy-   drophilea   de   celle-et   sont combattues par un constituant hydro- phobe fourni par l'anion   aoido.     Comzae   autres types d'acides qui 
 EMI67.1 
 peuvent être utilisés, on peut citer les acides aloanoiquea aryl-aubetituéo tels que l'aoide phénylbutyrique; lea acides oarboxyliques aromatiques, comme l'acide naphtalène-1-oarboxy- lique;

   lea acides aulfuriquaa substituée et su 1 tonique s aubatl- tue- s, comme l'acide laurylsultur1qu. et l'acide dodécylbenzène suif on'.que , respectivement! l'acide oholique, l'acide de lem- holz et lea composés dérives, comme   l'acide   tannique* IX.   Propriétés   diverses 1. Pas de réaction avec l'acide chlorhydrique   méthanolique   
1,8 N au reflux après   2¯heures;   récupération quantitative de la matière de départ. 



  2. L'activité antibiotique'de la Gentamycine   ont   complètement détruite par hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique   6N   à 
 EMI67.2 
 147 C en 15 minutes. Avec de l'acide chlorhydrique 2N z, 
100 C, il faut 7 heures de réaction pour détruire   complète-   ment l'activité. 



  3.   Stabilité :  l'activité de la   Gentamycine   n'est pas altérée de façon importante loraqu'une solution aqueuse de   l'anti.   biotique est soumise à une température de 100 C pendant 
30 minutes dans toute la gamme de pli allant de 2 à 12. 



  4. Autres dérivés la   Gentamycine,   comme les autres   antibioti-   ques ayant des groupes amino primaires, est   transformé*    en 
 EMI67.3 
 dérivés d'acide K-méthylène-aulf unique par l'action de for" maldéhyde bisulfite de sodium (da préférence aur le sulfate 
 EMI67.4 
 de Gentasycine). le degré de conversion des groupée amino primaires de la Gentumyo1no z l'état de dérivé de l'solde V-mthylbneeulron1que est fonction de la quantité du oompo- sé d'addition formaldéhyde-bieulfite de sodium   utilité   dans 

 <Desc/Clms Page number 68> 

      la réaction. le pH du milieu d'où est isolé le produit détermine si la produit est un acide méthanesulfonique ou un sel de cet acide.

   On prépare d'autres dérivés sulfona- tea analogues en faisant agir sur la Gentamyoine des compos- sés d'addition de cétones ou   d'aldéhydes   aliphatiques ou aromatiques avec du bisulfite. Ces dérivés présentent des indices thérapeutiques altérés par rapport à ceux de l'an- tibiotique principal.

   Le dérivé de   Gentamyoine   dans lequel tous les groupes amino primaires apparaissent   comme   ayant été transformés en leurs acides N-méthylènesulfoniques respectifs est préparé comme dans   1 'exemple   10.   Les   proprié-      tés de ce dérivé sont les suivantes   solub@e   dans l'eau, insoluble dans le méthanol;   ([alpha])D25:  + 49,7 (1 % dans l'eau); bandes d'absorption dans l'infra-rouge à 2,90 microns (s),   6,08   microns (m-s), 6,50 microns (sh), 8,72 microns (va) et 
9,62 microns (s). 



   X. Propriétés chromatographiques sur   papier   
La Gentamycine, telle que déterminée par des chromato- grammes sur papier, est différente des autres antibiotiques basiques. Pour obtenir les chromatogrammeson utilise un sys-   terne   ascendant. Le tableau. 14 donne les valeurs   comparatives   de RF dans sept systèmes différents   (les   valeurs qui sont re- liées par un tiret indiquent une raie alors que celles   qui   no sont pas reliées indiquent des taches distinctes et   séparé**).   



   Les antibiotiques produits par les espèces Micromonospora con- nues diffèrent en gros de la   Gentamyoine   par le fait que ce ne sont pas des bases, qu'ils n'ont pas un spectre   large   d'activi- té antibiotique et qu'ils ne peuvent pas être extrait*   avec   une résine Amberlite du type IRC-50 comme décrit dans le   cas   pré- sent. 

 <Desc/Clms Page number 69> 

 



   TABLEAU 14. 



  Comparaison des valeurs de RF de la Gentamyoine dans divers systèmes, avec celles d'autres antibiotiques basiques 
 EMI69.1 
 
<tb> Antibiotique <SEP> Système <SEP> ' <SEP> et <SEP> valeur <SEP> de <SEP> RF
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> G
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Gentamycine <SEP> 0,59 <SEP> 0,26 <SEP> 0,1 <SEP> 0,3 <SEP> 0,45 <SEP> 0,0- <SEP> 0,0-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 0,25 <SEP> 0,48
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Néomycine <SEP> 0,22 <SEP> 0,12 <SEP> 0,29 <SEP> 0,0 <SEP> 0,05- <SEP> 0,0- <SEP> 0,0-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 0,20 <SEP> 0,13 <SEP> 0,50
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Kanamycine <SEP> 0,30 <SEP> 0,18 <SEP> 0,25 <SEP> 0,0- <SEP> 0,15- <SEP> 0,02 <SEP> 0,76
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 0,35 <SEP> 0,

  25
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> famine <SEP> 0,30 <SEP> - <SEP> 0,30 <SEP> 0,05 <SEP> 0,75
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Streptomycine <SEP> 0,57 <SEP> 0,40 <SEP> 0,21 <SEP> 0,06 <SEP> 0,03- <SEP> 0,0 <SEP> 0,0-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 0,19 <SEP> 0,33
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Streptothricine <SEP> 0,36 <SEP> 0,30 <SEP> 0,27 <SEP> 0,27 <SEP> 0,09 <SEP> 0,0 <SEP> 0,18
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Paromomycino <SEP> 0,33 <SEP> 0,11 <SEP> 0,38 <SEP> 0,0 <SEP> 0,03- <SEP> 0,03 <SEP> 0,25
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 0,29
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Viomycine <SEP> 0,27 <SEP> 0,19 <SEP> 0,51 <SEP> - <SEP> 0- <SEP> 0,0 <SEP> 0,43-
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 0,25 <SEP> 0,65
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Dihydrostrepto- <SEP> 0,53 <SEP> 0,36 <SEP> 0,18- <SEP> - <SEP> 0,03- <SEP> 0,

  0 <SEP> 0,22
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> myoine <SEP> 0,45 <SEP> 0,3
<tb> 
 *)   Systèmes   A. 80 % de méthanol (dans de l'eau) + 3 % de NaCl, en utilisant, un papier tamponné au pH 2,3 avec sulfate -   bisulfate,   B. Propanol - pyridine - acide acétique - eau. 



     (15 !   10 : 3 :12). 



  C. Propanol - eau - acide acétique* (50 : 40 : 5). 



  D. 80 % de phénol aqueux. 



    E. n-butanol   saturé d'eau   contenant 2 %   d'acide p-toluène- sulfonique. 



  F. Butanol - eau (84 : 16) + 2 % de piperidine. 



  G. Eau   -butano.   (94 :6) + 0,25 % d'acide p-toluènesulfonique. 

 <Desc/Clms Page number 70> 

 
 EMI70.1 
 



  1 ES BA-3 (MEUHGE DE MOTIONS A BT 1!), préparé comme jor1t ci-dessus, présente les propriétés physiques et chimiquee Bui- vantes: 
I.   Analyse   a)   Analyse élémentaire qualitative       
0, H, N, 0 :pas d'autres   éléments     présenta,        
 EMI70.2 
 b) ) t!!!!¯9.!}!t!!!!!!¯!¯S!:2!:;e!! f ' 1. lfinhydrine positif 2. :E1son...Morgan positif 
3.   Maltol   négatif , 4.   Furfural   négatif 
Sakaguchi   négatif   
 EMI70.3 
 '6. Groupea mëthoxy négatif 
II. Solubilité ((( Semblable à   celle   de la Gentamyoine 
 EMI70.4 
 II 1. Site o tradana l'ultraviolet Transparent dans la gamme de   220 à   400 m . 
 EMI70.5 
 IY.

   Rormatipn de Bels   Sulfate   : poudre amorphe blanche; soluble dans   l'eau,   inso- lubie dans l'éthanol, le méthanol, l'acétone et   les   autres solvants organiques courants. 
 EMI70.6 
 



  V. Çhromator,gthie sur papier Présente les mêmes valeurs de Bp que la Gentam:fo1ne dantt les systèmes A, B, C, D, ! et G (voir tableau 14). Bans le système j E, on observe une séparation avec le Zal-3 (Fraction A) Sréaeri. j tant une valeur de Br égale à 0,15 et le BA-3 (Fraction .3} pré-      sentant une valeur de RF égale à 0,23par rapport à la valeur de RF de la   Gentamycine   dans ce système, valeur qui est égale à 0,45. i 
 EMI70.7 
 I R-451 HRUT , tel qu'il est produit par le procédé de l'exem-: ple 11 D est une substance amorphe incolore ayant lea ctraoté-""!   ristiques   physiques et chimiques   suivantes   :      

 <Desc/Clms Page number 71> 

 I. Point de fusion 
200 à   204"0.   
 EMI71.1 
 II, nal se teat u 1it tüe des grounèb) 1.

   Test de la ninhydrine négatif 2. Chlorure ferrique négatif 
 EMI71.2 
 III.Pouvoir.rotatoire spécifique, - "-.-¯¯ (OC)25- ..16  (0,5 % 'dans le chloroforme), ¯l"r¯ -#:."" IV. Solubilité -- " - - Soluble dans l'eau, insoluble dans l'éther de pétrole! soluble dans la plupart des 801 vante organiques..co\!rtJlt. dialysable à travers une membrane de "OellophaRe" dane un système méthanol-méthanol. 



  V. Spectre danu l'ultrav2olet La figure 4 montre le spectre d'absorption dans le méthanol avec une concentration de 5   g/100   cm3.   (X représente   la longueur d'onde en m , D représente la densité optique) : 
 EMI71.3 
 Àmax à 288 mu (E1 = 50). 



  VI. Spectre dans l'infra-rotî,-i   (dans le "Nujol") - (voir figure 5). Les pics d'absorption sont situés aux longueurs   d'ondes suivantes :   
 EMI71.4 
 >%(microns) Intensité des pica 
 EMI71.5 
 
<tb> 2,92 <SEP> s
<tb> 
<tb> 5,84 <SEP> m
<tb> 
<tb> 6,00 <SEP> m <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 6,12
<tb> 
<tb> 6,45 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 8,00 <SEP> . <SEP> sh
<tb> 
<tb> 8,07
<tb> 
<tb> 8,33 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 8,55 <SEP> eh
<tb> 
<tb> 9,10 <SEP> a <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 9,60 <SEP> , <SEP> s <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 10,26 <SEP> - <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 10,55 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 11,0? <SEP> w
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 72> 

 VII. Stabilité instable   au-dessous   du pH 7 à 20 C. Activité conservée au- dessus du pH 7 même après chauffage pendant 30 minutes à 100 C. 
 EMI72.1 
 



  VIII. Prorrïétée ghromatogre2hîgues sur papier Lorsqu'on prépare un caromatogramme sur papier de la .Manière indiquée ci-dessus et que les taches sont situées rloautographiquement contre le ta h loooca s ure oovaxt) décrit précédemment, les valeurs de Ro de R-451 dune cLiff,6., renia systèmes sont   déterminées   comme suit 
 EMI72.2 
 
<tb> Système <SEP> de <SEP> solvants <SEP> utilisé <SEP> RF
<tb> 
 
 EMI72.3 
 A. 80?? de méthanol aqueux + 3 99 de elllorurît 
 EMI72.4 
 
<tb> de <SEP> sodium; <SEP> ascendant; <SEP> papier <SEP> préalablement
<tb> 
<tb> 
<tb> tamponné <SEP> au <SEP> pH <SEP> 2,3 <SEP> avec <SEP> du <SEP> sulfate-
<tb> 
<tb> 
<tb> bisulfate <SEP> 0,60
<tb> 
 
 EMI72.5 
 B. n-propano1-pyridine-eau-ao1de acétique 
 EMI72.6 
 
<tb> (15 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 3 <SEP> : <SEP> 12) <SEP> ;

   <SEP> ascendant <SEP> 1,0
<tb> 
<tb> C. <SEP> n-propanol-eau-aoide <SEP> acétique
<tb> 
 
 EMI72.7 
 (50 ! z 40 < 5) 0,93 D. phénol aqueux à 80 ; ascendant 0,95 
 EMI72.8 
 
<tb> E. <SEP> benzène-méthanol <SEP> (9 <SEP> : <SEP> 1); <SEP> ascendant <SEP> 1,0
<tb> F. <SEP> benzène-chloroforme <SEP> (95 <SEP> : <SEP> 5); <SEP> descendant}
<tb> 
 
 EMI72.9 
 papier d'abord salure de formamido-methanol 
 EMI72.10 
 
<tb> (1 <SEP> : <SEP> 1) <SEP> et <SEP> séché <SEP> à <SEP> l'air <SEP> pour <SEP> éliminer <SEP> le
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> méthanol <SEP> avant <SEP> utilisation <SEP> 0,0
<tb> 
 
 EMI72.11 
 G. bonsène-éther de pétrole (gamme t.1bi1111 t1Qa 3P à 60"c) -aéétotie (10 8 5,5 t 5)! 0 oi 0,14' descendant . O,2eIO64 r 
 EMI72.12 
 Parai 9 NT.',1'T, ISOUBS du R-451, le constitua * &±±!&# | tel qu'il est produit par le, procédé de l'exempt 1.

   I, 'Mit uni substance amorphe ihc :>lore ayant lea propriété, '\l1Y"' t #? t. Sp8qtre du}a .1? ultraviolet * Tranaperent d$11S la gamme de ?20 à 360 syu II. Spectre dtffl  2xue ; t (deJis le "Nu;Jo11i) .. 1 a #fgue --îg#picsd ''absorptipn sont situés a'1pn. d'ondes sui"antel3; ils sont tous larges et intènàôvii 29d u , 6,25 rta; , 8,25 à 10,00 lU. 

 <Desc/Clms Page number 73> 

 LE   R-451B ,  tel qu'il est produit par le procédé de l'exemple 18 C, est une substance amorphe incolore ayant les propriétés   suivantes :   I. Spectre dans l'ultraviolet 
Transparent dans la gamme allant de 220 à 360 m . 
 EMI73.1 
 



  H. Spectre dans llînfra-roure s (dans le "3tujsl")   (voir la figure 7). Les pics d'absorption sont située aux longueurs   d'ondes suivantes avec les intensités indiquées :   
 EMI73.2 
 
<tb> # <SEP> (microns) <SEP> Intensités <SEP> des <SEP> pics
<tb> 
<tb> 2,94 <SEP> m-s
<tb> 5,72
<tb> 5,80 <SEP> m-s
<tb> 7,92 <SEP> m-s
<tb> 8,60 <SEP> m-s
<tb> 9,10 <SEP> s <SEP> (large)
<tb> 9,64 <SEP> s <SEP> (large)
<tb> 12,50 <SEP> m-s <SEP> (large)
<tb> 13,90 <SEP> m-s <SEP> (large)
<tb> 
 LE R-451D, tel qu'il est produit suivant l'invention, est une poudre amorphe blanche ayant les caractéristiques physique. et chimiques suivantes: 
 EMI73.3 
 I. Point de fusion (blooKof 1er) 
138 et   140 C.   



  II. Analyse a)   Elémentaire   
 EMI73.4 
 C < 52,02, H i 6,81#, N s 0,72, Cl 5104%, b) !n!l2.!!!!!!2-!±2E!2 OCH3 14.,15 ?5. 



  Tess¯s.uaj:a,ts¯dgsgrouggg 1. test de la ninhydrine négatif 2. test de   Elson-Morgan   positif 3. test du KMnO4 alcalin positif 4. test de   l'anthrone   bleu grisâtre 
 EMI73.5 
 5. tent de la 2,4-dini1;:r,o- ph(!nylhydra.z1ne positif 

 <Desc/Clms Page number 74> 

 
 EMI74.1 
 6. test de Ehrlioh. (diphénylamine) négatif 7, test du triphényl-tétrazolium négatif III, ouyo1r ;ott01re spécifique (C()5. + 29,2' (1 dans le dioxane) IV..   Solubilité   très soluble dans le chloroforma, le chlorée de   méthylène,     l'acétone   et le méthanol; modérément soluble dans l'éther; 
 EMI74.2 
 insoluble dent l'éther de pétrole, le toluène, 16 beiisëne, l'eau. 



  -Peotri dans 1-tultr violet . La figure 4 montre le spectre dane le méthanol (concentra- -' tiO1 2,97 mg/100 om3) <.a 290 jusqu'à ±951 =/1.1' (E1% =37). 



   Dans une solution de 6 cm3 de potasse normale diluée avec 
 EMI74.3 
 du méthanol à 100 om3, ............ 31% a 79. 



  VI. Speotre dans l'infra-rouge t (dans le *XuJolO) - (voir la   figure   8). Les pics d'absorption sont situés aux longueurs d'ondes suivantes 
 EMI74.4 
 
<tb> (microns) <SEP> Intensité <SEP> des <SEP> pion
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 2,88 <SEP> s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 5,73 <SEP> s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,13 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,33 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,45 <SEP> s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 7,98 <SEP> s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 8,32 <SEP> s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 8,50
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10,00 <SEP> )
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10,22 <SEP> s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10,55
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 11,00 <SEP> m-s
<tb> 
 
 EMI74.5 
 11 l'é5 m-a 
 EMI74.6 
 
<tb> 12,30 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 12,98 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 13,55 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 13,

  87 <SEP> m-s
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 75> 

 VII. Formation, de dérivée 
 EMI75.1 
 a) rem±!* 16 point de fusion 135 à 136 C; spectre dans l'ultraviolet, absorption maximum à 
 EMI75.2 
 285 M/U (Ele - 9,2). analyse élémentaire. s 0 9 53,00?:, H s 7,4r x a O#77?fj bandes d'absorption dans l'inlraira8a (dans le "Dujo I comme suit : 
 EMI75.3 
 
<tb> \ <SEP> (microns) <SEP> Intensité
<tb> 
<tb> 2,85 <SEP> w <SEP> (large)
<tb> 5,57 <SEP> m-s
<tb> 5,71 <SEP> a
<tb> 6,14 <SEP> w
<tb> 6,45 <SEP> m-s
<tb> 8,02 <SEP> s
<tb> 
 
 EMI75.4 
 8,38 M-9 8,88 # 9,17 9,55 VIII. Stabilité 
Le   R-451D   est stable à 0 C et dana l'obscurité. A la température ambiante dans la lumière solaire directe, l'activi- té antibiotique décroît lentement au bout de 24 heures et est complètement détruite au bout de 3 semaines environ.

   Dans le méthanol comme solvant, le R-451D est stable pendant au moins 2 semaines. Une rapide desactivation se produit à un pH inféri- eur à 5,5 tandis qu'au pH supérieur à 7 et allant jusqu'à 14, l'activité est conservée pendant quelques jours. L'activité antibiotique est détruite par traitement avec de l'acide   ohlor-   hydrique méthanolique   décinormal à   la température ambiante pen- dant 16 heures.

   Un traitement du mélange acide avec une   quanti-   té   stoechiométrique   de bicarbonate de sodium (solution   aqueuse   
 EMI75.5 
 à 2 ), suivi d'une élinination du aéthano7 par concentration 

 <Desc/Clms Page number 76> 

 dans le vide et extraction avec du chloroforme, donne un 
Balance de cinq   constituants,   tels que déterminas par   chroma'*'   tographie en couche mince sur du gel de   silice   en utilisant un mélange benzène-acétone (75 : 25) comme solvant et de l'acide sulfurique comme pulvérisation réactive. Toua les constituante sont moins polaires que le R-451D. Par traite- ment avec de la soude normale à la température ambiante pen- dant 16 heures, l'activité du   R-451D   est complètement conser- vée. 
 EMI76.1 
 



  IE B-4ftlE , * isole et purifié comme décrit précédemment (voir l'exemple 17) ent une poudre amorphe presque incolore   ayant   les propriétés physiques et chimiques suivantes t I. Point de   fusion   
 EMI76.2 
 ##59 96fT" T. , na3 ee 
 EMI76.3 
 
<tb> a) <SEP> Analyse <SEP> élémentaire, <SEP> quantitative <SEP> 
<tb> 
 
 EMI76.4 
 c s s5,nr; H t 7,54%;

   N 1 1,31et o 24.2'.' b) Testa qualitatifs des groupes 1. tuât da la ninhydrine 11 tif ( 2. test de E loori-14organ positif 
 EMI76.5 
 
<tb> 3. <SEP> test <SEP> avec <SEP> du <SEP> KMnO4 <SEP> alcalin <SEP> positif
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 4. <SEP> test <SEP> de <SEP> l'anthrone <SEP> positif
<tb> 
 
 EMI76.6 
 5. test dt la i,4'^li,riitz'D.p7;11jrx.ilydr.Z.tx .positif . 6. test d'Uhtlich(avec de la d1phényle.mine)négt1f - 7. teat du triphényl-ttrazolium popfltif 
 EMI76.7 
 III. pouvoir rotatoire 8péoitiQ (0O|5  + '6,1  (1 dana le d1oxane). 



  IV. Solubilité ' Soluble dans le ohloroformet le chlorure cte sthylMt ' ' l'acétone  le méthanol et l'éther;, modérément éluble :dtinl le benzène le toluène et l'hexane; insoluble dans t"lfS\h V. Spftotro '?Q) l'ultrvglel La figure 4 montre le spectre dans le méthanol Avec   un'*   

 <Desc/Clms Page number 77> 

 concentration de   3,0     mg/100   cm3   :#max =   240 m  (E1% = 232). 



  VI. Spectre dans l'infra-rouge (dans le "Nujol") - (voir la figure 9). Les pics d'absorption sont situés aux longueurs d'ondes suivantes avec l'intensité indiquée ci-dessous : 
 EMI77.1 
 
<tb> # <SEP> (microns) <SEP> Intensité <SEP> des <SEP> pics
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 2,94 <SEP> m-a
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 5,68 <SEP> s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 5,76 <SEP> s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 5,83 <SEP> a
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6 <SEP> , <SEP> 00 <SEP> ' <SEP> va
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,16.

   <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,22 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 7,87 <SEP> va
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 8,31 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 8,55 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 8,96 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 9,33 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 9,55
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 9,77 <SEP> m-a
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10,50 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10,90 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 11,26 <SEP> m-a
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 11,42 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 12,22 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 12,62 <SEP> m-a
<tb> 
 LES ANTIBIOTIQUES DU GROUPE SP-30 sont solubles dans la plupart des solvants organiques tels que l'acétate d'éthyle, le chloro- forme, le chlorure de méthylène (et lea autres hydrocarbures   halogènes)

     et les alcanols inférieurs {par exemple le méthanol et   l'éthanol);   ils ont une solubilité minimale dans l'eau. Du bouillon de fomentation à un pH de 2 à 9,5,on extrait facile- ment le   SP-30   par le butanol, l'acétate d'éthyle, le chlorure de méthylène, le chloroforme, le tétrachlorure de carbone, le benzène ou l'éther. 



   Lorsqu'ils sont soumis à certains tests qualitatifs des 

 <Desc/Clms Page number 78> 

      groupes, le SP-30 et   ses   constituants   Isolée   donnent les réponses suivantes   test.   de la ninhydrine et de Sakaguchi négatif   (La   SP-30 brut ainsi que tous ses constituante isolée) 
Sucres réducteurs (avec du nitrate d'argent   ammoniacal)   positif (Parmi les constituants   isolés, @   est fortement positif, B, C et D sont négatifs); 
Réduction de   ferrioyanure   positif (Parmi les constituants isolés. réagit négativement, B, 0 et D positivement). 



   . Le   Se-30   et ses constituants fractionnée, dans une solution méthanolique, sont absorbants dans l'ultraviolet dans   l'inter-     valle   allant de 220 à 400 m  avec les   Caractéristiques   suivan- tes : le   SP-30   brut a une courbe d'absorption pas très décrite avec des pointa d'inflexion à 260 m  et 290 m , le   pdint à   
260   m/u   ayant un E1% d'environ 28; le   SP-30A   a une courbe de type similaire avec une inflexion à 258 m  (E1% d'environ 70) et une seconde inflexion à 295 m/u environ; le   SP-30B   présente un maximum à 268 m  (E1% d'environ 111); le SP-30C ne présente pas de maxima mais des inflexions à 265 m  (E1% d'environ   181)   et à environ 290 m ;

   le SP-30D présente un maximum à 263 m  (E1% d'environ 115). les spectres dans   l'infra-rouge   du SP-30 et de   non   consti- tuante isolés en suspension dans du "Nujol"), sont indiqués par]      les figures 10 à   14,   respectivement.

   Les pics d'absorption et les caractéristiques de bandes sont donnés dans les tableaux   suivants :    

 <Desc/Clms Page number 79> 

 
 EMI79.1 
 
<tb> SP-30 <SEP> (voir <SEP> la <SEP> figure <SEP> 10) <SEP> Intensité <SEP> des <SEP> Pion
<tb> 
<tb> 
<tb> # <SEP> (microns)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 2,98 <SEP> s
<tb> 
<tb> 
<tb> 5,78 <SEP> a
<tb> 
<tb> 6,00 <SEP> m-a <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,58 <SEP> w
<tb> 
 
 EMI79.2 
 6 , 81 maza 
 EMI79.3 
 
<tb> 7,02 <SEP> w <SEP> (sh)
<tb> 
<tb> 7,22 <SEP> m
<tb> 
<tb> 7,71 <SEP> m-a <SEP> (sh)
<tb> 
<tb> 
<tb> 7,83 <SEP> a
<tb> 
<tb> 8,32 <SEP> w <SEP> (eh)
<tb> 
<tb> 
<tb> 8 <SEP> , <SEP> 86 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 9,28 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 
<tb> 9,54 <SEP> large
<tb> 
<tb> 9,75 <SEP> large
<tb> 
<tb> 
<tb> 13,42 <SEP> m
<tb> 
<tb> 14,20 <SEP> w <SEP> (large)

  
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> SP-30A <SEP> (voir <SEP> la. <SEP> figure <SEP> 11) <SEP> Intensité <SEP> des <SEP> pics
<tb> 
 
 EMI79.4 
 À (!nierons) 
 EMI79.5 
 
<tb> 2,95 <SEP> 'a <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 3,42 <SEP> m
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 5,82 <SEP> s <SEP> (sh)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 5,89 <SEP> a
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,15 <SEP> m <SEP> (ah)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,60 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,80 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 7,16 <SEP> m-a
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 7,56 <SEP> m <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 8,50 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 9,22 <SEP> w
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 9,46 <SEP> w
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 80> 

 
 EMI80.1 
 SP-30B (voir la figure 12) Intensité des pioa 
 EMI80.2 
 
<tb> 2,98 <SEP> w <SEP> (large)

  
<tb> 
 
 EMI80.3 
 5,72 m-s ; 5 , 80 mes 
 EMI80.4 
 
<tb> 6,79 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 7,15 <SEP> m-s
<tb> 
 
 EMI80.5 
 7,2l - Vs \ # - 
 EMI80.6 
 
<tb> 7,88
<tb> 
<tb> 
<tb> 8,70 <SEP> s <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 
<tb> 10,00 <SEP> s <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 11,51 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 
<tb> 12,00 <SEP> s <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 13,00 <SEP> (large)
<tb> 
 
 EMI80.7 
 SP-300 (voir la.

   figure 13) Inteaaite 4es PiOt 
 EMI80.8 
 
<tb> (microns)
<tb> 2,95 <SEP> w <SEP> (large)
<tb> 5,74 <SEP> s
<tb> 
 
 EMI80.9 
 6,20 , (eh) 
 EMI80.10 
 
<tb> 6,79 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 7,20
<tb> 7,70 <SEP> (sh)
<tb> 
<tb> 
<tb> 7,82
<tb> 
<tb> 8,85
<tb> 
<tb> 9,28 <SEP> s
<tb> 9,56 <SEP> m
<tb> 
<tb> 9,60 <SEP> (large)
<tb> 
 
 EMI80.11 
 9,90 bzz rua (large) 
 EMI80.12 
 
<tb> 11,50 <SEP> w <SEP> (large)
<tb> 12,00 <SEP> (large)
<tb> 
 
 EMI80.13 
 12,80 '',''* m-a (large) 
 EMI80.14 
 
<tb> 13,35 <SEP> w <SEP> (large)
<tb> 14,15 <SEP> (large)
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 81> 

 
 EMI81.1 
 
<tb> SP-30D <SEP> (voir <SEP> la-figure <SEP> 14) <SEP> Intensité <SEP> des <SEP> pion
<tb> 
<tb> \ <SEP> (microns) <SEP> 
<tb> 
<tb> 2,95 <SEP> m
<tb> 
<tb> 5,75 <SEP> s
<tb> 
<tb> 6 <SEP> , <SEP> or.

   <SEP> m <SEP> (sh)
<tb> 
<tb> 6,16 <SEP> w <SEP> (sh)
<tb> 
<tb> 6,30 <SEP> w <SEP> (sh)
<tb> 
<tb> 6,56 <SEP> w <SEP> (sh)
<tb> 
<tb> 
<tb> 6,78 <SEP> m-s
<tb> 
<tb> 7,20 <SEP> m
<tb> 7,28 <SEP> w <SEP> (sh)
<tb> 
<tb> 
<tb> 7,70 <SEP> a <SEP> (ah)
<tb> 
<tb> 7,80 <SEP> a <SEP> (ah)
<tb> 
<tb> 7,88
<tb> 
<tb> 8,32 <SEP> w
<tb> 
<tb> 8,52 <SEP> w <SEP> (ah)
<tb> 
<tb> 8,88
<tb> 
<tb> 9,28
<tb> 
<tb> 9,42 <SEP> m-a <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 9,56 <SEP> - <SEP> m-s <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 9,72 <SEP> m-s <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 10,44 <SEP> w
<tb> 
<tb> 11,30 <SEP> w <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 11,60 <SEP> w <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 11,82 <SEP> w <SEP> (sh)
<tb> 
<tb> 12,42 <SEP> a
<tb> 13,32 <SEP> m <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 
<tb> 13,48 <SEP> m <SEP> (large)
<tb> 
<tb> 14,20 <SEP> m <SEP> (large)

  
<tb> 
 La stabilité du   SP-30   varie d'un constituant à   1'autres   En par- ticulier, la fraction A est stable   à   la température   ambiante   en mélange avec un tampon aqueux   à   un pH compris entre 2 et 4. 



  A 100 C, son activité antibiotique diminue lorsque le pH des- cend au-dessous de 6. Son activité est détruite au pH 2 par chauffage à   100*0   pendant 30 minutes alors qu'on n'observe pas de perte d'activité dans des conditions similaires au pH 7 ou plus. La fraction   B est   stable au pH compris entre 2 et   10 à   la température ambiante. A température élevée (100 )elle est sta- ble pour un pH descendant jusqu'à 2 pendant 30 minutas, son activité diminuant à partir de ce point. La fraction 0 est sta- ble sur l'intervalle de pH allant de 2 à 10, même à 100 C pen- dant 30 minutes. La fraction D est stable du pH 2 au   pH   10 à la température   anbiante   et du pH 4 au pli 10 à 100 C pendant   30   min. 

 <Desc/Clms Page number 82> 

 
 EMI82.1 
 



  PROPRIETES BIOLOGIQUES D$8 T.' BIOTT UE OBTENUS D'APRES LES EXEMPLES PRECEDEES la IENT &N.INE possède un large spectre anti-bactérien et anti* rickettoial. C'est un agent anti-infectieux utile capable d'in- hiber efficacement certaines manifestations de maladies duos au Stphloooocua ureua, au I.r a.a.3. pneumonïae,et à d'autres UULRIIILIlJllh .|l irillirinLllJ I"MUIT  -*#"- Je" i""J Vir 1ril'IL organismes   pathogènes,   Elle est aussi   utile   pour traiter la 
 EMI82.2 
 z> mastite des beetia.ux. 



  Elle art partà.aul.ir$mert efficace pour combattre les tnd* fictions de l'appareil rjriixaire causées par les organismes gras** négatifs tels que les eapeoea de Proteua et de Patudomonaa. On ' oaït-4ue le nombre des Infections dues aux organismes gram-'-nega"'   tifs,-'qui   nécessitent une hospitalisation, va en   augmentant,   La   Gentamycine   apparaît particulièrement utile pour le traitement      
 EMI82.3 
 de telles infections grasi-négatlves chroniques des reins et du la vessie même sur des patienta réfractaires. L'activité anti- biotique élevée de la Gentamycine contre les   infections   dues au 
 EMI82.4 
 Prot6ite et au Pseudomonaa permet facilement une utilisation clinique.

   Comme exemple particulier   d'un   effet de ce genre, on , peut indiquer que la   Gentamyoine   a été utilisée avec succès 
 EMI82.5 
 pour traiter une infection chronique des reine due au Paeudomo- ? nas, à une dose de 1 mg/kg   administrés   trois fois par jour. 



  . Cette infection qui ne réagissait pas bien aux autres thérapies a été  - complètement     éliminée   de l'urine après 1 jour de traite-   ; ment   et n'a pas réapparu   cerne   au bout de 10 jours. Des   résul-     tata   analogues ont été obtenuecontre plusieurs infections dues 
 EMI82.6 
 i. au Proteus. Il apparaît donc que la Gentamycine comporte une combinaison avantageuse de types uniques d'activité conjointe- ment à une faible toxicité permettant son utilisation de préfé-   ronce-aux   autres antibiotiques. 
 EMI82.7 
 L'activité.antibiotique de la Gentamyoine est de 1120 Uni- téamg, celle de son chlorhydrate de 82t, et celle de son aul  

 <Desc/Clms Page number 83> 

 fate de 800 unités/mg. 



   L'activité in vitro comparée de la   Gentamyoine   contre divers organismes   grau-positifs,   gram-négatifs et   résistants   aux acides est rapportée dans le tableau 15 ci-dessous. 
 EMI83.1 
 

 <Desc/Clms Page number 84> 

 
 EMI84.1 
 TABLEAU 15. 
 EMI84.2 
 Spectre antibiotique (Activité in vitro) de la Gentamyoine 
 EMI84.3 
 par comparaison avec la :

  an81IlYQine et la 11 eomyoine 
 EMI84.4 
 Micro-organisme essayé Concentration nhib1tr1c Désignation minimale (/ug/cs3) Ho  ayatématiue de la Genta- W ,## souche x) myoine myoîne myoino 
 EMI84.5 
 
<tb> Gram-positif
<tb> 
 
 EMI84.6 
 Bacillus careus var. mycoidea DA 30 0,5 #0 0,5 l3acillua cereua 
 EMI84.7 
 
<tb> var. <SEP> mycoidea <SEP> DA <SEP> 34 <SEP> 0,5 <SEP> 1.5 <SEP> 0,5
<tb> Bacillus <SEP> cereua
<tb> 
 
 EMI84.8 
 var. mycoldea ATCC 7064 0,75 3,0 2,0' Bacillus r-egatherium DA 31 0,075 0,25 0,075 Baeïllus subtilie ATCC 6633 0,015 0,035 0,015 Bacillus sphaericua DA 32 0,1 K) 0,75 0125 Bacillua sphaerieun DA 33 0,05 0,75 0,075 Brucella abortua DA 70 0,25 0,75 ot5 Staphylococous ATCC 6538P 0,075 0,75 0,1 
 EMI84.9 
 
<tb> aureus
<tb> 
 
 EMI84.10 
 aureus A2G0 12715 Q 055 005 0,035 Staphylococcus 68 0 17 0,75 Û>375 aureus .;

   ;.1" Otl75 Ot75 ob375 Staphylococcue ATC0 99Ó6 0 25 1 5 ob75 aureus Staphylooooeue ATCO 116 175 aurous ATC0 1163 0,175 Ot75 O 3?5 SaSSu8 000CUB Grae Q 375 l S   25 Staphy1ooooQI.1S Smith 0 f:)5 0,75 0,375 ' Bï Sfeî  q00Ua DA40 Oi25 l 5 /.0<2. aureUI3 0025 1#5 StaphyloQoCQU8   375 0 2 "o# 5 * epiderznid1a DA 41 0,375 0,25 0*25 Sarcina lutea COC 9341À Ot25 0 75 '. 0025 Saroinalutea ATGC 9343 0,25 3,0 0.,2'5' Spyal>en9rCU8 DA 21 6,0.** ) # 5 .O*. /ô.O . 



  Streptooodous Da 20 12 0 )100 0 'f 3.G O' fecalie ATCO 10541 12tO >100,0 '46*io Micrococcua flavue DA 60 0,075 6,0 - - '# 075 . 



  Corynebao;er1um DA 80 2015 z5 . aimplex 

 <Desc/Clms Page number 85> 

 
 EMI85.1 
 TABLEAU 15 (aulto) Spectre antibiotique (Activité in vitro) dû la Gentamyoine par comparaison avec la Kànamyoine et la Neomycine 
 EMI85.2 
 Micro-organisme essayé. -- - Concentration inhibitrioe ,t..f l)dation minimale (/Ug/QM3) ..om eya o::ca qU& de la Genta- Kana- Neo- souche x) mycine mycine -- mycine,. 



  Gray-négatif Aerobacter aerogenea DA 9D 0,75 94,0 24,0 Aeromonac salmonicida DA 1CO 0,25 3,0 0,25 Alca11eenea op. ATCc' 10153 0,025 0,5 0,75 Alcalicenes fecalia ATOC b750 1,5 3,0 1,5 Escherichia coli DA 110 1,25 12,0 3,0 Eseherichia coli ATCC 10586 1,5 12,0 6,0 Escherichia lil 315 intermedia DA 111 '5 1,5 1,5 Klebaiella pneumoniae DA 1 O,;

  S5 0,75 0,375 Proteus hydrophlla DA 120 C,5 12,0 12,0 Proteus vulearis DA 121 6,0 16,0 12,0 aaruginosa ATGC iQ197 0'2  '25  '25 Paeudomonas X200 9027 0 25 12tO l 5 Pseudomonaa ATCC 9721 0,25 6,0 1- 0- --- Pseudomonas ATOC 10145   25 12tO 310 Psaudomonas ATCC 8709 0025 12to lo5 Salmonella 10 12'  ' le5 schottmuelleri  Salmonella DA11 6,0 12,0 12 0 
 EMI85.3 
 
<tb> typhimurium
<tb> 
 
 EMI85.4 
 Salmonella ATCC.9187. 3#0 1200 12 n 
 EMI85.5 
 
<tb> Résistant <SEP> à <SEP> l'acide
<tb> 
 
 EMI85.6 
 Myoobacterium amegmatia DA 150 0,15 # Uycobaoterium '7 EY 2O++* tuberculouis ¯¯¯ 37 "' "'" "¯¯¯ 
 EMI85.7 
 z) DA :

   référence au 2dp de Collection de la Schering Corpo- 
 EMI85.8 
 ration. 
 EMI85.9 
 HH) 1 d'extrait de levure, 1 yS de milieu de dextrose ***) 5 gaz de sérum humain ajouté 
 EMI85.10 
 +) Bouillon levure-boeuf (Difco) 
 EMI85.11 
 *+) Milieu Dubos t "tween 80" (=ono-o:'\5ah de polyoxyéthr.  ûne-sorbitaïl) 

 <Desc/Clms Page number 86> 

 
 EMI86.1 
 La susceptibilité des luîoro-organismes à l'égard de X #antibio- tique a   été déterminée   par la méthode   normalisée   de dilution en tube comme suit Dans chaque exemple,   on   a utilisé   des   
 EMI86.2 
 dilutions de 105 do bouillons de cultures de 4 heures comme' inooulumt les points extrêmes étant pris après l'incubation pendant 24 heures à 3?*C.

   Saut indication contraire,, in milieu nutritit était constitue par un bouillon d'infusion dé coeur- t' cervelle (1'ar. an oe tableau, les sulfates des antibioti- ques particuliers, ontété   utilises   dans les tests contre les   micro-organismes     énumérée.     Toutefois),  les   concentrations   inhi- 
 EMI86.3 
 1 bitripea minime.le sont exprimées par rapport à 1' antibiotique de base pur. 



   On a aussi essayé l'activité in vivo contre   certaines   infections   bactériennes   chez des souris. Les souris ont été 
 EMI86.4 
 '<- infectées avec un inoculum des bactéries particulières adtainia-" tré.es par Injection intraperitonéalet Elles ont été ensuite traitées par injections sous-cutanées de sulfate de Gentamyoine (724 unités par mg) dissous dans de l'eau, ces   injections   étant administrées suivant deux doses quotidiennes   égales*   la dose protectrice pour des pourcentages variables d'animaux injectés a été déterminée comme indiqué dans le tableau 16   ci**dessous   : ',   TABLEAU 16.   



   Activité in vivo de la   Gentamycine   
 EMI86.5 
 tico.-organieme d'infection Dose de Gentamy- Pourcentage 
 EMI86.6 
 
<tb> aine <SEP> /ug/souris/ <SEP> de <SEP> survie
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> ' <SEP> jour
<tb> 
 
 EMI86.7 
 Klebaiells pneumoniae 0 (solution 0 
 EMI86.8 
 
<tb> saline <SEP> témoin)
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 20 <SEP> 20
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 30 <SEP> 50
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> - <SEP> 40 <SEP> 80
<tb> 
<tb> 
<tb> 50 <SEP> 100
<tb> 
 
 EMI86.9 
 9t&phylocooousur6&-ray 40 40.

   -###- 60 .50 
 EMI86.10 
 
<tb> 80 <SEP> 100
<tb> 
 
 EMI86.11 
 Salmonella achottmuellort 80 50 

 <Desc/Clms Page number 87> 

 
La toxicité aiguë de la Gentamyoine sur des souris a été déterminée de la manière normalisée par diverses   voies    En uti- 
 EMI87.1 
 lisant le sulfate de Gentamyoine indiqué plus haut, sur don souris pesant 18 à 20 g, on a obtenu les résultats suivants :

   
 EMI87.2 
 
<tb> Mode <SEP> d'administration <SEP> 50 <SEP> (mg/kg <SEP> de <SEP> souris)
<tb> 
<tb> sous-cutané <SEP> 675
<tb> 
 
 EMI87.3 
 intrapéritonéal 550 
 EMI87.4 
 
<tb> intraveineux <SEP> 75
<tb> 
<tb> buccal <SEP> > <SEP> 10000 <SEP> 
<tb> 
 La   Gentamycine   présente en outre une activité   antivirale   
 EMI87.5 
 in vitro contre le Rickett,eia ¯2¯¯k¯arie De  groupes d'oeufs embryon* naires de six jours ont été infectés chacun avec cinquante foie la LD 50 de Rickettaia akari. Une seule dose de 3.0 mg de Genta- mycine, administrée 3 heures avant l'infection, assure une protection à 50 je (P7j50). On obtient une proteotion , 20 lorsqu'on commence le traitement par :a   Gentamyoine   deux heures après infection.

   Sur des souris   infeutées   par voie intracéré- 
 EMI87.6 
 brale avec arproxiaativemetit 450 fois la LD 50 de Rickettaia, akari,une protection à   100   est procurée par 5 mg de   Genta-   mycine, administrée par voie sous-cutanée 4 heures avant   infec-   tion et le traitement étant   poursuivi   pendant 4 jours   à   raison de5 mg par jour en2 doses. Lorsque le traitement par la 
 EMI87.7 
 Gentamycino est retardé 48 heures après l'infection intrao'r4- .   brale,   on obtient encore une protection à 100 % par administra- tion sous-cutanée de 10 mg par jour (deux doses de 5 mg chaque) pendant 5 jours. 
 EMI87.8 
 



  La Gentamyoine et ses sels ont un effet érapeut1qUe lorsqu'ils sont essayés sur des sourie contre la souche H 37 RY de mycob.act.eriun tuberculosis. 



   BA-3 s en utilisant une solution du mélange, on peut démontrer l'activité antibiotique de cette solution titrant 
 EMI87.9 
 10 unités/cn3 (basé sur la méthode de détermination utilisée pour la "ventarayaine), contre les S taphylococcua ua reua, 

 <Desc/Clms Page number 88> 

 
 EMI88.1 
 Streptococcus fecalia. 3aoiXlua subtilis, # Bscheriohl ftp'lf  Belmenella achottmuelleri, Paeudotaonas ir,os, et Elobaiel g pneumoniae. Il apparaît que le mélange est inaotif & l'é- gard,du Rickettaia akari sur des souris à 10 mg/our. Son aoti.-- vite antibiotique (essayée comme pour la Gentamycine) est d'environ 200 unités/mg. 



   LES ANTIBIOTIQUES DU GROUPE R-451, en   particulier   le 
 EMI88.2 
 R-451 et le R-451D, et CEUX DU GROUPE SP*30 possèdent W lange éventail d'activités contre les organismes graM'-positifat Ha ont une valeur particulière dans le traitement des maladies produites par les mioro-organisniea résistant à la pn,o3,.li . (voir leu tableaux 17, 21 et 24). Ils sont aussi utiles Pour traiter lea maladies causées par la 3o au,,a areuj9... le Diplococcus pneumoniae et d'autres iaiqro -Qr6'W*isro3B pa:.r5ia gènes. 



   Les antibiotiques du groupe   R-451   soit   aussi     actifs   contrer 
 EMI88.3 
 certains micro-organtemau attaqués par la pénicilline. On a déterminé cependant qu'ils sont différents des p6nioiHin'ee, comme le montre 1* absence de deaaotivatioa du R-451 eu du   R-451D   par la   ponioillinase.   En outra, ces   antibiotiques   peu-      vent aussi être utilises sur des   patients     présentant   ou   connus -   
 EMI88.4 
 comme présentant une sensibilité résultant d'une thérapie b la. pénicilline et/ou d'une thérapie utilisant des dérivés aybtbé-:

   tiques de pénicilline, ce qui est un phénomène xs,titsaient / fréquent apparaissant dans environ 8 à 10 % de la   population -   
 EMI88.5 
 des Etats-Unis d'Amër3,que, 1 $ELg¯4J>.l .BlttW?, , obtenu comme décrit dans l'exemple 11  et,! entre autres un agent anti"infectieux utile, capable d'inhibiirr certaines manifestations de maladies dues au a"" ., d au r eu s. au Strclyxocoe es, au 1 ylooçç numoi.ae, . ' et à   d'autres organismes     pathogènes.   Son activité in vitro comparée contre divers   organismes   est   rapportée   dans le ta- 

 <Desc/Clms Page number 89> 

 bleau 17 (cette activité étant déterminée comme pour la Genta- mycine, en utilisant toutefois un milieu nutritif formé d'ex- trait de levure, d'extrait de boeuf et do glucose).

   Son acti- vité in vivo contre certaines infections bactériennes chez des 
 EMI89.1 
 souris (18 à po g) est déterminée cor.:n.e pour la Gontamyoine. 



  Le tableau 18 donne les résultats. On obtient aussi une proteo- tion à 100 par la voie buccale contre le Streptococcua pyoe- nes en administrant 400 ug (20   mg/kg   de souris) en 2 doses   égales   administrées une déni-heure avant infection pour la première dose.

   La toxicité aiguë du   R-451   a été déterminée 
 EMI89.2 
 comme pour la Gentamycine et a donné les résultats suivants s 
 EMI89.3 
 Mode d'administration LD 50 (mdkg de souris) 
 EMI89.4 
 
<tb> sous-cutané <SEP> 1000
<tb> 
<tb> intrapritonl <SEP> 1000
<tb> 
<tb> intraveineux <SEP> 850
<tb> 
<tb> buccal <SEP> > <SEP> 2500
<tb> 
 
 EMI89.5 
 LE R#451A, obtenu comma'décrit dans l'exemple 18 B, et le   R-451B ,  obtenu comme décrit dans l'exemple 18 C, par une cathode de détermination sur disque   (disque   de 6,3 mm de dia- mètre),

   de telle uorte que la zone   d'inhibition   est mesurée   après   avoir placé un disque imprégné de l'antibiotique   correa-   pondant sur une plaque d'agar-agar ensemencée avec l'organisme d'essai et mise en incubation pendant 24 heures à 37 C,  présen-   
 EMI89.6 
 tent une activité in vitro contre certains micro-organismes tels que ce qui est indiqué dans les tableaux 19 et 20, respec- tivement.

   L'activité in vivo du   R-451B   a été déterminée comme pour le R-451 avec les résultats suivants : 
 EMI89.7 
 S t c'hy 1 o c.pc eus sureun PD 50 *= 500 /ug/souris (25 mg/ke de sou-  ris), streptococcua yo;enee FI)50 = F30 ug/fJQ'l1rie .( 4 mg/kg de sou- rial LER-451D,obtenu comme décrit dans   l'exemple   15,   prés-en-   
 EMI89.8 
 te une activité in vitro contre divers organismes c;ram-poElit1:f'a 

 <Desc/Clms Page number 90> 

 comme indiqué dans le tableau 21, la détermination étant la même que pour le R-451. Son activité in vivo a aussi été déter- minée comme pour le R-451.

   Les résultats de ces essais sont' 
 EMI90.1 
 donnée dans le tableau 220 la toxicité aiguë du R-45IDs telle qu'elle est déterminée sur des souris, est conme suit 
 EMI90.2 
 
<tb> Mode <SEP> d'administration <SEP> LD50 <SEP> (mg/kg <SEP> de <SEP> soûles) <SEP> - <SEP> 
<tb> 
 
 EMI90.3 
 mu  ...... util >ils lil|i #-.##### $oua-(1),ta.né ' 1000 intrapéri tonéal 500 
 EMI90.4 
 
<tb> intraveineux <SEP> 1.0
<tb> 
 Pour le R-451E,obtenu conformément   à   l'exemple 17, de 
 EMI90.5 
 la manière indiquée pour le R-451A et le R-451B, oa.a déterminée une activité in vitro dont les résultats sont rapportés dans le tableau 23. 
 EMI90.6 
 



  L'activité in vitro du SP-3Q. contre divers m1cro-orgQn1emes gram-positifs, déterminée comme pour la Gentamyoine main# sauf dat.ion--COntT.-e::rre;:-dans un milieu nutritif constitua par ¯un bouillon de phosphate de tryptoae, est indiquée par le tableau 24.   /*'La   substance utilisée pour les   estais     correspond   
 EMI90.7 
 danta a été obtenue conformément à l'exemple 19 <" et avait une, puissance de 4000 unités de dilution par tng, c'es dire que | 1 mg de cette matière  dissoute dans 1 c3 de aoht t-t a **1# 5 née à une dilution 4000 fois supérieure, inhibe eneoie la croissance de Sta h locoo ua aureus (ATCC 6'S38.' En outre, le   P-30   brut ainsi que   ses    constituants   isolés   (fractions)

     
 EMI90.8 
 ont été essayés par la technique de détermination eÙr,d18qU, . décrite à propos du R-451A et du R-451B, contre certaiwia ôrgô  #% niâmes   gram-positifs.   Le tableau 25 donne les résultats de   ces @     - essais*     L'activité   in   vivo   contre certaines infections bacté-   riennea   chez des souris a aussi été essayée comme pour la 
Gentamyoine.

   Aux animaux soumis à l'essaie,   on'   a   administré   la matière obtenue en suivant l'exemple 19 0 en suspension dans 
 EMI90.9 
 de la carboxyméthyl cellulose aqueuse à 0,25 $ 1. la dose prao- 

 <Desc/Clms Page number 91> 

 tectrice pour 100 % des animaux infecta avec du   Staphvlo-   
 EMI91.1 
 cor u -eup, est de 10 msourie/jour (II 40000 limités de dilu- tion par   souris   par jour)* La dose protectrice pour   100 %     de*   
 EMI91.2 
 animaux infectés avec du Piplococcue pneuraoniae est de 15 m&/ souris/jour (= 60000 unités de dilution/souris/jour},cette dose étant administrée pendant 2 jours.La toxicité aiguë (LD50) du même échantillon de SP-30 a également été mesurée de la manière habituelle,

   nous la forme d'une suspension dans de la   carboxymthyl   cellulose aqueuse à   0,25   avec les   résul-     tats suivants ! :   
 EMI91.3 
 
<tb> Mode <SEP> d'administration <SEP> LD50 <SEP> (mg/kg <SEP> de <SEP> sourie)
<tb> 
 
 EMI91.4 
 sous-oiitanê > 7500 
 EMI91.5 
 
<tb> intrapéritonéal <SEP> 7500
<tb> intraveineux <SEP> 800
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
 
 EMI91.6 
 

 <Desc/Clms Page number 92> 

 
TABLEAU,17. 



  Spectre antibiotique in vitro du R-451 
 EMI92.1 
 
<tb> Micro-organisme <SEP> essayé
<tb> 
 
 EMI92.2 
 Nom Hvatémfltiaue Concentration iahibitrloe Nom ayatématique Désignation minimale (/ug/cm3) 
 EMI92.3 
 
<tb> dela
<tb> souche
<tb> 
 
 EMI92.4 
 Bacillus coreus TOC 7064 0,75 
 EMI92.5 
 
<tb> Bacillus <SEP> cereus
<tb> 
 
 EMI92.6 
 var. mycoides DA.39 cl5 Bacillus metfathoritua DA 31 0,75 Bacillus subtille ÂTOC 6633 0,25 
 EMI92.7 
 
<tb> Staphylococcus <SEP> albua <SEP> DA <SEP> 2100 <SEP> 0,10
<tb> 
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538P <SEP> 0,075
<tb> 
 
 EMI92.8 
 Staphyloooccus aureun 1l,TCC 1163 Ot25 Staphylococcus aureue ACCO 12715 0,75 
 EMI92.9 
 
<tb> Staphylococcua <SEP> aureus <SEP> Gray <SEP> 0,50
<tb> 
<tb> Staphylocoocua <SEP> aureue <SEP> DA <SEP> 201 <SEP> @) <SEP> 0,10
<tb> 
 
 EMI92.10 
 Staphylococoua aureua DA 202 .

   0,25 Staphylocoocue aureua DA 203***' 0,30 Staphylococoua aureùa DA 1-04'") 0,15 Staphyloooooua aureua DA 205*' 0,40 Streptocoocua fecalia DA 20 0,75 Streptococous pyogenea AÏCO 12384 0,175 '- Streptoioccun pyogenes DA 21 0,?75 tt) Souche résistant à la Novobipeineo  ) Souche résistant h l'0?.ea.ndomyoiMe et à l'BrytQ.. 



  .Souches réaiutattt a la Pénicilline  . 



  ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯.,,-.r ....... 3 . 

 <Desc/Clms Page number 93> 

 
TABLEAU 18. 



  Activité in vivodu R-451 
 EMI93.1 
 i,eïero-orzanisme Dosage de E-451 Pourcentage de d'infection /ug/aouria/jours survie au bout 
 EMI93.2 
 
<tb> / <SEP> de <SEP> 24 <SEP> heures
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> Streptococcus <SEP> 0 <SEP> (solution <SEP> saline <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> pyogenes <SEP> témoin)
<tb> 
 
 EMI93.3 
 40 ( 2 ;/k; ) 50 
 EMI93.4 
 
<tb> 40 <SEP> (2 <SEP> mg/kg), <SEP> 100
<tb> 
<tb> une <SEP> seule <SEP> injec-
<tb> 
<tb> tion <SEP> 1 <SEP> heure
<tb> 
<tb> après <SEP> infection
<tb> 
 
 EMI93.5 
 Staphylocoocua aureua 40 (2 mg/PC) 50 Diplococcus 50 (2,5 mdlcg) 100 (après 
 EMI93.6 
 
<tb> pneumoniae <SEP> 2 <SEP> jours;
<tb> 
 
TABLEAU 19. 



  Activité in vitro du R-451A 
 EMI93.7 
 Concentration du Zone d'inhibiti,on Iiamtre en mm.) ¯, contre K-451A (/ue/ct<i3) Staphylococcua Streptococoua Bacillus ' aureua fecalia subtilie 
 EMI93.8 
 
<tb> 1000 <SEP> 18 <SEP> 23 <SEP> 13
<tb> 
<tb> 100 <SEP> 9 <SEP> 15 <SEP> 10
<tb> 
<tb> 
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> , <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 1 <SEP> 070
<tb> 
 
TABLEAU 20. 



  Activité in vitro du R-451B 
 EMI93.9 
 Zone d' inhib1 tion(diarnot.re en Mme) contre R-451B (/ug/cm3) Staphylococcus streptococcua. Daoi11u. 
 EMI93.10 
 
<tb> 



  / <SEP> aureus <SEP> fecalie <SEP> subtilis
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 1000 <SEP> 23 <SEP> 30 <SEP> 17
<tb> 
<tb> 
<tb> 100 <SEP> 20 <SEP> 26 <SEP> 8
<tb> 
<tb> 
<tb> 10 <SEP> 15 <SEP> 22 <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 1 <SEP> 15 <SEP> 0
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 94> 

 TABLEAU 21. 



  ; Spectre antibiotique du R-451D 
 EMI94.1 
 (Áo:tiN.i-té-:l:1î vitro), '¯¯¯¯¯(Âcjtiirt-H; vitro) ...:.- 
 EMI94.2 
 ¯j¯¯ "--'na-- # -¯-> é Concentration Micro-organisme essayé Désignation inhibitrice i otx t.L t1' de la minimale du. 



  Nom systématique souche R-45LD </Ug/oa3) 1,1 ...J #IITTI- - ' -"\t --"[#-"'#- Ba,r:i7.lua oereus AT CC 7064 0,25 Baoillus C4)rGUS var. 



  1: mycoidea # DA ,9 'J;075-- ' Bacillus meeatl'eriUÎl1 DA. 3 1 0,25 \ # BacÍl1ue megatheriua BZZ 3773 0,025 ;.. 



  Bacillua me;athsriwn DA 38 0,25. 



  Bacilles sphaerioua DA 32 0,75 -7 Baoillua ephaericus DA 33 " ' 0,25' Baoillus subtilis ATCO 6633 0,25 ' Diplocooous pneumoniae.) DA 150 0,25 
 EMI94.3 
 
<tb> Saroina <SEP> lutea <SEP> ATGC <SEP> 9431 <SEP> ' <SEP> 0,0075
<tb> 
 
 EMI94.4 
 Staphylococcua albue DA 2100 0,25 
 EMI94.5 
 
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 2027-2036 <SEP> chacun <SEP> 0,25
<tb> 
<tb> 
<tb> (10 <SEP> produits <SEP> isolés
<tb> 
<tb> 
<tb> cliniques <SEP> résistant <SEP> à
<tb> 
<tb> 
<tb> la- <SEP> Pénicilline, <SEP> 
<tb> 
 
 EMI94.6 
 Ja-Ttraoyoline, 
 EMI94.7 
 
<tb> la <SEP> Streptomycine,
<tb> et <SEP> l'Erythromycine)
<tb> 
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus' <SEP> Gray <SEP> 0,25
<tb> 
<tb> Streptococcua <SEP> fecalis <SEP> DA <SEP> 20 <SEP> 0,02$
<tb> 
 
 EMI94.8 
 streptocoooua pyogenea *' DA 21 0,25 
 EMI94.9 
 
<tb> *)

  Bouillon <SEP> infusion <SEP> cervelle-coeur <SEP> + <SEP> 0,5 <SEP> % <SEP> de <SEP> sérum
<tb> humain
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 95> 

   TABLEAU   22. 



  Activité   in vivo   du R-451D 
 EMI95.1 
 4.taraor;uniame Dose de R-45lD Pourcentage de survie d'infection /uc/aouri8/joura après 24 heures 
 EMI95.2 
 
<tb> Streptooocoua <SEP> 0 <SEP> (solution <SEP> saline <SEP> 0
<tb> 
<tb> pyogenes <SEP> témoin)
<tb> 
<tb> 
<tb> 75 <SEP> (3,75 <SEP> mg/kg) <SEP> 50
<tb> 
<tb> 
<tb> 100 <SEP> (5,0 <SEP> me/kg) <SEP> 100
<tb> 
 
 EMI95.3 
 Staphylococcus 250 (12,5 NË/kg) 50 auroua 400 (20 mkg) 100 Dirlococcus 75 (3t75 mlikg) 50 (après 2 Jours) 1 pneumor.iae 100 (5 o rat>ykG) 100 (après 2 jours) 
 EMI95.4 
 .TA3EKAU 2?. 



  Activité in vitro du R-451S - " j ¯ -- -. 
 EMI95.5 
 Concentration du P±pPn3-&-oïl, da lti zone d' inxi.bitian mm aan : R-451.E /us/cnt3 Staphylococcus Streptococcua Bacillue 
 EMI95.6 
 
<tb> ' <SEP> aureus <SEP> fecalis <SEP> aubtilia
<tb> 
 
 EMI95.7 
 1030 20 19 ' ¯ 24 ¯¯ ¯ 
 EMI95.8 
 
<tb> 100 <SEP> 15 <SEP> 13 <SEP> 19
<tb> 
<tb> 10 <SEP> 8 <SEP> 15
<tb> 
<tb> 0 <SEP> 0
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 96> 

 
TABLEAU 24. 



  Activité in vitro du   SP-30   
 EMI96.1 
 )Licro-or,ganïame essayé Concentration -nao. +##   ! inhibitrice Nom systématique de la souche minime (/OM3) Bao111us cereus var-MYCOÏ406 AÏCC. 7064 6,0 Baelllue garous var.mycoldes DA 39 0,75 Baoillue cerous var.mycoides DA 30 12,0 Baclilus megatheriun DA 31 0,25 ' 
 EMI96.2 
 
<tb> Bacillua <SEP> meatherium <SEP> DA <SEP> 36 <SEP> 3,0
<tb> 
 
 EMI96.3 
 Bacillus mecatherium DA 35 6eo Bac 1 Hua aphaoricua ' DA 32 zoo Bacillua ophacricue DA 33 1$P Diplococcus pneumoniab DA 999 0,075 
 EMI96.4 
 
<tb> Staphylococcus <SEP> albua <SEP> DA <SEP> 40.

   <SEP> 0,75
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538 <SEP> 0,25
<tb> 
<tb> Staphylococcua <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538P <SEP> .0,25
<tb> 
 
 EMI96.5 
 Staphylococous aureus ATOC 1271$ 2,0 
 EMI96.6 
 
<tb> Staphylococous <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 1163 <SEP> 1,0
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 25
<tb> 
<tb> var. <SEP> Gray.
<tb> 



  Staphylococcus <SEP> aureus
<tb> var. <SEP> Smith <SEP> DA <SEP> 141 <SEP> 0,25
<tb> 
 
 EMI96.7 
 Staphylococcus aureus DA 2026 0,25 
 EMI96.8 
 
<tb> (Produits <SEP> isolés <SEP> cliniques <SEP> DA <SEP> 2027 <SEP> 0,75
<tb> 
<tb> 
<tb> résistant <SEP> à <SEP> la <SEP> pénicilline) <SEP> DA <SEP> 2028 <SEP> 1,5
<tb> 
<tb> 
<tb> DA <SEP> 2029 <SEP> 0,75
<tb> 
<tb> 
<tb> DA <SEP> 2030 <SEP> 2,0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> VA <SEP> 2031 <SEP> 1,0
<tb> 
<tb> 
<tb> / <SEP> DA <SEP> 2032 <SEP> 0,75
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> DA <SEP> 2033 <SEP> 0,75
<tb> 
<tb> 
<tb> DA <SEP> 2034 <SEP> 0,75
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> DA <SEP> 2035. <SEP> 1,0
<tb> 
 
 EMI96.9 
 Staphylooooûua apidemidie DA 41 0,25 Saroina lutea ATCC 9341 0.7$ ' ## mierqoooiue flavue DA 60 0,05 atreptococcue pyogwes Ci , DA 21 0,025 streptooccoue teoalid '# ATCC 1041 16,0 Eaoher1chia 0011 DA 110 , . 16,0 Escherichia illtnned1s.

   DA 111 2,0Mycobanterium sl1'!-::Igulaiois' DA 150 4,0 Staphylooooous auteuat ATCC 9996 0" 7$. 

 <Desc/Clms Page number 97> 

 
TABLEAU 25. 



  Activité in vitro des antibiotiques   SP-30   
 EMI97.1 
 
<tb> Antibio- <SEP> Concentra- <SEP> Zone <SEP> d'inhibition <SEP> (mm) <SEP> contre
<tb> 
 
 EMI97.2 
 tique tion (/Ug) Staphylococcus Streptococcua Baoillue ' aureus pyogenea eubt111s 1 ............j< .....,.,.......,,.,!....! ..,!,. , ..,....,..<.. 
 EMI97.3 
 
<tb> 



  SP-30 <SEP> 1000 <SEP> 28 <SEP> 29 <SEP> 12
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 100 <SEP> 19 <SEP> 19
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10 <SEP> 13 <SEP> 9 <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 1 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> SP-30A <SEP> 1000 <SEP> 28 <SEP> 31 <SEP> 9
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 100 <SEP> 17 <SEP> 12 <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> SP-30B <SEP> 1000 <SEP> 28 <SEP> 35 <SEP> 11
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 100 <SEP> 20 <SEP> 20
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10 <SEP> 11 <SEP> + <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> SP-300 <SEP> 1000 <SEP> 28 <SEP> 33 <SEP> 14
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 100 <SEP> 22 <SEP> 24 <SEP> 8
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10 <SEP> 17 <SEP> 14 <SEP> 0
<tb> 
<tb> 

  
<tb> 
<tb> 
<tb> 1 <SEP> 9 <SEP> ¯ <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> SP-30D <SEP> 1000 <SEP> 19 <SEP> 19 <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 100 <SEP> 13 <SEP> 10 <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 10 <SEP> ¯ <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 1 <SEP> . <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> 
<tb> "¯" <SEP> indique <SEP> l'existence <SEP> d'une <SEP> légère <SEP> inhibition,
<tb> 
<tb> 
<tb> difficile <SEP> à <SEP> évaluer <SEP> numériquement.
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 98> 

 
 EMI98.1 
 



  PRESENTATIONS PHARMACEiqUES AtîTIBIQT ic PRECI'. 



   Pour   l'administration   aux   patients, les     antibiotiques   selon   l'invention   sont présentés   sous   les   forces   couramment '. utilisées pour les   antibiotiques.   Pour la   préparation   de ces formes de dosage, on peut utiliser les supports pharmaceutiques    usuels   
 EMI98.2 
 On va donner oi-deseoua des exemples .de telles formes pharmaceutiques contenant de la   Gentamyoine     (noue'la   forme   de*   son sulfate) comme principe actif. Bien entendu, le   sulfate   de 
 EMI98.3 
 .

   Gentamyoine peut être remplacé par d'autres dé vé de la Oon- tamyoj-ne, par de la Gentamyoine libre, par d'autres antibioti*" j   . ques   selon l'invention (y compris leurs dérivés   usuels)  ou par   des   mélanges de tels antibiotiques et/ou   dérivée.   
 EMI98.4 
 EXËKPEE A - Solution injectable 
Pour la préparation d'une solution injectable convenable, on dissout 50 g de   Gentamycine   (sous la   forme- de   son   sulfate)   dans une quantité suffisante d'eau d'injection, et on   complète   la solution obtenue avec de l'eau d'injection pour   obtenir   1,0 litre de solution.

   On filtre la solution à travers un fil- tre retenant les bactéries et on remplit   aseptiquement   des ampoules stériles avec cette solution. On fait passer les am-   poules à   l'autoclave à 121 C pendant 30 minutes. 



    EXEMPLE B -   Pommade   topique     On   peut préparer une pommade à partir des   constituante   suivants: 
 EMI98.5 
 Gentarayoine (sous forme de sulfate) 5,0   p- hydroxy-benzoate de méthyle tri,2 g P-hydroxy-benzoate de butyle 108 g huile minérale 100,0 g   petrolatum   q.s. 1 kg 
 EMI98.6 
 Pour préparer la pommade L l'aide des constituants ci-dessus,- on fait fondre le petrolatua et on le mélange à 70 - 9040 avec le p-hydroxy-benzoate de méthyle et le p-hydxoxywbsnoate de 

 <Desc/Clms Page number 99> 

 
 EMI99.1 
 butyle. Une fois que tout est dissous, on laisse la SOl\t1i!-:-,,-1 se re1'ro1d1r-à 400q environ.

   On disperse séparément le .8uat.- de   Gentamyoine   dans l'huile   mineraient   on fait   passer la   dis- 
 EMI99.2 
 persion us travers un uou23.i è colloïdes. On ajoute la disper- sion sortant de cet appareil à la-baB;3 de la pommade oi4deBsû  et on laisse le mélange se. refroidir spontanément à la tempéra- ture ambiante sous agitation continue. On remplit des tubea ou des pots appropriés avec ce produit. L'onguent ainsi obtenu peut aussi être utilisé comme   lommade   ophtalmique. 
 EMI99.3 
 



  EXw#LE C - Gouttes ophtalt:1iQue On obtient des gouttes ophtalmiques contenant de la Gentamyoinet à partir des constituante suivants z Ger.tsme3.ne (sous forme de sulfate) 5,0 g alcool p!Jnyl-é thylique 5,? g eau purifiée q.e. 1 litre pour préparer les ecuttes. on dissout l'alcool phényl-éthyllqua dans approxifflativèraent 90 ;. de l'eau, puis on dîesout-le aul- fate de Gentamycina dane la solution d'alcool phényl.éthy11que ' et on ajoute suffisamment d'eau pour que le produit atteigne 1 litre. On filtre la   solution h   travers un filtre retenant les 
 EMI99.4 
 bactéries et on remplit asoptiquement des flacons compte-gout- tes stériles avec cette solution.

Claims (1)

  1. R E S U M E . EMI99.5
    ¯¯-...,....¯¯¯. ¯¯....¯ L'invention concerne not#ment à la/ L'utilisation des . micro-organismes d'une des espèces !,:ioromonoEll' ra purpureag !!.. oc1.inoBJ)ora, M. carbonecea et LI. halophytica ou d'un de leurs mutants ou variante, ou de micro-organismes équivalents, pour la préparation de nouveaux antibiotiques d'une manière biologique usuelle; l'isolation de ces antibiotiques de la culture; et, éventuellement, leur transformation en dérivée usuels, en particulier leurs sels avec des acides, leurs dérivés N- et/ou 0-acylée et leurs pro- <Desc/Clms Page number 100> EMI100.1 " duita de réaction avec des composta d'addit3.ow bieu.'.tiques d'aldéhydes ou de cétones.
    2*/ Un procédé selon 1"/, présentant en outre les particu- larités suivantes prises séparément ou selon les diverses com- binaisons possibles t EMI100.2 a) on effectue une incubation aérpb;le des Nioro-orsania- mes utilisés dans un milieu nutritif aqueux qui contient du EMI100.3 carbone et da l'azote assimilables jusqu'à ce qu'au moins un composé ayant une activité antibiotique notable soit produit;
    b) pour préparer des nouveaux antibiotiques basiques, on fait incuber une souche capable de forcer des antibiotiques EMI100.4 basiques, du ruioro-oreanismen du Goitre ,gromo o , jusqu'à ce qu'au moins un composé ayant une activité antibiotique nota- EMI100.5 ble aoit produit, on isole lou fractions basiques antibiotique* ment actives du substrat ainsi obtenu et, éventuellement, on le'3 transforme en dérivés usuels, notamment en sole avec des EMI100.6 acides ou en produits do réaction i:.tveo let; composés d'addition j bisulfitiques d'aldéhydes, de préférence Se tormalddhyeot ou de cétones;
    -c) .an ttti-3d-c<r¯tg'8*Tn±crO'"0X'g±tniaines d'une des eppèceo- i R* purpurea et LI. echingapora, ou des cvloi &-'Oïiani9 # ëit* lente comme lea variante i, eah o,o, var. t2±ruie,ea et M. echinoapora var. pallidat pour la préparation i# î t eût-olo myoine et/ou de ses co-produita antibioTiques BA -3 (fractions .
    A et B d'une manière biologique usuelle, on isola et évutu lement, on purifie au moins un de ces antibiotiquaa 4,0a cul- turc, et, si on le déaire, on lea transforme en leurs dêzivési' d) on utilise une souche capable de produire de la.0enâ* mycine, de préférence une des souches HRRL 2953e 1,MU Z985, . ttRRL 2995 et HRRL 29961 e) après formation d'un produit ayant une activité anti- biotique notable, on extrait le mycélium de la culture avec un <Desc/Clms Page number 101> acide et on isole la Gentasycine et/ou Bas co-produite anti- biotiques de l'extrait acide par adsorption, par précipitation fractionnée de sels ou nar une combinaison do ces deux procé- dés ;
    f) on utilise du M. carbonacea, ou des micro-organismes équivalents connue, le variant M. carbonacea var. aurantiaca, pour préparer le nouvel antibiotique R-451 d'une manière biolo- gique usuelle, on isole et; éventuellemeKt, on purifie au moins . un de seo constituants R-451A, R-451B, R-451C, R-451D et R-451E de la culture, et, ai on le déaire, on les transforma en leurs dérivés usuels, en particulier en dérivés N- et/ou O-acyléa tels que l'acétate du constituant R-451D; g) on utilise une couche capable de produire du R-451, de préférence une des souches NRRL 2972 et NRRL 2997;
    h) on utilise du M. halophytica, ou des micro-organismes équivalents, pour préparer le nouvel antibiotique SP-30 d'une manière biologique usuelle, on iuole et, éventuellement, on purifie au moins un de seu constituants SP-30A, Si'-308, SP-30C et SP-30D de la culture, et, si on le désire, on les transfor- me en leurs dérivés usuels; i) on utilise une souche capable de produire du SP-30, de préférence la souche NRRL 2998;
    j) après formation d'un produit ayant une activité anti- biotique notable, conformément à l'un des paragraphes f) à i) ci-dessus, on sépare le mycélium de la culture, on extrait le bouillon restant avec un solvant non miscible à l'eau, et de l'extrait ainsi obtenu on isole les antibiotiques voulus ou des mélanges de ces antibiotiques par adsorption, par partage, par précipitation fractionnée ou par une combinaison de ces procédés;
    3 / Un procédé de préparation, de compositions pharmaceuti- ques antibiotiquement actives, caractérisé par le fait qu'au <Desc/Clms Page number 102> moins un des produits antibiotiquement actifs et/ou dérivée obtenue par un procédé selon 1 / ou 2 / est présente sous une forme convenant à l'administration pharmaceutique.
    4 / Un procédé selon 3 / caractérisé en ce que les pro- duits dérives ou mélangea, respectivement, sont mélangée avec un véhicule pharmaceutique convenable.
    Une préparation pharmaceutique antibiotiquement acti- va obtenue par un procédé tel que spécifié dans 3 / ou 4 /.
    6 / Les antibiotiques basiques qui peuvent être obtenus EMI102.1 par incubation de micro-organismes du genre Microtnoïioapora.
    7 / les produits antibiotiquement actifs qui peuvent être EMI102.2 obtenus par un procédé tel que spécifie dans l'/ ou 26/1 y boa* pris leurs dérivés usuels tels que leura sels avec des acideal leurs dérivés N- et/ou 0-acylés, et leurs produits de réaction ' avec des composés d'addition biaulfitiquea d'aldéhydes ou de cétonos, ainsi que les mélanges de ces produits et/ou dérivés. EMI102.3 80/ La Oentamyoine, comme antibiotique nouveau, et se$ dérivés usuels, en particulier ses sels avec des acides et se*. EMI102.4 produite de réaction avec des composés d'addition bisulfiti- ques d'aldéhydes et de cétones.
    9*/ Le sulfate de Gentamicine. 7.0 / Le chlorhydrate de Gentamyoine 11*/ Le N-méthylène sulfonate de Gentamycine. 12"/ Les fractions A et B du nouvel antibiotique. 1 r. 'i leurs dérivés usuels, en particulier leurs sels avec des aci- des, et les mélanges de ces fractions et/ou dérivés.
    13 / Comme nouvel antibiotique, le R-451 et ses constitua - EMI102.5 ante 4 à E, notamment les constituants R-451BO R--t51D -et B-4>IB# leurs dérivés usuels, notamment leurs dérivés N- et/ou 0- acylés, et les mélanges de ces constituants et/bu dérivés. EMI102.6 14*/ L'acétate de R-t51D. ' 159/ Comme nouvel antibiotique le SP-30 et ses a'ongt3.tt' <Desc/Clms Page number 103> ants SP-30A, SP-30B, SP-300 et SP-30D, leurs dérivés usuels EMI103.1 et les mélangea de ces conatîtuante et/ou dèrivée.
    16 / Les procédés déorits dans les exemples 1 à 21 et les procédés manifestement équivalents. EMI103.2
    177 / les composés antibiotiqueaent actifs qui peuvent itre obtenus suivant les exemples 1 à 21 ou par un procède qui est un équivalent évident de l'un quelconque de cas exemple .
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NO (1) NO118368B (fr)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1271896B (de) * 1962-04-02 1968-07-04 George M Luedemann Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums No. 467

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DK120770B (da) 1971-07-12
NO118368B (fr) 1969-12-22
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CA933153A (en) 1973-09-04
CY357A (en) 1966-12-30
GB1021401A (en) 1966-03-02
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CH428098A (de) 1967-01-15

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