Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotiea Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotica auf mikrobiologischem Wege.
Erfindungsgemäss werden neue Antibiotica gewon nen, indem man eine gewisse Art der Gattung Micro- monospora (Ordnung Actinomycetales), nämlich Micro- monospora halophytica (einschliesslich ihrer Mutanten* * Unter Mutanten werden sowohl natürliche als auch künstliche Mutanten verstanden, insbesondere Mutanten, die aus den betreffenden Mikroorganismen mit Hilfe von Muta- tionsmitteln, wie Hochfrequenzstrahlung (Röntgen- und Ultra violettstrahlung),
Actinophagen und Stickstofflosten, gebildet werden. und Varianten), in einem wässrigen Nährmedium be brütet, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, bis sich antibiotisch aktive Substanz gebildet hat, und aus dem hiernach vorliegenden Substrat die anti biotisch aktiven Fraktionen isoliert. Diese können weiter aufgetrennt und die so erhaltenen Antibiotica in ihre üblichen Derivate übergeführt werden.
Insbesondere werden erfindungsgemäss durch Be- brütung geeigneter Micromonosporaarten neue und wertvolle Antibiotica gewonnen, deren wichtigste Ver treter im folgenden als Antibiotica der SP-30-Gruppe bezeichnet sind.
Kulturen der erfindungsgemäss vorzugsweise ver wendeten Mikroorganismen wurden in der Kulturen sammlung des Landwirtschaftsministeriums (Depart ment of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research and Develop- ment Division, Peoria, Illinois, hinterlegt, wo sie unter ihren NRRIrNummern allgemein erhältlich sind.
<I>Die</I> vorzugsweise <I>verwendeten Mikroorganismen</I> Ein Mikroorganismus, der sich als zur Herstellung von Antibiotica der SP-30-Gruppe geeignet erwiesen hat, wurde als Micromonospora halophytica n. sp. be zeichnet und wird im folgenden kurz M. halophytica ge nannt. Er hat die NRRL-Nummer 2998 erhalten und wurde ursprünglich aus dem Schlamm am Grund eines Salzteiches in Syracuse, N.
Y., USA, isoliert. - M. halo- phytica zeichnet sich durch ein langes, verzweigtes Mycel mit durchschnittlichem Durchmesser von 0,5 ,u und durch reichliche Sporenbildung aus. Die Sporen sind ellipsoidal bis kugelförmig und haben eine Längsachse bzw. einen Durchmesser von 1,2,u. In älteren Kulturen erscheinen sie glattwandig und dunkel gefärbt.
Die Sporen scheinen statistisch-gleichmässig über das ganze Mycel verteilt und von kurzen oder langen Sporophoren getragen zu sein; gelegentlich sind sie auch stiellos. Das vegetative Mycel teilt sich normalerweise nicht in poly morphe Elemente auf, sondern scheint ein Ganzes zu bleiben. Das Mycel ist nicht säurefest und grampositiv.
Zur Isolierung der, genannten Mikroorganismen wird etwas von der getrockneten Schlammprobe in sterilem destilliertem Wasser geschüttelt, und nach Herstellung geeigneter Verdünnungen wird die Suspension auf ein Agarmedium aufgestrichen. Das Medium enthält zweck mässig 0,5 % Tryptose, 2,0 % lösliche Stärke, 0,3 % Cal- ciumpropionat und 2,0% Agar; alles in destilliertem Wasser.
Die Kulturen werden auf antibiotische Aktivität ge prüft, indem man sie zunächst bis zu 60 Tage bei 26 C in dem folgenden Medium wachsen lässt: 0,32o1 Rind fleischextrakt,<B>0,5%</B> Tryptose, 0,1% Dextrose, 2,4 lösliche Stärke, 0,5 % Hefeextrakt, 1,5 % Agar, alles in Leitungswasser. Dann extrahiert man den ganzen wäss- rigen Agar mit Butanol und engt den Butanol Wasser- Extrakt ein.
Durch das Butanol-Wasser-Gemisch wird genügend Antibioticum extrahiert, um ein Konzentrat zu liefern, das in einem Scheibentest das Wachstum von Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis verhindert. Eine antibiotische Aktivität gegen die gleichen Orga nismen lässt sich beobachten, wenn man 96 Stunden in einem wässrigen Medium submers bebrütet, das ge eignete Nährstoffe enthält; z. B. ein Nährmedium, das.
1 % NZ-Amin Typ A (ein pankreatisches Kaseinhydro- lysat, erhältlich von der Firma Sheffield Chemical Co., Norwich, N. Y.) und 5 % lösliche Stärke (Markenbe zeichnung Difco, von der Firma Difco Laboratories Inc., Detroit, Mich.) enthält. M. halophytiea zeichnet sich durch gutes Wachstum im pH-Bereich 6,8 bis 7,8 aus.
Ihre Kolonien auf vielen natürlichen Agarmedien sind anfangs orange, nehmen aber mit zunehmendem Alter (20 Tage) gewisse Braun nuancen an: hellbraun, orangebraun und braun sind übliche Farbvarianten. Die Kolonie wird nur selten dunkelbraun, niemals schwarz. Der genannte Mikro organismus bildet reichlich Sporen, besonders in älte ren, braungefärbten Kolonien.
Bei Verwendung eines 0,5 % Hefeextrakts und 1 % eines der folgenden Zucker: Galactose, Lactose, Laevulose, Mannose, Raffinose und Trehalose enthaltenden Agars bildet sich gewöhnlich ein rötfichbraunes diffundierbares Pigment.
Tabellen I bis V vergleichen die vorstehend be schriebene neue mit gewissen bekannten Micromono- sporaarten. Sofern sich in einzelnen Tabellenfeldern Striche befinden, bedeutet dies, dass entsprechende Da ten entweder fehlen oder nicht in die Tabellen aufge nommen wurden.
Tabelle I vergleicht die charakteristischen Eigen schaften von Kolonien der erfindungsgemäss bevorzugt verwendeten und einiger bekannter Arten der Gattung Micromonospora bei Verwendung verschiedener Medien nach 14tägiger Bebrütung bei 26 C. Die Daten für die bekannten Arten, mit denen die erfindungsgemäss ver wendeten verglichen werden, sind aus Bergey's Manual of Determinative Bacteriology , 7. Auflage, 1957, her ausgegeben von der Williams & Wilkins Company, Baltimore, entnommen.
In den Tabellen 1I und III sind Wachstum und Koloniefarbe der erfindungsgemäss bevorzugt verwende ten Micromonosporaarten mit den entsprechenden Eigenschaften dreier verfügbarer bekannter Micromono- sporaarten bei Verwendung weiterer Kulturmedien ver glichen. Die hier verwendeten Medien sind diejenigen, die man gewöhnlich zur Bestimmung von Streptomyces- arten verwendet.
Die in Tabelle II aufgenommenen Koloniebeobachtungen wurden nach 14tägiger Be- brütung der betreffenden Medien bei 24 bis 26 C ange stellt. Die gewählten Farbbezeichnungen beziehen sich auf die folgenden Systeme:
Die jeweils erste Farbbe zeichnung besteht aus einem Farbnamen gemäss dem Descriptive Color Name Dietionary von Taylor, Knoche und Granville, herausgegeben durch die Con tainer Corporation of America, 1950, in Verbindung mit einer diesem Namen entsprechenden Nummer, wel che dem Color Harmony Manual , 4.
Auflage (1958), herausgegeben ebenfalls von der Container Corporation of America, entnommen ist; die zweite Bezeichnung besteht aus einem Farbnamen und einer Nummer glei cher Bedeutung gemäss National Bureau of Standards (USA), Circular 553 vom 1. November 1955. Zusätzlich zu den Aussagen von Tabelle II wurde für M. halophy- tica noch das Verhalten in einem Glucose-.Hefe-Extrakt- Agar nach Waksman beobachtet, mit dem folgenden Ergebnis: Wachstum: gut; Kolonie faltig.
Farbe: ziegel rot g5NG, intensivbraun-55.
Die oben erwähnten Mikroorganismen sind im stande, verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zu benutzen.
In Tabelle IV wird ihre Kohlenstoffquellenbenutzung mit derjenigen gewisser bekannter Micromonospora- arten an Hand visueller Schätzungen ihres Wachstums auf Agarplatten in einem Medium verglichen, das aus 0,5 % Hefeextrakt Difco (einem Produkt der Firma Difco Laboratories Inc., Detroit); 1,5 % Agar und 1 des betreffenden Testkohlehydrats, alles in destilliertem Wasser, besteht.
Zusätzlich zu den Daten der Tabelle IV wurde die Kohlenstoffquellenbenutzung durch M. halo- phytica in gleicher Weise auch noch an den folgenden Kohlehydraten untersucht: Melibiose, Trehalose, Adonit, Dulcit und Ribose; wobei im Falle der beiden erstge nannten ein gutes, im Falle der drei letztgenannten Kohlehydrate dagegen ein nur schlechtes Wachstum be obachtet wurde.
In Tabelle V wird die Stickstoffquellenbenutzung der erfindungsgemäss bevorzugten Mikroorganismen der Gattung Micromonospora mit derjenigen anderer Micro- monosporaarten an Hand visueller Schätzungen ihres Wachstums auf Agarplatten in einem Medium ver glichen, das auf 1 % Glucose, 1,5 % Agar und der be treffenden Stickstoffquelle (in einer Konzentration wie angegeben), alles in destilliertem Wasser, besteht. Die in Tabelle V verwendeten Farbbezeichnungen beruhen auf dem im Zusammenhang mit den Tabellen I1 und III erläuterten System.
<I>Bildung</I> und <I>Isolierung der</I> Antibiotica Der oben beschriebene und die anderen erfindungs gemäss verwendbaren Mikroorganismen liefern mit Hilfe der im folgenden beschriebenen Fermentationsverfahren antibiotisch aktive Substanzen. Nach der Fermentation (Bebrütung) finden sich diese sowohl im Mycel als auch in der Brühe; nach Abtrennung des Mycels von der Brühe wird als Quelle zu ihrer Gewinnung vorzugs weise die Brühe verwendet. Man erhält zunächst Mi schungen von Antibiotica.
Aus papierchromatographischen Untersuchungen hat sich ergeben, dass die durch M. halophytica und deren Äquivalente gebildeten antibiotischen Substanzen aus mindestens vier Komponenten zu bestehen scheinen. Das von M. halophytica gebildete Antibioticagemisch wird im folgenden mit SP-30 bezeichnet und die ge nannten vier Komponenten mit SP-30A, SP-30B, SP-30C bzw. SP-30D.
Zur Bildung der antibiotischen Substanzen können die Mikroorganismen bei einer Temperatur von 25 bis 40 C unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert werden. Geeignete Kohlenstoffquellen sind Kohle hydrate, wie Stärke, Dextrin, gewisse Zucker und der gleichen. Geeignete Stickstoffquellen können sowohl organischer als auch anorganischer Natur sein, vorzugs weise sind es aber organische Produkte, wie Sojabohnen mehl, Peptone und dergleichen.
Die Fermentation wird vorzugsweise bei einem pH im Bereiche von 6 bis 8 gewöhnlich über, einen Zeit raum von etwa 96 bis 120 Stunden durchgeführt; gegen Ende dieser Zeitspanne ist maximale Antibioticabildung erreicht. Man trennt nun Mycel und Brühe voneinander und isoliert die Antibiotica wie im folgenden beschrie ben.
Da sich der überwiegende Anteil antibiotisch aktiver Substanzen in der Brühe befindet, wird das Mycel in der Regel abfiltriert und verworfen. Die antibiotischen Substanzen können aus der Brühe durch Lösungsmittel extraktion, etwa wie im folgenden beschrieben, isoliert werden. Sie können durch verteilungschromatographi- sche Methoden, wie im folgenden näher erläutert, in ihre Komponenten aufgetrennt werden.
Es wird zweckmässig wie folgt vorgegangen: Die antibiotischen Substanzen werden zunächst aus dem von der Brühe erhaltenen Extrakt durch Abdamp fen des Lösungsmittels in Form eines Rückstandes abge trennt. Der Rückstand wird papierchromatographisch untersucht, was als Anhaltspunkt für die Verteilungs- chromatographie dient.
Die Papierchromatogramme wer den in verschiedenen Lösungsmittelsystemen aufgenom men und die Rr-Werte für die einzelnen Komponenten nach bioautographischen Standardmethoden ermittelt, die darin bestehen, dass man ein Papierchromatogramm entwickelt und trocknet und es dann über eine mit Staphylococcus aureus beimpfte Agarplatte legt. Nach einer Kontaktdauer von 15 Minuten wird das Papier von der Platte getrennt, die man dann 16 bis 20 Stun den bei 37 C bebrütet.
Aus der Lage der Inhibitions- zonen lässt sich auf die Rr-Werte der antibiotisch aktiven Komponenten schliessen.
Tabelle VI zeigt die verwendeten Lösungsmittel systeme und die darin für die Antibioticakomponenten ermittelten Ry-Werte; es ist jeweils angegeben, ob es sich um ein absteigendes oder aufsteigendes Lösungs mittel handelt.
In den folgenden Beispielen sind geeignete Ver fahren zur Fermentation von M. halophytica, zum Ex trahieren der antibiotischen Substanzen aus der Brühe und zum Auftrennen dieser Substanzen in ihre Haupt komponenten erläutert. In einigen dieser Beispiele sind Prüfwerte der betreffenden antibiotischen Substanzen, ausgedrückt in Einheiten pro mg, als Massstab ihrer Aktivität angegeben.
Die Prüfung erfolgt mikrobiolo gisch nach einem standardisierten Agar-Diffusions-Prüf- verfahren [ disc type ; vgl. Donald C. Grove and Wil- liam A. Randell, cAssay Methods of Antibiotics A Laboratory Manual , New York (1955)] unter Ver wendung von Staphylococcus aureus (ATCC 6538P) als Testorganismus.
Es wird eine Kurve aufgenommen, indem man die erzielte Wirkung gegen die Dosierung der betreffenden antibiotischen Substanz (verdünnt in Phosphatpuffer bei pH = 8) in dem folgenden Medium aufträgt:
EMI0003.0038
Pepton <SEP> 0,60
<tb> Pankreatisches <SEP> Caseinhydrolysat <SEP> 0,40
<tb> Hefeextrakt <SEP> 0,30
<tb> Rindfleischextrakt <SEP> 0,15
<tb> Dextrose <SEP> <B><I>0,15%</I></B>
<tb> Agar <SEP> 1,50
<tb> PH <SEP> 6,6. Die verwendete Suspension des Testorganismus (Staphylococcus aureus) wird derart standardisiert, dass sie in einem Kolorimeter Licht mit einer Wellenlänge von 660 mlc zu 20' durchlässt.
Die quantitative Wirk samkeit der jeweiligen Antibioticumprobe wird aus der Bezugskurve ermittelt und in Einheiten pro mg ausge drückt; als Einheit gilt eine solche Menge Testsubstanz, die erforderlich ist, um bei einer Scheibe von 13,5 mm Durchmesser eine Inhibitionszone von 18 mm zu bil den. <I>Beispiel 1</I> Gewinnung von rohem SP-30 durch Bebrütung von M. halophytica im Laboratoriumsmassstab <I>A.
Keimung</I> Man bringt eine lyophilisierte Kultur von M. halo- phytica in einen 300-ml-Schüttelkolben ein, der 100 ml des folgenden sterilen Nährmediums enthält:
EMI0003.0051
Bacto-Rindfleischextrakt <SEP> 3 <SEP> g
<tb> Tryptose <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Dextrose <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 24 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1000 <SEP> ml* * In diesem und in ähnlichen Rezepten durch die ganze Beschreibung hindurch ist das Lösungsmittel (meist Wasser) einmal als absolute Menge, ein andermal mit dem Vorsatz ad angegeben.
Obwohl dies, genau genommen, unterschiedliche Angaben sind, so können doch im Rahmen der für diese Rezepte erforderlichen Genauigkeit diese beiden Ausdrücke be liebig gegeneinander ausgetauscht werden. Man bebrütet den Kolben samt Inhalt 5 Tage bei 37 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Touren pro Minute, 5 cm Rüttelbewegung).
<I>B. Fermentation</I> (Bebrütung) Man überträgt je 25 ml des durch vorstehende Kei- mung erhaltenen Inoculums auf vier Zwei-Liter-Kolben, deren jeder 500 ml des folgenden Mediums enthält:
EMI0003.0062
Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 50 <SEP> g
<tb> NZ-Amin <SEP> Typ <SEP> A <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Weiches <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 1 <SEP> Liter
<tb> (pH <SEP> nach <SEP> Sterilisierung <SEP> = <SEP> 7,45) Die Kolben samt Inhalt werden 96 bis 120 Stun den bei 28 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine bebrütet. <I>C.
Isolierung von</I> SP-30 <I>aus der</I> Fermentationsbrühe Zu 3,5 Litern der vereinigten Substrate aus Teil B dieses Beispiels fügt man als Filterhilfe Diatomeenerde, filtriert, wäscht den Filterkuchen mit mehreren 100 ml Wasser und vereinigt Filtrat und Waschflüssigkeit (Ge samtvolumen etwa 3600 ml).
Dann versetzt man mit einem gleich grossen Volumen Äthylacetat, rührt 30 Minuten lang, trennt die Äthylacetat-Schicht ab und extrahiert die wässrige Schicht nochmals mit einem glei chen Volumen Äthylacetat. Die Äthylacetatextrakte wer den vereinigt und auf einem Dünnschichtverdampfer im Vakuum zu einem Rückstand eingedampft,
der etwa 4 g wiegt und auf Agarplatten eine antibiotische Aktivi tät gegen Staphylococcus aureus ATCC 209P bis herab zu einer Verdünnung von 1 ,uglml zeigt.
<I>Beispiel 2</I> Gewinnung von rohem SP-30 durch Fermentation von M. halophytica in technischem Massstab <I>A. Keimung</I> Wie in Beispiel 1 (A). <I>B. Bereitung eines</I> Inoculums Man überträgt je 25 ml des durch vorstehende Kei- mung erhaltenen ersten Inoculums auf vier Zwei-Liter- Kolben, deren jeder.
500 ml des für die Keimung ver wendeten sterilen Mediums enthält, bebrütet die Kolben samt Inhalt 5 Tage bei 28 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Touren pro Minute, 5 cm Rüt telbewegung) und vereinigt die Kolbeninhalte.
Je 25 ml des so erhaltenen zweiten Inoculums überträgt man auf zehn Zwei-Liter-Kolben, deren jeder 500 ml des obigen sterilen Mediums enthält, bebrütet die Kolben samt In- halt 3 bis 5 Tage bei 28 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Touren pro Minute, 5 cm Rüt telbewegung), vereinigt die Kolbeninhalte und über trägt sie aseptisch in eine sterile Inoculamflasche mit seitlichem Ansatzrohr (Gesamtvolumen: etwa 5 Liter). <I>C.
Tankfermentation</I> Man überträgt die 5 Liter des nach Teil B dieses Beispiels erhaltenen Inoculums aseptisch in einen etwa 130 Liter fassenden Fermenter, der etwa 90 Liter des folgenden sterilen Mediums enthält:
EMI0004.0008
Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 4500 <SEP> g
<tb> NZ-Amin <SEP> Typ <SEP> A <SEP> 900 <SEP> g
<tb> Entschäumungsmittel* <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> Weiches <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 90 <SEP> Liter * verwendet wurde das Handelsprodukt Antifoamer GE 60g der General Electric Company, doch sind auch andere Entschäumungsmittel brauchbar.
Man bebrütet 55 bis 65 Stunden (bis das kompakte Zellvolumen etwa 4,5 bis 5,0 % beträgt, wie man durch fünf Minuten dauerndes Zentrifugieren mit 2800 U/min bestimmt) aerob unter den folgenden Bedingungen:
EMI0004.0017
Temperatur <SEP> 26 <SEP> C
<tb> Zufuhr <SEP> an <SEP> ,steriler <SEP> Luft <SEP> etwa <SEP> 76 <SEP> bis <SEP> 80 <SEP> Liter
<tb> pro <SEP> Minute
<tb> Druck <SEP> etwa <SEP> 0,5 <SEP> bis <SEP> 0,6 <SEP> atü
<tb> Rührbewegung <SEP> 160 <SEP> bis <SEP> 165 <SEP> Umdrehungen
<tb> pro <SEP> Minute Die folgenden Daten sind typisch für den Verlauf der Fermentation:
EMI0004.0018
Nach <SEP> ... <SEP> Stunden <SEP> Temperatur <SEP> Luftzufuhr <SEP> Druck <SEP> Umdrehungen <SEP> Kompaktes <SEP> Scheibenprüfung
<tb> Bebrütung <SEP> in <SEP> <SEP> C <SEP> in <SEP> Liter <SEP> pro <SEP> Minute <SEP> in <SEP> atü <SEP> pro <SEP> Minute <SEP> pH <SEP> Zellvolumen <SEP> gegen
<tb> in <SEP> % <SEP> Staph.
<SEP> aureus
<tb> 0 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0,49 <SEP> 160 <SEP> 6,80 <SEP> - <SEP> 8 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0,55 <SEP> 160 <SEP> 6,95 <SEP> 1,0 <SEP> 16 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0,53 <SEP> 160 <SEP> 6,85 <SEP> 1,0 <SEP> 23 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0,52 <SEP> 160 <SEP> 7,10 <SEP> 1,5 <SEP> 14-mm-Zone
<tb> 31 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0,53 <SEP> 160 <SEP> 7,35 <SEP> 1,5 <SEP> 38 <SEP> 26 <SEP> 79 <SEP> 0,49 <SEP> 165 <SEP> 7,60 <SEP> 2,5 <SEP> 46 <SEP> 26 <SEP> 79 <SEP> 0,54 <SEP> 165 <SEP> 7,75 <SEP> 2,5 <SEP> 21-mm-Zone
<tb> 54 <SEP> 26 <SEP> 79 <SEP> 0,52 <SEP> 165 <SEP> 7,90 <SEP> 4,5
<tb> 65 <SEP> 26 <SEP> 79 <SEP> 0,51 <SEP> 165 <SEP> 7,80 <SEP> 5,0 <SEP> 25-mm-Zone <I>D.
Isolierung von SP-30</I> cius <I>der Tankfermentation</I> Man filtriert das Mycel von der Brühe unter Ver wendung einer Filterhilfe ab, stellt das pH des Filtrats auf 7,0 ein und extrahiert die vorliegenden 90 Liter mit 2 Volumina Äthylacetat. Den Extrakt engt man im Vakuum auf 3 Liter ein, entfernt die sich beim Stehen abscheidende wässrige Schicht und konzentriert an schliessend weiter auf etwa 200 ml. Dann lässt man über Nacht in der Kälte stehen, filtriert von dem ausgefal lenen Niederschlag ab,
giesst das Filtrat in das zehn fache Volumen einer Mischung aus Petroläther und Äthyläther (1 :1) und filtriert den dabei ausfallenden Niederschlag ebenfalls ab. Man wäscht ihn mit meh reren Portionen der Lösungsmittelmischung und ver einigt die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat. Die ver einigten Flüssigkeiten, die die antibiotischen Substanzen enthalten, werden im Vakuum zu einem Rückstand aus 18 g eines dunkelbraunen Öles abgedampft.
Dieses, das rohe SP-30, verhindert das Wachstum von Staphylococ- cus aureus 209P auf Agar in Verdünnungen bis herab zu 1 ssg/ml.
<I>Beispiel 3</I> Auftrennung von SP-30 in seine Komponenten Die Auftrennung des rohen SP-30, wie man es nach den Beispielen 1 und 2 erhält, in :seine Komponenten erfolgt säulenchromatographisch unter Verwendung gereinigter Diatomeenerde (Handelsprodukt Chromo- sorb W der Firma Johns Manville & Co., nicht mit Säure gewaschen, Korngrösse 60 bis 100 mesh) als inerten Träger.
Man bepackt eine Glassäule mit einem Durchmesser von etwa 12,7 mm und einer Höhe von etwa 305 mm mit einer Suspension von Chromosorb W in Form- amid. Dann mischt man eine kleine Menge Chromo- sorb W mit 1 ml einer methanolischen Lösung von 408 mg SP-30 [erhalten nach Beispiel 2 (D)], trocknet die Mischung zur Entfernung des Methanols im Va kuum und bringt sie sorgfältig oben auf die Säule auf.
Man eluiert zunächst der Reihe nach mit je 100 ml der folgenden Lösungsmittelgemische: a) Benzol-Chloroform <B>(95:</B> 5 ),gesättigt mit Formamid; b) Benzol-Chloroform (90:10), gesättigt mit Formamid; c) Benzol-Chloroform <B>(75:</B> 25), gesättigt mit Formamid; d) Benzol-Chloroform <B><I>(50:</I></B> 50), gesättigt mit Formamid; e) Benzol-Chloroform <B>(25:</B> 75), gesättigt mit Formamid;
anschliessend mit 600 mg Chloroform und schliesslich mit 1000 ml Methanol. Man erhält so insgesamt 84 Frak tionen zu je 25 ml. Jede dieser Fraktionen wird bio- autographisch gegen Staphylococcus aureus ATCC 6538P getestet, und auf Grund der Testergebnisse wer den die Fraktionen mit ähnlicher antibiotischer Aktivität und Zusammensetzung zu Gruppen vereinigt.
Jede der so gebildeten Gruppen wird im Vakuum abgedampft, mit Wasser versetzt und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden getrennt zur Trockne eingedampft, die erhaltenen Rückstände, wie vor stehend beschrieben, gegen Staphylococcus aureus bioautographisch getestet und ihre Komponenten durch die Lage der Flecken im Papierehromatogramm identi fiziert.
Die Aktivität wird nach dem standardisierten Scheibenverfahren unter Verwendung einer Scheibe mit einem Durchmesser von 6,3 mm, die mit Staphylococcus aureus imprägniert wurde, ermittelt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle VII dargestellt.
<I>Physikalische</I> und <I>chemische Eigenschaften der</I> nach <I>obigen Beispielen gewonnenen</I> Antibiotica Die Antibiotica der SP-30-Gruppe sind in den meisten der üblichen organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, Chloroform Methylenchlorid (sowie ande ren Halogenkohlenwasserstoffen) und niedrigen Alka- nolen (z. B. Methanol und Äthanol), löslich; sehr schlecht löslich in Wasser.
Bei einem pH im Bereiche von 2 bis 9,5 werden sie aus der Fermentationsbrühe durch Butanol, Äthylacetat, Methylenchlorid, Chloro form, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol oder Äther leicht extrahiert.
In qualitativen Tests auf bestimmte Gruppen ver hält sich SP-30 wie folgt: Ninhydrin- und Sakaguchitest: negativ (sowohl das rohe SP-30 als auch alle ein zelnen Fraktionen); Auf reduzierende Zucker (ammoniakalisches Silber nitrat): positiv (von den einzelnen Komponenten reagieren Komponente A stark positiv, die Komponenten B, C und D negativ); Reduktion von Ferlücyanid: positiv (von den einzelnen Komponenten reagieren Komponente A negativ, die Komponenten B, C und D positiv).
SP-30 und seine einzelnen Komponenten zeigen, ge löst in Methanol, das folgende Absorptionsverhalten gegen Ultraviolettlicht (im Bereiche von 220-400 mg): Das rohe SP-30 hat eine ziemlich schwer zu beschrei bende Absorptionskurve mit Wendepunkten bei 260 und 290 mIt, wobei der Wendepunkt bei 260 mg ein El"- von etwa 28 aufweist; die Komponente SP-30A hat eine ähnliche Kurve mit Wendepunkten bei 258<I>mA</I> (El"- etwa 70) und 295 mg; SP-30B zeigt ein Maxi mum bei 268 ma (E1-/- etwa 111);
SP-30C zeigt ein Maximum, aber Wendepunkte bei 265 mg (E1-/- etwa <B>181)</B> und bei etwa 290 mg; SP-30D zeigt ein Maximum bei 263 mm (E1-/- etwa 115).
Die Infrarotspektra von SP-30 und seinen Kom ponenten SP-30A, SP-30B; SP-30C und SP-30D suspendiert in Nujol*, sind in den Fig. 1 bis 5 der Zeichnungen dargestellt.
Die Absorptionsmaxima (sches = schwach, m = mittel, m-st = mittel bis stark, st = stark, sst = sehr stark, Sch = Schulter) und son stigen Charakteristica der Spektren befinden sich bei den folgenden Wellenlängen:
Rohes SP-30 (siehe Fig. 1) * Nujol ist eine Handelsmarke für ein Mineralöl auf Kohlenwasserstoffbasis, hinreichend rein für die Infrarotspektro- skopie, erhältlich von der Firma Plough Inc., Memphis, Ten- nessee.
EMI0005.0057
<I>2(1z)</I> <SEP> Intensität
<tb> 2,98 <SEP> st
<tb> 5,78 <SEP> st
EMI0005.0058
2(u) <SEP> Intensität
<tb> 6,00 <SEP> m-st <SEP> (breit)
<tb> 6,58 <SEP> sches
<tb> 6,81 <SEP> m-st
<tb> 7,02 <SEP> sches <SEP> (Sch)
<tb> 7,22 <SEP> m
<tb> 7,71 <SEP> m-st <SEP> (Sch)
<tb> 7,83 <SEP> st
<tb> 8,
32 <SEP> sches <SEP> (Sch)
<tb> 8,86 <SEP> m-st
<tb> 9,28 <SEP> m-st
<tb> 9,54 <SEP> breit
<tb> 9,75 <SEP> breit
<tb> 13,42 <SEP> m
<tb> 14,20 <SEP> sches <SEP> (breit) SP-30A (siehe Fig. 2)
EMI0005.0060
<I>40</I> <SEP> Intensität
<tb> 2,95 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 3,42 <SEP> m
<tb> 5,82 <SEP> st <SEP> (Sch)
<tb> 5,89 <SEP> st
<tb> 6,15 <SEP> m <SEP> (Sch)
<tb> 6,60 <SEP> sches
<tb> 6,80 <SEP> sches
<tb> 7,16 <SEP> m-st
<tb> 7,56 <SEP> m-(breit)
<tb> 8,50 <SEP> sches
<tb> 9,22 <SEP> sches
<tb> 9,46 <SEP> sches SP-30B (siehe Fig. 3)
EMI0005.0062
R(u) <SEP> Intensität
<tb> 2,98 <SEP> sches <SEP> (breit)
<tb> 5,72 <SEP> m-st
<tb> 5,80 <SEP> m-st
<tb> 6,79 <SEP> m-st
<tb> 7,15 <SEP> m-st
<tb> 7,21 <SEP> m-st
<tb> 7,88 <SEP> st
<tb> 8,
70 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 10,00 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 11,51 <SEP> m-st
<tb> 12,00 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 13,00 <SEP> st <SEP> (breit) SP-30C (siehe Fig. 4)
EMI0005.0064
Intensität
<tb> 2,95 <SEP> sches <SEP> (breit)
<tb> 5,74 <SEP> st
<tb> 6,20 <SEP> .sches <SEP> (Sch)
<tb> 6,79 <SEP> m-st
<tb> 7,20 <SEP> m
<tb> 7,70 <SEP> st <SEP> (Sch)
<tb> 7,82 <SEP> st
EMI0006.0001
Ä,(64) <SEP> Intensität
<tb> 8,85 <SEP> st
<tb> 9,28 <SEP> st
<tb> 9,56 <SEP> m
<tb> 9,60 <SEP> m <SEP> (breit)
<tb> 9,90 <SEP> m <SEP> (breit)
<tb> 11,50 <SEP> schw <SEP> (breit)
<tb> 12,00 <SEP> m-st <SEP> (breit)
<tb> 12,80 <SEP> m-st <SEP> (breit)
<tb> 13,35 <SEP> schw <SEP> (breit)
<tb> 14,15 <SEP> schw <SEP> (breit)
SP-30D (siehe Fig. 5)
EMI0006.0004
A(u) <SEP> Intensität
<tb> 2,95 <SEP> m
<tb> 5,75 <SEP> st
<tb> 6;00 <SEP> m <SEP> (Sch)
<tb> 6,16 <SEP> schw <SEP> (Sch)
<tb> 6,30 <SEP> schw <SEP> (Sch)
<tb> 6,56 <SEP> schw <SEP> (Sch)
<tb> 6,78 <SEP> m-st
<tb> 7,20 <SEP> m
<tb> 7,28 <SEP> schw <SEP> (Sch)
<tb> 7,70 <SEP> st <SEP> (Sch)
<tb> 7,80 <SEP> st <SEP> (Sch)
<tb> 7,88 <SEP> st
<tb> 8,32 <SEP> schw
<tb> 8,52 <SEP> schw <SEP> (Sch)
<tb> 8,88 <SEP> st
<tb> 9,28 <SEP> st
<tb> 9,42 <SEP> m-st <SEP> (breit)
<tb> 9,56 <SEP> m-st <SEP> (breit)
<tb> 9,72 <SEP> m-st <SEP> (breit)
<tb> 10,44 <SEP> schw
<tb> 11,30 <SEP> schw <SEP> (breit)
<tb> 11,60 <SEP> schw <SEP> (breit)
<tb> <B>11,82</B> <SEP> schw <SEP> (Sch)
<tb> 12,42 <SEP> st
<tb> 13,32 <SEP> m <SEP> (breit)
<tb> 13,
48 <SEP> m <SEP> (breit)
<tb> 14,20 <SEP> m <SEP> (breit) Die Stabilität der Antibiotica der SP-30-Gruppe ist für die verschiedenen Komponenten verschieden. Frak tion A ist bei Zimmertemperatur in Mischung mit einem wässrigen Puffen bei einem pH-Bereich von 2 bis 10 sta bil.
Beim Erhitzen auf 100 C sinkt seine antibiotische Aktivität ab, wenn das pH kleiner als 6 ist. Die Aktivi tät geht bei 30 Minuten langem Erhitzen auf 100 C bei pH = 2 verloren, wogegen sie unter ähnlichen Be dingungen bei einem pH von 7 und mehr nicht ver mindert wird. - Die Fraktion Bist bei Zimmertempe ratur innerhalb eines pH-Bereiches von 2 bis 10 stabil.
Bei erhöhter Temperatur (100 C) ist sie bis herab zu einem pH von 2 dreissig Minuten lang stabil; dann nimmt die Aktivität ab. - Fraktion C ist auch noch bei 100 C innerhalb eines pH-Bereiches von 2 bis 10 dreissig Minuten lang stabil. - Fraktion D ist bei Zim mertemperatur innerhalb eines pH-Bereiches von 2 bis 10, bei l00 C innerhalb eines pH-Bereiches von 4 bis 10 dreissig Minuten lang stabil.
<I>Biologische Eigenschaften der nach obigen</I> <I>Beispielen erhaltenen</I> Antibiotica Die Antibiotica der SP-30-Gruppe haben einen breiten Wirkungsbereich gegen gnampositive Organis men.
Sie sind von besonderem Wert für die Behandlung von Krankheiten, die durch penicillinresistente Mikro organismen hervorgerufen wurden (siehe Tabelle VIII). Ausserdem sind sie zur Behandlung von durch Staphylo- coccus aureus, Diplococcus pneumoniae und andere pathogene Mikroorganismen hervorgerufene Krankhei ten brauchbar.
Tabelle VIII gibt die In-vitro-Aktivität von SP-30 gegen eine Anzahl grampositiver Organismen an. Die Anfälligkeit der Mikroorganismen gegen die Antibiotica wurde nach normierten Rohrverdünnungsverfahren er mittelt:
Als Inoculum wurde durchwegs eine Verdün nung auf 10-5 einer 24 Stunden alten Brühekultur ver wendet, wobei die Endpunkte nach 24stündiger Bebrü- tung bei 37 C aufgenommen wurden; das Nährmedium besteht aus Tryptose-Phosphat-Brühe. (Das für diese Bestimmung verwendete antibiotische Material ist das aus Beispiel 1(C) erhaltene, das eine Potenz von 4000 Verdünnungseinheiten pro mg aufweist; d. h., wenn man 1 mg des Produktes:
in 1 ml Lösungsmittel löst und auf das 4000fache verdünnt, so wird unter den angewandten Testbedingungen immer noch das Wachstum von Sta- phylococcus aureus [ATCC 6538P] verhindert.) - So wohl SP-30 als auch seine einzelnen Komponenten (Fraktionen) zeigen ausserdem nach dem Scheibenprüf verfahren (Scheibendurchmesser 6,3 mm), wobei die Inhibitionszone gemessen wurde, nachdem eine mit dem Antibioticum imprägnierte Scheibe auf eine mit dem Testorganismus beimpfte Agarplatte aufgebracht und 24 Stunden bei 37 C bebrütet worden war,
eine In-vitro- Aktivität gegen gewisse Mikroorganismen, wie in Ta belle IX ausgeführt. Es wurde auch die In-vivo-Aktivi- tät gegen gewisse bakterielle Infektionen von Mäusen geprüft. Die Mäuse wurden mit einem Inoculum der be treffenden Bakterien durch intraperitoneale Injektion infiziert und wurden dann zweimal täglich mit sub kutanen Injektionen von SP-30, wobei das obige Mate rial aus Beispiel 19(C), suspendiert in 0,
25 % iger wäss riger Carboxymethyleellulose, verwendet wurde, be handelt. Ein 100%iger Schutz der mit Staphylococcus aureus infizierten Tiere wurde dabei mit Hilfe von 10 mg (- 40 000 Verdünnungseinheiten) pro Maus und Tag erzielt, ein 100%iger Schutz der mit Diplococcus pneumoniae infizierten Tiere mit Hilfe von 15 mg (= 60 000 Verdünnungseinheiten) pro Maus und Tag, verabreicht über 2 Tage.
- Die akute Toxizität LD5o des gleichen SP-30-Präparats, in üblicher Weise bestimmt (Dosierungsform: Suspension in 0,25 % iger wässriger Carboxymethylcellulose), ergab sich zu 7500 mg pro kg Maus bei subkutaner, 7500 mg pro kg Maus bei intraperiotonealer und 800 mg pro kg Maues bei intra venöser Verabreichung.
<I>Pharmazeutische</I> Verabreichungsformen <I>der obigen</I> Antibiotica Die erfindungsgemäss erhältlichen Antibiotica kön nen zur Verabreichung an den Patienten in eine der für Antibiotica üblichen Dosierungsformen gebracht werden. Hierzu können übliche pharmazeutische Trägersubstan zen verwendet werden.
EMI0007.0001
EMI0008.0001
<I>Tabelle <SEP> Il</I>
<tb> Verwendetes <SEP> M. <SEP> halophytica <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusca <SEP> M. <SEP> sp. <SEP> ATCC <SEP> 10026
<tb> Medium <SEP> NRRL <SEP> 2998 <SEP> ATCC <SEP> 12452 <SEP> NRRL <SEP> B-943
<tb> Bennett's <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig; <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut.
<tb> Agar <SEP> Kolonie <SEP> faltig, <SEP> eingerollt. <SEP> Farbe: <SEP> Peripherie <SEP> Farbe: <SEP> terracottafarben- <SEP> Farbe: <SEP> Peripherie
<tb> Farbe: <SEP> kupferfarben- <SEP> terracottafarben-g5PE, <SEP> g5PE, <SEP> intensivbraun-55. <SEP> terracottafarben-g5iPE,
<tb> g5LC;
<SEP> braunorange-54. <SEP> intensivbraun-55m, <SEP> intensivbraun-55,
<tb> Zentrum <SEP> Schokolade- <SEP> Zentrum <SEP> gewürznelken braun-g4PN, <SEP> dunkel- <SEP> braun-3PL, <SEP> dunkel braun-59. <SEP> gelbbraun-78.
<tb> Emerson- <SEP> Wachstum: <SEP> gut: <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut.
<tb> Agar <SEP> Kolonie <SEP> eher <SEP> faltig. <SEP> Farbe: <SEP> bittersüssfarben- <SEP> Farbe: <SEP> mandarinen- <SEP> Farbe: <SEP> eichenbraun Farbe: <SEP> kupferfarben- <SEP> g5PC, <SEP> tieforange-51. <SEP> farben-g5PA, <SEP> lebhaft- <SEP> g4P1, <SEP> intensivbraun <SEP> 55.
<tb> g5LC; <SEP> braunorange-54. <SEP> orange.
<tb> Tomaten- <SEP> <B>*</B>Wachstum: <SEP> gut; <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig.
<tb> mark-Hafer- <SEP> faltige <SEP> Kolonie. <SEP> Farbe:
<SEP> Peripherie <SEP> Farbe: <SEP> hellpfirsich- <SEP> Farbe: <SEP> hellpfirsich mehl-Agar <SEP> Farbe: <SEP> :Peripherie <SEP> terracottafarben-g5PE, <SEP> farben-g5IA, <SEP> mittel- <SEP> farben-g5IA, <SEP> mittel terracottafarben-g5:PE, <SEP> intensivbraun-55, <SEP> rotorange-37. <SEP> rotorange-37.
<tb> intensivbraun-55, <SEP> Zentrum <SEP> Schokolade Zentrum <SEP> hellbraun- <SEP> braun-4PN, <SEP> dunkel g4NC,intensivbraun <SEP> 55. <SEP> braun <SEP> 59.
<tb> Glucose- <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht.
<tb> Asparagin- <SEP> bis <SEP> schlecht. <SEP> Farbe: <SEP> terracottafarben- <SEP> Farbe: <SEP> leuchtend Agar <SEP> Kolonie <SEP> flach. <SEP> g5PE, <SEP> intensivbraun-55. <SEP> orange-g5LA,
<tb> Farbe:
<SEP> orange-g4LA, <SEP> intensivorange-50.
<tb> intensivorange-50.
<tb> Glucose- <SEP> * <SEP> Wachstum: <SEP> gut; <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut.
<tb> Hefeextrakt- <SEP> Kolonie <SEP> faltig. <SEP> Farbe: <SEP> tiefbraun-g4PL, <SEP> Farbe: <SEP> terracottafarben- <SEP> Farbe: <SEP> eichenbraun Agar <SEP> Farbe: <SEP> hellzimtbraun- <SEP> dunkelbraun-59. <SEP> g5PE, <SEP> intensivbraun-55. <SEP> g4PI, <SEP> intensivbraun-55.
<tb> g4LG, <SEP> mittelbraun-58.
<tb> * <SEP> Zusatz <SEP> von <SEP> 0,1% <SEP> CaC03 <SEP> zum <SEP> Medium.
EMI0008.0002
<I>Tabelle <SEP> I11</I>
<tb> Verwendetes <SEP> M. <SEP> halophytica <SEP> M. <SEP> chaleea <SEP> M, <SEP> fusca <SEP> NRRL <SEP> B-943 <SEP> M. <SEP> sp. <SEP> ATCC <SEP> 10026
<tb> <U>Med</U>ium <SEP> NRRL <SEP> 2998 <SEP> AT<U>CC</U> <SEP> 12452
<tb> Kartoffel <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut.
<tb> Farbe: <SEP> rostrot- <SEP> Farbe: <SEP> bittersüssfarben- <SEP> Farbe: <SEP> bittersüssfarben g6PG, <SEP> g5PC, <SEP> tieforange-51. <SEP> g5PC, <SEP> tieforange-51.
<tb> mittelrotbraun-43.
<tb> Karotte <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig.
<tb> Farbe: <SEP> Schokolade- <SEP> Farbe:
<SEP> feuerrot-g5NC,
<tb> braun-g4PN, <SEP> intensivrotorange-35.
<tb> dunkelbraun-59.
<tb> Saccharose- <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum.
<tb> Nitrat-Agar <SEP> bis <SEP> schlecht;
<tb> (Czapek-Agar) <SEP> Kolonie <SEP> flach. <SEP> Farbe:
<tb> eichenbraun-g4PI,
<tb> intensivbraun-55.
<tb> Tyrosin-Agar <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig; <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht.
<tb> (Beobachtungen <SEP> Kolonie <SEP> schwach <SEP> erhöht <SEP> Farbe: <SEP> schwarzes <SEP> Farbe: <SEP> kein <SEP> diffundier- <SEP> Farbe: <SEP> kein <SEP> diffundier nach <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> und <SEP> und <SEP> gefurcht. <SEP> diffundierbares <SEP> bares <SEP> Pigment. <SEP> bares <SEP> Pigment.
<tb> 14 <SEP> Tagen; <SEP> nach <SEP> Farbe:
<SEP> keine <SEP> Reaktion. <SEP> Pigment.
<tb> Gordon <SEP> und <SEP> Smith,
<tb> J. <SEP> Bact. <SEP> 69, <SEP> 147)
<tb> Pepton-Eisen-Agar <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig.
<tb> (Beobachtungen <SEP> Farbe: <SEP> keine <SEP> Reaktion. <SEP> Farbe: <SEP> Farbe: <SEP> keine <SEP> Reaktion. <SEP> Farbe: <SEP> keine <SEP> Reaktion.
<tb> nach <SEP> 2, <SEP> 7 <SEP> und <SEP> keine <SEP> Reaktion.
<tb> 14 <SEP> Tagen)
<tb> Bromkresol- <SEP> - <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig; <SEP> Wachstum: <SEP> gut;
<tb> purpur-Milch <SEP> Verdauung <SEP> findet <SEP> Verdauung <SEP> findet <SEP> statt. <SEP> Verdauung <SEP> findet <SEP> statt.
<tb> statt. <SEP> Farbe: <SEP> keine <SEP> Farbe: <SEP> keine <SEP> pH- <SEP> Farbe:
<SEP> keine <SEP> pH pHÄnderung. <SEP> Änderung. <SEP> Änderung.
EMI0009.0001
<I>Tabelle <SEP> IV</I>
<tb> Verwendetes <SEP> M. <SEP> halophytica <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusca <SEP> M. <SEP> sp.
<tb> Testkohlehydrat <SEP> NRRL <SEP> 2998 <SEP> ATCC <SEP> 12452 <SEP> NRRL <SEP> B-943 <SEP> ATCC <SEP> 10026
<tb> Arabinose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Cellulose <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Glucose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Galactose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> mittelmässig
<tb> Lactose <SEP> gut <SEP> mittelmässig <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Laevulose <SEP> gut <SEP> mittelmässig <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Mannose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Raffinose <SEP> scheint <SEP> etwas <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb>
zu <SEP> wachsen
<tb> Rhamnose <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Stärke <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Saccharose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Xylose <SEP> gut <SEP> gut <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Inosit <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Mannit <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Sorbit <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
<tb> Zur <SEP> Kontrolle:
<tb> 0,5 <SEP> % <SEP> Hefeextrakt <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht <SEP> schlecht
EMI0009.0002
<I>Tabelle <SEP> V</I>
<tb> Verwendete <SEP> M. <SEP> halophytica <SEP> M. <SEP> chalcea <SEP> M. <SEP> fusca <SEP> M. <SEP> sp.
<tb> Stickstoffquelle <SEP> NRRL <SEP> 2998 <SEP> ATCC <SEP> 12452 <SEP> NRRL <SEP> B-943 <SEP> ATCC <SEP> 10026
<tb> <B>0,5%</B> <SEP> Difco - <SEP> Wachstum: <SEP> gut; <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut.
<tb> Hefeextrakt <SEP> Kolonie <SEP> faltig. <SEP> Farbe: <SEP> rostrot-gssPG, <SEP> Farbe: <SEP> rotbraun- <SEP> Farbe: <SEP> bittersüss Farbe: <SEP> hellzimtbraun- <SEP> mittelrotbraun-43. <SEP> orange-g4PC, <SEP> farben-g5PC,
<tb> g4LG, <SEP> mittelbraun-58. <SEP> intensivorange-50. <SEP> tieforange-51.
<tb> 1,0% <SEP> NZ-Amin, <SEP> Wachstumsmittelmässig; <SEP> Wachstum:
<SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut. <SEP> Wachstum: <SEP> gut.
<tb> Typ <SEP> A <SEP> Kolonie <SEP> erhöht <SEP> und <SEP> Farbe: <SEP> hennafarben- <SEP> Farbe: <SEP> hennafarben- <SEP> Farbe: <SEP> terracotta gefurcht. <SEP> g5PG, <SEP> intensivbraun-55. <SEP> g5.PG, <SEP> intensiv- <SEP> farben-g5PE,
<tb> Farbe: <SEP> feuerrot-g5NC, <SEP> braun <SEP> 55. <SEP> intensivbraun-55.
<tb> intensivrotorange-35.
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Asparagin <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht.
<tb> Farbe: <SEP> gewärznelken braun-g3PL, <SEP> dunkel gelbbraun-78.
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Glutaminsäure <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum: <SEP> mittelmässig. <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht.
<tb> Farbe:
<SEP> gewürznelken braun-g3PL, <SEP> dunkel gelbbraun-78.
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Natrium- <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum.
<tb> nitrat
<tb> 1 <SEP> % <SEP> Ammonium- <SEP> Wachstum: <SEP> schlecht. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum. <SEP> Kein <SEP> Wachstum.
<tb> nitrat
EMI0010.0001
<I>Tabelle <SEP> V1</I>
<tb> Chromatographische <SEP> Studien <SEP> an <SEP> den <SEP> durch <SEP> Bebrätung
<tb> von <SEP> M.
<SEP> halophytica <SEP> gebildeten <SEP> antibiotischen
<tb> Substanzen
<tb> Verwendetes <SEP> RF-Werte <SEP> der <SEP> Hauptflecken
<tb> Lösungsmittelsystem
<tb> A, <SEP> absteigend <SEP> 0,0, <SEP> 0,35, <SEP> 0,60, <SEP> 0,72
<tb> B, <SEP> aufsteigend <SEP> 0,02, <SEP> 0,11, <SEP> 0,95
<tb> C, <SEP> aufsteigend <SEP> 0,95
<tb> D, <SEP> aufsteigend <SEP> 0,95
<tb> E, <SEP> aufsteigend <SEP> 1,0
<tb> F, <SEP> aufsteigend <SEP> 1,0
<tb> G, <SEP> aufsteigend <SEP> 1,0
<tb> H, <SEP> absteigend <SEP> 0,01, <SEP> 0,44, <SEP> 0,65, <SEP> 0,83 Verwendete <I>Systeme:</I> A: Benzol-Chloroform <B>(93:</B> 7 V.
T.), gesättigt mit Formamid. Chromatographisches Papier vor Verwen dung in 25 % iges methanolisches Formamid getaucht, abgelöscht und zur Entfernung des Methanols 5 Minu ten an der Luft getrocknet.
B: Benzol-Methanol <B>(9:</B> 1).
C: Methanol-Wasser <B>(80:</B> 20) mit 3 % igem Natrium chloridgehalt. Das Papier wurde vor dem Entwickeln mit einer an Natriumsulfat 0,95molaren und an Na- triumbisulfat 0,5molaren Lösung gepuffert und ge trocknet. D: Propanol-Essigsäure-Wasser <I>(50:5:40).</I> E: Butanol-Essigsäure-Wasser (4: 1 :5).
F: Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser <B><I>(15:</I></B> 10 :<B>3:</B> 12).
G: Phenol-Wasser (80 g : 20 ml).
H: Methylenehlorid-Tetrachlorkohlenstoff (80:20), mit Formamid gesättigt. Das chromatographische Papier wurde vor der Verwendung in 50%iges methanolisches Formamid getaucht, abgelöscht und zur Entfernung des Methanols 5 Minuten an der Luft getrocknet.
Die beobachteten RF-Werte unterscheiden die Antibiotica der SP-30-Gruppe von allen bekannten Antibiotica einschliesslich Oleandomycin, Novobiocin, Penicillin G und Erythromycin.
EMI0010.0035
<I>Tabelle <SEP> V11</I>
<tb> Chromatographie <SEP> von <SEP> Antibiotica <SEP> der <SEP> SP-30-Gruppe
<tb> an <SEP> Diatomeenerde
<tb> Eluatfraktion <SEP> Nr. <SEP> Gruppe <SEP> Nr.
<SEP> enthält <SEP> Komponenten
<tb> 1 <SEP> A <SEP> keine
<tb> 2 <SEP> bis <SEP> 5 <SEP> B <SEP> D <SEP> (Spur)
<tb> 6 <SEP> bis <SEP> 16 <SEP> C <SEP> D, <SEP> C <SEP> (Spur)
<tb> 17 <SEP> bis <SEP> 23 <SEP> D <SEP> C, <SEP> D <SEP> (Spur)
<tb> 24 <SEP> bis <SEP> 43 <SEP> E <SEP> C
<tb> 44 <SEP> bis <SEP> 46 <SEP> F <SEP> C, <SEP> B
<tb> 47 <SEP> bis <SEP> 57 <SEP> G <SEP> B, <SEP> C <SEP> (Spur)
<tb> 58 <SEP> bis <SEP> 80 <SEP> H <SEP> keine
<tb> 81 <SEP> bis <SEP> 84 <SEP> I <SEP> A, <SEP> B <SEP> (Spur),
<tb> C <SEP> (Spur)
EMI0010.0036
<I>Tabelle <SEP> V111</I>
<tb> In <SEP> vitro-Aktivität <SEP> von <SEP> SP-30
<tb> Systematischer <SEP> Name <SEP> der <SEP> Minimale <SEP> Inhibitionskonzentration
<tb> ve<U>r</U>wendeten <SEP> <U>M</U>ikro<U>o</U>rganismen <SEP> Stammbezeichnung <SEP> in <SEP> ,ug/ml
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var.
<SEP> mycoides <SEP> ATCC <SEP> 7064 <SEP> 6,0
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var. <SEP> mycoides <SEP> DA <SEP> 39 <SEP> 0,75
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var. <SEP> mycoides <SEP> DA <SEP> 30 <SEP> 12,0
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> DA <SEP> 31 <SEP> 0,25
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> DA <SEP> 36 <SEP> 3,0
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> DA <SEP> 35 <SEP> 6;
0
<tb> Bacillus <SEP> sphaericus <SEP> DA <SEP> 32 <SEP> 2,0
<tb> Bacillus <SEP> sphaericus <SEP> DA <SEP> 33 <SEP> 1,0
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> DA <SEP> 999 <SEP> 0,075
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> DA <SEP> 40 <SEP> 0,75
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538 <SEP> 0,25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 6538P <SEP> 0,25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 12715 <SEP> 2,0
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 1163 <SEP> 1,0
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC <SEP> 9996 <SEP> 0,75
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> var. <SEP> Gray <SEP> - <SEP> 0,25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> var.
<SEP> Smith <SEP> DA <SEP> 141 <SEP> 0,25
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 2026 <SEP> 0,25
<tb> (penicillinresistente <SEP> klinische <SEP> Isolate) <SEP> DA <SEP> 2027 <SEP> 0,75
<tb> DA <SEP> 2028 <SEP> 1,5
<tb> DA <SEP> 2029 <SEP> 0,75
EMI0011.0001
Systematischer <SEP> Name <SEP> der <SEP> Minimale <SEP> Inhibitionskonzentration
<tb> verwendeten <SEP> Mikroorganismen <SEP> Stammbezeichnung <SEP> in <SEP> ygIml
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> DA <SEP> 2030 <SEP> 2,0
<tb> (pencillinresistente <SEP> klinische <SEP> Isolate) <SEP> DA <SEP> 2031 <SEP> 1,0
<tb> DA <SEP> 2032 <SEP> 0,75
<tb> DA <SEP> 2033 <SEP> 0,75
<tb> DA <SEP> 2034 <SEP> 0,75
<tb> DA <SEP> 2035 <SEP> 1,0
<tb> Staphylococcus <SEP> epidermidis <SEP> DA <SEP> 41 <SEP> 0,25
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> ATCC <SEP> 9341 <SEP> 0,
75
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> <B>D</B>A <SEP> 60 <SEP> 0,05
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> C <SEP> DA <SEP> 21 <SEP> 0,025
<tb> Streptococcus <SEP> fecalis <SEP> ATCC <SEP> 10541 <SEP> 16,0
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> DA <SEP> 110 <SEP> 16,0
<tb> Escherichia <SEP> intermedia <SEP> DA <SEP> 111 <SEP> 2,0
<tb> Mycobacterium <SEP> smegmatis <SEP> DA <SEP> 150 <SEP> 4,
0
EMI0011.0002
<I>Tabelle <SEP> IX</I>
<tb> In-vitro-Aktivität <SEP> der <SEP> Antibiotica <SEP> der <SEP> SP-30-Gruppe
<tb> Verwendetes <SEP> Angewandte <SEP> Konzentration <SEP> Inhibitionszone <SEP> in <SEP> mm <SEP> gegen
<tb> Antibioticum <SEP> in <SEP> pg <SEP> Staphylococcus <SEP> Streptococcus <SEP> Bacillus
<tb> aureus <SEP> pyogenes <SEP> subtilis
<tb> SP-30 <SEP> 1000 <SEP> 28 <SEP> 29 <SEP> 12
<tb> 100 <SEP> 19 <SEP> 19
<tb> 10 <SEP> 13 <SEP> 9 <SEP> 0
<tb> 1 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> SP-30A <SEP> 1000 <SEP> 28 <SEP> 31 <SEP> 9
<tb> 100 <SEP> 17 <SEP> 12 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> * <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> SP-30B <SEP> 1000 <SEP> 28 <SEP> 35 <SEP> 11
<tb> 100 <SEP> 20 <SEP> 20 <SEP> 8
<tb> 10 <SEP> 11 <SEP> * <SEP> 0
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> S#P-30C <SEP> 1000 <SEP> 28 <SEP> 33 <SEP> 14
<tb> 100
<SEP> 22 <SEP> 24 <SEP> 8
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<tb> 1 <SEP> 9 <SEP> * <SEP> 0
<tb> SP-30D <SEP> 1000 <SEP> 19 <SEP> 19 <SEP> 0
<tb> <B>100</B> <SEP> 13 <SEP> 10 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> @\ <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> * <SEP> bedeutet <SEP> das <SEP> Vorhandensein <SEP> einer <SEP> kleinen, <SEP> zahlenmässig <SEP> schlecht <SEP> definierbaren <SEP> Inhibitionszone.