DE1617796C

DE1617796C - Fermentatives Verfahren zur Herstel lung der Antibiotika N 329A und N 329B Ausscheidung aus 1567095

Info

Publication number: DE1617796C
Application number: DE19641617796
Authority: DE
Inventors: Haruo Ashiya Nishimura (Japan)
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1963-08-03
Filing date: 1964-07-11
Publication date: 1973-05-17

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein fermentatives Verfahren zur Herstellung der Antibiotika N-329A und N-329 B. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces tsusimaensis ATCC Nr. 15 141 in einem wäßrigen Nährmedium züchtet und dann in üblicher Weise aufarbeitet.

Im Laufe der Forschungen auf dem Gebiete der Antibiotika wurde eine Streptomyces-Art gefunden, die in der Sammlung von Shionogi & Co., Ltd., Osaka, Japan, mit N-329 bezeichnet wurde und im American Type Culture Collection unter der laufenden Nummer ATCC Nr. 15 141 hinterlegt wurde und die imstande ist, zwei Antibiotika unter der Bezeichnung N-329 A und N-329 B zu erzeugen.

Die Standard-Art an Streptomyces N-329 wurde in einer Erdprobe gefunden, gesammelt in Tsushima • Island, Nagasaki Pref., Japan, isoliert und zeigt die folgenden krobiologischen Charakteristika.

Morphologische Charakteristika

Die morphologische Eigenschaft dieses Stammes wurde auf einem synthetischen oder organischen Medium, gemäß der Agar-Zylinderkultur-Methode, gemäß N i s h i m u r a und Mitarbeiter, J. Antibiotics (A), Bd. 10, S. 227 (1957), nach 14tägiger Inkubation bei 28° C beobachtet, und die bis ins einzelne gehenden Beobachtungen wurden mit Hilfe eines Elektronenmikroskopes durchgeführt. Die Sporophoren sind gerade bis wellig und verzweigt in Büschel. Die Sporen sind in Form von Ketten ausgebildet. Die Form der Sporen ist ellipsoidal bis zylindrisch, und die Oberfläche ist glatt.

Kultur-Charakteristika

Die Beobachtung würde während einer Htägigen Inkubationszeit bei 28° C durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

	Wachstum	-	Aeriales mycelium	Farbe	•lösliches Pigment
Medium	gut	Sporulation	gelblichweiß	Substratum mycelium	hellgelblich-
Synthetischer		gut, pulvrig	. bis gelblich	hellgelblich-	braun
Agar (Glycerin			grau	braun bis
Czapek's				graugelb
Agar)	mäßig		gelblichgrau	braun	kein
Glucose-		gut		gelblichgrau
Asparagin-
Agar	mäßig		gelblichgrau		kein
Calcium-		mäßig		gelblichgrau
malat-Agar				bis hellgeib-
	gut		gelblichgrau	lichbraun	kein bis Q /"· Vt Wf r% r% V\|
Stärke-Agar		gut, pulvrig		gräulichbraun	braun
	mäßig		gelblichgrau		schwach gelb
Glucose-	(Häutchen)	mäßig		gelblichgrau
Czapek's-
Lösung		-

	Wachstum	Spekulation	Aeriales mycelium	Farbe	lösliches Pigment
Medium	gut	gut, pulvrig	gelblichweiß	Substratum mycelium¹	schwach gelb
Nähragar				schwach gelb	lichbraun
	gut	gut, pulvrig	gelblichgrau	lichbraun	gelblichbrauh
Glücose-				gelblichbraun	(chromogen)
Bouillon-Agar	gut .	mäßig,	gelblichweiß		gelblichbräun.
Glucose-		pulvrig		gelblichbraun	(chromogen)
Pepton-Agar	gut	gut	gelblichgrau		gelbiichbraun
Glucose-Brühe	(Häutchen)			schwach gelb
-				bis schwach
	dürftig	—	■ —	gelblichbraun	— ■ ·
Cellulose-Agar	gut, dick,	gut	gelblichgrau	—	gelblichbraun
Kartoffel	faltig			schwach gelb-	bis bräun
				iichbraun	lichschwarz

Temperaturempfindlichkeit des Wachstums.

gutes Wachstum bei 28°C, günstiges Wachstum bei 37⁰C, kein Wachstum bei 45° C.

Physiologische Charakteristika

Die Beobachtung erfolgte nach Inkubation bei 28° C während 14 Tagen, falls nicht anders angeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt: .

KohlenstofTquelle

Test

Säurebildung aus Glucose-

pepton

(10 Tage Inkubation bei 28° C)

Melanoid-Pigment

Tyrosinase-Reaktion

Stärke-Hydrolyse

Nitrat-Reduktion

Gelatin-Verflüssigung

Milch-Peptonisation

Cellulose-Reaktion

Ergebnis

Negativ

Positiv

Positiv (stark)

Positiv

Negativ

20

Die Verwendung der Kohlenstoffquellen im basalem Medium von P r i d h a m und G ο 111 i e b durch den Organismus nach 14tägiger Inkubation bei 28° C wird in der folgenden Tabelle gezeigt, worin die Zeichen »+« und »++« eine steigende Verwendung anzeigen, und das Zeichen » —« keine Verwendung und das Zeichen »±« eine zweifelhafte Verwendung angeben:

Kohlenstoffquelle

d-Glucose + +

d-Mannose + +

d-Fructose + +

Mannitol + +

Calactose + +

Maltose 4- +

1-Arabinose +

Sucrose +

d-Xylose +

Ergebnis

gutes Wachstum

desgl.

desgl. günstiges Wachstum

desgl.

desgl. ..·;.

35

40

45

10

15

Lactose +

Salicin +

Inositol ±

Rhamnose ±

Rhaffinose ±

Sorbitol -

Inulin —

Dulcitol -

Ergebnis

desgl.

desgl.
schwaches Wachstum

desgl.

desgl.
kein Wachstum

desgl.

Aus den Ergebnissen dieser Beobachtungen können die Charakteristiken von Streptomyces N-329 wie folgt zusammengefaßt werden: Sporophoren sind gerade bis wellig in Büscheln, Oberfläche der Sporen ist milde, und die Sporen sind ellipsoidal bis zylindrisch. Wachstumstypus auf Glucose-Brühe ist vom Häutchentypus. Säureerzeugung aus Glucose ist negativ. Farbe des Aerial Myceliums ist gelblichweiß bis gelblichgrau und das Mycelsubstrat ist schwach gelblichbraun auf synthetischem Medium, Farbe des Aerial Myceliums ist gelblichweiß bis gelblichgrau, das Mycelsubstrat schwach gelblichbraun bis gelblichbraun, und das lösliche Pigment ist gelblichbraun (chromogen) auf organischem Medium. Melanoid-Pigment und Tyrosinase-Reaktion sind positiv. Reduktion auf Nitrat ist positiv.

Unter den vielen Streptomyces-Arten, beschrieben in Bergey's »Manual of Determinative Bacteriology«, Waksman and Lechevalier's »Actinomyces and their Antibiotics«, Waksman's »The Actinomyces« und anderen Literaturangaben, scheint Streptomyces N-329 am meisten durch seine morphologischen Eigenschaften, durch seine Farbe auf aerialem Mycelium auf synthetischem Agar, durch einige biöche^ mische Charakteristiken und Wachstumstypus auf Glucose-Brühe, dem Streptomyces griseus verwandt zu sein. Er unterscheidet sich aber vom Streptomyces griseus im ausbreitbaren 'Pigment auf einer Anzahl von Medien und am Melanoid»)Pigment, wie dies in der folgenden Tabelle gezeigt wird:

, . ; Eigenschaften . ,- . .·■' .	Streptomyces ' ■ , ' N-329 ' '·■/J₁₁	kein '''	S	trdptomyces grise - W-11,8 ;,	US	' H-12 .-,-
Glycerin-Czapek's-Agar, lösliches ^J	schwach gelblichbrauh		';■·'	kein "■'		kein '"■■
Pigment . . ;,; ^: '		kein				■
Glucose-Czapek's-Lösung, lösliches' r ■;, Pigment ':..!.;.	schwach gelblichbraun	kein		kein		kein
Nähragar, lösliches Pigment ·	schwach gelblich ■	kein		kein·		kein
Pepton-Glucose-Agar, lösliches Pigment '■· ,· ·	gelblichbraun	kein		kein		kein
Glucose-Boüillon-Agar, lösliches *Piffmpnt ■' ■'"'■'."**	gelblichbraun	negativ,		kein		kein
*JL ■& »JLwXJL ι** Melanoid-Pigment . ,	positiv	schwach		negativ,		negativ ,
Gelatin-Medium ,	, dunkelbraun	gelblich		schwach		kein .
		braun		gelblich
			braun ■

Dieser Mikroorganismus wurde somit als neue Art befunden und mit dem Namen Streptomyces tsusimaensis ATCC 15 141 bezeichnet.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Antibiotika N-329 A und/oder N-329 B während der Züchtung des Mikroorganis-

mus Streptomyces tsusimaensis ATCC 15141, in einem wäßrigen Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 25 bis etwa 32° C, vorteilhafterweise bei 27 bis 29° C, unter aeroben Bedingungen, erzeugt. Die Zusammensetzung des Nährmediums kann innerhalb eines sehr weiten Bereiches variieren. Erforderlich sind eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Spuren anorganischer Elemente. Kohlenstoffquellen sind Stärke, Glucose, Glycerin, Dextrin, Maltose, Fructose, Sucrose, Lactose und Melassen. Stickstoffquellen für den Fermentationsprozeß sind Fleischextrakte, Pepton, Getreidequellwasser, Soyabohnenmehl, Erdnußmehl, Weizenkleber, Baumwollsamenmehl, Casamino-Säure, das ist das Hydrolyzat von Casein, NZ-Amin, das ist das enzymatische Hydrolyzat von Casein, und Hefeextrakte. Anorganische Elemente sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Kaliumphosphat.

Bei Durchführung der Fermentation in einem verhältnismäßig größeren Maßstab können zweckmäßigerweise Antischaummittel, wie Pflanzenöle, Specköl und Polypropylenglycol zum Fermentationsmedium, vor oder im Laufe der Fermentation, zugefügt werden.

Bei Durchführung der Fermentation unter den genannten Bedingungen werden N-329A und N-329B im Medium angereichert. Die Erträge dieser Antibiotika variieren in Abhängigkeit von den Fermentationsbedingungen, insbesondere von der Fermentationsdauer. Im allgemeinen führt eine kürzere Dauer zu einer höheren Ausbeute des Antibiotikums N-329A, und eine längere Dauer verursacht einen höheren Ertrag an Antibiotikum N-329B. Falls z. B. die Fermentation bei einer Temperatur von 27 bis -29° C durchgeführt wird, erhält man maximale Erträge des N-329A und des N-329B innerhalb von 48 bis 192 Stunden bzw. von 144 bis 312 Stunden. Eine bessere Belüftung führt des weiteren zur Erhöhung des Ertrages an Antibiotikum N-329 B. Im allgemeinen kann die Fermentation innerhalb einer weiten Zeitspanne, d. h. etwa 30 bis etwa 340 Stunden, unter optimalen Temperatur- und Belüftungsbedingungen durchgeführt werden.

Nach erfolgtem Wachstum des Mikroorganismus wird das Mycelium von der Fermentationsbrühe, unter Verwendung von Standardeinrichtungen, wie Filterpressen und Zentrifugen, separiert. Bei dieser Separierung kann ein übliches Filterhilfsmittel, wie Kieselgur der Handelsmarke »Hyflo Super-Cel«, Asbest, aktivierte Kohle und Talk, zur Verwendung kommen. Gewünschtenfalls kann der. pH der^.Fer-.; ■. mentatiohsbrühe auf etwa 7,0 vor der Separierung' eingestellt werden. Der so abgeschiedene Kuchen des Myceliums wird mit dem Filterhilfsmittel, falls ein solches verwendet wird, einem Lösungsmittelextrak- '55 tionsverfahren, zwecks Gewinnung des Antibiotikums, unterworfen. Zum Beispiel wird der Kuchen mit einem Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol, Acethanol, Petroläther, Äther, Benzol, Chloroform, Eisessig und Butylacetat, geschüttelt, und nach Abdampfen des Lösungsmittels aus dem Extrakt ergibt sich ein Gemisch, das die Antibiotika N_r329A und N-329 B enthält. ' ■

Zur Isolierung jedes der Antibiotika N-329A und N-329 B wird das Gemisch einem üblichen Trennungsverfahren, wie Extraktion, Ausfällen, Adsorption oder Umkristallisation oder einer Kombination derselben unterworfen, z. B. kann das Gemisch in Petroläther gelöst und dann konzentriert werden, wobei sich ein kristalliner Niederschlag bildet. Der Niederschlag wird abfiltriert und aus Aceton oder Methanol umkristallisiert und ergibt das Antibiotikum N-329A in Form reiner Kristalle. Das Filtrat wird im weiteren konzentriert, auf Tonerde chromatographiert und mit Petroläther eluiert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels aus dem Eluat wird der Rückstand aus Aceton oder Methanol umkristallisiert und ergibt das Antibiotikum N-329 B als reine Kristalle.

N-329A hat den F. = 148 bis 149,5° C. Die Elementaranalyse ist die folgende:

C 65,65, H 8,85, O 25,48; kein Stickstoff, Schwefel und Halogen. Das Molekulargewicht beträgt 730 bis 740 mit Hilfe der Rast-Methode. Die oben angeführten Analysen entsprechen der Molekularformel C₄₀H₆₄O₁₂ für das Antibiotikum N-329A. Die spezifische Drehung beträgt [a]f + 0,5 ± 2° (C = 1,269% in Chloroform). Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum in 95%igem Äthanol ist durch die Maxima bei 211 bis 213 πΐμ (E{*„ = 6,4), charakterisiert (s. dazu Fig. 1). Das Infrarot-Absorptionsspektrum in einem • Nujol-Mull zeigt die folgenden charakteristischen ν Banden 2921, 1726, 1468, 1425, 1383, 1371, 1360, 1333, 1298, 1265, 1190, 1168, 1152, 1135, 1116, 1095, 1061, 1021, 996, 974, 948, 932, 912, 893, 868, 852, 813, 793, 750, 723, 658 cm"¹ (s. Fig. 2). Das Antibiotikum N-329A weist einen positiven Dragendorf-Test und eine Jodreaktion auf. Ninhydrin-, Biuret-, Molisch-, Indol-, Anthron-, Tollen's-phloroglucin-Sakaguchi und Ferrichlorid-Test sind negativ, und auch ein Säurehydrolysat ergibt einen negativen Ninhydrin-Test.

Das andere Antibiotikum N-329 B hat den F. = 190,5 bis 191°C. Die Elementaranalyse ist die folgende: C 58,48, H 8,22, O 24,77, N 7,66; kein Schwefel und Halogen. Das Molekulargewicht beträgt 764, festgestellt mit Hilfe der Rast-Methode. Die obigen Analysen entsprechen der Molekularformel C₃₆H₆₀O₁₂N₄. Die spezifische Rotation ist [α]? + 36,2 ± 2° (C = 1,015% in Chloroform) und [α]? + 32,2 ± 1,3° (C = 1,539% in Benzol). Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum in η-Hexan zeigt kein Maximum (s. Fig. 3). Das Infrarot-Absorptionsspektrum in einer Kaliumbromid-Tablette weist die folgenden charakteristischen Banden auf: 3300, 2954, 1743, 1652, 1538, 1470, 1375, 1345, 1313, 1302, 1252, 1191, 1147, 1131, 1098, 1027, 1009, 978, 931, 886, 865, 795, 764, 749 cnT¹ (s. dazu Fig. 4). Das Antibiotikum ergibt einen positiven Dragendorf-Test und eine Jodreaktipn, und ein Säurehydrolysat zeigt einen starken positiven Ninhydrin-Test. Biuret-, Molisch-, Indol-, Anthron-, Tollen's-phlorÖglucin-, Sakaguchi- und Ferrichlorid-Reaktionen sind negativ. Es wurde überdies bestätigt, daß das Säurehydrolysat des Antibiotikums N-329 B Valin, a-Oxyisovaleriansäure und Milchsäure, festgestellt mit Hilfe der Papierchromatographie, enthält. ■

;_; Die oben angeführten physikal-chemischen Eigenschaften der Antibiotika N-329A und N-329. B sind sehr dem vormals bekannten Antibiotikum. Nonactin ähnlich (s. dazu Corbaz und Mitarbeiter, HeIv. Chim. Acts, Vol. 38, S. 1445 [1955])'; dieses Antibiotikum wird auch als SQ 15,859 (s. Dutcher, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, S. 173 [1961]), und TA 25M-I (s. Okuda und Mitarbeiter, Studies on macrocyclic polylactone antibiotics) bezeichnet. Auf der 130. Versammlung der Japan

Antibiotic Research Association, gehalten in Tokyo, Japan, am 25. Mai 1962, wurden die Eigenschaften obengenannter Antibiotika und des Valinomycins (s. Brockmann und Mitarbeiter, Chem. Ber.,

Bd. 88, S. 57 [1955]); Ann., Bd. 603, S. 216 [1957], Brown und Mitarbeiter, Antibiotics and Chemotherapy, Bd. 12, S. 482 [1962]) mit Hilfe der folgenden Tabelle verglichen:

	N-329A	Nonactin	5>Q 15,859	TA 25 M-I	N-329B	,Valinomycin	Valinomycin
Eigenschaften		(C ο r b a ζ und	(Dutcner)	(O k u d a und		(Brockmann	(B r ο w η
		Mitarbeiter)		Mitarbeiter)		und Mitarbeiter)	und Mitarbeiter)
Schmelz	148 bis		148 bis		190,5 bis
punkt ...	149,5° C	147 bis	152° C	142 bis	191°C	19O⁰C	186 bis
		148° C		143,5⁰C			186,5° C
Elementar	C 65,65%		C 65,30%		C 58,48%
analyse ..	H 8,85%	C 65,13%	H 8,50%	C 65,18%	H 8,22%	C 58,34%	C 58,12%
	O 25,48%	H 8,81%	O 26,20%	H 9,05%	O 24,77%	H 8,25%	H 7,83%
		O 26,20%		Q	N 7,66%	O 25,92%	O 26,49%
						N 7,48%	N 7,56%
Molekular	730 bis		500 bis		764
gewicht ..	740	719 bis	700	626,85		675, 775,	734
		727				750
Molekular	C₄₀H₆₄O₁₂		C₄₀H₆₄O₁₂		Cs₄H₅₆ _₅₈ O₁₀ZC₃₆H₆₀
formel ...	C₄₀H₆₄O₁₂		O₁₂N₄ZC₃₆H₆C O₁₂N₄ ·	,O₁₂N₄Z

Spezifische Rotation	[α]? + 0,5° (±2°) .	Nonactin	[α]? (±2°)	SQ 15,859		Valino	[α]? +31,3^C (C =1,57% in Benzol)
N-329A	(C = 1,269% in CHCl₃)-		(C =.1,2% in CHCl₃)	-	[α]? + 31,0° (C = 1,6% in Benzol)	mycin Brown
Spezifische Rotation	[α] i^s + 0,5° (C = 7% in Dioxan)	N-329B	[α]?+ 32,20 (±1,3°) (C = 1,5% in Benzol)	Valino
TA 25 M-I				mycin Brock
				mann

N-329A	Nonactin (C ο r b a ζ und Mitarbeiter)	SQ 15,859 Du tcher	TA 25 M-I (O k u d a und Mitarbeiter)	N-329B	Valinomycin (Brockmann und Mitarbeiter)	Valinomycin (Brown und Mitarbeiter)
Ultrayiolett-Äbsorptions- Spektrum Zusammensetzung des Säurehydrolysats: Valin	211 bis 213 ηΐμ 264 άμ	keine , Bänder	End-Ab- sorptioh	keine Absorption	281 ήΐμ 4 Mol 2 Mol ■	keine . Absorption
α-Oxyisovaleriänsäure Milchsäure

Bemerkung: Die Angaben sind den Referenzen jedes Autors entnommen.

Im Hinblick auf die obengenannten Ähnlichkeiten wurden die wirklichen. Vergleichsteste der Antibiotika N-329A und N-329B mit den authentischen Proben der obengenannten bekannten Antibiotika, geliefert durch 'jeden Autor,-, durchgeführt, und zwar Mm

Schmelzpunkt, in der Elenientaranalyse,. im MoIekulargewicht, in der spezifischen Rotation, im Ültr^r" violett-Absorptionsspektrum⁴' und/oder Infrarot-Absorptionsspektrum, und es wurde· bestätigt, daß die physikalisch-chemischen Eigenschaftenrder Antibio-

209544/458

tika N-329A und N-329B im wesentlichen identisch mit jenen von Nonactin (SQ 15,859, TA 25 M-I) bzw. mit Valinomycin sind.

Bisher war bekannt, daß Nonactin besonders inaktiv gegenüber chemischen Verbindungen und Mikroorganismen ist. Es war auch bekannt, daß Valinomycin aktiv in vitro gegenüber Mycobacterium tuberculosis ist, wegen ihrer relativ hohen Toxizität aber in der Praxis nicht angewandt wurde. Es wurde nun jetzt unerwarteterweise gefunden, daß die Antibiotika N-329A und N-329B und auch die genannten bekannten Antibiotika, die im wesentlichen dieselben physikalisch-chemischen Eigenschaften wie jedes einzelne

der ersteren besitzen, charakteristische hochaktive pilztötende Wirksamkeit gegenüber Piricularia oryzae und/oder einigen anderen phytopathogenen Pilzen aufweisen.

Zwecks Bestimmung der minimalen Inhibitions-Konzentrationen der Antibiotika N-329 A und N-329 B gegenüber verschiedenen Mikroorganismen, einschließlich Bakterien, Pilze und Hefen und zwecks direktem Vergleich mit jenen von Nonactin, SQ 15,859, TA 25 M-I und zwei Proben von Valinomycin, wurden diese Antibiotika, unter Verwendung ihrer Acetonlösungen, geprüft. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengestellt:

Test-Organismus Minimale Inhibitionskonzentration in mcg/ml

N-329A

Nonactin

(C ο r b a z

und Mitarbeiter

SQ 15,859 (D u t c h e r)

TA 25 N-I

(Ok u da

und Mitarbeiter)

9. 10. 11. 12. 13, 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29-

Shigelladysenteriae

Shigella paradysenteriae, Ohara

Salmonella typhosa

Salmonella paratyphi A

Escherichia coli

Pseudomonas aeruginosa

Klebsiella pneumoniae

Bacillus subtilis

Bacillus anthracis

Staphylococcus aureus, 209 P

Diplococcus pneumoniae, Typus I Diplococcus pneumoniae, V-Typus Diplococcus pneumoniae, Typus II... Diplococcus pneumoniae, Typus III..

Streptococcus hemolyticus, D

Streptococcus hemolyticus, H

Corynebacterium diphteriae, Tront...

Corynebacterium diphteriae, HA

Mycobacterium tuberculosis, H 37 RV

Mycobacterium avium .........

Mycobacterium 607

Mycobacterium smegmatis

Mycdbaterium phlei

Piricularia oryzae

Heiminthosporium sigmoideum..

Sclerbtiana libertiänä ;.........

Ophiobolus graminis

Fusarium oxysporiüm :....:....

Cochlibboliis riliyabiänus

Phytdphthbrä iöfestaris ... ......

Altanaria kikuchiana...: ,

EpideTmbphyton ferrügineum

Triciibpliytori rubfürn Täkaise

TnchSphytön iriterdigitale ;:...:...:, Trichbphytbri pedis Tricridphytbn m'eritagrbphytis ;:

iiäriöpsis brevicäülis. ftchiä ierrheni Pichia larinbsie'

> 100,0

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> iöb',0

> itiöö

Fortsetzung

Test-Organismus Minimale Inhibitionskonzentration in mcg/ml

N-329A

Nonactin

(C ο r b a ζ

und Mitarbeiter)

SQ 15,859 (D u t c h e r)

TA 25 N-I

(Okuda

und Mitarbeiter)

40. Rhodotorula minuta

41. Torulopsis gropengieperi ..

42. Debaryomyces subglobosus

43. Aspergillus niger ..

44. Candida albicans, M-8 ....

45. Saccharomyces exiguus

46. Cryptococcus difiuluens ...

> 100,0

> ίοο,ο

> 100,0

Test-Organismus Minimale I nhibitionskonzentration in mcg/ml

N-329 B

Valinomycin (Brock mann)

Valinomycin (Brown)

1. Shigella dysenteriae

2. Shigella paradysenteriae, Ohara

3. Salmonella typhosa

4. Salmonella paratyphi A

5. Escherichia coli

6. Pseudomonas aerugimosa

7. Klebsieila pneumoniae

8. Bacillus subtilis

9. Bacillus anthracis

10. Staphylococcus aureus, 209 P

11. Diplococcus pneumoniae, Typus I

12. Diplococcus pneumoniae, V-Typus I .

13. Diplococcus pneumoniae, Typus II...

14. Diplococcus pneumoniae, Typus IH ..

15. Streptococcus hemolyticus, D

16. Streptococcus hemolyticus, H

17. Corynebacterium diphteriae, Tront...

18. Corynebacterium diphteriae, HA

19. Mycobacterium tuberculosis, H 37RV

20. Mycobacterium avium

21. Mycobacterium 607

22. Mycobacterium smegmaüs

23. Mycobacterium phlei :

24. Piriculäria bryzae.

25. Helmirithospörium sigmöideum. .

26. Sclerötiäne libertiana..:.......;....

27. Öphibboius graminis..;..;.....;...

28. Füsariüm öxyspbrium'.:......:.....

29. CochliöDoiüs rtuyäbiänus ..:..:..:..

30. Phytbjjhiiiörä infestans: :.::...

31. Ältanäria kikuchiana;..;.:..:.....; 32: JEpidenribphyibn ferrügineum :...:.':

33. Trichöphyton rubrurn, Takäse;...;..

34. TrichöpHyton interdigitalie.;.:..:::.

35. Tricnöpnyton pedis ;.;.::..:::.:... 3fj; Trichöphyton mentägropnytis ....;:. 37. Scopüläriopsis brevicaulis..;..:.....

> 100,0

5,0

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>ιοο,ό

> 100,0

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> 100,0

>ioö,ö >ibb,o

Fortsetzung

14

Test-Organismus

Minimale Inhibitionskonzentration in mcg/ml

N-329 B Valinomycin
(B rock mann)

Valinomycin
(Brown)

38. Pichia fermentans

39. Pichia farinose

40. Rhodotorula minuta

41. Torulopsis gropengieperi .

42. Debarymyces subglobosus

43. Aspergillus niger

44. Candida albicans, M-8 ...

45. Saccharomyces exiguus ...

46. Cryptococcus diffuluens ..

> 100,0

Bemerkung

Kulturmedium: 1 bis 10 Rindsextrakt; 11 bis 18,

Rindsextrakt + 10% Kaninchenblut; 19,

Kirchner + 10% Menschenplasma; 20 bis 23,

Rindsextrakt + Glycerin; 24 bis 31, Kartoffel-Glucose; 32 bis 46, Sabouraud + Hefeextrakt.

Testmethode: 1 bis 18 und 20 bis 46, Agar-Streich-Verdünnungsmethode; 19, Unterflächenkultur.

Endpunkt beobachtet: 1 bis 18, kein Wachstum nach 24 Stunden bei 37°C; 19, kein Wachstum nach 3 Wochen bei 37°C; 20 bis 23, kein Wachstum nach 48 Stunden bei 37° C; 24 bis 31, kein Wachstum nach 10 Tagen bei 28⁰C; 32 bis 44, kein Wachstum nach 7 Tagen bei 28° C; 45 bis 46, kein Wachstum nach 2 Tagen bei 28° C.

Aus den vorangehenden Tabellen ist ersichtlich, daß die Antibiotika N-329 A, Nonactin, SQ 15,859 und Ta 25 M-I in ihrer Wirkung ziemlich spezifisch sind. Das heißt, daß Piricularia oryzae inhibitiert wird, obgleich die anderen Organismen überhaupt nicht berührt werden. Die minimale Inhibitionskonzentrationen dieser vier Antibiotika gegenüber den genannten phytopathogenen Pilzen sind von derselben Größenordnung, wobei keine quantitative Differenz beobachtet wurde. Die obigen Tabellen zeigen auch, daß sowohl die Antibiotika N-329 B und Valinomycin ziemlich spezifisch in ihrer Wirksamkeit sind. So wird z. B. Piricularia oryzae stark inhibitiert, sowie auch Mycobacterium tuberculosis, H 37RV, und diese Antibiotika sind auch wirksam gegen einige phytopathogene Pilze, wie Helminthosporium sigmoideum und Ophiobolus graminis und einige gram-positive Bakterien, wie Diplococcus pneumoniae, Streptococcus hemolyticus und Corynebacterium diphteriae.

Zwecks Testierung der fungicidalen Wirksamkeit der Antibiotika N-329A und N-329 B wurden sogenannte Kontakt-Test-Techniken durchgeführt, unter Verwendung einer Sporensuspension von Piricularia oryzaa.. Diese Sporensuspension wurde aus einer 14tägigen Kulturbrühe von Kartoffel-Glucose schräg im Reagenzglas angelegte Agrarkulturen geerntet und mit 10 ml sterilem Wasser suspendiert. Da die Antibiotika in Wasser unlöslich sind, wurde eine wäßrige Suspension der Antibiotika hergestellt und dann zur gewünschten Konzentration mit sterilem destilliertem Wasser verdünnt. Im Kontakttest mit der Sporensuspension von Piricularia oryzae wird ein Gemisch von 8 ml der Antibiotika, in Konzentrationen von 1 bis 100 meg pro Milliliter und 0,3 ml der Sporensuspension bei Zimmertemperatur, das ist bei etwa 23° C, während etwa 4, 8 und 24 Stunden stehengelassen. Jede dieser Proben wurde zentrifugiert, und die Sporen wurden 2mal mit sterilem Salzwasser gewaschen. Die. gewäschenen Sporen wurden dann auf der Oberfläche der Kartoffel-Glucose-Agarkultür geimpft und bei 28° C während 14 Tagen bebrütet.. Nach Impfung wird diese schräg im Reagenzglas angelegte Agarkultur auf Gegenwart einer Vermehrung geprüft und mit Vergleichskulturen, die unter identischen Bedingungen bebrütet wurden, verglichen. Die niedrigste Konzentration der das Wachstum der schräg im Reagenzglas angelegten Agarkultur verbindernde Antibiotika wurde als fungicide Konzentration der Antibiotika betrachtet. Die Ergebnisse dieser Studien sind in der folgenden Tabelle angeführt, worin die Zeichen » + « und »—« das Wachstum bzw. kein Wachstum anzeigen:

40 Antibiotika	Konzen tration in mcg/ml	Ergebnis entnommei 4	.se der Sub j in Stunde 8	culturen, nabständen 24
N-329 A 45	100 50 10 1			:
N-329 B 50. . .	. 100 · .50 . 10 . . . 1 .	+ ■ -··	—	—
Kein (Vergleich)	■■ + -^;	• + "	■ ^

Wie aus der oben angeführten Tabelle zu ersehen ist, sind beide Antibiotika gegenüber Piricularia oryzae fungicid, wobei das Antibiotikum N-329 B eine stärkere fungicide Wirksamkeit gegenüber dem Organismus als das Antibiotikum N-329 A aufweist. , Wegen ihrer fungicidalen Wirksamkeit in vitro gegenüber Piricularia oryzae wurde ein sogenannter Topftest im Treibhaus durchgeführt, wobei experimentale Infektionen auf. Blatttriebe in Reispflanz-Setzlingen aufgetragen wurden. Die Setzlinge Aichiasahi wurden in Töpfe von etwa' 100 mm Durchmesser bebrütet. Die Blatttriebe der Reispflanz-Setzlinge wurden dann mit einer Sporensuspension von

Piricularia oryzae, KU, durch Besprühen der Oberflächen der Blätter infiziert. 1 Tag nach der Infektion erfolgte nur eine Behandlung durch Besprühen mit den Antibiotika, welche mit Natriumcarboxymethyl-Cellulose suspendiert waren; beim Besprühen wurden 20 ml der Antibiotikum-Suspensionen in jeden Topf verwendet. Die Wirksamkeit der Antibiotika wurde durch den Grad (Typus) der Symptome der infizierten Triebe am 10. Tag nach der Infektion beurteilt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Konzentration	Symptome der infizierten Blätter am 10. Tag nach der Infektion	N-329 B
in mcg/ml	N-329A	Fleckentypus
100,0	Fleckentypus	(bräunlicher
	(bräunlicher	Flecken:
	Flecken:	Blatt, grün)
	Blatt, grün)	Fleckentypus
50,0	Fleckentypus	(bräunlicher
	(bräunlicher	Flecken:
	Flecken:	Blatt, grün)
	Blatt, grün)	Diffuser Typus
25,0	Diffuser Typus	(Blatt, gelb
	(Blatt gelb	lich)
	lich)	Diffuser Typus
12,5	Diffuser Typus	(Blatt, gelb
	(Blatt, gelb	lich)
	lich)	Diffuser Typus
0	Diffuser Typus	(Blatt, gelb
(Vergleich)	(Blatt, gelb	lich)
	lich)

20

35

Aus den in obiger Tabelle angeführten Angaben ergibt sich, daß beide Antibiotika, d. h. das N-329 A und das N-329 B, wirksam gegenüber Infektionen von Piricularia oryzae in Blatttrieben auf Reispflanzen-Setzlingen sind und daß die Schutzwirkung beider Antibiotika eine sehr ähnliche Wirksamkeit aufweist.

Wie oben ersichtlich, weisen die Antibiotika N-329 A und N-329 B fungistatische und fungicidale Wirksamkeiten gegenüber Piricularia oryzae und einige andere phytopathogene Pilze, wie Helminthosporium sigmoi-Jeum und Pphiobolus graminis auf. Demgemäß sind sie für die Therapie und die Prophylaktik von Pflanzenkxankheiten, verursacht durch die genannten phytopathogenen Pilze, insbesondere Reisbrand, nützlich. Anders dargelegt sind diese Antibiotika als aktive Bestandteile in keimtötenden Mittel zum landwirtschaftlichen Gebrauch nützlich.

Eine bevorzugte Ausführungsform des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens ist durch das folgende Beispiel veranschaulicht.

Beispiel

IO Ein wäßriges Nährmedium wird aus den folgenden Materialien hergestellt: g/\

Getreidestärke 10,0

Sojabohnenmehl 10,0

Glycerin 5,0

Getreidequellwasser 5,0

Calciumcarbonat 3,5

Natriumchlorid 3,0

Das pH wird auf etwa 7,0 eingestellt. Nach Sterilisierung mit Dampf bei 120⁰C während 20 Minuten wird das Medium mit Streptomyces tsusimaensis HTCl 15 141 geimpft und unter Rühren und Belüftung während einer Zeitspanne von 144 bis 192 Stunden, bei einer Temperatur von 27 bis 29°C, kultiviert.

Die Fermentationsbrühe wird dann mit Kieselgur der Handelsmarke »Hyflo-Super-Cel«, und zwar mit einer Menge von 10 g pro Liter der Fermentationsbrühe, vermengt, mit 10%iger Chlorwasserstoffsäure auf etwa pH 7,0 eingestellt, während 30 Minuten gerührt und durch Saugen filtriert. Der gesammelte Kuchen des Mycels und des Kieseigurs wird mit Wasser gewaschen und 3mal mit etwa Y₄. Volumen Aceton geschüttelt. Die Acetonextrakte werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und dann mit Petroläther geschüttelt. Der Petrolätherextrakt wird zur Abscheidung einer kristallinen Substanz konzentriert. Die kristalline Substanz wird filtriert und aus Aceton umkristallisiert, wobei das Antibiotikum N-329 A, in Kristallen mit F. = 148 bis 149,5° C, erhalten wird. Das Filtrat, aus welchem das Antibiotikum N-329 A separiert wurde, wird zwecks Entfernung des Lösungsmittels abgedampft. Die erhaltene ölige Substanz wird durch eine mit Tonerde gefüllte Kolonne, die mit Petroläther vorbehandelt wurde, durchgesetzt und die Kolonne dann mit Petroläther entwickelt. Jedes der eluierten Fraktionen mit Petroläther wird einem Test zur Bestimmung der Antibiotikum-Wirksamkeit mit HiUe der Papierscheiben- oder Schalenmethode, unter Verwendung von Corynebacterium diphtheriae, unterworfen (s. E d w i η und Mitarbeiter, J. Bacteriology, Bd. 50, S. 459 [1945]; N i s h i m u r a und Mitarbeiter, Annual Report of Shionogi Research Laboratory, Nr. 11, S. 145 [1961]). Die Fraktionen, die die antibiotische Wirksamkeit zeigen, werden vereinigt, unter reduziertem Druck konzentriert und bei Zimmertemperatur zwecks Abscheidung einer kristallinen Substanz stehengelassen. Die kristalline Substanz wird filtriert und aus Aceton umkristallisiert und liefert das Antibiotikum N-329 B in Form von Kristallen mit F. = 190,5 bis 191⁰C

Aus 501 des Nährmedium erhält man 2 bis 3 g an Antibiotikum N-329A und 0,2 bis 0,3 g des Antibiotikums N-329 B.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen 209544/458

Claims

Patentanspruch:

Fermentatiyes Verfahren zur . Herstellung der Antibiotika N-329 A und N-329 B, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces tsusimaensis ATCC Nr. 15 141 in einem wäßrigen Nährmedium züchtet und dann in üblicher Weise aufarbeitet.

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