DE1667923B2 - - Google Patents
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Description
Gegenstand der Erfindung ist das Antibiotikum B-2847 Y der Konstitutionsformcl I
J.'
Me iMe
AcO
MeO
Me O
1.1
OH
worin Me die Methylgruppe bedeutet,
der Summenformel C43HmN2Oh, dem Infrarot-Spektrum mit folgenden signifikanten Absorptionen bei den
Wellenzahlen:
3490(M), 3350(W), 3000(M), 29-1O(M), 2880(M), 1725(S), 1708(S), 1680(S), 1630(VS) 1605(VS) 1.5SO(VS)
1440(M), 1410(S), 1365 (S), 1330(S), 1300(M), 1287(M), 1225 (S) 1235(S) 117MVS)' 1160(S)'
1140(Sh), 1093(VS), 1072 (VS). 1020(W), 1002 (M), 985(M), 970 (M) 945 (M) 920 (M)' 908(M)'
887(M), 823 (M) cm1 (in CHCI1),
und der spezifischen Drehung:
[ίί|,ϊ = + 325 ± 30(C= 1,0 EtOH)
[ίί|,ϊ = + 325 ± 30(C= 1,0 EtOH)
t 376 + 40 (C = 0,5 Me2CO), d.is als Chinon vorliegt.
Gegenstand der Frfmdung ist weiterhin das Antibiotikum H-2847 K der Formel II, das die llytlrochinnnform
von B-2847 Y ist.
AcO
McO
Me1
OH
Me" OH
worin Me die Methylgruppe bedeutet.
Der Unterschied im Zuckerrest am C-AtOm4 zwischen B-2847 Y und H-2847 R beruht auf einer Tautomerie.
die im folgenden Formelschema erläutert ist,
O —H
HO
HNHH
CIl
(!) (Pyranose)
Oxidatio"
Reduktion
H3C HHH
(II) (Aldose)
OH
~O —H HO
H3C HHH/
Me OH
(IiI) (Fyranose) (IV) (Aidose) (V)
in dem lediglich in den Formeln I und II der hier allein interessierenden Chinon- bzw. Hydrochinonring mit
den Kohlenstoffatomen Ci his Ci und der über cbs
Stickstoffatom mil dem ( -Λΐοηη verknüpfte /.ucker
rest gezeichnet cind. Die Pyranoseform von B-2847 Y
(I Λ) steht im Gleichgewicht mit der Aldoseform (I I?)
Entsprechende« gilt für die llydrochinonform von Π 2847 Y. also das R-2847 R. Λη·, der Aldoseform von Il
(F'nri'':l Il B). das sieh uns i\vv Pyranoseform Il A im
Gleichgewicht gebildet hat. entsteht vorwiegend die Struktur eines 5-Ring/uckers, d.h. die Verbindung II.
wegen der stärkeren Niikleophilität des Str.'kstoffatoms
gegenüber dc ties Sauerstoffs Reι Oxidation von Il
verschiebt sich iedoch das Gleichgewicht über Il H nach
Il Λ und führt wieder zu B-2847 Y mit den beiden Strukturen i Λ und I B.
Die Konstitution der Antibiotika R-2847 Y und R war am Anmeldet,it' '-och nicht aufgeklärt. Diese würde
vielmehr erstnuli; in Tetrahedron erstens l%9 Nr. 2
S. 97— 100 veröffentlicht und steht in Einklang mit den
vorstehend angegebenen Parametern.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotika B-2847 Y und/oder
B-2847 R der Formeln I und II. das dadurch gekennzeichnet ist. daß man Streptomyces tolypophorus
nov.sp. ATCC -21177 bei Temperaturen von etwa 20 bis
45 C unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das assimilierbaren Kohlenstoff, verwertbaren
Stickstoff und andere für das Wachstum des Mikroorganismus erforderliche Nährstoffe enthält und das in
der Kulturbrühe und/oder dem Kulturrückstand ange reicherte Antibiotikum B-2847 Y und/oder B-2847 R
mit einem organischen Lösungsmittel im pH-Bereich von 2 bis 8 extrahiert und auf chromatographischem
Weg isoliert, wobei zur Isolierung von B-2847 R die Gegenwart von L-Ascorbinsäure in einer Menge von
nicht weniger als I Mol pro Mol B-2847 R erforderlich ist.
Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Mikroorganismus Streptomyces tolypophorus nov.sp..
der nach Maßgabe der Rechtsvorschriften über den Umgang mit Mikroorganismen an Dritte zu den
üblichen Bedingungen abgegeben wird, der aus einer Bodenprobe in Tokio, Japan, isoliert worden ist, hat die
nachstehend genannten morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften. Hierbei basieren die mit
»Rdg« gekennzeichneten Farbbezeichnungen auf »Ridgeway's Color Standard and Nomenclature«:
1) Morphologische Eigenschaften:
Sporophoren: gerade oder wellig, keine Spiralen und keine Windungen. Luftmycel, Bildung von
Sklerotium, 4 bis 20 μ, wächst beispielsweise auf Glucose-Hefeextrakt, Malzextraktagar oder GIycering-Asparagin-Agar. Sporen ellipsoid, 0,8 bis
1,1 μ mal 13 bis 23 μ mit glatter Oberfläche.
2) Merkmale der Kulturen:
a) Czapek-Agar:
Wachstum: reichlich, faltig und erhaben, zeigt gerissene Oberfläche an der Kante des Wachstums,
Ligt Orange Yellow (Rdg. III, 17-d) bis Deep Chrome (Rdg. III, 17-b).
Luftmycel: gut, weiß.
Rückseite: Buff Yellow (Rdg. IV, 19-d bis Light Orange Yellow (Rdg. III, 17-d).
Lösliches Pigment: Pale Orange Yellow {Rdg. III, 17-f) bis Ochraceous-Buff (Rdg. XV, 15-b).
b) GIucose-Czapek-Agar:
IiMiIMt1 von Luftmycel. lösliches Pigment, l-'arbc
der Rückseite die gleiche wie auf C'/apek-Agar.
. ) (ilycerin-C/apck-Agar:
. ) (ilycerin-C/apck-Agar:
Wachstum: reichlich, aber weniger faltig als auf
Medium a) oder b). fast die gleichen übrigen
Eigenschaften wie auf Medium a) oder b).
il) Glucose-Asparagin-Agar:
il) Glucose-Asparagin-Agar:
Wachstum: gut. Pale Orange Yellow, dringt in Agar ein
Luftmycel: spärlich bis mäßig, dünn. weiß.
Rückseite: Pale Orange Yellow.
Lösliches Pigment nicht vorhanden.
e) Nährbrühe:
Auf der Oberfläche schwimmende kleine Kolonien. Luftmycel: weiß bis Pallid Mouse Gra\ (Rdg. Ll.
15 -f).
Lösliches Pigment: nicht vorhanden.
f) Nähragar:
Wachstum- schlecht bis mäßig, farblos.
Luftmycel: schlecht, dünn, weiß bis Pallid Mouse
Gray.
Lösliches Pigment: nicht vorhanden.
Rückseite: farblos bis Pale Orange Yellow,
g) Glucose-Nährbrühe:
g) Glucose-Nährbrühe:
Wachstum: reichlich, entwickelt sich zuerst auf der Oberfläche, bildet später Floccus.
Luftmycel: schlecht, dünn, weiß bis Capucine Buff
(Rdg. III, 13-f).
Lösliches Pigment: blaßgelb (Pale Yellow),
h) Glucose-Nähragar:
Wachstum: reichlich, faltig und erhaben, farblos bis
Marx Yellow (Rdg. III, 15-i).
Luftmycel: mäßig und dünn, weiß.
Lösliches Pigment: gelblich-braun,
i) Glycerin-Nähragar:
(Rdg. III, 15-k).
Luftmycel: schlecht, an den Rändern des Wachstums weiß.
Lösliches Pigment: gelblich-braun,
j) Stärkeagar:
Rückseite: farblos,
k) Ganzes Ei:
17-b).
Luftmycel: lösliches Pigment nicht vorhanden.
I" Hefeextrakt-Agar:
weiß.
Lösliches Pigment: Marx Yellow bis orangegelb,
m) Kartoffel-Stichkultur:
Wachstum: schlecht, blaßgelblichbraun bis blaßbraun.
Lösliches Pigment: nicht vorhanden,
n) Möhrenstichkultur:
Luftmycel: weiß,
o) Lackmusmilch (37° C):
ρ) Gelatine (2VC):
Schnelle Verflüssigung, Bildung von weißem Liiftmycel.
Lösliches Pigment: gelblichbraun, q) Löffler-Serum (37°C):
Wachstum: dünn, schlecht, orangegelb, schwache
Verflüssigung.
Luftmyc«;): nicht vorhanden,
r) Cellulose:
r) Cellulose:
Wachstum: farblos, wird allmählich orangegelb. '" Liiftmycel: weiß, watteartig.
Cellulose: nicht zersetzt.
s) Calciumrnaleat-Agar:
s) Calciumrnaleat-Agar:
Wachstum: mäßig, Pale Orange Yellow, dringt in
Agar ein. r.
Luftmyce!: dünn und weiß.
Rückseite: Pale Orange Yellow bis Ochraceous-Buff(Rdg.
XV, I5'b).
Lösliches Pigment: nicht vorhanden oder chamois
(Rdg. XXX, 19"-b).
t) Tyrosin-Agar:
t) Tyrosin-Agar:
Wachstum: spärlich, farblos bis gelb.
Luftmycel: schlecht, weiß.
Rückseite: farblos.
Lösliches Pigment: nicht vorhanden. r>
u) Pepton-Agar:
Wachstum: spärlich bis mäßig.
Luftmycel: wenig, dünn, weiß.
Rückseite: farblos.
Lösliches Pigment: nicht vorhanden.
3) Physiologiiche Eigenschaften
a) Optimaler pH-Wert: etwas Wachstum zwischen pH 4,0 und 10,0, optimales Wachstum zwischen
pH 6,0 und 8,0. π
b) Optimale Temperatur: Wachstum wurde im Temperaturbereich zwischen etwa 20 und 43° C beobachtet;
optimale Temperatur 28°C, aerob.
c) Keine Hydrolyse von Stärke.
d) Nitratreduktion: positiv.
e) Farbbildung: keine.
Wenn dieser Mikroorganismus auf einigen synthetischen Medien kultiviert wird, zeigt er ein ledergelbes bis
hellorangegelbes Wachstum und erzeugt lösliche Pigmente von blaßorangegelb bis gelblichbraun. Sein
Luftmycel ist weiß.
Auf gewissen proteinhaltigen Medien erzeugt der Mikroorganismus lösliche Pigmente von gelblichbrauner
Farbe, jedoch gehört er nicht zum chromogenen Typ.
Der Mikroorganismus zeigt keine Hydrolyse von Stärke und keine Verflüssigung von Gelatine und
reduziert Nitrat zu Nitrit.
Die Verwertung von Kohlenstoffquellen, ermittelt nach der Methode von Pridham und Gottlieb, ist nachstehend
in Tabelle 1 angegeben.
60
Erythrit | — |
Adonit | — |
D-Sorbit | _ |
i-Inosit | + + + |
D-Männit | + bis + + |
Dulcit | + bis + + |
D-Xylose | + + bis + + + |
L-Arabinose | + + |
l.-Sorbosf +
Trehalose + + H-
Salicin + bis + +
Esculin - bis ±
Inulin + +
Natriumacetat + bis + +
Natriumciirat + bis + +
D-Galactose + + H-
D Glucose H- bis + +
D-. ructose + +
Rhamnose + + +
Melibiose + +
Maltose H- H-
Saccharose H- + +
Lactose H- bis + +
Raffinose + bis H- +
Natriumsuccinat + bir, 4- +
D-Mannose H- +
Stärke + bis + +
Glycerin + +
Kontrolle -
Zeichenerklärung:
+ + += starkes Wachstuni:
+ + = gutes Wachstum;
+ + += starkes Wachstuni:
+ + = gutes Wachstum;
+ = mäßiges Wachstum:
± = schwaches Wachstum.
Ein Vergleich der vorstehend beschriebenen morphologischen Eigenschaften mit den Beschreibungen in
»The Actinomycetes«, 2, 152 ff. (S.A. Waksman 1961) und »Applied Microbiology« 6, 52 (T. G. Pridham 1958)
zeigt, daß Streptomyces tolypophorus ähnliche morphologische Eigenschaften hat wie Spezies, wie Streptomyces
globisporus, Streptomyces autotrophicus, Streptomyces orientalis, Streptomyces kimberi und Streptomyces
aburaviensis, die sich sämtlich durch gerade oder wellige Sporophoren und weißes Luftmycel auszeichnen.
Streptomyces tolypophorus unterscheidet sich jedoch von Streptomyces globisporus insofern, als der erstere
orangegelbes Wachstum auf synthetischem Agar zeigt, weißes Luftmycel bei der Kartoffel-Stichkultur bildet
und auf Cellulose wächst, während der letztere auf synthetischem Agar farbloses Wachstum zeigt, bei der
Kartoffel-Stichkultur grünlichgelbes Luftmycel bildet und auf Cellulose nicht wächst.
Streptomyces tolypophorus unterscheidet sich von Streptomyces autotraphicus darin, daß der erstere auf
Stärkeagar mäßig wächst, Gelatine schnell verflüssigt und Nitrat zu Nitrit reduziert, während der letztere auf
Stärkeagar schlechtes Wachstum zeigt, Gelatine nicht verflüssigt und Nitrat nicht reduziert.
Streptomyces tolylpophorus scheint große Ähnlichkeit
mit Streptomyces orientalis insofern zu haben, als er auf Cellulose wächst, obwohl der letztere auf Czapek-Agar
geringeres Wachstum zeigt und in Gelatine keine löslichen Pigmente bildet
Streptomyces tolypophorus bildet elliptische Sporen, bildet in Gelatine gelbichbraune lösliche Pigmente und
koaguliert Milch nicht, während Streptomyces kimberi kleine kugelige Sporen bildet, in Gelatine keine löslichen
Pigmente bildet und Milch koaguliert
Streptomyces tolypophorus unterscheidet sich ferner von Streptomyces aburaviensis in der Bildung von
lösiichen Pigmenten in Glucose-Asparagin-Agar oder in
Calciummaleat-Agar und in der Ausnutzung der Kohlenstoffquellen.
Nach dem Bericht von L Ettlinger und Mitarbeitern
(Archiv für Mikrobiologie 31 (1958). S. i26) scheint
Streptomyces tolypophorus zu der Reihe »(B) Sporen glatt — II. Luftmycel niveus« zu gehören. Von den
Mikroorganismen, die zu dieser Reihe gehören, unterscheidet sich jedoch Streptomyces tolypophorus ein- r,
deutig von Streptomyces rubrireticuli und Streptomyces niveoruber insofern, als die letztere Gruppe gewundene
oder spiralförmige Sporophoren bildet. Streptomyces tolypophorus unterscheidet sich von Streptomyces
fulvisstmus darin, daß der letztere ein gold- bis orange- ι ο
farbenes lösliches Pigment auf Czapek-Agar oder auf Glucose-Asparagin-Agar bildet und ein tiefes rotbraunes Wachstum auf Nähragar hat. Streptomyces
tolypophorus unterscheidet sich von Streptomyces phaeochromogenes darin, daß der letztere zum chromo- ιί
genen Typ gehört.
Hinsichtlich der Bildung von skierotischem Granulat werden Mikroorganismen, wie Chainia (M. J. Thirumalachar:
Natua· Bd. 176 (1955), S. 934, Streptomyces griseus (M L. Gattani: Natur Bd. 180 (1?57), S. 1293) 2n
usw. genannt, die beide »skierotisches Granulat« aus einem Substratmycel bilden, während im Falle von
Streptomyces tolypophorus das skleronsche Granulat sich nicht aus einem Substratmycel, sondern aus einem
Luftmycel entwickelt, in dieser Hinsicht hat Strepto- 2'>
myces tolypophorus große Ähnlichkeit mit Streptomyces aerocolonigenes, der von R. Shinobu und Mitarbeitern
beschrieben wird (The Botanical Magazine Bd. 73 (1960), S. 212), unterscheidet sich jedoch vom
letzteren insofern, als der letztere nur ein geringes jo
Luftmycel und auf Glycerin-Czapek-Agar ein braunes lösliches Pigment bildet, ein hellbraunes lösliches
Pigment hat, auf Stärkeagar ein aprikosengelbes Wachstum zeigt, in Tyrosinase und Diastase positiv
reagiert, hinsichtlich der Ausnutzung von Raffinose ü
negativ und hinsichtlich der Rhamnoseausnutzung zweifelhaft ist.
Streptomyces tolypophorus ist nach den vorstehenden Ausführungen als neue Spezies einzustufen und
wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC-21177 hinterlegt.
Als Kohienstoffquellen eignen sich beispielsweise Glucose, Inosit. Xylose, Galactose, Fructose und
Saccharose. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Pepton, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser,
Fleischextrakt, Reiskleie, Weizenkleine, Harnstoff, Ammoniumsalze und organische oder anorganische
Stickstoffverbindungen. Ferner kann eine geringe Menge organischer Salze, z. B. Natriumchlorid, Phosphate,
Salze von Metallen, wie Calcium, Zink, Mangan und Eisen, dem Medium zugesetzt werden. Falls erforderlich,
können übliche Nährelemente oder ein Antischaummittel, z. B. tierisches öl, pflanzliches Öl oder
Mineralöl, ebenfalls zugesetzt werden.
Die Kultivierung kann mit einem flüssigen oder festen
Kulturmedium erfolgen, jedoch wird die Submerskultur vorgezogen. Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur,
Fermentationsdauer und pH-Wert des Mediums, sind so zu wählen, daß die Bildung von B-2847 eo
maximal ist. Die Bildung von B-2847 erreicht ihr Maximum in der Schüttelkultur in etwa 2—7 Tagen. Das
Kulturmedium wird vorzugsweise in neutralem pH-Bereich, d. h. bei etwa pH-Wert 5 bis 9 gehalten. Die
Kultivierungstemperatur liegt zweckmäßig zwischen b5
etwa 25 und 35° C.
Das auf diese Weise in der Kulturbrühe angereicherte Antibiotikum B-2847 wird daraus durch Extraktion entfernt
und chromatographisch isoliert. Das Antibiotikum B-2847, das fettlöslich und hauptsächlich in der Kulturflüssigkeit
angereichert ist, wird vorzugsweise aus dem Pil tritt gewonnen und dann gereinigt.
Eine gewisse antimikrobische Aktivität ,st im Mycel
festzustellen, so daß der Extrakt des Mycels mit einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton und Äthanol,
vorzugsweise ebenfalls einer weiteren Reinigung zur Gewinnung des Antibiotikums wie beim Kulturfiltrat
unterworfen wird.
Als organische Lösungsmittel, die zur Extraktion des
Kulttirfiltrats verwendet werden, eignen sich beispielsweise Acetate, wie Äthylacetat und Butylacetat. Äther.
wie Diethylether, Ketone, ι. B. Methylisobutylketon,
Alkohole, z. B. n-Butanol und η-Amylalkohol, aromatische
Verbindungen, z. B. Benzol und Toluol, und halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Chloroform und
Dichlormethan.
Das Lösungsmittel, das die gewünschte Substanz enthält, wird mit einer wäßrigen Lösung oder einer auf
einen pH-Wert von etwa 8 eingestellten Pufferlösung gemischt, um die Verunreinigungen in die wäßrige
Phase zu überführen, dann mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt,
und die gewünschte Verbindung wird mit einem geeigneten Adsorptionsmittel direkt aus dem Konzentrat
gewonnen, wobei die gewünschten Substanzen zuerst am Adsorptionsmittel adsorbiert und dann mit
geeigneten Losungsmitteln eluiert werden. Als Adsorptionsmittel können Silicagel, mit Oxalsäure imprägniertes
Silicagel, Aktivkohle usw. verwendet werden. Die rohe Substanz kann auch einer weiteren Reinigung
durch fraktionierende Fällung mit einem geeigneten Lösungsmittel unterworfen werden. Beispielsweise wird
die rohe Substanz mit Diäthyläther gemischt, um die gewünschte Fraktion in das organische Lösungsmittel
zu überführen, oder mit einem Gemisch von Äthylacetat und η-Hexan gemischt, wobei B-2847 ausgefällt wird,
aus dem die reine Substanz leicht erhalten wird.
Die verwendeten Lösungsmittel sind verschieden je nach der Art der Adsorptionsmitte). Beispielsweise wird
das adsorbierte B-2847 bei der Chromatographie an Silicagel zuerst mit rsiedrigpolaren Lösungsmi tsln, wie
Benzol, Diäthyläther, Äthylacetat usw. behandelt, um Verunreinigungen zu entfernen, und dann mit hochpolaren Lösungsmitteln, wie Äthylacetat, Aceton,
Äthanol, n-Butanol, Wasser, Essigsäure, einer Pufferlösung usw., allein oder in Kombination eluiert
Bei Verwendung von Aktivkohle als Adsorptionsmittel werden Äthylacetat, Äthylacetat in Mischungen
mit einer geringen Chloroformmenge und Aceton als Lösungsmittel für die Elution nach Behandlung mit
η-Hexan, Benzo, Diäthyläther usw verwendet.
Die Antibiotika B-2847 Y und R werden in Kulturmedium
nebeneinander gebildet. Isolierbar ist jedoch mit üblichen Isoliermethoden nur ein Antibiotikum, und
zwar kann unter aeroben Bedingungen nur B-2847 Y isoliert werden, während in Gegenwart von L-Ascorbinsäure,
also einem Reduktionsmittel, B-2847 R gebildet wird.
1) Löslichkeit
B-2847 Y ist in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Aceton,
Chloroform, Äihylacetai und Benzol leicht löslich und in Wasser, Petroläther und η-Hexan unlöslich oder schwer
löslich.
B-2847 ist in Methanol. Äthanol. Aceton. Chloroform.
Äthylacetat leicht löslich, in Benzol und Diathylather
löslich, in M/15-Phosphatpuffer bei pH-Wert 2 bis 10
und in Wasser schwerlöslich und in η-Hexan und Petroläther unlöslich.
2) Farbreaktion
B-2847 Y reagiert positiv gegenüber Tollens-Reagenz
und Magnesiumacetatreagenz, negativ gegenüber Barton-Reagenz (FeCl3 plus K3Fe(CN)6), in der Molisch-Reaktion und gegenüber Ehrlich-Reagenz.
B-2847 R ist positiv gegenüber Tollens-Reagenz,
Fisen(III)-chlorid, Barton-Reagens, negativ in der Ninhydrin-Reaktion, Mollisch-Reaktion, Sakaguchi-Reakticn und gegenüber Ehrlich-Reagens.
3) Rf-Werte
Durch Papierverteilungschromatographie nach der aufsteigenden Methode auf Whatman-F.lterpapier Nr. ί
wurden die folgenden Rf-Werte erhalten und als Farbflecken und als Inhibierungszone auf dem BRjautogramm unter Verwendung von Staphylococcus aureus
als Testorganismus beobachtet:
Durch Dünnschichtchromatographie wurden die folgenden Rf-Werte ermittelt:
Lösungsmittel Rf-Wert
B-2847 YB-2847 R
1% Oxalsäure
4) Elementaranalyse (%):
B-2847 Y: Prismen aus Äthylacetat-n-Hexan
, 3 umkristallisiert:
C 60,71 ±1,0, H 6,59 ±OA N 3,10 + 0,5;
B-2847 R: Prismen aus Benzol umkristallisiert:
C 64,66 ± 1,0, H 6,67 ± OA N 3,03 ± 0,5.
^ 5) Molekulargewicht (gemessen nach der V.P.O.-Methode unter Verwendung von Äthyiacetat ais Lösungs
mittel):
B-2847 Y und B-2847 R: etwa 600 bis 1000.
6) Spezifische Drehung:
Lösungsmittel
Rf-Wert
B-2847 Y
B-2847 Y
B-2847 R
B-2847 Y: [α]ΐ
B-2847 R: [α] i
+325 ±30 (C= 1,0 EtOH)
+376±40 (C=0£ Me2CO)
+ 225 ±20 (C=I1O EtOH)
n-Hexan, Benzol, Äthanol, 0,78
Wasser (1 :3:1 :3)
η-Hexan, Benzol, Aceton, 0,60 0,65
Wasser (30:10:18:22)
η-Hexan, Diathylather, Aceton, 0,27
Wasser (15:5:8:12)
7) Absorptionsspektrum
Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum und das Absorptionsspektrum im sichtbaren Bereich in Äthanollösung sind in F i g. 1 und F i g. 2 dargestellt. Das
Spektrum enthält die folgenden wesentlichen Absorp-J3 tionsmaxima:
B-2847 Y
EtOH
EtOH
B-2847 R
El*
EW
232±2πιμ 332±30
290±2πιμ 269±30
337 ±2 πιμ 154±15
370 bis 430 ιημ (Schulter)
232±2ΐημ
310±2πιμ
420 bis 460 Γημ
426 ±40
184±20
ca. 80
Phosphatpuffer (pH 72) λ wax
B-2847 Y
E
234±2ηιμ
3I8±2mμ
384±2πιμ
465±2πιμ
356 ±35
298 ±30
65± 6
56± 5
Das Infrarotspektrum von B-2847 Y und B-2847 R, gemessen in Chloroformlösung, ist in F i g. 3 und 4 dargestellt Das Spektrum enthält die folgenden wesentlichen Banden in cm-1 (CHCh):
B-2847 Y:
3490 (mittel), 3350 (schwach), 3000 (mittel), 2940 (mittel), 2880 (mittel), 1725 (stark), 1708 (stark), 1680
(stark), 1630 (sehr stark), 1605 (sehr stark), 1510 (sehr stark), 1440 (mittel), 1410 (stark), 1365 (stark),
1330 (stark), 1300 (mittel), 1287 (mittel), 1255 (stark),
1235 (stark), 1175 (sehr stark). 1160 (stnrk), 1140 (Schulter), 1093 (sehr stark), 1072 (sehr stark), 1020
(schwach), 1002 (mittel), 985 (mittel), 970 (mittel),
945 (mittel), 920 (mittel), 908 (mittel), 887 (mittel), 823 (mittel).
B-2847 R:
3500 (mittel), 3400 (schwach), 3040 (mittel), 2950 (mittel), 2910 (Schulter), 1715 (rtark), 1685
(Schulter), 1665 (sehr stark), 1645 (stark), 1626 (stark), 1610 (Schulter), 1565 (sehr stark), 1525 (sehr
stark), 1445 (sehr stark), 1385 (sehr stark), 1345
(mittel), 1315 (stark), 1250 (sehr stark), 1155 (stark),
1093 (stark), 1067 (sehr stark), 1002 (mittel), 973 (stark), 951 (mittel), 915 (mittel), 890 (mittel).
Das Antibiotikum B-2847 hat die folgenden biologischen Eigenschaften:
1) Antibiotisches Spektrum
Die antibiotische Wirkung von B-2847 gegen ver schiedene Mikroorganismen ist in Tabelle 2 angegeben.
Der Test wird mit gewöhnlichen Bakterien 20 Stunden
bei 37°C auf Boutlionagar, mit säurefesten Bakterien 48 Stunden bei 37°C auf Glycerin-Bouillon-Agar und mit
Hefen und Pilzen 48 Stunden bei 28°C auf Glucose-Bouillon-Agar (pH 7,0) durchgeführt
Mikroorganismen | Hemmende Mindestkonzentration. | B-2847 R |
Mikrograrnm/ml | 50 | |
B-2847 Y | 10 | |
Escherichia coli | 50 | 20 |
Proteus vulgaris | 10 | |
Pseudomonas aeruginosa | ||
Staphylococcus aureus Terajima | 0,0005 | |
Staphylococcus aureus Hetley | 0,005 | 0,001 bis 0,0005 |
Staphylococcus aureus ATCC 4012 | 0,005 | |
Staphylococcus aureus 209 P | 0,001 | |
Staphylococcus aureus 209 P | 0,0001 | |
(resistent gegen Streptomycin) | ||
Staphylococcus aureus 209 P | 0,001 | |
(resistent gegen Chlortetracyclin) | ||
Staphylococcus aureus 209 P | 0,0001 | |
(resistent gegen Chloramphenicol) | ||
Staphylococcus aureus 209 P | 0,001 | 0,5 bis 0,2 |
(resistent gegen Oleandomycin-Erythromycin) | 0,2 bis 0,1 | |
Bacillus cereus | 0,2 bis 0,1 | |
Bacillus subtilis PCI 219 | 0,1 | |
Bacillus subtilis ATCC 6633 | 0,1 | |
Bacillus brevis | 0,005 | >50 |
Sarcina variabilis | 0,001 | >50 |
Mycobacterium avium | >50 | |
Mycobacterium avium | >50 | 10-20 |
(resistent gegen Streptomycin) | 50 | |
Mycobacterium smegmatis | 10-20 | >50 |
Mycobacterium phlei | 50 | >50 |
Mycobacterium sp. ATCC 607 | >50 | >50 |
Candida albicans | >50 | >50 |
Penicillium chrysogenum | >50 | >50 |
Syccharomyces cerevisiae | >50 | >50 |
Piricularia oryzae | >50 | |
Aspergillus niger | >50 | |
Wie die Werte zeigen, hat das Antibiotikum B-2847 eine starke Wirkung gegen grampositive Bakterien.
Die Lethaldosis bei der Maus nach 4 Tagen wurde bestimmt, indem B-2847 Y als Lösung in Carboxymethylcellulose und B-2847 R als wäßrige Polyoxyäthylenlösung in hydriziertem Rizinusöl injiziert
wurden.
B-2847 Y B-2847 R
Intraperitoneal, mg/kg
Subkutan, mg/kg
Intravenös, mg/kg
330 396
2200 500
330
Staphylokokken sind pyogene oder eitererzeugende Bakterien. Sie pflegen begrenzte Läsionen beispielsweise in Form von Abszessen u. dgl. zu büden, die häufig
in der Haut auftreten. Staphylokokken sind die Ursache von Furunkeln und Karbunkeln und anderen häufigen
Wundinfektionen. Die neuen Produkte gemäß der
Erfindung sind wertvoll für örtlich anzuwendende Zubereitungen für die Behandlung dieser Infektionsart bei
so Warmblütern. Eine brauchbare Zubereitung für die örtliche Anwendung zur Behandlung einer auf
Staphylococcus aureus zurückzuführenden Infektionen wird beispielsweise wie folgt hergestellt: In 1 g Wollfett
werden 8 mg des Antibiotikums B-2847 Y oder
B-2847 R gleichmäßig verteilt. Das Gemisch wird dann
gleichmäßig mit weißem Petrolatum in einer solchen Menge gemischt, daß 10 g Salbe erhalten werden.
Aufgrund der vorstehend beschriebenen bakteriziden und bakteriostatischen Eigenschaften eignen sich die
Mi neuen Verbindungen gemäß der Erfindung (als Lösung,
die etwa 20 bis 200 Mikrogramm Antibiotikum B-2847 Y oder B-2847 R pro ml enthält) beispielsweise
für die Desinfektion von Geräten und Apparaturen in Krankenhäusern, die gewöhnlich pathogenen gram-
b5 positiven Bakterien des Typs, der gebenüber diesen
Verbindungen empfindlich ist, ausgesetzt sind.
Die erfindungsgemäßen Antibiotika sind, wie der
nachfolgende Versuchsbericht zeigt, bekannten Anti-
biotika hinsichtlich antibakterieller Aktivität sowohl in
vitro als auch in vivo überlegen.
Versuchsbericht
1. Antibakterielle Aktivität (in vitro)
1. Antibakterielle Aktivität (in vitro)
Vergleichsdaten zwischen den erfindungsgemäßen Antibiotika B-2847 Y und B-2847 R und Vertretern
bekannter Antibiotika hinsichtlich hemmender Mindestkonzentration (MHK, Mikrogramm/ml) sind in der
folgenden Tabelle 3 dargestellt. Der Versuch wurde bei 37" C auf Bouillon Agar während 20 Stunden ausgeführt.
IO
15
20
25
2. Antibakteriell Aktivität (in vivo)
Mäuse werden intraperitoneal mit Staphylococcus jo
aureus 308A in einer Menge infiziert, die ohne nachfolgende Vergabe einer Heildroge zum Tode
führen würde. Den so wifizieri-n Mäusen wurden
subkutan die entsprechenden Antibiotika verabfolgt und die entsprechende effektive I» sis (EDso) wurde jj
bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 3 | Testmikroorganismus | Pseudomonas |
Antibiotikum | Staphylococcus | aeruginosa |
aureus 209P | 50 | |
0,001 | 20 | |
B-2847 Y | 0,001 -0,0005 | >100 |
B-2847 R | 0,1 | >100 |
Cephaloridin | 0,2 | >100 |
Cephalothin | 0,4 | >100 |
Oxacillin | 0,1 | >100 |
Dichloroxacillin | 2,0 | >50 |
Chloramphenicol | 0,4 | |
Erythromycin | ||
Tabelle 4 | ED«, (mg/kg) |
LD50 (mg/kg) |
LD50 ED50 |
40 |
Antibiotika | 0,07 0,06 0,2 8,8 |
2200 500 6000 6000 |
31428 8 33 J 30 000 681 |
43 |
B-2847 Y B-2847 R Cephaloridin Cephalothin |
||||
Stabilität gegen 0-Lactamase
V)
Antibiotika Hemmende Mindestkonzentration, tig/ml
Vor der Inkubation Nach Inkubation
mit ß-Lactamase mit /J-Lactamase*)
mit ß-Lactamase mit /J-Lactamase*)
B-2847 Y
Β-28Γ4 R
Cephaloridin
Cephalothin
Β-28Γ4 R
Cephaloridin
Cephalothin
0,001
0,001-0,0005
0,1
0,2
0,001
0,001-0,0005
>100
>100
>100
>100
*) 1 ml einer Lösung, die 2(^g/ml an Testantibiolikum
enthält, wurde mit 0,1 ml einer Lösung von roher 0-Lactamase
(Protein; 4 mg/ml) gemischt, welche aus Proteus vulgaris
stammt, worauf das Gemisch eine Stunde lang bei 30° bebrütet wird.
Aus Tabelle 5 geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Antibiotika stabil gegen /9-Lactamase sind,
während Cephaloridin und Cephalothin durch /i-Lactamase
inaktiviert werden. Dies bedeutet, daß die erfin-
60 dungsgemäßen Antibiotika wirksamer gegen resistente Mikroorganismen eines Herdes sind als Cephaloridin
und Cephalothin.
200-mi-Kolben, die je 20 ml eines sterilisierten
Kulturmediums aus 3% Glucose, 0,2% Pepton, 1% Glycerin, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,05% CaCl2, 0,1%
MgSO4 ■ 7 H2O, 0,01% FaSO4,0,01% MnSO4 und 03%
CaCO3 enthielten, wurden mit einer Kultur von Streptomyces
tolypophorus ATCC-21177 beimpft, die etwa 6—8 Tage bei 28° C auf Bennett-Agar gezüchtet worden
war. Die Kultur in jedem Kolben wurde bei 28° C und hei 220 UpM 72 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung
geschüttelt Die Kulturbrühe wurde vereinigt und zentrifugiert, wobei 121 obenstehende
Flüssigkeit erhalten wurden, die mit einem Drittel ihres Volumens an η-Hexan gewaschen wurde. Die wäßrige
Phase wurde mit verdünnter H2SO* auf pH 3,0 eingestellt
und zweimal mit >/3 und '/s ihres Volumens an
Äthylscetat extrahiert Die Äthylacetatschichten wurden vereinigt und zweimal mit '/3 ihres Volumens an
Sörensen-M/15-Phosphatpufferlösung (pH 8,0) gewaschen.
Die erhaltene Äthylacetatlösung wurde zweimal mit '/β ihres Volumens an Wasser gewaschen, mit wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt Das Konzentrat wurde der Dünnschichtchromatographie
an einer Silicagelplatte unterworfen, die mit 2%iger Oxalsäure imprägniert war. Als
Lösungsmittel dieme Aceton, das 1% Oxalsäure enthielt.
Die Fraktionen, die auf dem Chromatogramm einen Rf-Wert von etwa 0,2 hatten, wurden aufgefangen und
mit Äthylacetat und Wasser gemischt. Das Gemisch wurde geschüttelt, worauf die Äthylacetatphase abgetrennt,
mehrmals mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, unter vermindertem
Druck eingeengt und mit η-Hexan oder Petroläther gemischt wurde, wobei 45 mg rohe Kristalle von
B-2847 Y erhajter. wurden, die aus einem Gemisch von
n-Hcxan und Äthylacetat (3:1) umkristallisiert wurden, wobei 25 mg B-2847 Y vom Schmelzpunkt 120-I25°C
(Zers.) erhalten wurden. Das Produkt zeigte antimikrobische Aktivität.
Hemmende Mindestkonzentration: 0,001 iviikrogramm/ml
(Testorganismus: Staphylococcus aureus 209 P).
8,5 I Äthylacetatlösung, die auf die vorstehend angegebene Weise erhalten worden war, wurden eingeengt
und mit 1,0 ml Äthylacetat und 10 ml η-Hexan gemischt, wobei 570 mg rohes B-2847 Y erhalten wurden,
von denen 300 mg mit 9 ml Diethylether extrahiert wurden. Nach Filtration wurde das klare Filtrat erneut
mit 9 ml Diäthyläther extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt. Das so erhaltene
Konzentrat wurde in Äthylacetat, das 1% Oxalsäure enthielt, gelöst, an einer Silicagelsäule von 12 g chromäfögräphieft
und mit 600ml Äthyläcetäf, das (% Oxalsäure enthielt, gewaschen. Der adsorbierte Teil
von B-2847 Y wurde aufgefangen und mit einer Äthylacetat-Kochsalz-Lösung extrahiert. Die Äthylacetatphase
wurde ausreichend mit Wasser gewaschen, getrocknet, eingeengt und an dem oben genannten Adsorbtionsmittel
adsorbiert, wobei 11 mg Kristalle von B-2847 erhalten wurden. Das Produkt hatte den elei-
chen Schmelzpunkt und die gleiche antimikrobische Aktivität wie vorstehend erwähnt,
Ein 50-l-Behälter enthielt 30 I eines Kulturmediums
der folgenden Zusammensetzung: 3% Glucose, 1% Glycerin, 0,2% Pepton, 13% Sojabohnenmehl, 0,05%
MgSO4-ZH2O, 0.1% FeSO4, 0,01% ZnSO4, 0,01%
MnSO4 und 0,3% CaCo3 (pH 7). Dieses Medium wurde
mit einer Kulturbrühe, die unter den in Beispiel 1 genannten Bedingungen erhalten worden war, in einer
Menge von etwa 1,5 bis 2,0 VoI.-%, bezogen auf das Kulturmedium, geimpft und 42 Stunden bei 28° C gehalten,
wobei 30 1 Luft/Minute zugeführt wurden und mit 240 UpM gerührt wurde. Die Kulturbrühe wurde
mit einem Filterhilfsstoff >>HyfIo Superoel« filtriert,
wobei 21 i FiIi at erhalten wurden, das auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise extrahiert wurde. Die Äthylacetatlösung
wurde unter vermindertem Druck eingeengt und das Konzentrat in Äthylacetat gelöst und mit ίο
dem lOfdchen Volumen η-Hexan behandelt, wobei 1,5 g
rohes Pulver von B-2S17 Y erhalten wurden.
500 mg des so erhaltenen rohen Pulvers wurden in 10 ml Benzol-Äthylacetat (1:1) gelöst. Die Lösung
wurde an einer Säule aus 25 g Silicagel chromatographiert Das Silicagel wurde nacheinander mit Benzol,
Benzol-Äthylacetat (1 :1), (1 :2),(1 :3), Äthylacetat und
Äthylacetat-Aceton (1 :1) gewaschen. Die Fraktionen mit antimikrobischer Wirksamkeit wurden aufgefangen,
eingeengt, in Äthylacetat gelöst und an einer Säule aus jo 73 g Aktivkohle Chromatographie«. Die Säule wurde
dann nacheinander mit Äthylacetat, Äthylacetat-Chloroform (95 :5 und 90 :10) eluiert. Die aktiven Fraktionen
wurden aufgefangen und eingeengt. Das Konzentrat wurde dann in η-Hexan gelöst und in einem r>
Kühlschrank gehalten, wobei 71 mg Kristalle von B-2847 Y erhalten wurden, die aus einer n-Hexan-Äthvlacetat-Lösung
umkristallisiert wurden, wobei 40 mg B-2847 Y vom Schmelzpunkt 120- 125°C (Zers.)
erhalten wur.'en. Dieses Produkt zeigte antimikrobi- « sehe Wirksamkeit.
Hemmende Mindestkonzentration: 0,001 Mikrogramm/ml
(Testorganismus: Staphylococcus aureus 209 P)
13 g des rohen Pulvers wurden dirch Dünnschichtchromatographie
an Silicagel abgetrennt und an Aktivkohle Chromatographien, wobei 102 mg rohes B-2847 Y
erhalten wurden.
700 mg des so erhaltenen rohen Pulvers wurden w nacheinander an einer Säule aus 14 g Aktivkohle und
zweimal an Silicagel der Dünnschichtchromatographie unterworfen, wobei 33 mg rohes B-2847 Y erhalten
wurden. Außerdem wurden 5 g rohes Pulver zweimal mit 200 ml und lüOml Diäthyläther extrahiert. Der -,5
Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt und an einer Säule aus 100 g Aktivkohle Chromatographie«.
Die erhaltene aktive Fraktion wurde eingeengt. Das Konzentrat wurde an einer Säule aus Silicagel auf
die am Schluß von Beispiel 1 angegebene Weise chro- «i
matögräphicrt. Hierbei wurden 320 mg B-2847 Y erhalten.
In einen 2-l-Kolben wurden 500 ml eines 15 Minuten
bei I2I"C sterilisierten Mediums der folgenden Zusammensetzung
gegeben: IYr Glucose, 1% Glycerin, 0,5%
Pepton, 1% Maisquellwasser, 1% Sojabohnenmehl und 0,5% gefälltes CaCO3 (pH 7,0). Dieses Medium wurde
mit Streptomyces tolypophorus ATCC-2J177 geimpft und 48 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung
bei 28° C bebrütet.
1001 eines in einem 200-1-Tank enthaltenen Kulturmediums
aus 3% Glucose, 1% Glycerin, 0,2% Pepton, 1,5% Sojabohnenmehl, 0,05% CaCI2, 0,1%
MgSO4 · 7 H2O, 0,01% FeSO4, 0,01% ZnSO4 und 03%
CaCO3 wurden mit 31 der in den 2-l-Kolben erhaltenen
Kulturbrühe geimpft und 42 Stunden fermentiert, wobei 1001 Luft/Minute zugeführt wurden und mit 200 UpM
gerührt wurde.
Die so erhaltene Kulturbrühe wurde filtriert 85 I des Filtrats wurden mit Äthylacetat auf die in Beispiel 1 beschriebene
Weise extrahiert, wobei 7,5 g rohes Pulver erhalten wurden, das zweimal jeweils mit dem 30fachen
Pulvervolumen an Diäthyläther extnrJiiert wurde. Der
Extrakt wurde eingeengt, der Rückstand in 7,5 ml Äthylacetat gelöst und mit 53 ml η-Hexan versetzt.
Hierbei wurden 2,9 g Pulver erhalten
Eine Lösung von 10 g des Pulvers in 50 m! Äthylacetat-Diäthyläther
(1 :1) wurde an 100 g Aktivkohle Chromatographien. Die Aktivkohlesäule wurde dann
nacheinander mit Diäthyläther, Äthylacetat und Chloroform eluiert B-2847 Y, das hauptsächlich mit der
Äthylacetatfraktion eluiert worden war, wurde unier vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wurde
mit Äthylacetat und Kochsalzlösung extrahiert. Der enthielt, auf 40 g Silicagel gegeben.
Die B-2847 Y-Fraktionen wurden aufgefangen und mit Äthylacetat und Kochsalzlösung extrahiert. Der
Extrakt wurde gut mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingeengt. Das Konzentrat wurde in Äthylacetat
oder einem Gemisch von Äthylacetat und n-Hexan kristallisiert, wobei rohe Kristalle von B-2847 Y erhalten
wurden. Die rohen Kristalle wurden aus Äthylacetat umkristallisiert, wobei 1,2 g gelbe Kristalle erhalten
wurden, die sich bei 120 bis 125° C zersetzten. Die hemmende
Mindestkonzentration der Kristalle gegen Staphylococcus aureus 209 P betrug 0,001 Mikrograrr
τι/ml.
Da eine gewisse Menge B-2847 Y in der mit Chicroform
von Aktivkohle eluierten Fraktion enthalten war, wurde die Fraktion erneut an Aktivkohle und an Silicagel
gereinigt, wobei 340 mg Kristalle von B-2847 Y erhalten
wurden.
1,8 kg nasses Mycel wurden durch Filtration oder Zentrifugieren von 20 1 der gemäB Beispiel 3 erhaltenen
Kulturbrühe abgetrennt. Diese nassen Mycel wurden mit 41 Aceton-Wasser (3:1) gemischt und filtriert,
wobei 3,4 I klares Filtrat erhalten wurden, das unter veimindertem Druck bei einer Temperatur von nicht
mehr als 40°C eingepngt wurde. Das Konzentrat wui'de
mit verdünnter H2SO4 auf pH 3,5 eingestellt und zweimal
mit je 0,8 I Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde getrocknet, unter vermindertem Druck eingeengt
und mit η-He .an oder Diäthyläther-Petroläther (1 :10) gemischt, wobei 250 mg eines rohen Pulvers erhalten
wurden (Reinheit etwa 5 Gew.-%).
Je 500 ml eines in 2-l-Kolben enthaltenen sterilisierten Mediums aus 2°/.· Glucose. J% löslicher Stärke.
1% Sojabohnenmehl, 1% Maisquellwasser. 1% Pepton,
3% NaCl und 0,5% CaCOj (pH 7,0) wurden mit Streptomyces tolypophorus ATCC-21177 geimpft und
24 Stunden in einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtung bei 28"C fermentiert. 3 I der so erhaltenen
vereinigten Kulturbrühe wurden in einen 200-l-Tank überführt, der 1001 eines sterilisierten Mediums enthielt,
das die gleiche Zusammensetzung hatte wie das Medium in den Kolben. Dieses Medium wurde 24 Stunden
bebrütet.
Die Gesamtkultur im 200-l-Tank wurde in einen 2000-l-Tank überführt, der 10001 eines sterilisierten
Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt: 3% Glucose, 0,2% Pepton, 1,5% Sojabohnenmehl. 0,3%
Calciumcarbonat (pH 7,0) und Siliconöl (Schaumverhütungsmitlel).
Das Medium wurde bei 280C 42 Stunden bebrütet, wobei 10001 Luft/Minute zugeführt wurden
und mit 140UpM gerührt wurde.
840 I des Filtrats wurden auf pH 8,0 bis 3,0 eingestellt und mit Vj seines Volumens an Äthylacetat extrahiert.
Die Äinyiacetaitrakiion wurde zweimal mit je der Hälfte ihres Volumens einer 0,1 %igen wäßrigen Ascorbinsäurelösung
gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck unter einer Stickstoffatmosphäre
eingeengt.
Das Konzentrat wurde mit 2 I einer Lösung von Diäthyläther und Petroläther (1 : 10) gemischt, wobei etwa
70g rohes Pulver von B 2847 R (Reinheit 10%) erhalten wurden.
5 g dieses rohen Pulvers wurden in 250 ml Chloroform gelöst. Das unlösliche Material wurde entfernt.
Die Chloroformlösung wurde durch eine Säule von 500 g Silicagel geleitet, das einer Vorbehandlung unterworfen
worden war. bei der es in 1,1 I Aceton, das 1% Oxalsäure und 0,2 I Ascorbinsäure enthielt, suspendiert
und nach Entfernung des Acetons unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet wurde. Die
Säule wurde dann nacheinander mit 21 Diäthyläther 2 I eines Gemisches aus Diäthyläther und I % Oxalsäiin
enthaltendem Äthylacetat (9:1). 21 eines Gemische: aus Diäthyläther und 1% Oxalsäure enthaltenden
-, Älhylacetat (4 : 1). 1 I eines Gemisches aus Diäthyläthei
und 1% Oxalsäure enthaltendem Äthylacetat (1:1) unc 2 I Äthylacetat, das 1% Oxalsäure enthielt, eluiert.
B-2847 R war im Gemisch aus Diäthyläther unc Äthylacetat und im Äthylacetat enthalten. Das ver
in einigte Elui.t wurde sieben- bis achtmal mit einer wäll
rigen Lösung, die 0,1% !-Ascorbinsäure enthielt, unc
mit destillierten Wasser gewaschen, getrocknet unc unter vermindertem Druck in einer Stickstnffatmo
Sphäre eingeengt, wobei etwa 400 mg B-2847 R (Rein
r, heit 80 Gew.-%) erhalten wurden.
800 mg B-2847 R. das auf die in Beispiel 5 angegebene
Weise hergestellt worden war, wurden in 60 ml Acetoi
_'n gelöst, mit etwa 40 ml einer 1—2% !-Ascorbinsäure
enthaltenden wäßrigen Lösung und 60 ml Wasser ge mischt und dann mit 100 ml Benzol (oder 150 ml Di
äthyläther, das kein Peroxyd enthielt) extrahiert. Der Extrakt wurde zweimal mit Wasser gewaschen, mi
r, wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, unter \ermin
dertem Druck in einer Stickstoffatmosphäre eingeengt und d.'..in mit η-Hexan gemischt, wobei etwa 350 mg
rötlich-orangefarbene Kristalle von B-2847 R erhalter wurden, die aus Benzol umkristallisiert wurden, wöbe
in rötlich-orangefarbene Kristalle erhalten wurden. Die
Kristalle wurden mit einer geringen Menge gekühlterr Benzol und η-Hexan gewaschen und unter Kühlung
getrocknet, wobei etwa 200 mg B-2847 R (Reinheit übei 90%) erhalten wurden.
Hier/u 4 Blatt Zeichnungen
Claims (4)
- Patentansprüche:
1. Antibiotikum B-2847 Y der Konstitutionsformel IAcO(DMeMe O13worin Me die Methylgruppe bedeutet,der Summenformel C43H54N2Oi+, dem Infrarot-Spektrum mit folgenden signifikanten Absorptionen bei denWellenzahlen:3490 (M,, 3350(W), 3000 (M), 2940 (M), 2880 (M), 1725 (S), 1708 (S), 1680(S), 1630 (VS), 1605 (VS), 1510(VS), 1440/M), l^'.O(S), 1365 (S), 1330(S), 1300 (M), 1287 (M), 1225 (S), 1235 (S), 1175(VS) 1160(S), U40(Sh\ 1093(VS), 1072 (VS), 1020(W), 1002 (M), 985 (M), 970 (M), 945 (M), 920(M) 908 (M), 887 (M), 823 (M) -m1 (in CHCl3),und der spezifischen Drehung: [a]2,;' = +325 + 30(C= 1,0 EtOH)+ 376 ± 40 (C = 0,5 Me2CO), das als Chinon vorliegt. - 2. Antibiotikum B-2847 R der Formel IlAcOMeO(II)Me31OHworin Me die Mclhyigruppe bi lcutet, eder Summenformel C43H56N3O14, dem Infrarot-Spektrum mit folgenden signifikanten Absorptionen bei den Wellenzahlen:3500 (M), 3400 (W), 3040 (M), 2950 (M), 2910 (Sh), 1715 (S), 1685 (Sh), 1665 (VS), 1645 (S), 1620 (S), 1610 (Sh), 1565 (VS), 1525 (VS), 1455 (VS), 1385 (VS), 1345 (M), 1315 (S), 1250 (VS), 1155 (S), 1093 (S), 1067 (VS), 1002 (M), 973 (S), 951 (M), 915 (M), in 890(M)Cm-I(JnCHCI3),und einer spezifischen Drehung:[λ]£ = +225±20 ^C=I1O EtOH), das als Hydrochinon vorliegt. '"'
- 3. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika B-2847 Y und B-2S47 R der Formeln I und II, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces tolypophorus nov.sp. ATCC-21277 bei Temperaturen von etwa 20 bis 45" C unter aeroben Bedingungen in einem Medium züchtet, das assimilierbaren Kohlenstoff, verwertbaren Stickstoff und andere für das Wachstum des Mikroorganismus erforderliche Nährstoffe enthält und das in der Kulturbrühe und/oder dem Kulturrückstand angereicherte Antibiotikum B-2847 Y und/oder B-2847 R mit einem organischen Lösungsmittel im pH-Bereich von 2 bis 8 extrahiert und auf chromatographischem Weg isoliert, wobei zur Isolierung von B-2847 R die Gegenwart von L-Ascorbinsäure in einer Menge von nicht weniger als 1 Mol pro Mol B-2847 R ist.
- 4. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend Antibiotikum B-2847 Y und/oder B-2847 R als Wirkstoff in Verbindung mit pharmazeutisch unbedenklichen Träger- oder Hilfsstoffen.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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