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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums, das durch Züch- tung einer bisher nicht beschriebenen Variante von Micromonospora halophytica der Ordnung Actinomycetales unter kontrollierten Bedingungen gewonnen werden kann.
Der Mikroorganismus für die Herstellung des erfindungsgemäss erhältlichen Antibioticums ist eine Variante von Micromonospora halophytica, die aus dem Schlamm am Grund eines Salzteiches in Syracuse,
EMI1.1
Y.,UtilizationResearch and Development Division, Peoria, Illinois, hinterlegt, wo sie unter ihrer NRRL-Nummer allgemein erhältlich ist. Der Mikroorganismus wurde als Micromonospora halophytica var. nigra bezeichnet und hat die NRRL-Nummer 3097 erhalten.
M. halophytica var. nigra zeichnet sich durch ein langes, verzweigtes Mycel mit einem Durchmesser von etwa 0,5 Mm und reichliche Sporenbildung aus. Die Sporen sind elliptisch bis kugelförmig, und ihr grösster Durchmesser beträgt durchschnittlich l, 2 jim. in älteren Kulturen erscheinen sie glattwandig und dunkelgefärbt. Die Sporen scheinen statistisch gleichmässig über das ganze Mycel verteilt und von kurzen oder langen Sporophoren getragen zu sein ; gelegentlich sind sie auch stiellos. Das vegetative Mycel teilt sich normalerweise nicht in polymorphe Elemente auf, sondern scheint ein Ganzes zu bleiben. Das Mycel ist nicht säurefest und grampositiv.
Zur Isolierung der genannten Mikroorganismen wird etwas von der getrockneten Schlammprobe in sterilem destilliertem Wasser geschüttelt, und nach Herstellung geeigneter Verdünnungen wird die Sus-
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;Wasser-Gemisch wird genügend Antibioticum extrahiert, um ein Konzentrat zu liefern, das in einem Scheibentest das Wachstum von Staphylococcus aureus und Bacillus subtilis verhindert. Eine antibiotische Aktivität gegen die gleichen Organismen lässt sich beobachten, wenn man 96 h in einem wässerigen Medium, das geeignete Nährstoffe enthält, z. B. 10/0 NZ-Amin Typ A (ein pankreatisches Kaseinhydrolysat, erhältlich von der Firma Sheffield Chemical Co., Norwich, N. Y.) und 5% lösliche Stärke (Markenbezeichnung Difco, von der Firma Difco Laboratories Inc., Detroit, Mich. ), submers bebrütet.
Die in Tabelle I aufgenommenen Koloniebeobachtungen wurden nach 14 tägiger Bebrütung bei 24 bis 260 C in den betreffenden Medien angestellt. Die Farbangaben bestehen aus zwei Bezeichnungen : Die jeweils erste Farbbezeichnung besteht aus einem Farbnamen gemäss dem "Descriptive Color Na-
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me Dictionaryn von Taylor, Knoche und Granville, herausgegeben durch die Container Corporation of
America [1950], (USA), in Verbindung mit einer diesem Namen entsprechenden Nummer, welche dem "Color Harmony Manual", 4. Auflage [1958], herausgegeben ebenfalls von der Container Corporation of America, entnommen ist ; die zweite Bezeichnung besteht aus einem Farbnamen und einer Nummer 5 gleicher Bedeutung, gemäss National Bureau of Standards (USA), Circular 553 vom 1.
November 1955.
Tabelle I
EMI2.1
<tb>
<tb> Koloniebeobachtungen <SEP> auf <SEP> verschiedenen <SEP> Medien
<tb> Verwendetes <SEP> Medium <SEP> : <SEP> Beobachtungen <SEP> : <SEP>
<tb> Bennett's <SEP> Agar <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut <SEP> ; <SEP> Kolonie <SEP> faltig.
<tb>
+ <SEP> 0, <SEP> 1"%) <SEP> CaCO <SEP> Faibe <SEP> : <SEP> kofferbraun-g4NE,
<tb> intensivbraun-55.
<tb>
Emerson's <SEP> Agar <SEP> Wachstum <SEP> : <SEP> gut <SEP> ; <SEP> Kolonie <SEP> gekerbt-
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP> CaCOg <SEP> eingerollt.
<tb>
Farbe <SEP> : <SEP> sepiabraun-g3PN, <SEP>
<tb> dunkel <SEP> gelblich-braun-78.
<tb>
Tomatenmark-Wachstum <SEP> : <SEP> gut <SEP> ; <SEP> faltige <SEP> Kolonie.
<tb>
Hafermehl-Agar <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> terracottafarben-gSPE, <SEP>
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP> CaCO <SEP> intensivbraun-55.
<tb>
Glucose-Wachstum <SEP> : <SEP> mittelmässig <SEP> ; <SEP>
<tb> Asparagin-Agar <SEP> Kolonie <SEP> flach.
<tb>
+ <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP> CaCO <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> orange-g4LA,
<tb> intensivorange-50.
<tb>
Glucose-Hefe-Wachstum <SEP> : <SEP> gut <SEP> ; <SEP> Kolonie <SEP> faltig.
<tb> extrakt-Agar <SEP> Farbe <SEP> : <SEP> terracottafarben-g5PE, <SEP>
<tb> (0, <SEP> 5% <SEP> Hefe, <SEP> 1, <SEP> Wo <SEP> Dextrose) <SEP> intensivbraun-55.
<tb>
0, <SEP> 1% <SEP> CaCOa <SEP>
<tb>
Zusätzlich wurde das Wachstumsverhalten von M. halophytica var. nigra auf üblichen Untersuchungsmedien beobachtet ; die Ergebnisse sind die folgenden: Kartoffelscheiben - Wachstum: spärlich, verkörpert durch mehrere grosse Makrokolonien, welche sich von einer Impfstelle her entwickeln, sonst wird kein Wachstum gezeigt. Karottenscheiben-Wachstum : gering. Czapek's Agar-Wachstum : mit- telmässig, faltig ; Farbe : schokoladenbraun-g4PN, dunkelbraun-59. Tyrosin-Agar-Wachstum : mittelmässig ; keine Farbreaktion. PeptonEisen-Agar-Wachstum; mittelmässig: keine Farbreaktion.
Auf einem Agarmedium, bestehend aus 1% NZ-Amin Typ A plus lU Glucose undO, l'%) Calciumcar- bonat, ist das Wachstum mittelmässig, die Kolonie wenig faltig und die Farbe terracottafarben-g5PE, in- tensivbraun-55. Wenn die Stickstoffquelle 0, 5U Difco-Hefeextrakt ist, ist das Wachstum gut, faltig ; die Farbe ist ebenfalls terracottafarben-g5PE, intensivbraun-55.
M. halophytica var. nigra wächst innerhalb eines pH-Bereiches von 6,8 bis 7,8 gut. Die Kolonien sind auf vielen natürlichen Agarmedien anfänglich orange, aber sobald die Sporenbildung zunimmt, werden sie olivbraun und eventuell schwarz. Die reichliche schwarze Sporenschicht, typisch für diese Kultur auf vielen Medien, unterscheidet sich deutlich von der hellbraunen bis braunen Sporenschicht, die von M. halophytica var. halophytica gebildet wird. Ausserdem bildet M. halophytica var. nigra nicht das rötlich-braune diffusionsfähige Pigment, das M. halophytica var. halophytica auf gewissen Medien bildet.
Die von M. halophytica var. nigra gebildete, typische schwarze Sporenschicht wird gewöhnlich auf Platten gefunden, bei denen für die Kohlenhydratausnutzungsuntersuchungen die folgenden Kohlenhydrate verwendet wurden : D-Fructose, D-Galaktose, D-Lactose, Raffinose und D-Trehalose.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm des Mikroorganismus Micromonospora halaophytica var. nigra, hinterlegt unter der Registriernummer NRRL 3097, oder
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eine von dessen Mutanten oder Varianten mit im wesentlichen gleicher biologischer Aktivität, unter üblichen Bedingungen, vorzugsweise aerob in einem wässerigen Nährmedium, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, bebrütet und das gebildete Antibiotikum aus der Kultur isoliert. Mutanten können aus dem beschriebenen Organismus durch mutierende Mittel, wie Hochfrequenzbestrahlung (Röntgenstrahlen, ultraviolettes Licht), Actinophagen und/oder Stickstoff-Lost erhalten werden.
Bildung und Isolierung des Antibioticums
Der oben beschriebene Mikroorganismus liefert mit Hilfe der im folgenden beschriebenen Fermentationsverfahren ein, Antibioticum, welches sowohl im Mycel als auch in der Brühe gefunden wird. Es wird im allgemeinen vorgezogen, die Brühe nach Abtrennung des Mycels als Antibioticumquelle zu verwenden. Nach papierchromatographischen Untersuchungen unter Anwendung verschiedener Lösungsmittelsysteme scheint das gewonnene Antibioticum eine einzige Substanz zu sein, jedoch erfolgte in gewissen Lösungsmittelsystemen Auftrennung in vier verschiedene Fraktionen. Die durch M. halophytica var. nigra erzeugte Substanz wird im folgenden als No. 467 bezeichnet.
Zur Bildung von No. 467 kann M. halophytica var. nigra bei einer geeigneten Temperatur zwischen etwa 25 bis 400 C unter submersen aeroben Bedingungen in einem wässerigen Näbrmedium. das eine as- similierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält, kultiviert werden. Geeignete Stickstoffquellen können sowohl organischer als auch anorganischer Natur sein, vorzugsweise sind es aber organische Pro-
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Stärke, Dextrin, verschiedene Zucker u. dgl.
Die Bebrütung erfolgt ungefähr 96 bis 120 h lang bei einem PH-Wert von ungefähr 6, 5 bis 8, 0. Ungefähr gegen Ende dieses Zeitraumes ist maximale Antibioticumbildung erreicht. Man trennt das Mycel durch Filtration ab und gewinnt das Antibioticum aus der Brühe durch Solventextraktion, wie weiter un- ten beschrieben wird.
Das Antibioticum wird aus dem aus der Brühe gewonnenen Extrakt durch Eindampfen des Lösungsmittels zu einem Rückstand gewonnen. Der Rückstand wird papierchromatographisch untersucht. Die Papierchromatogramme werden in verschiedenen Lösungsmittelsystemen entwickelt und die l) --Werte für die einzelnen Komponenten nach bioautographischen Standardmethoden ermittelt ; diese bestehen darin, dass man ein Papierchromatogramm entwickelt und trocknet und es dann über eine mit Staphylococcus aureus beimpft Agarplatte legt. Nach einer Kontaktdauer von 15 min wird das Papier von der Platte entfernt, die dann bei 370 C 16 bis 20 h bebrütet wird.
Die Beobachtung der Inhibierungszonen gestattet die Bestimmung der RF-Werteder antibiotisch wirksamen Bestandteile.
EMI3.2
Tabelle II
EMI3.3
<tb>
<tb> Chromatographische <SEP> Untersuchungen <SEP> des <SEP> durch <SEP> Fermentation <SEP> von <SEP> M. <SEP> halophytica <SEP> var. <SEP> nigra
<tb> erzeugten <SEP> Antibioticums
<tb> System: <SEP> RF-Wert <SEP> der <SEP> Hauptflecken <SEP> : <SEP>
<tb> A-absteigen <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 06 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 40 <SEP> ; <SEP> 0,66
<tb> B-aufsteigend <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> - <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> C-aufsteigen <SEP> 0, <SEP> 78 <SEP> - <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> D-aufsteigend <SEP> 0, <SEP> 95
<tb> E-aufsteigend <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> F-aufsieigend <SEP> l, <SEP> 0
<tb> G-aufsteigend <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> H-absteigend <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> ; <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ;
<SEP> 0,9
<tb>
Lösungsmittelsysteme :
A) Benzol-Chloroform (93 : 7 Vol. -Teile), gesättigt mit Formamid ; Chromatographiepapier vor Gebrauch in eine 25%ige methanolische Formamidlösung getaucht, abgelöscht und zur Entfernung des Methanols 5 min an der Luft getrocknet ; Entwicklungszeit 2 h.
B) Benzol-Methanol (9 : 1).
C) Methanol-Wasser (80 : 20) mit 3%igem Natriumchloridgehalt. Das Papier wurde vor dem Entwickeln mit einer an Natriumsulfat 0,95-molaren und an Natriumbisulfat 0,5-molaren Lösung gepuffert
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und getrocknet ; 4 bis 6 h.
D) Propanol-Essigsäure-Wasser (50 : 5 : 40) ; 18 h.
E) Butanol-Essigsäure-Wasser (4 : 1 : 5) ; 18 h.
F) Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser (15 : 10 : 3 : 12) ; 18 h. i G) Phenol-Wasser (80 g : 20 ml) ; 18 h.
H) Benzol-Petroläther-Aceton (10 : 2, 5 : 5) ; 1 bis 2 h.
Die beobachteten, in Tabelle II angegebenen RF-Werte unterscheiden die Antibiotica von allen andern bekanntenAntibiotica einschliesslich Oleandomycin, Novobiocin, Penicillin G, Erythromycinund
Gentamycin. Sie sind denjenigen der SP-30-Antibiotica ähnlich, die in der Patentschrift Nr. 246 924 beschieben sind, mit gewissen Unterschieden in den Lösungsmittelsystemen A und B der obigen Tabelle II.
In den folgenden Beispielen sind geeignete Verfahren zum Bebrüten von M. halophytica var. nigra, zum Extrahieren des Antibioticums aus der Brühe und zur Isolierung von No. 467 angegeben. Die Wert- bestimmung erfolgte durch "Standard-Scheiben-Analysen-Methoden" ("standard disc assay methods") gegen Staphylococcus aureus.
Bei Beispiel l : Schüttelkolben-Bebrütung von Micromonospora halophytica var. nigra
A) Keimung :
Man gibt eine lyophilisierte Kultur von M. halophytica var. nigra in einen 300 ml-Schüttelkolben, der 100 ml des folgenden sterilen Mediums enthält :
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<tb>
<tb> Rindfleischextrakt <SEP> 3 <SEP> g <SEP>
<tb> Tryptose <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Dextrose <SEP> l <SEP> g <SEP>
<tb> lösliche <SEP> Stärke <SEP> 24 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Wasser <SEP> ad <SEP> 11
<tb>
Man bebrütet den Kolben samt Inhalt 5 Tage bei 370 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Umdr/min, 5 cm Rüttelbewegung).
B) Fermentation (Bebrütung) :
Man überträgt je 25 ml des durch vorstehende Keimung erhaltenen Inoculums auf vier Zwei - LiterKolben, deren jeder 500 ml des folgenden Mediums enthält :
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<tb>
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 50 <SEP> g
<tb> NZ-Amin <SEP> Typ <SEP> A <SEP> 10 <SEP> g
<tb> enthärtetes <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 11
<tb> PH-Wert <SEP> nach
<tb> Sterilisation <SEP> 7, <SEP> 45.
<tb>
Diese Kolben samt Inhalt bebrütet man 96 bis 120 h lang bei 280 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine.
Manchmal ist es vorteilhaft, eine zweite Keimung anzuschliessen, wobei ein 25 ml-Inoculum der ersten Keimung aseptisch in 500 ml des Keimungsmediums übertragen wird und wie oben 72 h lang geschüttelt wird.
C) Alternativ-Verfahren zur Fermentation (Bebrütung) :
Man verwendet 500 ml eines Nährmediums, das 30 g Sojabohnenmehl, 40 g Dextrose, 5 g Calciumcarbonat und 1000 ml Leitungswasser enthält. Man überträgt je 25 ml des durch vorstehende Keimung erhaltenen Inoculums auf vier Zwei-Liter-Kolben, deren jeder das vorstehend genannte Nährmedium enthält, und bebrütet die Kolben samt Inhalt 5 Tage lang bei 280 C auf einer rotierenden Schüttel- maschine.
D) Extraktion von No. 467 :
Man filtriert die 40 l Fermentationssubstrat, die durch Vereinigung von 20 Chargen der Fermentation von M. halophytica var. nigra entsprechend Teil B oder C dieses Beispiels erhalten wurden. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen ; durch Vereinigung der Filtrate erhält man ungefähr 40 l. Man extrahiert zweimal mit dem gleichen Volumen Äthylacetat (je 40 l) und dampf zu einem Rückstand ein.
Das dunkle Öl wird in 100 ml Äthylacetat aufgenommen und langsam unter Rühren zu einem Liter einer
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Äthylacetat-Petroläther-Mischung (l : l) gegeben. Nach Filtrieren wird die Lösung zu einem Rückstand von 5, 2 g eines dunkelbraunen Öls eingedampft. Das Öl wird in 150 ml eines Benzol-Chloroform-Ge- misches (l : l) aufgenommen und wieder filtriert. Zu dem Filtrat werden langsam unter Rühren 1, 5 l Hexan gegeben.
Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet ; man erhält 1, 12 g von No. 467 als amorphes Pulver, das (auf Agarplatten) antibiotische Wirksamkeit gegenüber Staphylococcus aureus (ATCC 209P) bis herab zu einer Verdünnung von 0, 1 y/ml zeigt ; gegenüber Streptococcus faecalis zeigt es Wirksamkeit bis herab zu 1 y/ml und gegenüber B. subtilis bis herab zu 10 y/ml.
Bei s pie 1 2 : Tankfermentation von M. halophytica var. nigra
A) Keimung :
Eine lyophilisierte Kultur von M. halophytica var. nigra wird in einen 300 ml-Schüttelkolben gegeben, der 100 ml des sterilen Mediums, wie in Beispiel 1 (Keimung) beschrieben, enthält.
Man bebrütet 5 Tage lang bei 370 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Dmdr/min, 5 cm Rüttelbewegung).
B) Bereitung des Inoculums :
Man überträgt je 25 ml des durch vorstehende Keimung gewonnenen Inoculums auf vier Zwei-LiterKolben, deren jeder 100 ml des für die Keimung verwendeten sterilen Mediums enthält. Man bebrütet die Kolben samt Inhalt 5 Tage lang bei 280 C auf einer rotierenden Schüttelmaschine (280 Umdr/min, 5 cm Rüttelbewegung), vereinigt die Kolbeninhalte und fügt je 25 ml des durch diese Vereinigung erhaltenen zweiten Inoculums zu zehn Zwei-Liter-Kolben, deren jeder 500 ml des oben beschriebenen sterilen
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C) Fermentation (Bebrütung) :
Man überträgt die entsprechend Teil B dieses Beispiels erhaltenen 5 l Inoculum aseptisch in einen etwa 130 1 fassenden Fermentationstank, der ungefähr 90 l des folgenden sterilen Mediums enthält :
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<tb>
<tb> Lösliche <SEP> Stärke <SEP> 4500 <SEP> g
<tb> NZ-Amin <SEP> Typ <SEP> A <SEP> 900 <SEP> g
<tb> Antischaummittel <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> enthärtetes <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 90 <SEP> l.
<tb>
Man bebrütet 55 bis 65 h lang [bis das kompakte Zellvolumen ("packed cell volume") etwa 4,5 bis 5, 00/0 des Gesamtvolumens beträgt, wie durch 5minutiges Zentrifugieren einer 10 ml- Probe bei 2800 Umdr/min bestimmt wird] unter den folgenden Bedingungen :
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<tb>
<tb> Temperatur <SEP> 260 <SEP> C <SEP>
<tb> Zufuhr <SEP> an <SEP> steriler <SEP> Luft <SEP> etwa <SEP> 75 <SEP> bis <SEP> 80 <SEP> l/min
<tb> Druck <SEP> etwa <SEP> 0,5 <SEP> bis <SEP> 0,6 <SEP> atü
<tb> Bewegung <SEP> 160 <SEP> bis <SEP> 165 <SEP> Umdr/min.
<tb>
Die folgenden Zahlenangaben sind typisch für den Verlauf der Bebrütung :
EMI5.4
<tb>
<tb> Kompak- <SEP> Scheiben- <SEP>
<tb> Dauer <SEP> tes <SEP> prüfung
<tb> der <SEP> Luft- <SEP> Zell- <SEP> gegen <SEP>
<tb> Bebrütung <SEP> Temp. <SEP> zufuhr <SEP> Druck <SEP> Bewegung <SEP> volumen <SEP> Staph.
<tb>
(h) <SEP> (0 <SEP> C) <SEP> (L/min) <SEP> (atü) <SEP> (Umdr/min) <SEP> PH <SEP> aureus
<tb> 0 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0, <SEP> 49 <SEP> 160 <SEP> 6, <SEP> 80
<tb> 8 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0,55 <SEP> 160 <SEP> 6, <SEP> 95 <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> 16 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0,53 <SEP> 160 <SEP> 6,85 <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> 23 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0,52 <SEP> 160 <SEP> 7,10 <SEP> 1,5 <SEP> 14mm-Zone
<tb> 31 <SEP> 26 <SEP> 76 <SEP> 0, <SEP> 53 <SEP> 160 <SEP> 7, <SEP> 35 <SEP> 1, <SEP> 5
<tb> 38 <SEP> 26 <SEP> 79 <SEP> 0,49 <SEP> 165 <SEP> 7,60 <SEP> 2,5 <SEP> -
<tb>
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<tb>
<tb> Kompak- <SEP> Scheiben- <SEP>
<tb> Dauer <SEP> tes <SEP> prüfung
<tb> der <SEP> Luft- <SEP> ZeIl- <SEP> gegen <SEP>
<tb> Bebrütung <SEP> Temp. <SEP> zufuhr <SEP> Druck <SEP> Bewegung <SEP> volumen <SEP> Staph.
<tb>
(h) <SEP> (0 <SEP> C) <SEP> (L/min) <SEP> (atü) <SEP> (Umdr/min) <SEP> PH <SEP> (%) <SEP> aureus
<tb> 46 <SEP> 26 <SEP> 79 <SEP> 0,54 <SEP> 165 <SEP> 7, <SEP> 75 <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> 21 <SEP> mm-Zone <SEP>
<tb> 54 <SEP> 26 <SEP> 79 <SEP> 0,52 <SEP> 165 <SEP> 7,90 <SEP> 4, <SEP> 5
<tb> 65 <SEP> 26 <SEP> 79 <SEP> 0,51 <SEP> 165 <SEP> 7,80 <SEP> 5,0 <SEP> 25 <SEP> mm-Zone <SEP>
<tb>
D) Isolierung von No. 467 :
Man filtriert das Mycel von der Brühe unter Verwendung einer Filterhilfe ab, stellt denpH-Wert des Filtrates auf 7,0 ein und extrahiert die vorliegenden 90 l mit zwei Volumina Äthylacetat. Den Extrakt engt man im Vakuum auf 3 l ein, entfernt die sich beim Stehen abscheidende wässerige Schicht und engt die Lösung anschliessend weiter auf etwa 200 ml ein.
Dann lässt man über Nacht in der Kälte stehen, filtriert von dem ausgefallenen Niederschlag ab, giesst das Filtrat in das zehnfache Volumen einer Mischung aus Petroläther und Äthyläther (1 : 1) und filtriert den dabei ausfallenden Niederschlag ebenfalls ab. Man wäscht ihn mit mehreren Portionen der Lösungsmittelmischung [Petroläther-Äthyl- äther (l : l)] und vereinigt die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat. Die vereinigten Flüssigkeiten, die die antibiotischen Substanzen enthalten, werden im Vakuum zu einem Rückstand aus 18 g eines dunkelbraunen Öls eingedampft. Dieses Rohprodukt verhindert das Wachstum von Staphylococcus aureus 209P auf Agar in Verdünnungen bis herab zu 1 y/ml.
Physikalische und chemische Eigenschaften von No. 467 No. 467 ist in den meisten der üblichen organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, Chloroform, Methylenchlorid (sowie andern Halogenkohlenwasserstoffen) und lliedrigen Alkanolen (z. B. Methanol und Äthanol), löslich ; es hat eine sehr geringe Löslichkeit in Wasser. Bei einem pH-Wert im Bereiche von 2 bis 9,5 wird es aus der Fermentationsbrühe durch Butanol, Äthylacetat, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Benzol oder Äther leicht extrahiert.
Bei qualitativen Tests auf bestimmte Gruppen verhält sich No. 467 wie folgt :
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<tb>
<tb> Ninhydrin- <SEP> und <SEP> Sakaguchitest <SEP> negativ
<tb> Reduzierende <SEP> Zucker <SEP> (mit <SEP> ammoniakalischer
<tb> Silbernitratlösung) <SEP> positiv
<tb> Reduktion <SEP> von <SEP> Ferricyanid <SEP> positiv.
<tb>
Das Antibioticum No. 467 zeigt, gelöst in Methanol, das folgende Absorptionsverhalten gegen ultraviolettes Licht (im Bereich von 210 bis 400 nm) : Es hat eine ziemlichschwer zu beschreibende Absorptionskurve mit Wendepunkten bei 264 und 302 nm ; wobei der Wendepunkt bei 264 nm ein E ''0=183 und der Wendepunkt bei 302 nm ein E'"= 116,2 haben.
Das Antibioticum No. 467 ist stabil gegen Säuren und gegen Erhitzen.
Die Elementaranalyse zeigt das folgende Ergebnis :
C 60, 73% ; H 7, 53% ; N 3, 79%;
O 27,20%; Cl 0,04%; S 0, 80%.
Das infrarotspektrum von No. 467, suspendiert inMineralöl (Nujol) istinFig. l Inder Zeichnung dargestellt, wobei X die Wellenlänge in Mm, y die Frequenz in cm* und A die Absorption bedeuten.
Die Absorptionsmaxima und sonstigen Charakteristika sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt (schw = schwach, m = mittel, m-st = mittel bis stark, st = stark, Sch = Schulter).
Zur Vermeidung eventueller Irrtümer wird darauf verwiesen, dass die bei den Wellenlängen von3, 5 bis 3,6, 6,75 bis 6,85 und 13,80 bis 13,90 m in der graphischen Darstellung gemäss Fig. 1 dargestellten Spitzen auf dem Vorhandensein des Mineralöls Nujol beruhen und in der folgenden Tabelle daher nicht aufscheinen.
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<tb>
<tb>
Wellenlänge
<tb> (jim) <SEP> Intensität
<tb> 2, <SEP> 98-3, <SEP> 15 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 3,65 <SEP> m-Schw <SEP> (breit)
<tb> 5,77 <SEP> schw-m
<tb> 5,83 <SEP> schw-m
<tb> 6,02 <SEP> m-st
<tb> 6,05 <SEP> m-st
<tb> 6,07 <SEP> m-st
<tb> 6, <SEP> 13 <SEP> Sch <SEP>
<tb> 6, <SEP> 18 <SEP> st <SEP>
<tb> 6,30 <SEP> Sch
<tb> 6, <SEP> 37 <SEP> m
<tb> 6, <SEP> 45 <SEP> m
<tb> 6,58 <SEP> m-st
<tb> 7, <SEP> 85 <SEP> - <SEP> 7, <SEP> 95 <SEP> st <SEP> (breit)
<tb> 8,05 <SEP> st
<tb> 8,20 <SEP> Sch
<tb> 8,35 <SEP> Sch
<tb> 8,45 <SEP> Sch
<tb> 8,52 <SEP> m-st
<tb> 8,65 <SEP> Sch
<tb> 9,43 <SEP> m-st
<tb> 9,55 <SEP> m-st
<tb> 9,80 <SEP> Sch
<tb> 10,25 <SEP> schw-m
<tb> 11, <SEP> 15-11, <SEP> 25 <SEP> schw <SEP> (breit)
<tb> 11,95 <SEP> schw
<tb> 13, <SEP> 15.. <SEP> rn-st <SEP>
<tb>
Biologische Eigenschaften von No. 467
Das Antibiotikum No.
467 hat einen breiten Wirkungsbereich gegen grampositive Organismen. Es istvonbesonderemWertfürdieBehandlungvonKrankheiten, diedurchpenicillimesistenteMikroorganismen hervorgerufen werden, da dieses neue Antibioticum imstande ist, solche Organismen zu hemmen oder zu vernichten. Ausserdem ist es zur Behandlung von Krankheiten, die durch Staphylococcus aureus, Diplococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes und andere pathogene Mikroorganismen hervorgerufen werden, brauchbar. Ausserdem ist dieses Antibioticum eine wertvolle Laboratoriums - Sterilisierungs- Hilfe bei der Beseitigung von Überwucherung von grampositiven Organismen auf Anlagen, die zur Untersuchung des Wachstums von gramnegativen Organismen dienen.
Die In-vitro-Aktivität von No.467 im Vergleichstest gegen eine Reihe grampositiver Organismen ist in Tabelle IV dargestellt. Die Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegen das Antibioticum wurde nach normierten Rohr verdünnungsverfahren wie folgt ermittelt : Als Inoculum wurden durchwegs Verdünnungen auf 10 -5 von 24 h alten Brühekulturen verwendet, wobei die Endpunkte nach 24stündiger Be- brütung bei 370 C aufgenommen wurden. Wo nicht anders angegeben, besteht das Nährmedium aus Tryptose-Phosphat-Brühe. Bei diesen Tests wurde das nach Beispiel 1 (D) erhaltene Antibioticum mit einer Wirksamkeit von 18000 Verdünnungseinheiten pro mg verwendet.
(Stärkeangaben in"Verdünnungs- einheiten" dienen als Basis für die Angabe der Wirksamkeit ; eine Stärke von"18 000 Verdünnungseinheiten pro mg" bedeutet, dass 1 mg des Produktes, wenn es in 1 ml Lösungsmittel aufgelöst und auf das 18 000 fache verdünnt worden ist, noch das Wachstum von Staphylococcus aureus (ATCC 6538P) in einem Tryptose-Phosphat-Brühe-Medium bei Verwendung des oben beschriebenen Inoculums zu hindern vermag.)
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Tabelle IV
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<tb>
<tb> Antibiotisches <SEP> Spektrum <SEP> von <SEP> No. <SEP> 467 <SEP>
<tb> Untersuchte <SEP> Mikroorganismen
<tb> Minimale <SEP> InhibitionsStamm- <SEP> konzentration <SEP>
<tb> Systematischer <SEP> Name <SEP> bezeichnung <SEP> (yglml)
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var. <SEP> mycoides <SEP> ATCC-7064 <SEP> 0,57
<tb> Bacillus <SEP> cereus <SEP> var.
<SEP> mycoides <SEP> DA-30 <SEP> > 0, <SEP> 78
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> DA-31 <SEP> 0,57
<tb> Bacillus <SEP> sphaericus <SEP> DA-32 <SEP> 0,57
<tb> Bacillus <SEP> sphaericus <SEP> DA-33* <SEP> 0,28
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC-6538 <SEP> 0,03
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC-6538P <SEP> 0,03
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC-12715 <SEP> 0, <SEP> 14 <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC-1163 <SEP> 0,14
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> ATCC-9996 <SEP> 0,52
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> var. <SEP> Gray-0, <SEP> 14
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> var.
<SEP> Smith <SEP> DA-141 <SEP> 0,20
<tb> Staphylococcus <SEP> epidermidis <SEP> DA-41 <SEP> 0,03
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> ATCC-9341 <SEP> 0,07
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> C <SEP> DA-21 <SEP> 0, <SEP> 14
<tb>
EMI8.2
DA bezieht sich auf die Nummern der Sammlung der Schering
Corporation, Bloomfield, New Jersey, USA.
Die In-vivo-Aktivität von No. 467 gegen gewisse bakterielle Infektionen von Mäusen wurde ebenfalls untersucht. Die Mäuse wurden mit einem Inoculum der betreffenden Bakterien durch intraperitoneale In- jektion infiziert. Sie wurden dann durch subkutane Injektionen des Antibioticums (Stärke 18 000 Veri dünnungseinheiten/mg), suspendiert in 0, 2S iger wasseriger Carboxymethylcellulose, behandelt ; die
Injektionen wurden in zwei getrennten Dosierungen verabreicht. Auf diese Weise wurde die PD. ge- gen Staphylococcus aureus zu 20 mg/kg bestimmt. Bei subkutaner oder oraler Verabreichung von
50 mg/kg des Antibioticums tritt ebenfalls eine signifikante Verzögerung des Todes von streptokok- keninfizierten Mäusen ein.
Gegen Diplococcus pneumoniae wird voller Schutz durch subkutane Gaben von weniger als 20 mg/kg erreicht.
Die akute Toxicität (LD) für No. 467 (Stärke = 18 000 Verdünnungseinheiten/mg), bestimmt nach dem Standardverfahren unter Verwendung von Mäusen mit einem Gewicht zwischen 18 und 20 g in der
Anwendungsform einer Suspension in 0, 25% niger wässeriger Carboxymethylcellulose, ist folgende : Sub- kutan 2500 mg/kg und intraperitoneal 1500 mg/kg.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass man den Stamm des Mikroorganismus Micromonospora halophytica var. nigra, hinterlegt unter der Re- gistriernummer NRRL 3097, oder eine von dessen Mutanten oder Varianten mit im wesentlichengleicher biologischer Aktivität, unter üblichen Bedingungen, vorzugsweise aerob in einem wässerigen Nähr- medium, das assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, bebrütet und das gebildete Antibioti- kum aus der Kultur isoliert.
EMI8.3