DE1667923C3 - Neue Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie pharmazeutische Zubereitung, die diese Antibiotika enthält - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist das Antibiotikum B-2847 Y der Konstitutionsformel I

AcO

MeO

Me

OH

worin Me die Methylgruppe bedeutet,

der Summenformel C43H54N2O14, dem. Infrarot-Spektrum mit folgenden signifikanten Absorptionen bei den Wellenzahlen:

3490(M), 3350(W), 3000(M), 2940(M), 2880(M), 172S(S), 1708(S), 1680(S), 1630(VS), 1605(VS), 1510(VS), 1440(M), 1410(S), 1365 (S), 1330(S), 1300 (M), 1287 (M), 1225 (S), 1235 (S), 1175(VS), 1160(S), 1140(Sh), 1093(VS), 1072 (VS), 1020 (W), 1002 (M), 985 (M), 970 (M), 945 (M), 920 (M), 908 (M), 887 (M), 823 (M) cm"¹ (in CHCI₃),

und der spezifischen Drehung:
[α]% = + 325 ± 30 (C = 1,0 EtOH)

+ 376 ± 40 (C = 0,5 Me₂CO), das als Chinon vorliegt.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin das Antibiotikum B-2847 R der Formel II, das die Hydrochinonform von B-2847 Y ist.

33 32

Me Me

AcO

MeO

OH

Me" OH

worin Me die Methylgruppe bedeutet.

Der Unterschied im Zuckerrest am C-AtOm₄ zwischen B-2847 Y und B-2847 R beruht auf einer Tautomerie, die im folgenden Formelschema erläutert ist.

Me

HNHH

O-

-Ο —Η

HO

-CH

H₃C H H H

(1) (Pyranose)

(II) (Aldose)

Oxidation

Reduktion

OH

Me

NH

~O — H HO

Me OH (ΠΙ) (Pyranose) (IV) (Aldose) (V)

in dem lediglich in den Formeln I und II der hier allein interessierenden Chinon- bzw. Hydrochinonring mit

den Kohlenstoffatomen Ci bis C4 und der über das Stickstoffatom mit dem C-Atoiru verknüpfte Zuckerrest gezeichnet sind. Die Pyranoseform von B-2847 Y (I A) steht im Gleichgewicht mit der Aldoseform (I B). Entsprechendes gilt für die Hydrochinonform von B-2847 Y, also das B-2847 R. Aus der Aldoseform von II (Formel II B), das sich aus der Pyranoseform II A im Gleichgewicht gebildet hat, entsteht vorwiegend die Struktur eines 5-Ring-Zuckers, d.h. die Verbindung II, wegen der stärkeren Nukleophilität des Stickstoffatoms gegenüber der des Sauerstoffs. Bei Oxidation von II verschiebt sich jedoch das Gleichgewicht über Il B nach Il A und führt wieder zu B-2847 Y mit den beiden Strukturen I A und I B.

Die Konstitution der Antibiotika B-2847 Y und R war am Anmeldetag noch nicht aufgeklärt. Diese würde vielmehr erstmalig in Tetrahedron erstens 1969 Nr. 2 S. 97 —100 veröffentlicht und steht in Einklang mit den vorstehend angegebenen Parametern.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotika B-2847 Y und/oder B-2847 R der Formeln I und II, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces tolypophorus nov.sp. ATCC-21177 bei Temperaturen von etwa 20 bis 45^CC unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das assimilierbaren Kohlenstoff, verwertbaren Stickstoff und andere für das Wachstum des Mikroorganismus erforderliche Nährstoffe enthält und das in der Kulturbrühe und/oder dem Kulturrückstand angereicherte Antibiotikum B-2847 Y und/oder B-2847 R mit einem organischen Lösungsmittel im pH-Bereich von 2 bis 8 extrahiert und auf chromatographischem Weg isoliert, wobei zur Isolierung von B-2847 R die Gegenwart von L-Ascorbinsäure in einer Menge von nicht weniger als 1 Mol pro Mol B-2847 R erforderlich ist.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus Streptomyces tolypophorus nov.sp., der nach Maßgabe der Rechtsvorschriften über den Umgang mit Mikroorganismen an Dritte zu den üblichen Bedingungen abgegeben wird, der aus einer Bodenprobe in Tokio, Japan, isoliert worden ist, hat die nachstehend genannten morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften. Hierbei basieren die mit »Rdg« gekennzeichneten Farbbezeichnungen auf »Ridgeway's Color Standard and Nomenclature«:

1) Morphologische Eigenschaften:

Sporophoren: gerade oder wellig, keine Spiralen und keine Windungen. Luftmycel, Bildung von Sklerotium, 4 bis 20 μ, wächst beispielsweise auf Glucose-Hefeextrakt, Ma'.zextraktagar oder GIycering-Asparagin-Agar. Sporen ellipsoid, 0,8 bis 1,1 μ mal 13 bis 23 μ mit glatter Oberfläche.

2) Merkmale der Kulturen: ^5:>

a) Czapek-Agar:

Wachstum: reichlich, faltig und erhaben, zeigt gerissene Oberfläche an der Kante des Wachstums, Ljgt Orange Yellow (Rdg. III, 17-d) bis Deep to Chrome (Rdg. III, 17-b).
Luftmycel: gut, weiß.

Rückseite: Buff Yellow (Rdg. IV, 19-d bis Light Orange Yellow (Rdg. III, 17-d).
Lösliches Pigment: Pale Orange Yellow (Rdg. III, 17-0 b's Ochraceous-Buff (Rdg. XV, 15-b).

b) Glucose-Czapek-Agar:

Wachstum: tiefere Falten als auf Czapek-Agar, Bildung von Luftmycel, lösliches Pigment, Farbe der Rückseite die gleiche wie auf Czapek-Agar.

c) Glycerin-Czapek-Agar:

Wachstum: reichlich, aber weniger faltig als auf Medium a) oder b), fast die gleichen übrigen Eigenschaften wie auf Medium a) oder b).

d) Glucose-Asparagin-Agar:

Wachstum: gut, Pale Orange Yellow, dringt in Agar ein.

Luftmycel: spärlich bis mäßig, dünn, weiß.

Rückseite: Pale Orange Yellow.

Lösliches Pigment nicht vorhanden.

e) Nährbrühe:

Auf der Oberfläche schwimmende kleine Kolonien.

Luftmycel: weiß bis Pallid Mouse Gray (Rdg. LI, 15"'"-f).

Lösliches Pigment: nicht vorhanden.

f) Nähragar:

Wachstum: schlecht bis mäßig, farblos.

Luftmycel: schlecht, dünn, weiß bis Pallid Mouse Gray.

Lösliches Pigment: nicht vorhanden.

Rückseite: farblos bis Pale Orange Yellow,
g) Glucose-Nährbrühe:

Wachstum: reichlich, entwickelt sich zuerst auf der Oberfläche, bildet später Floccus.

Luftmycel: schlecht, dünn, weiß bis Capucine Buff (Rdg. Ill, 13-f).

Lösliches Pigment: blaßgelb (Pale Yellow),
h) Glucose-Nähragar:

Wachstum: reichlich, faltig und erhaben, farblos bis Marx Yellow (Rdg. III, 15-i).

Luftmycel: mäßig und dünn, weiß.

Rückseite: Marx Yellow.

Lösliches Pigment: gelblich-braun,
i) Glycerin-Nähragar:

Wachstum: reichlich und faltig, Sudan Brown (Rdg. III, 15-k).

Luftmycel: schlecht, an den Rändern des Wachstums weiß.

Lösliches Pigment: gelblich-braun,
j) Stärkeagar:

Wachstum: farblos, mäßig.

Luftmycel: dünn, weiß.

Lösliches Pigment: nicht vorhanden.

Rückseite: farblos,
k) Ganzes Ei:

Wachstum: mäßig, faltig, Deep Chrome (Rdg. III, 17-b).

Luftmycel: lösliches Pigment nicht vorhanden.
1) Hefeextrakt-Agar:

Wachstum: reichlich, faltig.

Luftmycel: dünn, an den Rändern des Wachstums weiß.

Rückseite: Mars Yellow.

Lösliches Pigment: Marx Yellow bis orangegelb,
m) Kartoffel-Stichkultur:

Wachstum: schlecht, blaßgelblichbraun bis blaßbraun.

Luftmycel: dünn und weiß.

Lösliches Pigment: nicht vorhanden,
n) Möhrenstichkultur:

Wachstum: schlecht bis mäßig, keine Änderung der Möhrenfarbe.

Luftmycel: weiß,
o) Lackmusmilch (37° C):

Langsame Peptonisierung ohne Koagulierung.

Lösliches Pigment: rötlichbraun.

ρ) Gelatine (25°C):

Schnelle Verflüssigung, Bildung von weißem Luftmycel.

Lösliches Pigment: gelblichbraun, q) Löffler-Serum (37° C):

Wachstum: dünn, schlecht, orangegelb, schwache Verflüssigung.

Luftmycel: nicht vorhanden,
r) Cellulose:

Wachstum: farblos, wird allmählich orangegelb.

Luftmycel: weiß, watteartig.

Cellulose: nicht zersetzt,
s) Calciummaleat-Agar:

Wachstum: mäßig, Pale Orange Yellow, dringt in Agar ein.

Luftmycel: dünn und weiß.

Rückseite: Pale Orange Yellow bis Ochraceous-Buff(Rdg. XV, 15'-b).

Lösliches Pigment: nicht vorhanden oder chamois (Rdg. XXX, 19"-b).

t) Tyrosin-Agar:

Wachstum: spärlich, farblos bis gelb.

Luftmycel: schlecht, weiß.

Rückseite: farblos.

Lösliches Pigment: nicht vorhanden.

u) Pepton-Agar:

Wachstum: spärlich bis mäßig.

Luftmycel: wenig, dünn, weiß.

Rückseite: farblos.

Lösliches Pigment: nicht vorhanden. jo

3) Physiologische Eigenschaften .

a) Optimaler pH-Wert: etwas Wachstum zwischen pH 4,0 und 10,0, optimales Wachstum zwischen pH 6,0 und 8,0.

b) Optimale Temperatur: Wachstum wurde im Temperaturbereich zwischen etwa 20 und 43° C beobachtet; optimale Temperatur 28° C, aerob.

c) Keine Hydrolyse von Stärke.

d) Nitratreduktion: positiv. to

e) Farbbildung: keine.

Wenn dieser Mikroorganismus auf einigen synthetischen Medien kultiviert wird, zeigt er ein ledergelbes bis hellorangegelbes Wachstum und erzeugt lösliche Pigmente von blaßorangegelb bis gelblichbraun. Sein Luftmycel ist weiß.

Auf gewissen proteinhaltigen Medien erzeugt der Mikroorganismus lösliche Pigmente von gelblichbrauner Farbe, jedoch gehört er nicht zum chromo- genen Typ.

Der Mikroorganismus zeigt keine Hydrolyse von Stärke und kernt Verflüssigung von Gelatine und reduziert Nitrat zu Nitrit

Die Verwertung von Kohlenstoffquellen, ermittelt nach der Methode von Pridham und Gottlieb, ist nachstehend in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Erythrit

Adonit

D-Sorbit

i-Inosit

D-Mannit

Dulcit

D-Xylose

L-Arabinose

+ bis + + + bis + + + + bis + + +

60

65

L-Sorbose +

Trehalose + + +

Salicin + bis + +

Esculin — bis ±

Inulin + +

Natriumacetat + bis + +

Natriumeitrat + bis + +

D-Galactose + + +

D-Glucose + bis + +

D-Fructose + +

Rhamnose + + +

Melibiose + +

Maltose + +

Saccharose + + +

Lactose + bis H- +

Raffinose + bis + +

Natriumsuccinat + bis + +

D-Mannose + +

Stärke + bis + +

Glycerin + +

Kontrolle —

Zeichenerklärung:
+ + + = starkes Wachstum;
+ + = gutes Wachstum;

+ = mäßiges Wachstum;

± =» schwaches Wachstum.

Ein Vergleich der vorstehend beschriebenen morphologischen Eigenschaften mit den Beschreibungen in »The Actinomycetes«, 2, 152 ff. (S.A. Waksman 1961) und »Applied Microbiology« 6, 52 (T. G. Pridham 1958) zeigt, daß Streptomyces tolypophorus ähnliche morphologische Eigenschaften hat wie Spezies, wie Streptomyces globisporus, Streptomyces autotrophicus, Streptomyces orientalis, Streptomyces kimberi und Streptomyces aburaviensis, die sich sämtlich durch gerade oder wellige Sporophoren und weißes Luftmycel auszeichnen.

Streptomyces tolypophorus unterscheidet sich jedoch von Streptomyces globisporus insofern, als der erstere orangegelbes Wachstum auf synthetischem Agar zeigt, weißes Luftmycel bei der Kartoffel-Stichkultur bildet und auf Cellulose wächst, während der letztere auf synthetischem Agar farbloses Wachstum zeigt, bei der Kartoffel-Stichkultur grünlichgelbes Luftmycel bildet und auf Cellulose nicht wächst

Streptomyces tolypophorus unterscheidet sich von Streptomyces autotraphicus darin, daß der erstere auf Stärkeagar mäßig wächst, Gelatine schnell verflüssigt und Nitrat zu Nitrit reduziert während der letztere auf Stärkeagar schlechtes Wachstum zeigt Gelatine nicht verflüssigt und Nitrat nicht reduziert

Streptomyces tolylpophorus scheint große Ähnlichkeit mit Streptomyces orientalis insofern zu haben, als er auf Cellulose wächst obwohl der letztere auf Czapek-Agar geringeres Wachstum zeigt und in Gelatine keine löslichen Pigmente bildet

Streptomyces tolypophorus bildet elliptische Sporen, bildet in Gelatine gelbichbraune lösliche Pigmente und koaguliert Milch nicht während Streptomyces kimberi kleine kugelige Sporen bildet in Gelatine keine löslichen Pigmente bildet und Milch koaguliert

Streptomyces tolypophorus unterscheidet sich ferner von Streptomyces aburaviensis in der Bildung von löslichen Pigmenten in Glucose-Asparagin-Agar oder in Calciummaleat-Agar und in der Ausnutzung der Kohlenstoff quellen.

Nach dem Bericht von L Ettlinger und Mitarbeitern

(Archiv für Mikrobiologie 31 (1958), S. 326) scheint Streptomyces tolypophorus zu der Reihe »(B) Sporen glatt — 11. Luftmycel niveus« zu gehören. Von den Mikroorganismen, die zu dieser Reihe gehören, unterscheidet sich jedoch Streptomyces tolypophorus eindeutig von Streptomyces rubrireticuli und Streptomyces niveoruber insofern, als die letztere Gruppe gewundene oder spiralförmige Sporophoren bildet. Strepiomyces tolypophorus unterscheidet sich von Streptomyces fulvissimus darin, daß der letztere ein gold- bis orangefarbenes lösliches Pigment auf Czapek-Agar oder auf Glucose-Asparagin-Agar bildet und ein tiefes rotbraunes Wachstum auf Nähragar hat. Streptomyces tolypophorus unterscheidet sich von Streptomyces phaeochromogenes darin, daß der letztere zum chromogenen Typ gehört.

Hinsichtlich der Bildung von skierotischem Granulat werden Mikroorganismen, wie Chainia (M. J. Thirumalachar: Nature Bd. 176 (1955), S. 934, Streptomyces griseus (M. L. Gattani: Natur Bd. 180 (1957), S. 1293) usw. genannt, die beide »skierotisches Granulat« aus einem Substratmycel bilden, während im Falle von Streptomyces tolypophorus das skierotische Granulat sich nicht aus einem Substratmycel, sondern aus einem Luftmycel entwickelt. In dieser Hinsicht hat Streptomyces tolypophorus große Ähnlichkeit mit Streptomyces aerocolonigenes, der von R. Shinobu und Mitarbeitern beschrieben wird (The Botanical Magazine Bd. 73 (1960), S. 212), unterscheidet sich jedoch vom letzteren insofern, als der letztere nur ein geringes Luftmycel und auf Glycerin-Czapek-Agar ein braunes lösliches Pigment bildet, ein hellbraunes lösliches Pigment hat, auf Stärkeagar ein aprikosengelbes Wachstum zeigt in Tyrosinase und Diastase positiv reagiert, hinsichtlich der Ausnutzung von Raffinose negativ und hinsichtlich der Rhamnoseausnutzung zweifelhaft ist.

Streptomyces tolypophorus ist nach den vorstehenden Ausführungen als neue Spezies einzustufen und wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC-21177 hinterlegt.

Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Glucose, Inosit, Xylose, Galactose, Fructose und Saccharose. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Pepton, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Fleischextrakt, ReiskJeie, Weizenkleine, Harnstoff, Ammoniumsalze und organische oder anorganische Stickstoffverbindungen. Ferner kann eine geringe Menge organischer Salze, z. B. Natriumchlorid, Phosphate, Salze von Metallen, wie Calcium, Zink, Mangan und Eisen, dem Medium zugesetzt werden. Falls erforderlich, können übliche Nähreiemente oder ein Antischaummittel, z. B. tierisches Öl, pflanzliches öl oder Mineralöl, ebenfalls zugesetzt werden.

Die Kultivierung kann mit einem flüssigen oder festen Kulturmedium erfolgen, jedoch wird die Submerskultur vorgezogen. Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur, Fermentationsdauer und pH-Wert des Mediums, sind so zu wählen, daß die Bildung von B-2847 maximal ist Die Bildung von B-2847 erreicht ihr Maximum in der Schüttelkultur in etwa 2—7 Tagen. Das Kulturmedium wird vorzugsweise in neutralem pH-Bereich, d.h. bei etwa pH-Wert 5 bis 9 gehalten. Die Kultivierungstemperatur liegt zweckmäßig zwischen etwa 25 und 35° C

Das auf diese Weise in der Kulturbrühe angereicherte Antibiotikum B-2847 wird daraus durch Extraktion entfernt und chromatographisch isoliert. Das Antibiotikum B-2847, das fettlöslich und hauptsächlich in der Kulturflüssigkeit angereichert ist, wird vorzugsweise aus dem Filtrat gewonnen und dann gereinigt.

Eine gewisse antimikrobische Aktivität ist im Mycel festzustellen, so daß der Extrakt des Mycels mit einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton und Äthanol, vorzugsweise ebenfalls einer weiteren Reinigung zur Gewinnung des Antibiotikums wie beim Kulturfiltrat

to unterworfen wird.

Als organische Lösungsmittel, die zur Extraktion des Kulturfiltrats verwendet werden, eignen sich beispielsweise Acetate, wie Äthylacetat und Butylacetat, Äther, wie Diäthyläther, Ketone, z. B. Methylisobutylketon, Alkohole, z.B. n-Butanol und η-Amylalkohol, aromatische Verbindungen, z. B. Benzol und Toluol, und halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform und Dichlormethan.
Das Lösungsmittel, das die gewünschte Substanz enthält, wird mit einer wäßrigen Lösung oder einer auf einen pH-Wert von etwa 8 eingestellten Pufferlösung gemischt, um die Verunreinigungen in die wäßrige Phase zu überführen, dann mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt, und die gewünschte Verbindung wird mit einem geeigneten Adsorptionsmittel direkt aus dem Konzentrat gewonnen, wobei die gewünschten Substanzen zuerst am Adsorptionsmittel adsorbiert und dann mit geeigneten Lösungsmitteln eluiert werden. Als Adsorp-

jo tionsmittel können Silicagel, mit Oxalsäure imprägniertes Silicagel, Aktivkohle usw. verwendet werden. Die rohe Substanz kann auch einer weiteren Reinigung durch fraktionierende Fällung mit einem geeigneten Lösungsmittel unterworfen werden. Beispielsweise wird die rohe Substanz mit Diäthyiäther gemischt, um die gewünschte Fraktion in das organische Lösungsmittel zu überführen, oder mit einem Gemisch von Äthylacetat und η-Hexan gemischt, wobei B-2847 ausgefällt wird, aus dem die reine Substanz leicht erhalten wird.

4n Die verwendeten Lösungsmittel sind verschieden je nach der Art der Adsorptionsmittel. Beispielsweise wird das adsorbierte B-2847 bei der Chromatographie an Silicagel zuerst mit niedrigpolaren Lösungsmitteln, wie Benzol, Diäthyläther, Äthylacetat usw. behandelt, um Verunreinigungen zu entfernen, und dann mit hochpolaren Lösungsmitteln, wie Äthylacetat, Aceton, Äthanol, n-Butanol, Wasser, Essigsäure, einer Pufferlösung usw., allein oder in Kombination eluiert.

Bei Verwendung von Aktivkohle als Adsorptionsmittel werden Äthylacetat Äthylacetat in Mischungen mit einer geringen Chloroformmenge und Aceton als Lösungsmittel für die Elution nach Behandlung mit η-Hexan, Benzo, Diäthyiäther usw. vci wendei.

Die Antibiotika B-2847 Y und R werden in Kulturmedium nebeneinander gebildet Isolierbar ist jedoch mit üblichen Isoliermethoden nur ein Antibiotikum, und zwar kann unter aeroben Bedingungen nur B-2847 Y isoliert werden, während in Gegenwart von L-Ascorbinsäure, also einem Reduktionsmittel, B-2847 R gebildet wird.

1) Löslichkeit

B-2847 Y ist in Methanol, Äthanol n-Butanol, Aceton. Chloroform, Äthylacetat und Benzol leicht löslich und in Wasser, Petroläther und η-Hexan unlöslich oder schwer löslich.

B-2847 isi in Methanol, Äthanol, Aceton. Chloroform.

Äthylacetat leicht loslich, in Benzol und Diäthylather löslich, in M/15-Phosphatpufi'cr bei pH-Wert 2 bis 10 und in Wasser schwerlöslich und in η-Hexan und Petroläthei unlöslich.

2) Farbreaktion

B-2847 Y reagiert positiv gegenüber Tollens-Reagenz und Magnesiumacetatreagenz, negativ gegenüber Barton-Reagenz (FeCl₃ plus K₃Fa(CN)₆), in der Molisch-Reaktion und gegenüber Ehrlich-Reagenz.

B-2847 R ist positiv gegenüber Tollens-Reagenz, Eisen(III)-chlorid, Barton-Reagens, negativ in der Ninhydrin-Reaktion, Mollisch-Reaktion, Sakaguchi-Reaktion und gegenüber Ehrlich-Reagens.

3) Rf-Werte

Durch Papierverteilungschromatographie nach der aufsteigenden Methode ai.f Whatman-Filterpapier Nr. 1 wurden die folgenden Rf-Werte erhalten und als Farbflecken und als Inhibierungszone auf dem Bioautogramm unter Verwendung von Staphylococcus aureus als Testorganismus beobachtet:

Durch Dünnschichtchromatographie wurden die folgenden Rf-Werte ermittelt:

Lösungsmittel	Rf-Wert	0,7
Äthylacetat, Aceton (1:1) mit	B-2847 YB-2847 R	0,2
1 % Oxalsäure	0,05
Äthylacetat mit 1% Oxalsäure
Aceton mit 1 % Oxalsäure	0,00
0,2

Lösungsmittel

Rf-Wert
B-2847 Y

B-2847 R

n-Hexan, Benzol, Äthanol, 0,78

Wasser (1:3:1:3)

η-Hexan, Benzol, Aceton, 0,60 0,65

Wasser (30: 10:18: 22)

η-Hexan, Diäthylather, Aceton, 0,27

Wasser (15:5:8:12)

10

4) Elementaranalyse (%):

B-2847 Y: Prismen aus Äthylacetat-n-Hexan
umkristallisiert:

C60,71 ±1,0. H6,59±0,5, N3,10±0,5;
B-2847 R: Prismen aus Benzol umkristallisiert:

C 64,66 ±1,0, H 6,67 ±0,5, N 3,03 + 0,5.

5) Molekulargewicht (gemessen nach der V.P.O.-Methode unter Verwendung von Äthylacetat ais Lösungsmittel):

B-2847 Y und B-2847 R: etwa 600 bis 1000.

6) Spezifische Drehung:

B-2847 Y: |λ]£ = +325±30 (C= 1,0 EtOH)

+ 376 ±40 (C= 0,5 Me₂CO)
B-2847 R: [λ]'/ = +225±20 (C= 1,0 EtOH)

7) Absorptionsspektrum

Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum und das Absorptionsspektrum im sichtbaren Bereich in Äthanollösung sind in F i g. 1 und F i g. 2 dargestellt. Das Spektrum enthält die folgenden wesentlichen Absorptionsmaxima:

25

30

B-2847 Y	B-2847 R
EtOH
Λ max	λ max

232±2πιμ 332±30 232±2ιημ

290±2πιμ 269±30 310±2ηιμ

337±2πιμ 154± 15 420 bis 460 πιμ 370 bis 430 πιμ (Schulter)

426 ±40
184±20
ca. 80

Phosphatpuffer (pH 7,2) B-2847 Y

λ wax E

50

234±2ΐημ
3Ι8±2ιημ
384±2πιμ
465±2ιημ

356 ±35

298 ±30

65± 6

56± 5

55

Das Infrarotspektrum von B-2847 Y und B-2847 R, gemessen in Chloroformlösung, ist in F i g. 3 und 4 dargestellt. Das Spektrum enthält die folgenden wesentlichen Banden in cm-' (CHCI3):

B-2847 Y:

3490 (mittel), 3350 (schwach), 3000 (mittel), 2940 (mittel), 2880 (mittel), 1725 (stark), 1708 (stark), 1680 (stark), 1630 (sehr stark), 1605 (sehr stark), 1510 (sehr stark), 1440 (mittel), 1410 (stark), 1365 (stark). 1330 (stark), 1300 (mittel), 1287 (mittel), 1255 (stark), 1235 (stark), 1175 (sehr stark), 1160 (stark), 1140 (Schulter), 1093 (sehr stark), 1072 (sehr stark), 1020

b0 (schwach), 1002 (mittel), 985 (mittel), 970 (mittel), 945 (mittel), 920 (mittel), 908 (mittel), 887 (mittel), 823 (mittel).

B-2847 R:

3500 (mittel), 3400 (schwach), 3040 (mittel), 2950 (mittel), 2910 (Schulter), 1715 (stark), 1685 (Schulter), 1665 (sehr stark), 1645 (stark), 1626 (stark), 1610 (Schulter), 1565 (sehr stark), 1525 (sehr stark), 1445 (sehr stark), 1385 (sehr stark), 1345 (mittel), 1315 (stark), 1250 (sehr stark), 1155 (stark), 1093 (stark), 1067 (sehr stark), 1002 (mittel), 973 (stark), 951 (mittel), 915 (mittel), 890 (mittel).

Das Antibiotikum B-2847 hat die folgenden biologischen Eigenschaften:

1) Antibiotisches Spektrum

Die antibiotische Wirkung von B-2847 gegen verschiedene Mikroorganismen ist in Tabelle 2 angegeben

Der Test wird mit gewöhnlichen Bakterien 20 Stunden bei 37° C auf Bouillonagar, mit säurefesten Bakterien 48 Stunden bei 37° C auf Glycerin-Bouillon-Agar und mit

Tabelle 2

Hefen und Pilzen 48 Stunden bei 28° C auf Glucose-Bouillon-Agar (pH 7,0) durchgeführt.

Mikroorganismen

Hemmende Mindestkonzentration,
Mikrogramm/ml

B-2847 Y B-2847 R

Escherichia coli	50	50
Proteus vulgaris	10	10
Pseudomonas aeruginosa		20
Staphylococcus aureus Terajima	0,0005
Staphylococcus aureus Hetley	0,005
Staphylococcus aureus ATCC 4012	0,005
Staphylococcus aureus 209 P	0,001	0,001 bis 0,0005
Staphylococcus aureus 209 P	0,0001
(resistent gegen Streptomycin)
Staphylococcus aureus 209 P	0,001
(resistent gegen Chlortetracyclin)
Staphylococcus aureus 209 P	0,0001
(resistent gegen Chloramphenicol)
Staphylococcus aureus 209 P	0,001
(resistent gegen Oleandomycin-Erythromycin)
Bacillus cereus		0,5 bis 0,2
Bacillus subtilis PCI 219	0,1	0,2 bis 0,1
Bacillus subtilis ATCC 6633	0,1	0,2 bis 0,1
Bacillus brevis	0,005
Sarcina variabilis	0,001
Mycobacterium avium	>50	>50
Mycobacterium avium	>50	>50
(resistent gegen Streptomycin)
Mycobacterium smegmatis	10-20	10-20
Mycobacterium phlei	50	50
Mycobacterium sp. ATCC 607	>50	>50
Candida albicans	>50	>50
Penicillium chrysogenum	>50	>50
Syccharomyces cerevisiae	>50	>50
Piricularia oryzae	>50	>50
Aspergillus niger	>50	>50

Wie die Werte zeigen, hat das Antibiotikum B-2847 eine starke Wirkung gegen grampositive Bakterien.

Die Lethaldosis bei der Maus nach 4 Tagen wurde bestimmt, indem B-2847 Y als Lösung in Carboxy methylcellulose und B-2847 R als wäßrige Polyoxy- äthylenlösung in hydriziertem Rizinusöl injiziert wurden.

LD₅₀
B .'847 Y

B-2847 R

Intraperitoneal, mg/kg 330 396 Subkutan, mg/kg 2200 500

Intravenös, mg/kg 330

Staphylokokken sind pyogene oder eitererzeugende Bakterien. Sie pflegen begrenzte Läsionen beispielsweise in Form von Abszessen u. dgl. zu bilden, die häufig in der Haut auftreten. Staphylokokken sind die Ursache von Furunkeln und Karbunkeln und anderen häufigen Wundinfektionen. Die neuen Produkte gemäß der Erfindung sind wertvoll für örtlich anzuwendende Zubereitungen für die Behandlung dieser Infektionsart bei Warmblütern. Eine brauchbare Zubereitung für die örtliche Anwendung zur Behandlung einer auf Staphylococcus aureus zurückzuführenden Infektionen wird beispielsweise wie folgt hergestellt: In 1 g Wollfett werden 8 mg des Antibiotikums B-2847 Y oder B-2847 R gleichmäßig verteilt. Das Gemisch wird dann gleichmäßig mit weißem Petrolatum in einer solchen Menge gemischt, daß 10 g Salbe erhalten werden.

Aufgrund der vorstehend beschriebenen bakteriziden und bakteriostatischen Eigenschaften eignen sich die neuen Verbindungen gemäß der Erfindung (als Lösung, die etwa 20 bis 200 Mikrogramm Antibiotikum B-2847 Y oder B-2847 R pro ml enthält) beispielsweise für die Desinfektion von Geräten und Apparaturen in Krankenhäusern, die gewöhnlich pathogenen grampositiven Bakterien des Typs, der gebenüber diesen Verbindungen empfindlich ist, ausgesetzt sind.

Die erfindungsgemäßen Antibiotika sind, wie der nachfolgende Versuchsbericht zeigt, bekannten Anti-

biotika hinsichtlich antibakterieller Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo überlegen.

Versuchsbericht
1. Antibakterielle Aktivität (in vitro)

Vergleichsdaten zwischen den erfindungsgemäßen Antibiotika B-2847Y und B-2847 R und Vertretern bekannter Antibiotika hinsichtlich hemmender Mindestkonzentration (MHK, Mikrogramm/ml) sind in der folgenden Tabelle 3 dargestellt. Der Versuch wurde bei 37° C auf Bouillon Agar während 20 Stunden ausgeführt.

Tabelle 3

Antibiotikum	Testmikroorganismus	Pseudomonas
	Staphylococcus	atruginosa
	aureus 209P	50
B-2847 Y	0,001	20
B-2847 R	0,001—0,0005	>100
Cephaloridin	0,1	>100
Cephalothin	0,2	>100
Oxacillin	0,4	>100
Dichloroxacillin	0,1	>100
Chloramphenicol	2,0	>50
Erythromycin	0,4

25

2. Antibakterielle Aktivität (in vivo)

Mäuse werden intraperitoneal mit Staphylococcus aureus 308A in einer Menge infiziert, die ohne nachfolgende Vergabe einer Heildroge zum Tode führen würde. Den so infizierten Mäusen wurden subkutan die entsprechenden Antibiotika verabfolgt und die entsprechende effektive Dosis (ED50) wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4

Antibiotika

ED₅₀
(mg/kg)

LD₅₀
(mg/kg)

LD₅Q
ED₅₀

B-2847 Y	0,07	2200	31428
B-2847 R	0,06	500	8 333
Cephaloridin	0,2	6000	30 000
Cephalothin	8,8	6000	681

Tabelle 5

Stabilität gegen j3-Lactamase

Antibiotika Hemmende Mindestkonzentration, μg/ml

Vor eier Inkubation Nach Inkubation
mit j3-Lactamase mit |3-Lactamase*)

B-2847 Y	0,001	0,001
B-2874 R	0,001-0,0005	0,001-0,0005
Cephaloridin	0,1	>100
Cephalothin	0,2	>100

*) 1 ml einer Lösung, die 20μ%/π\\ an Teslantibiotikum enthält, wurde mit 0,1 ml einer Lösung von roher j9-Lactamase (Protein; 4 mg/ml) gemischt, welche aus Proteus vulgaris stammt, worauf das Gemisch eine Stunde lang bei 30° bebrütet wird.

Aus Tabelle 5 geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Antibiotika stabil gegen j9-Lactamase sine¹ während Cephaloridin und Cephalothin durch /?-Lactamase inaktiviert werden. Dies bedeutet, daß die erfindungsgemäßen Antibiotika wirksamer gegen resistente Mikroorganismen eines Herdes sind als Cephaloridin und Cephalothin.

. Beispiel 1

200-ml-Kolben, die je 20 ml eines sterilisierten Kulturmediums aus 3% Glucose, 0,2% Pepton, 1% Glycerin, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,05% CaCl₂, 0,1% MgSO₄ - 7 H₂O, 0,01% FeSO₄, 0,01% MnSO₄ und 03% CaCÜ3 enthielten, wurden mit einer Kultur von Streptomyces tolypophorus ATCC-21177 beimpft, die etwa 6—8 Tage bei 28° C auf Bennett-Agar gezüchtet worden war. Die Kultur in jedem Kolben wurde bei 28°C und bei 220 UpM 72 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung geschüttelt Die Kulturbrühe wurde vereinigt und zentrifugiert, wobei 121 obenstehende Flüssigkeit erhalten wurden, die mit einem Drittel ihres Volumens an η-Hexan gewaschen wurde. Die wäßrige Phase wurde mit verdünnter H₂SO₄ auf pH 3,0 eingestellt und zweimal mit ·Λ und ¹A ihres Volumens an Äthylacetat extrahiert Die Äthylacetatschichten wurden vereinigt und zweimal mit >/3 ihres Volumens an Sörensen-M/15-Phosphatpufferlösung (pH 8,0) gewaschen.

Die erhaltene Äthylacetatlösung wurde zweimal mit '/β ihres Volumens an Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem D: uck eingeengt. Das Konzentrat wurde der Dünnschichtchromatographie an einer Silicagelplatte unterworfen, die mit 2%iger Oxalsäure imprägniert war. Als Lösungsmittel diente Aceton, das 1% Oxalsäure enthielt.

Die Fraktionen, die auf dem Chromalogramm einen Rf-Wert von etwa 0,2 hatten, wurden aufgefangen und mit Äthylacetat und Wasser gemischt. Das Gemisch wurde geschüttelt, worauf die Äthylacetatphase abgetrennt, mehrmals mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem Druck eingeengt und mit η-Hexan oder Petroläther gemischt wurde, wobei 45 mg rohe Kristalle von B-2847 Y erhalten wurden, die aus einem Gemisch von η-Hexan und Äthylacetat (3:1) umkristallisiert wurden, wobei 25 mg B-2847 Y vom Schmelzpunkt 120—125° C (Zers.) erhalten wurden. Das Produkt zeigte antimikrobische Aktivität.

Hemmende Mindestkonzentration: 0,001 Mikrogramm/ml (Testorganismus: Staphylococcus aureus 209 P).

8,5 1 Äthylacetatlösung, die auf die vorstehend angegebene Weise erhalten worden war, wurden eingeengt und mit 1,0 ml Äthylacetat und 10 ml η-Hexan gemischt, wobei 570 mg rohes B-2847 Y erhalten wurden, von denen 300 mg mit 9 ml Diäthyläther extrahiert wurden. Nach Filtration wurde das klare Filtrat erneut mit 9 ml Diäthyläther extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Das so erhaltene Konzentrat wurde in Äthylacetat, das 1% Oxalsäure enthielt, gelöst, an einer Silicagelsäule von 12 g chromatographiert und mit 600 ml Äthylacetat, das 1% Oxalsäure enthielt, gewaschen Der adsorbierte Teil von B-2847 Y wurde aufgefangen und mit einer Äthylacetat-Kochsalz-Lösung extrahiert. Die Äthylacetatphase wurde ausreichend mit Wasser gewaschen, getrocknet, eingeengt und an dem oben genannten Adsorbtionsmittel adsorbiert, wobei 11 mg Kristalle von B-2847 erhalten wurden. Das Produkt hatte den glei-

chen Schmelzpunkt und die gleiche antimikrobische Aktivität wie vorstehend erwähnt

Beispiel 2

Ein 50-1-Behälter enthielt 301 eines Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung: 3% Glucose, 1% Glycerin, 0,2% Pepton, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,05% MgSO₄ -7 H₂O, 0,1% FeSO₄, 0,01% ZnSO₄, 0,01% MnSO₄ und 03% CaCo₃ (pH 7). Dieses Medium wurde mit einer Kulturbrühe, die unter den in Beispiel 1 genanntet Bedingungen erhalten worden war, in einer Menge von etwa 1,5 bis 2,0 Vol.-%, bezogen auf das Kulturmedium, geimpft und 42 Stunden bei 28° C gehalten, wobei 3OS Luft/Minute zugeführt wurden und mit 240UpM gerührt wurde. Die Kulturbrühe wurde mit einem Filterhilfsstoff »Hyflo Superoel« filtriert, wobei 21 i Filtrat erhalten wurden, das auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise extrahiert wurde. Die Äthylacetatlösung wurde unter vermindertem Druck eingeengt und das Konzentrat in Äthylacetat gelöst und mit dem lOfachen Volumen η-Hexan behandelt, wobei 1,5 g rohes Pulver von B-2847 Y erhalten wurden.

500 mg des so erhaltenen rohen Pulvers wurden in 10 ml Benzol-Äthylacetat (1:1) gelöst Die Lösung wurde an einer Säule aus 25 g Silicagel chromatographiert Das Silicagel wurde nacheinander mit Benzol, Benzol-Äthylacetat (1 :1), (1 :2), (1 :3), Äthylacetat und Äthylacetat-Aceton (1:1) gewaschen. Die Fraktionen mit antimikrobischer Wirksamkeit wurden aufgefangen, eingeengt, in Äthylacetat gelöst und an einer Säule aus la 7,5 g Aktivkohle Chromatographie«. Die Säule wurde dann nacheinander mit Äthylacetat, Äthylacetat-Chloroform (95 :5 und 90 :10) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden aufgefangen und eingeengt. Das Konzentrat wurde dann in η-Hexan gelöst und in einem Kühlschrank gehalten, wobei 71 mg Kristalle von B-2847 Y erhalten wurden, die aus einer n-Hexan-Äthylacetat-Lösung umkristallisiert wurden, wobei 40 mg B-2847 Y vom Schmelzpunkt 120-125⁰C (Zers.) erhalten wurden. Dieses Produkt zeigte antimikrobisehe Wirksamkeit.

Hemmende Mindestkonzentration: 0,001 Mikrogramm/ml (Testorganismus: Staphylococcus aureus 209 P)

1,5 g des rohen Pulvers wurden durch Dünnschichtchromatographie an Silicagel abgetrennt und an Aktivkohle chromatographiert, wobei 102 mg rohes B-2847 Y erhalten wurden.

700 mg des so erhaltenen rohen Pulvers wurden nacheinander an einer Säule aus 14 g Aktivkohle und zweimal an Silicagel der Dünnschichtchromatographie unterworfen, wobei 33 mg rohes B-2847 Y erhalten wurden. Außerdem wurden 5 g rohes Pulver zweimal mit 200 ml und 150 ml Diäthyläther extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt und an einer Säule aus 100 g Aktivkohle chromatographiert. Die erhaltene aktive Fraktion wurde eingeengt. Das Konzentrat wurde an einer Säule aus Silicagel auf die am Schluß von Beispiel 1 angegebene Weise chro- bo matographiert. Hierbei wurden 320 mg B-2847 Y erhalten.

Beispiel 3

In einen 2-1-Kolben wurden 500 ml eines 15 Minuten bei 121°C sterilisierten Mediums der folgenden Zusammensetzung gegeben: 1% Glucose, 1% Glycerin, 0,5% Pepton, 1% Maisquellwasser, 1% Sojabohnenmehl und 0,5% gefälltes CaCO₃ (pH 7,0). Dieses Medium wurde mit Streptomyces tolypophorus ATCC-21177 geimpft und 48 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 28° C bebrütet

1001 eines in einem 200-1-Tank enthaltenen Kulturmediums aus 3% Glucose, 1 % Glycerin, 0,2% Pepton. 1,5% Sojabohnenmehl, 0,05% CaCl₂, 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,01% FeSO₄, 0,01% ZnSO₄ und 0,3% CaCO₃ wurden mit 31 der in den 2-1-Kolben erhaltenen Kulturbrühe geimpft und 42 Stunden fermentiert wobei 100 1 Luft/Minute zugeführt wurden und mit 200 UpM gerührt wurde.

Die so erhaltene Kulturbrühe wurde filtriert 85 1 des Filtrats wurden mit Äthylacetat auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise extrahiert wobei 7,5 g rohes Pulver erhalten wurden, das zweimal jeweils mit dem 30fachen Pulvervolumen an Diäthyläther extrahiert wurde. Der Extrakt wurde eingeengt, der Rückstand in 7,5 ml Äthylacetat gelöst und mit 53 ml η-Hexan versetzt. Hierbei wurden 2,9 g Pulver erhalten.

Eine Lösung von 10 g des Pulvers in 50 ml Äihylacetat-Diäthyläther (1 :1) wurde an 100 g Aktivkohle chromatographiert Die Aktivkohlesäule wurde dann nacheinander mit Diäthyläther, Äthylacetat und Chloroform eluiert. B-2847 Y, das hauptsächlich mit der Äthylacetatfraktion eluiert worden war, wurde unter vermindertem Druck eingeengt Das Konzentrat wurde mit Äthylacetat und Kochsalzlösung extrahiert. Der enthielt, auf 40 g Silicagel gegeben.

Die B-2847 Y-Fraktionen wurden aufgefangen und mit Äthylacetat und Kochsalzlösung extrahiert. Der Extrakt wurde gut mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Das Konzentrat wurde in Äthylacetat oder einem Gemisch von Äthylacetat und n-Hexan kristallisiert, wobei rohe Kristalle von B-2847 Y erhalten wurden. Die rohen Kristalle wurden aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei 1,2 g gelbe Kristalle erhalten wurden, die sich bei 120 bis 125°C zersetzten. Die hemmende Mindestkonzentration der Kristalle gegen Staphylococcus aureus 209 P betrug 0,001 Mikrogramm/ml.

Da eine gewisse Menge B-2847 Y in der mit Chloroform von Aktivkohle eluierten Fraktion enthalten war, wurde die Fraktion erneut an Aktivkohle und an Silicagel gereinigt, wobei 340 mg Kristalle von B-2847 Y erhalten wurden.

Beispiel 4

1,8 kg nasses Mycel wurden durch Filtration oder Zentrifugieren von 201 der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Kulturbrühe abgetrennt. Diese nassen Mycel wurden mit 4 1 Aceton-Wasser (3:1) gemischt und filtriert, wobei 3,4 I klares Filtrat erhalten wurden, das unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von nicht mehr als 40°C eingeengt wurde. Das Konzentrat wurde mit verdünnter H₂SO₄ auf pH 3,5 eingestellt und zweimal mit je 0,81 Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde getrocknet, unter vermindertem Druck eingeengt und mit η-Hexan oder Diäthyläther-Petroläther (1 :10) gemischt, wobei 250 mg eines rohen Pulvers erhalten wurden (Reinheit etwa 5 Gew.-%).

Beispiel 5

Je 500 ml eines in 2-1-Kolben enthaltenen sterilisierten Mediums aus 2% Glucose, 3% löslicher Stärke, 1% Sojabohnenmehl, 1% Maisquellwasser, 1% Pepton, 3% NaCI und 0,5% CaCO₃ (pH 7,0) wurden mit Streptomyces tolypophorus ATCC-21177 geimpft und

24 Stunden in einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung bei 28°C fermentiert. 31 der so erhaltenen vereinigten Kulturbrühe wurden in einen 200-l-Tank überführt, der 1001 eines sterilisierten Mediums enthielt, das die gleiche Zusammensetzung hatte wie das Medium in den Koiueu. Dieses Medium wurde 24 Stunden bebrütet.

Die Gesamtkultur im 200-l-Tank wurde in einen 2000-l-Tank überführt, der 10001 eines sterilisierten Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt: 3% Glucose, 0,2% Pepton, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,3% Calciumcarbonat (pH 7,0) und Siliconöl (Schaumverhütungsmittel). Das Medium wurde bei 28°C 42 Stunden bebrütet, wobei 1000 1 Luft/Minute zugeführt wurden und mit 140 UpM gerührt wurde.

8401 des Fütrats wurden auf pH 8,0 bis 3,0 eingestellt und mit Vj seines Volumens an Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatfraktion wurde zweimal mit je der Hälfte ihres Volumens einer 0,l%igen wäßrigen Ascorbinsäurelösung gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck unter einer Stickstoffatmosphäre eingeengt.

Das Konzentrat wurde mit 2 1 einer Lösung von Diäthylätherund Petroläther(l : 10) gemischt, wobei etwa 70 g rohes Pulver von B-2847 R (Reinheit 10%) erhalten wurden.

5 g dieses rohen Pulvers wurden in 250 ml Chloroform gelöst. Das unlösliche Material wurde entfernt. Die Chloroformlösung wurde durch eine Säule von 500 g Silicagel geleitet, das einer Vorbehandlung unterworfen worden war, bei der es in 1,1 1 Aceton, das 1% Oxalsäure und 0,2 1 Ascorbinsäure enthielt, suspendiert und nach Entfernung des Acetons unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet wurde. Die Säule wurde dann nacheinander mit 2 I Diäthyläther 2 1 eines Gemisches aus Diäthyläther und 1 % Oxalsäure enthaltendem Äthylacetat (9:1), 21 eines Gemisches aus Diäthyläther und 1% Oxalsäure enthaltenden"

Äthylacetat (4 :1), 1 I eines Gemisches aus Diälhyläthei und 1% Oxalsäure enthaltendem Äthylacetat (1:1) unc 2 1 Äthylacetat, das 1% Oxalsäure enthielt, eluiert.

B-2847 R war im Gemisch aus Diäthyläther unc Äthylacetat und im Äthylacclat enthalten. Das ver-

ίο einigte Eluat wurde sieben- bis achtmal mit einer wäßrigen Lösung, die 0,1% 1-Ascorbinsäure enthielt, unc mit destilliertem Wasser gewaschen, getrocknet unc unter vermindertem Druck in einer Stickstoffatmosphäre eingeengt, wobei etwa 400 mg B-2847 R (Rein heit 80 Gew.-%) erhalten wurden.

Beispiel 6

800 mg B-2847 R, das auf die in Beispiel 5 angegebene Weise hergestellt worden war, wurden in 60 ml Acetor gelöst, mit etwa 40 ml einer 1—2% !-Ascorbinsäure enthaltenden wäßrigen Lösung und 60 ml Wasser ge mischt und dann mit 100 ml Benzol (oder 150 ml Di äthyläther, das kein Peroxyd enthielt) extrahiert Dei Extrakt wurde zweimal mit Wasser gewaschen, mi wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, unter vermin dertem Druck in einer Stickstoffatmosphäre eingeeng und dann mit η-Hexan gemischt, wobei etwa 350 mj rötlich-orangefarbene Kristalle von B-2847 R erhalter wurden, die aus Benzol umkristallisiert wurden, wöbe

jo rötlich-orangefarbene Kristalle erhalten wurden. Die Kristalle wurden mit einer geringen Menge gekühlten Benzol und η-Hexan gewaschen und unter Kühlung getrocknet, wobei etwa 200 mg B-2847 R (Reinheit übei 90%) erhalten wurden.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

1. Patentansprüche:
   1. Antibiotikum B-2847 Y der Konstitutionsformel I

   AcO

   MeO

   Me

   OH \ /

   worin Me die Methylgruppe bedeutet,

   der Summenformel C₄₃H₅₄N₂Oj₄, dem Infrarot-Spektrum mit folgenden signifikanten Absorptionen bei den

   Wellenzahlen:

   3490 (M), 3350 (W), 3000 (M), 2940 (M), 2880 (M), 1725 (S), 1708 (S), 1680 (S), 1630 (VS), 1605 (VS), 1510(VS), 1440(M), 1410 (S), 1365 (S), 1330 (S), 1300 (M), 1287 (M), 1225 (S), 1235 (S), 1175 (VS), 1160(S), 1140(Sh). 1093 (VS), 1072 (VS), 1020 (W), 1002 (M), 985 (M), 970 (M), 945 (M), 920 (M), 908 (M), 887 (M), 823 (M) cm"¹ (in CHCl₃),

   und der spezifischen Drehung:

   [a] i; = + 325 ± 30 (C = 1,0 EtOH)

   + 376 ± 40 (C = 0,5 Me₂CO), das als Chinon vorliegt.
2. 2. Antibiotikum B-2847 R der Formel II

   AcO

   X>o„

   worin Me die Methylgruppe bedeutet,

   der Summenformel C43H56N2O14, dem Infrarot-Spektrum mit folgenden signifikanten Absorptionen bei den Wellenzahlen:

   3500 (M), 3400 (W), 3040 (M), 2950 (M), 2910 (Sh), 1715 (S), 1685 (Sh), 1665 (VS), 1645 (S), 1620 (S), 1610· (Sh), 1565 (VS), 1525 (VS), 1455 (VS), 1385 (VS), 1345 (M), 1315 (S), 1250 (VS), 1155 (S), 1093 (S), 1067 (VS), 1002 (M), 973 (S), 951 (M), 9i5 (M), ^90(M)Cm-¹ (JnCHCI₃),

   und einer spezifischen Drehung:

   [«]f = +225 ±20 (C=I₁O EtOH), das als Hydrochinon vorliegt ^
3. 3. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika B-2847 Y und B-2847 R der Formeln I und II, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces tolypophorus nov.sp. ATCC-21277 bei Temperaturen von etwa 20 bis 45° C unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das assimilierbaren Kohlenstoff, verwertbaren Stickstoff und andere für das Wachstum des Mikroorganismus erforderliche Nährstoffe enthält und das in der Kulturbrühe und/oder dem Kulturrückstand angereicherte Antibiotikum B-2847 Y und/oder B-2847 R mit einem organischen Lösungsmittel im pH-Bereich von 2 bis 8 extrahiert und auf chromatographischem Weg isoliert, wobei zur Isolierung von B-2847 R die Gegenwart von L-Ascorbinsäure in einer Menge von nicht weniger als 1 Mol pro Mol B-2847 R ist.
4. 4. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend Antibiotikum B-2847 Y und/oder B-2847 R als Wirkstoff in Verbindung mit pharmazeutisch unbedenklichen Träger- oder Hilfsstoffen.