DE1271896B - Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums No. 467 - Google Patents

Verfahren zur Herstellung des neuen Antibioticums No. 467

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DE1271896B
DE1271896B DEP1271A DE1271896A DE1271896B DE 1271896 B DE1271896 B DE 1271896B DE P1271 A DEP1271 A DE P1271A DE 1271896 A DE1271896 A DE 1271896A DE 1271896 B DE1271896 B DE 1271896B
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Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND
DEUTSCHES
PATENTAMT
AUSLEGESCHRIFT
Int. Cl.:
Deutsche KI.:
Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:
C12d
C 07g
30h-6
12p-15
P 12 71 896.6-41 (L 50269)
22. März 1965
4. Mi 1968
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums, das insbesondere durch Züchtung einer bisher nicht beschriebenen Variante von Micromonospora halophytica der Ordnung Actinomycetales unter kontrollierten Bedingungen gewonnen werden kann.
Der bevorzugte Mikroorganismus für die Herstellung des erfindungsgemäßen Antibioticums ist eine Variante von Micromonospora halophytica, die aus dem Schlamm am Grund eines Salzteiches in Syracuse, N. Y., USA., isoliert wurde. Eine Kultur des lebenden Organismus wurde in der Kulturensammlung des Landwirtschaftsministeriums (Department of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research and Development Division Peoria, Illinois, hinterlegt, wo sie unter ihrer NRRL-Nummer allgemein erhältlich ist.
Der Mikroorganismus wurde als Micromonospora halophytica var. nigra bezeichnet und hat die NRRL-Nummer 3097 erhalten.
M. halophytica var. nigra zeichnet sich durch ein langes, verzweigtes Mycel mit einem Durchmesser von etwa 0,5 μηι und reichliche Sporenbildung aus. Die Sporen sind elliptisch bis kugelförmig, und ihr größter Durchmesser beträgt durchschnittlich 1,2 μπι. In älteren Kulturen erscheinen sie glattwandig und dunkel gefärbt. Die Sporen scheinen statistisch gleichmäßig über das ganze Mycel verteilt und von kurzen oder langen Sporophoren getragen zu sein; gelegentlich sind sie auch stiellos. Das vegetative Mycel teilt sich normalerweise nicht in polymorphe Elemente auf, sondern scheint ein Ganzes zu bleiben. Das Mycel ist nicht säurefest und grampositiv.
Zur Isolierung der genannten Mikroorganismen wird etwas von der getrockneten Schlammprobe in sterilem destilliertem Wasser geschüttelt, und nach Herstellung geeigneter Verdünnungen wird die Suspension auf ein Agarmedium aufgestrichen. Das Medium enthält zweckmäßig 0,5% Tryptose, 2,0 °/0 lösliche Stärke, 0,3 °/o Calciumpropionat und 2,0 % Agar; alles in destilliertem Wasser.
Die Kulturen werden auf antibiotische Aktivität geprüft, indem man sie zunächst bis zu 60 Tagen bei 260C in dem folgenden Medium wachsen läßt: 0,3% Rindfleischextrakt, 0,5% Tryptose, 0,1% Dextrose, 2,4% lösliche Stärke, 0,5 % Hefeextrakt, 1,5% Agar; alles in Leitungswasser. Dann extrahiert man den ganzen wäßrigen Agar mit Butanol und engt den Butanol-Wasser-Extrakt ein. Durch das Butanol-Wasser-Gemisch wird genügend Antibioticum extrahiert, um ein Konzentrat zu liefern, das in einem Scheibentest das Wachstum von Staphylococcus aureus Verfahren zur Herstellung des neuen
Antibioticums No. 467
Anmelder:
George M. Luedemann, Bloomfield, N. J.;
Marvin J. Weinstein,
East Brunswick, N. J. (V. St. A.)
Vertreter:
Dr.-Ing. A. v. Kreisler, Dr.-Ing. K. Schönwald,
Dr.-Ing. Th. Meyer und Dr. J. F. Fues,
Patentanwälte, 5000 Köln 1, Deichmannhaus
Als Erfinder benannt:
George M. Luedemann, Bloomfield, N. J.;
Marvin J. Weinstein,
East Brunswick, N. J. (V. St. A.)
Beanspruchte Priorität:
V. St. v. Amerika vom 23. März 1964 (354 168)
und Bacillus subtilis verhindert. Eine antibiotische Aktivität gegen die gleichen Organismen läßt sich beobachten, wenn man 96 Stunden in einem wäßrigen Medium, das geeignete Nährstoffe enthält, z. B. 1 % NZ-Amin Typ A (ein pankreatisches Kaseinhydrolysat, erhältlich von der Firma Sheffield Chemical Co., Norwich, N. Y.) und 5% lösliche Stärke (Markenbezeichnung Difco, von der Firma Difco Laboratories Inc., Detroit, Mich.), submers bebrütet.
Die in Tabelle I aufgenommenen Koloniebeobachtungen wurden nach 14tägiger Bebrütung bei 24 bis 0C in den betreffenden Medien angestellt. Die Farbangaben bestehen aus zwei Bezeichnungen: Die jeweils erste Farbbezeichnung besteht aus einem Farbnamen gemäß dem »Descriptive Color Name Dictionary« von Taylor, Knoche und G r a ην i 11 e, herausgegeben durch die Container Corporation of America, 1950 (USA.), in Verbindung mit einer diesem Namen entsprechenden Nummer, welche dem »Color Harmony Manual«, 4. Auflage (1958), herausgegeben ebenfalls von der Container Corporation of America, entnommen ist; die zweite Bezeichnung besteht aus einem Farbnamen und einer Nummer gleicher Bedeutung, gemäß National Bureau of Standards (USA.), Circular 553 vom 1.11.1955.
809 568/534
Tabelle I
Koloniebeobachtungen auf verschiedenen Medien
Verwendetes Medium Beobachtungen
Bennetts Agar
. +0,1% CaCO3 		Wachstum: gut; Kolonie faltig
Farbe: kofferbraun-g4NE, intensivbraun-55
Emersons Agar
+ 0,1% CaCO3 		Wachstum: gut; Kolonie gekerbteingerollt
Farbe: sepiabraun-g3PN,
dunkel gelblichbraun-78
Tomatenmark-Hafermehl-Agar
+ 0,1% CaCO3 		Wachstum: gut; faltige Kolonie
Farbe: terracottafarben-g5PE, intensivbraun-55
Glucose-Asparagin-Agar
+ 0,1% CaCO3 		Wachstum: mittelmäßig; Kolonie flach
Farbe: orange-g4LA, intensivorange-50
Glucose-Hefeextrakt-Agar
(0,5% Hefe, 1,0% Dextrose)
+ 0,1% CaCO3 		Wachstum: gut; Kolonie faltig
Farbe: terracottaf arben-5gPE,
intensivbraun-55
Zusätzlich wurde das Wachstumsverhalten von M. halophytica var. nigra auf üblichen Untersuchungsmedien beobachtet; die Ergebnisse sind die folgenden: Kartoffelscheiben—Wachstum: spärlich, verkörpert durch mehrere große Makrokolonien, welche sich von einer Impfstelle her entwickeln, sonst wird kein Wachstum gezeigt. Karottenscheiben—Wachstum: gering. Czapeks Agar—Wachstum: mittelmäßig, faltig; Farbe: schokoladenbraun-g4PN, dunkelbraun-59. Tyrosin-Agar—Wachstum: mittelmäßig; keine Farbreaktion. Pepton-Eisen-Agar—Wachstum: mittelmäßig; keine Farbreaktion.
Auf einem Agarmedium, bestehend aus 1% NZ-Amin Typ A + 1% Glucose und 0,1% Calciumcarbonat, ist das Wachstum mittelmäßig, die Kolonie wenig faltig und die Farbe terracottafarben-g5PE, intensivbraun-55. Wenn die Stickstoffquelle 0,5% Difco-Hefeextrakt ist, ist das Wachstum gut, faltig; die Farbe ist ebenfalls terracottafarben-5gPE, intensivbraun-55.
M. halophytica var. nigra wächst innerhalb eines pH-Bereiches von 6,8 bis 7,8 gut. Die Kolonien sind auf vielen natürlichen Agarmedien anfänglich orange, aber sobald die Sporenbildung zunimmt, werden sie olivbraun und eventuell schwarz. Die reichliche schwarze Sporenschicht, typisch für diese Kultur auf vielen Medien, unterscheidet sich deutlich von der hellbraunen bis braunen Sporenschicht, die von M. halophytica var. halophytica gebildet wird. Außerdem bildet M. halophytica var. nigra nicht das rötlichbraune diffusionsfähige Pigment, das M. halophytica var. halophytica auf gewissen Medien bildet. Die von M. halophytica var. nigra gebildete, typische schwarze Sporenschicht wird gewöhnlich auf Platten gefunden, bei denen für die Kohlenhydratausnutzungsuntersuchungen die folgenden Kohlenhydrate verwendet wurden: D-Fructose, D-Galaktose, D-Lactose, Raffinose und D-Trehalose.
Bildung und Isolierung des Antibioticums
Die oben beschriebenen Mikroorganismen liefern mit Hilfe der im folgenden beschriebenen Fermentationsverfahren ein Antibioticum, welches sowohl im Mycel als auch in der Brühe gefunden wird. Es wird im allgemeinen vorgezogen, die Brühe nach Abtrennung des Mycels als Antibioticumquelle zu verwenden.
as Nach papierchromatographischen Untersuchungen unter Anwendung verschiedener Lösungsmittelsysteme scheint das gewonnene Antibioticum eine einzige Substanz zu sein, jedoch erfolgte in gewissen Lösungsmittelsystemen Auftrennung in vier verschiedene Fraktionen. Die durch M. halophytica var. nigra erzeugte Substanz wird im folgenden als Nr. 467 bezeichnet.
Zur Bildung von Nr. 467 kann M. halophytica var. nigra bei einer geeigneten Temperatur zwischen etwa 25 und 400C unter submersen aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält, kultiviert werden. Geeignete Stickstoffquellen können sowohl organischer als auch anorganischer Natur sein, vorzugsweise sind es aber organische Produkte, wie Sojabohnenmehl, Peptone u. dgl. Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Stärke, Dextrin, verschiedene Zucker u. dgl.
Die Bebrütung erfolgt ungefähr 96 bis 120 Stunden lang bei einem pH-Wert von ungefähr 6,5 bis 8,0. Ungefähr gegen Ende dieses Zeitraumes ist maximale Antibioticumbildung erreicht. Man trennt das Mycel durch Filtration ab und gewinnt das Antibioticum aus der Brühe durch Solventextraktion, wie weiter unten beschrieben wird.
Das Antibioticum wird aus dem aus der Brühe gewonnenen Extrakt durch Eindampfen des Lösungsmittels zu einem Rückstand gewonnen. Der Rückstand wird papierchromatographisch untersucht. Die Papierchromatogramme werden in verschiedenen Lösungsmittelsystemen entwickelt und die RF -Werte für die einzelnen Komponenten nach bioautograpbischen Standardmethoden ermittelt; diese bestehen darin, daß man ein Papierchromatogramm entwickelt und trocknet und es dann über eine mit Staphylococcus aureus beimpfte Agarplatte legt. Nach einer Kontaktdauer von 15 Minuten wird das Papier von der Platte entfernt, die dann bei 37°C16 bis 20 Stunden bebrütet wird. Die Beobachtung der Inhibierungszonen gestattet die Bestimmung der Re-Werte der antibiotisch wirksamen Bestandteile.
In Tabelle II sind die Rf-Werte von Nr. 467 in verschiedenen Lösungsmittelsystemen angegeben.
Tabelle II
Chromatographische Untersuchungen
des durch Fermentation von M. halophytica var. nigra
erzeugten Antibioticums
System RF-Wert der Hauptflecken
A — absteigend 0,0; 0,06, 0,40, 0,66
B — aufsteigend 0,0 bis 1,0
C — aufsteigend 0,78 bis 1,0
D — aufsteigend 0,95
E — aufsteigend 1,0
F — aufsteigend 1,0
G — aufsteigend 1,0
H — absteigend 0,0; 0,1, 0,9
IO
Lösungsmittelsysteme
A. Benzol—Chloroform (93:7 Volumteile), gesättigt mit Formamid; Chromatographiepapier vor Ge- ao brauch in eine 25%ige methanolische Formamidlösung getaucht, abgelöscht und zur Entfernung des Methanols 5 Minuten an der Luft getrocknet; Entwicklungszeit 2 Stunden.
B. Benzol—Methanol (9:1). a5
C. Methanol—Wasser (80:20) mit 3%igem Natriumchloridgehalt. Das Papier wurde vor dem Entwickeln mit einer an Natriumsulfat 0,95molaren und an Natriumbisulfat 0,5molaren Lösung gepuffert und getrocknet; 4 bis 6 Stunden.
D. Propanol—Essigsäure—Wasser (50:5:40); 18 Stunden.
E. Butanol—Essigsäure—Wasser (4:1:5); 18 Stunden.
F. Propanol—Pyridin—Essigsäure—Wasser (15:10:3:12); 18 Stunden.
G. Phenol—Wasser (80 g :20 ml); 18 Stunden. H. Benzol—Petroläther—Aceton (10:2,5:5); 1 bis 2 Stunden.
35
40
Die beobachteten, in Tabelle II angegebenen Werte unterscheiden die Antibiotica von allen anderen bekannten Antibiotica einschließlich Oleandomycin, Novobiocin, Penicillin G, Erythromycin und Gentamycin.
In den folgenden Beispielen sind geeignete Verfahren zum Bebrüten von M. halophytica var. nigra, zum Extrahieren des Antibioticums aus der Brühe und zur Isolierung von Nr. 467 angegeben. Die Wertbestimmung erfolgte durch »Standard-Scheiben-Analysen-Methoden« (»standard disc assay methods«) gegen Staphylococcus aureus.
Beispiel 1
Schüttelkolben-Bebrütung
von Micromonospora halophytica var. nigra
A. Keimung
Man gibt eine lyophilisierte Kultur von M. halophytica var. nigra in einen 300-ml-Schüttelkolben, der 100 ml des folgenden sterilen Mediums enthält:
Rindfleischextrakt 3 g
Tryptose 5 g
Dextrose Ig
Lösliche Stärke 24 g
Hefeextrakt 5 g
Wasser ad 11
55 Man bebrütet den Kolben samt Inhalt 5 Tage bei 37°C auf einer rotierenden Schüttelmaschine [280 Umdrehungen pro Minute (U/min), 5 cm Rüttelbewegung].
B. Fermentation (Bebrütung)
Man überträgt je 25 ml des durch vorstehende Keimung erhaltenen Inoculums auf vier 2-1-Kolben, deren jeder 500 ml des folgenden Mediums enthält:
Lösliche Stärke 50 g
NZ-Amin Typ A 10 g
Enthärtetes Wasser ad 11
pH-Wert nach Sterilisation 7,45
Diese Kolben samt Inhalt bebrütet man 96 bis 120 Stunden lang bei 28° C auf einer rotierenden Schüttelmaschine.
Manchmal ist es vorteilhaft, eine zweite Keimung anzuschließen, wobei ein 25-ml-Inoculum der ersten Keimung aseptisch in 500 ml des Keimungsmediums übertragen wird und wie oben 72 Stunden lang geschüttelt wird.
C. Alternativverfahren zur Fermentation
(Bebrütung)
Man verwendet 500 ml eines Nährmediums, das 30 g Sojabohnenmehl, 40 g Dextrose, 5 g Calciumcarbonat und 1000 ml Leitungswasser enthält. Man überträgt je 25 ml des durch vorstehende Keimung erhaltenen Inoculums auf vier 2-1-Kolben, deren jeder das vorstehend genannte Nährmedium enthält, und bebrütet die Kolben samt Inhalt 5 Tage lang bei 280C auf einer rotierenden Schüttelmaschine.
D. Extraktion von Nr. 467
Man filtriert die 401 Fermentationssubstrat, die durch Vereinigung von 20 Chargen der Fermentation von M. halophytica var. nigra entsprechend Teil B oder C dieses Beispiels erhalten wurden. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen; durch Vereinigung der Filtrate erhält man ungefähr 401. Man extrahiert zweimal mit dem gleichen Volumen Äthylacetat (je 401) und dampft zu einem Rückstand ein. Das dunkle Öl wird in 100 ml Äthylacetat aufgenommen und langsam unter Rühren zu 11 einer Äthylacetat-Petroläther-Mischung (1:1) gegeben. Nach Filtrieren wird die Lösung zu einem Rückstand von 5,2 g eines dunkelbraunen Öls eingedampft. Das öl wird in 150 ml eines Benzol-Chloroform-Gemisches (1:1) aufgenommen und wiederum filtriert. Zu dem Filtrat werden langsam unter Rühren 1,5 1 Hexan gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet; man erhält 1,12 g von Nr. 467 als amorphes Pulver, das (auf Agarplatten) antibiotische Wirksamkeit gegenüber Staphylococcus aureus (ATCC 209P) bis herab zu einer Verdünnung von 0,1 μg/ml zeigt; gegenüber Streptococcus faecalis zeigt es Wirksamkeit bis herab zu 1 μg/ml und gegenüber B. subtilis bis herab zu 10 μg/ml.
Beispiel 2
Tankfermentation von M. halophytica var. nigra
A. Keimung
Eine lyophilisierte Kultur von M. halophytica var. nigra wird in einen 300-ml-Schüttelkolben gegeben,
7 8
der 100 ml des sterilen Mediums, wie im Beispiel 1 C. Fermentation (Bebrütung)
(Keimung) beschrieben, enthält. Man überträgt die entsprechend Teil B dieses Bei-
Man bebrütet 5 Tage lang bei 37 C auf einer iels erhaltenen 5 γ Inocuium aSeptisch in einen etwa
rotierenden Schälmaschine (280 U/min, 5 cm Ruttel- 13Q χ fassenden Fermentationstank, der ungefähr 901
bewegung). 5 des folgendeI1 sterilen Mediums enthält:
B. Bereitung des Inoculums T .. ,. , „ .. , ...„
Lösliche Starke 4500 g
Man überträgt je 25 ml des durch vorstehende NZ-Amin Typ A 900 g
Keimung gewonnenen Inoculums auf vier 2-1-Kolben, Antischaummittel 100 ml
deren jeder 100 ml des für die Keimung verwendeten io Enthärtetes Wasser ad 901
sterilen Mediums enthält. Man bebrütet die Kolben
samt Inhalt 5 Tage lang bei 28 0C auf einer rotierenden Man bebrütet 55 bis 65 Stunden lang [bis das kom-
Schüttelmaschine (280 U/min, 5 cm Rüttelbewegung), pakte Zollvolumen (»packed cell volume«) etwa 4,5 vereinigt die Kolbeninhalte und fügt je 25 ml des bis 5,0% des Gesamtvolumens beträgt, wie durch durch diese Vereinigung erhaltenen zweiten Inoculums 15 5minutiges Zentrifugieren einer 10-ml-Probe bei 2x1 zehn 2-1-Kolben, deren jeder 500 ml des oben 2800 U/min bestimmt wird] unter den folgenden beschriebenen sterilen Mediums enthält. Man bebrütet Bedingungen:
die Kolben samt Inhalt 3 bis 5 Tage lang bei 28 0C auf
einer rotierenden Schüttelmaschine (280 U/min, 5 cm Temperatur 26° C
Rüttelbewegung), vereinigt die Inhalte und überträgt ao Zufuhr an steriler Luft etwa75 bis 80 l/min
die Brühe aseptisch in einen sterilen Inoculumkolben Druck etwa 0,5 bis 0,6 atü
mit seitlichem Ansatzrohr (Gesamtvolumen: etwa 5 1). Bewegung 160 bis 165 U/min
Die folgenden Zahlenangaben sind typisch für den Verlauf der Bebrütung:
Dauer
der
Bebrütung		 Temperatur Luftzufuhr Druck Bewegung pH Kompaktes
Zellvolumen		 Scheibenprüfung
gegen Staph. aureus
Stunden 0C I/min atü U/min %
0 26 76 0,49 160 6,80
8 26 76 0,55 160 6,95 1,0 —
16 26 76 0,53 160 6,85 1,0 —
23 26 76 0,52 160 7,10 1,5 14-mm-Zone
31 26 76 0,53 160 7,35 1,5 —
38 26 79 0,49 165 7,60 2,5 —
46 26 79 0,54 165 7,75 2,5 21-mm-Zone
54 26 79 0,52 165 7,90 4,5 —
65 26 79 0,51 165 7,80 5,0 25-mm-Zone
D. Isolierung von Nr. 467
Man filtriert das Mycel von der Brühe unter Verwendung einer Filterhüfe ab, stellt den pH-Wert des Filtrates auf 7,0 ein und extrahiert die vorliegenden 901 mit 2 Volumina Äthylacetat. Den Extrakt engt man im Vakuum auf 3 1 ein, entfernt die sich beim Stehen abscheidende wäßrige Schicht und engt die Lösung anschließend weiter auf etwa 200 ml ein. Dann läßt man über Nacht in der Kälte stehen, filtriert von dem aufgefallenen Niederschlag ab, gießt das Filtrat in das zehnfache Volumen einer Mischung aus Petroläther und Äthyläther (1:1) und filtriert den dabei ausfallenden Niederschlag ebenfalls ab. Man wäscht ihn mit mehreren Portionen der Lösungsmittelmischung [Petroläther—Äthyläther (1:1)] und vereinigt die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat. Die vereinigten Flüssigkeiten, die die antibiotischen Substanzen enthalten, werden im Vakuum zu einem Rückstand aus 18 g eines dunkelbraunen Öls eingedampft. Dieses Rohprodukt verhindert das Wachstum von Staphylococcus aureus 209P auf Agar in Verdünnungen bis herab zu 1 μg/ml.
Physikalische und chemische Eigenschaften von Nr. 467
Nr. 467 ist in den meisten der üblichen organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, Chloroform, Methylenchlorid (sowie anderen Halogenkohlenwasserstoffen) und niedrigen Alkanolen (z. B. Methanol und Äthanol), löslich; es hat eine sehr geringe Löslichkeit in Wasser. Bei einem pH-Wert im Bereich von 2 bis 9,5 wird es aus der Fermentationsbrühe durch Butanol, Äthylacetat, Methylenchlorid,_ Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol oder Äther leicht extrahiert.
Bei qualitativen Tests auf bestimmte Gruppen verhält sich Nr. 467 wie folgt:
Ninhydrin- und Sakaguchitest negativ
Reduzierende Zucker (mit ammoni-
akalischer Silbernitratlösung) ... positiv
Reduktion von Ferricyanid positiv
Das Antibioticum Nr. 467 zeigt, gelöst in Methanol, das folgende Absorptionsverhalten gegen ultraviolettes Licht (im Bereich von 210 bis 400 nm): Es hat eine ziemlich schwer zu beschreibende Absorptionskurve mit Wendepunkten bei 264 nm und 302 nm; wobei der Wendepunkt bei 264 nm ein E10/° =183 und der Wendepunkt bei 302 nm eine ElO/o = 116,2 haben.
Das Antibioticum Nr. 467 ist stabil gegen Säuren und gegen Erhitzen.
Die Elementaranalyse zeigt das folgende Ergebnis:
C 60, 73%; H 7,53%; N 3,70%; 0 27,20%;
Cl 0,04%; S 0,80%.
Das Infrarotspektrum von Nr. 467, suspendiert in Mineralöl (Nujol), ist in F i g. 1 der Zeichnung dargestellt, wobei λ die Wellenlängen in μΐη, y die Frequenz in cm"1 und A die Absorption bedeutet. Die Absorptionsmaxima und sonstigen Charakteristika sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt (schw = schwach, m = mittel, m—st = mittel bis stark, st = stark, Sch = Schulter):
Wellenlänge
(μπι)		 Intensität
2,98 bis 3,15 st (breit)
3,65 m—schw (breit)
5,77 schw—m
5,83 schw—m
6,02 m—st
6,05 m—st
6,07 m—st
6,13 Sch
6,18 St
6,30 Sch
6,37 m
6,45 m
6,58 m—et
7,85 bis 7,95 st (breit)
8,05 St
8,20 Sch
8,35 Sch
8,45 Sch
8,52 m—st
8,65 Sch
9,43 m—st
9,55 m—st
9,80 Sch
10,25 schw—m
11,15 bis 11,25 schw (breit)
11,95 schw
13,15 m—st
13,80 bis 13,90 schw—m (breit)
10
Biologische Eigenschaften
von Nr. 467
Das Antibioticum Nr. 467 hat einen breiten Wirkungsbereich gegen grampositive Organismen. Es ist von besonderem Wert für die Behandlung von Krankheiten, die durch penicillinresistente Mikroorganismen hervorgerufen werden, da dieses neue Antibioticum imstande ist, solche Organismen zu hemmen oder zu
ίο vernichten. Außerdem ist es zur Behandlung von Krankheiten, die durch Staphylococcus aureus, Diplococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes und andere pathogene Mikroorganismen hervorgerufen werden, brauchbar. Außerdem ist dieses Antibioticum eine wertvolle Laboratoriums-Sterilisierungs-Hilfe bei
der Beseitigung von Überwucherung von grampositiven Organismen auf Anlagen, die zur Untersuchung des Wachstums von gramnegativen Organismen dienen.
Die In-vitro-Aktivität von Nr. 467 im Vergleichstest gegen eine Reihe grampositiver Organismen ist in Tabelle IV dargestellt. Die Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegen das Antibioticum wurde nach normierten Rohrverdünnungsverfahren wie folgt ermittelt: Als Inoculum wurden durchweg Verdünnungen auf 10~5 von 24 Stunden alten Brühekulturen verwendet, wobei die Endpunkte nach 24stündiger Bebrütung bei 37°C aufgenommen wurden. Wo nicht anders angegeben, besteht das Nährmedium aus Tryptose-Phosphat-Brühe. Bei diesen Tests wurde das nach Beispiel 1 (D) erhaltene Antibioticum mit einer Wirksamkeit von 18000 Verdünnungseinheiten pro Milligramm verwendet. (Stärkeangaben in »Verdünnungseinheiten« dienen als Basis für die Angabe der Wirksamkeit; eine Stärke von »18000 Verdünnungseinheiten pro Milligramm« bedeutet, daß 1 mg des Produktes, wenn es in 1 ml Lösungsmittel aufgelöst und auf das 18000fache verdünnt worden ist, noch das Wachstum von Staphylococcus aureus [ATCC 6538P] in einem Tryptose-Phosphat-Brühe-Medium bei Verwendung des oben beschriebenen Inoculums zu hindern vermag).
Tabelle IV
Antibiotisches Spektrum von Nr. 467 Untersuchte Mikroorganismen
Systematischer Name Stammbezeichnung
Minimale Inhibitionskonzentration
μg/ml
Bacillus cereus var. mycoides ....
Bacillus cereus var. mycoides
Bacillus megatherium
Bacillus sphaericus
Bacillus sphaericus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus var. Gray Staphylococcus aureus var. Smith
Staphylococcus epidermidis
Sarcina lutea
Streptococcus pyogenes C
ATCC-7064
DA-30
DA-31
DA-32
DA-33
ATCC-6538
ATCC-6538P
ATCC-12715
ATCC-1163
ATCC-9996
DA-141
DA-41
ATCC-9341
DA-21
0,57
>O,78
0,57
0,57
0,28
0,03
0,03
0,14
0,14
0,52
0,14
0,20
0,03
0,07
0,14
809 568/534
Die In-vivo-Aktivität von Nr. 467 gegen gewisse bakterielle Infektionen von Mäusen wurde ebenfalls untersucht. Die Mäuse wurden mit einem Inoculum der betreffenden Bakterien durch intraperitoneale Injektion infiziert. Sie wurden dann durch subkutane Injektionen des Antibioticums (Stärke 18000 Verdünnungseinheiten pro Milligramm), suspendiert in 0,25%iger wäßriger Carboxymethylcellulose, behandelt; die Injektionen wurden in zwei getrennten Dosierungen verabreicht. Auf diese Weise wurde die PD50 gegen Staphylococcus aureus zu 20 mg/kg bestimmt. Bei subkutaner oder oraler Verabreichung von 50 mg/kg des Antibioticums tritt ebenfalls eine signifikante Verzögerung des Todes von streptokokkeninfizierten Mäusen ein. Gegen Diplococcus pneumoniae wird voller Schutz durch subkutane Gaben von weniger als 20 mg/kg erreicht.
Die akute Toxizität (LDs0) für Nr. 467 (Stärke = 18000 Verdünnungseinheiten pro Milligramm), bestimmt nach dem Standardverfahren unter Verwendung von Mäusen mit einem Gewicht zwischen 18 und 20 g in der Anwendungsform einer Suspension in
0,25%iger wäßriger Carboxymethylcellulose, ist folgende: Subkutan 2500 mg/kg und intraperitoneal 1500 mg/kg.
In der belgischen Patentschrift 624 816 ist die Verwendung von Micromonospora halophytica oder auch einer ihrer Mutanten oder Varianten zur Herstellung von neuen antibiotisch wirksamen Substanzen beschrieben, wobei die Substanzen SP-30A, SP-30B, SP-30C und SP-30D genannt werden.
Die vorliegende Erfindung hat die Herstellung eines neuen Antibioticums (Nr. 467) mit Hilfe von Mikroorganismen zum Gegenstand. Der bevorzugte Mikroorganismus, Micromonospora halophytica var. nigra, der gemäß dieser Erfindung verwendet wird, ist in der belgischen Patentschrift 624 876 nicht erwähnt. Diese Nigravariante zeigt bedeutende morphologische Unterschiede gegenüber Micromonospora halophytica. Ferner unterscheidet sich das in der belgischen Patentschrift 624 876 beschriebene Antibioticum SP-30 in wesentlichen Punkten vom Antibioticum 467, wie die folgenden Vergleichsdaten zeigen.
a) Qualitative Gruppentests
SP-30
467
Reduzierende Zucker (mit ammoniakalischer Silbernitratlösung), positiv
(Von den isolierten Bestandteilen ist A stark positiv; B, C und D sind negativ)
Reduktion von Ferricyanid, positiv
(Von den isolierten Bestandteilen reagiert A negativ; B, C und D positiv)
Reduzierende Zucker (mit ammoniakalischer Silbernitratlösung), positiv
Reduktion von Ferricyanid, positiv
Diese Eigenschaften zeigen, daß 467 sich von allen SP-30-Einzelkomponenten, d. h. von SP-30A, SP-30B, SP-30 C und SP-30D, unterscheidet.
b) Verhalten gegen Ultraviolettlicht
SP-30
467
SP-30 und seine fraktionierten Bestandteile in methanolischer Lösung absorbieren Ultraviolettlicht im Bereich von 220 bis 400 ηιμ mit folgenden Merkmalen: Das rohe SP-30 hat eine schwer zu beschreibende Absorptionskurve mit Wendepunkten bei 260 und 290 πιμ, wobei der Wendepunkt bei 260 πιμ ein E10Zo = etwa 28 hat. SP-30 A hat eine Kurve ähnlicher Art mit einem Wendepunkt bei 258 ΐημ (Ε10-'» = etwa 70) und einem zweiten Wendepunkt bei etwa 295 πιμ. SP-30 B hat keine Maxima, aber Wendepunkte bei 265 ηιμ (Ε1"/» = etwa 181) und bei etwa 290 πιμ. SP-30 D hat ein Maximum bei 263 πιμ (Ε10Λ> = etwa 115).
Diese Daten veranschaulichen unter anderem den Unterschied zwischen den nicht aufgelösten SP-30-Komponenten, d. h. ihrem ursprünglichen Gemisch, und Nr. 467.
c) Infrarotspektren
Die Antibiotica SP-30 und 467 haben wesentlich verschiedene Infrarotspektren. Diese Unterschiede Absorptionsverhalten der methanolischen Lösung gegen Ultraviolettlicht (im Bereich von 210 bis 400 nm): Die ziemlich schwer zu beschreibende Absorptionskurve zeigt Wendepunkte bei 264 nm und 302 nm, wobei der Wendepunkt bei 264 nm ein E1"/» = 183 und der Wendepunkt bei 302 nm ein E1"/» = 116,2 haben.
sind ganz deutlich an den übereinandergelegten Linien erkennbar (F i g. 2).
d) Chromatographische Analyse
Ein Vergleich der bei der chromatographischen Analyse der Antibiotica unter Verwendung der gleichen Lösungsmittelsysteme erhaltenen Daten zeigt, daß die beiden Substanzen voneinander verschieden sind.
13
SP-30 467
System Rf-Wert der Hauptflecken
A — absteigend 0,0; 0,35; 0,60; 0,72
B — aufsteigend 0,02; 0,11; 0,95
C — aufsteigend 0,95		 System Rf-Wert der Hauptflecken
A — absteigend 0,0; 0,06; 0,40; 0,66
B — aufsteigend 0,0 bis 1,0
C = aufsteigend 0,78 bis 1,0
e) Biologische Aktivitäten I. Unterschiede sind auch in den verglichenen In-vitro-Aktivitäten zu sehen (s. Tabelle 24 und Tabelle IV):
Systematischer Name
Minimale Inhibitionskonzentration SP-30 467
Stammbezeichnung μg/ml 6,0 0,57
12,0 _>0,78
ATCC-7064 0,25 0,57
DA-30*) 2,0 0,57
DA-31 1,0 0,28
DA-32 0,25 0,03
DA-33 0,25 0,03 bis 0,06
ATCC-6538 2,0 0,14
ATCC-6538P 1,0 0,14
ATCC-12715 0,75 0,52
ATCC-1163 0,25 0,14
ATCC-9996 0,25 0,20
— 0,25 0,03
DA-141 0,75 0,07
DA-41 0,025 0,14
ATCC-9341
DA-21
Bacillus cereus var. mycoides
Bacillus cereus var. mycoides
Bacillus megatherium
Bacillus sphaericus
Bacillus sphaericus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus var. Gray Staphylococcus aureus var. Smith
Staphylococcus epidermidis
Sarcina lutea
Streptococcus pyogenes C
* DA bezieht sich auf die Nummern der Sammlung der Schermg Corporation, Bloomfield, New Jersey, USA.
II. Die akuten Toxizitäten (LD50 ) sind ebenfalls verschieden: SP-30 2500
7500		 467 Maus
Maus
mg/kg Maus
mg/kg Maus		 mg/kg
mg/kg
LD50 subkutan
LD50 intraperitoneal
>7500
7500

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verwendung von Micromonospora halophytica
    var. nigra, wie sie unter NRRL 3097 hinterlegt wurde, zur Herstellung des neuen Antibioticums Nr. 467 durch Züchtung in einem üblichen Nährmedium unter aeroben Bedingungen und Gewinnung des Antibioticums aus der Kultur.
    In Betracht gezogene Druckschriften: Belgische Patentschrift Nr. 624 816.
    Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
    809 568/534 6.68 © Bundesdruckerei Berlin
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