DE1617890A1 - Neues Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHON WALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL.-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR -ING. KLOPSCH KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 22. Oktober I969 Fu/st.-

Takeda Chemical Industries Ltd.,

27* Doshomachi 2-ohomej Higashi-ku, Osaka (Japan)

Neues Antibiotikum und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung bezieht sioh auf ein neues, als "Lateriomyoin p" bezeichnetes Antibiotikum und auf ein Verfahren zu seiner Herstellung durch Züchtung von Mikroorganismen.

Der Erfindung liegen die folgenden Peststellungen zugrunde:

1. Streptomyces griseoruber Nr. 71o7Q, ein Stamm, der von den Erfindern aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die in Aqua Bianca, Mexiko, entnommen wurde, vermag das neue Antibiotikum zu bilden.

2. Das Antibiotikum wird angereichert, wenn der Mikro-Organismus in einem Nährmedium gezüchtet wird.

3* Das angereicherte Antibiotikum kann in der gewünschten Reinheit aus der Kulturlösung unter Ausnutzung der physikalisch-chemischen Eigenschaften des Antibiotikums isoliert werden.

4. Das Antibiotikum ist sehr wirksam gegen grampositive Bakterien.

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Nach dem Verfahren gemäß der Erfindung werden Mikroorganismen verwendet, die zur Gattung Streptomyces griseoruber gehören und Lateriomycin P zu bilden vermögen. Zu diesen Mikroorganismen gehören beispielsweise a) der vorstehend genannte Stamm Streptomyces griseoruber Nr. TIoTo und b) Mutanten und Varianten dieses Stammes.

Streptomyces griseoruber Nr. JIoJo hat die nachstehend genannten morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften. Hierbei basieren die mit "Rdg" gekennzeichneten Parbbezeichnungen auf "Ridgway's Colour Standards and Nomenclature".

a) Morphologische Eigenschaften

Das Luftmycel entwickelt sich gut auf Glueose-Asparaginagar. Seine Farbe ist zunächst weiß und geht dann in Pale Vinaceous Pink oder Pale Mouse Gray über. Die Sporophoren bilden Schleifen oder Spiralen. Die Sporen sind elliptisch oder oval, o,5 - o,8 u χ l,o - 1,3 V, und glatt an der Oberfläche.

b) Merkmale der Kulturen 2o Czapek-Agar;

Vegetatives Mycel (nachstehend als VM bezeichnen): reichlich, faltig, farblos, später Congo Pink (Rdg. XXVIII 7"-b).

Luftmycel (nachstehend als LM bezeichnet): 25 samtartig, kreideweiß, später Pallid Mouse Gray (Rdg. LI, 15""'-f).

χ Lösliches Pigment (nachstehend als LP bezeichnet): Light Pinkish Cinnamon (Rdg. XXIX, 15^lf-d).

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Glycerin-Czapek-agar ϊ

VM: mäßig, Pale. Vinaeeous-Drab (Rdg. XLV, 5""-d) bis Dark Vinaceous-Drab (Rdg. XLV, 5""-i).

LM: dünn, Pallid Purple-Drab (Rdg. XLV, l""-f) bis Pale Quaker Drab (Rdg. LI, l"'"-d).

LP: schwach-braun. Glueose-Czapek-agar:

VM: reichlich, faltig, Light Vinaceous-Cinnamon (Rdg. XXIX, 13"-d) bis Fawn Color (Rdg. XL, Γ5"') LM: dünn, Pallid Vinaceous-Drab (Rdg. XLV, 5""-f) LP: schwach-braun odr nicht vorhanden.

Qluoose-Asparagen-agar:

VM: reichlich, Buff-Pink (Rdg. XXVIII, ll"-d) bis Pale Congo Pink (Rdg. XXVIII, 7"-f).

LM: samtartig, Pale Vinaceous-Plnk (Rdg. XXVIII, 9"-f) bis Pale Mouse dray (Rdg. LI,'15^flln-d).

LP: Salmon-Buff (Rdg. XIV, ll"-d). Nähragar:

VM: mäßig, farblos, später dunkelbraun.

LM: wenig, pulverförmig, weiß bis Pale Mouse Gray. LP: dunkelbraun.

NährbrUhe:

VM: mäßig, schwach brauner Film ohne Sediment. LM: weiß bis Pallid Mouse Gray. LP: schwärzlich braun.

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Glucose-Nährbrühe: " .

Past wie bei der Nährbrühe, jedoch reichlicheres und flechtenartiges Wachstum.

Gluoose-Nähragar;

VM: reichlich, faltig, dunkelbraun.

LM: dünn, kreideweiß bis Pallid Quaker Drab (Rdg. LI, l""'-f).

LP: dunkelbraun. Glycerin-Nähragar:

VM: reichlich, faltig, dunkelbraun. LM: wenig, kreideweiß. LP: dunkelbraun.

Qlycerin-Nährbrühe: fast wie auf Glucose-Nährbrtthe. Stärkeagar:

VM: reichlich, Pallid Vinaceous Drab (Rdg. XLV,

5""-f) bis Vinaceous-Lavender (Rdg. XLIV, 65ⁱⁿ-f).

LM: reichlich, samtartig, weiß bis Vinaceous-Lavender.

LP: Pale PErs^ian Lilac (Rdg. XXXVIII, 69"-f) oder 2o * nicht vorhanden.

Eimedium (37°C)

VM: reichlich, sich ausbreitend, bräunlich-schwarz. LM: wenig, weiß bis Pale Quaker Drab. LP: Farbe des Mediums wird milchig weiß.

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Hefeextrakt-agar:

VM: reichlich, faltig, Buff-Pink (Rdg. XXVIII, ll"-d) bis braun.

LM: reichlich, samtartig, kreideweiß bis Pallid 5 Mouse Gray .

LP: Army Brown (Rdg. XL, 13"'-i). Kartoffelbrei:

VM: reichlich, faltig, Pale Purple-Drab (Rdg. XLV, l""-d) bis Pale Quaker Drab.

. LM: wenig, Mouse Gray.
LP: dunkelbraun.

Milch (37°C)i cremefarbene, ringförmige, schwache Pqfconisierung ohne Koagulierung.

Nährgelatine (25°C):

VM: wenig, flechtenartig, dunkelbraun.

LM: wenig, weiß bis Mouse Gray, Verflüssigung langsam.

Nitratreduktion in Czapek-Lösung: keine Reduktion. Cellulose: kein Wachstum.

2o Hydrolyse auf Stärkeagar: Hydrolyse, Wachstumszone/enzymatische Zone = 11-15 mm/15-17 nun·

Pepton-Agar:

VM: dünn, sich ausbreitend, dunkelbraun, LM: dünn, pulverförmig, weiß bis Mouse Gray

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LP: dunkelbraun Calciummaleat-Agar:

VM: reichlich, Pale Salmon Color (Rdg. XIV, 9¹-f) bis Plesh Color (Rdg. XIV, 7'-d).

LM: reichlich, samtartig, weiß bis Mouse Gray.

LP: nicht vorhanden oder Light Pinkish Cinnamon (Rdg. XXIX, 15"-d).

Möhrenbrei:

VM: reichlich, faltig.

LM: wenig, weiß bis Orient Pink (Rdg. II, 9-f)

bis Light Mouse Gray.

LP: schwach braun. Tyrosin-Agar:

VM: dünn, farblos bis Ivory Yellow (Rdg. XXX, 2l"-f).

LM: nicht vorhanden. LP: nicht vorhanden.

Auf synthetischen Medien entwickelt sich das vegetative Mycel dieses Stammes gut. Es ist zunächst farblos, färbt sich jedoch blaß-orange oder blaß-rosa und bildet ein blaßgelblichbraunes oder blaß-rosa lösliches Pigment. Auf einen proteinhaltigen Nährboden ist die Farbe des vegetativen Mycels blaßbraun oder dunkelbraun, während ein weißes oder Pallid Mouse Gray Luftmycel gebildet wird. Das lösliche Pigment ist braun oder schwärzlich braun. Nach den vorstehend genannten Eigenschaften gehört dieser Stamm zum chromogenen Typ.

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-	D-Maltose	XKX
X	Saccharose	XXX
XXX	Lactose	XXX
XXX	Raffinose	XXX
X	. Trehalose	XXX
XX	Salicin	-
XXX	Inulin	XXX
XKX	Cellobiose	XXX
XXX	Glycerin	XKX
XXX	Natriumaoetat	X
XXX	Natriumsuccinat	XX
XXX	Natriumeitrat	X
	Kontrolle

c) Ausnutzung der Kohlenstoffquellen, ermittelt nach der Pridham-Methode.

Kohlenstoffquelie Wachstum Kohlenstoffquelle Wachstum

Erythrit 5 D-Sorbit i-Inosit D-Mannit Dulcit

D-Ribose Io D-Xylose L-Arabinose D-Galactose D-Glucose

D-Eructose 15 L-Rhamnose

Zeichenerklärung: xxx = sehr gutes Wachstum;

KX « gutes Wachstum;

χ a mäßiges Wachstum;

2o X= schwaches Wachstum;

= kein Wachstum. *

Ein Vergleich der vorstehend beschriebenen mikrobischen Eigenschaften mit der Beschreibung in "The Actinomycetes", Band II, von ,S.A, Waksman, herausgegeben von The Williams and Wilkins Company 1961, zeigt, daß der für die Zwecke der Erfindung geeignete Stamm ähnliche KiJfcureigenschaften hat wie Streptomyces fervens De Boer et al., Streptomyces purpurasoens Lindenbein und Streptomyces griseeruber Yamaguchi & Saburi. In den morpholigisehen Eigenschaften zeigt der Stamm jedoch gewisse Unterschiede gegenüber Streptomyces fervens De Boer et all und Streptomyces purpurascens Lindenbein. Streptomyces fervens De Boer et al. bildet nämlich monovertizillate oder bivertizillate Verzweigungen, und die Sporen von Streptomyces purpurascens

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Lindenbein sind an der Oberfläche spinös. Im Gegensatz '■ hierzu bildet der erfindungsgemäß verwendete Stamm diese Verzweigung nicht, und seine Sporen sind an der Oberfläche glatt. Dagegen scheinen die morphologischen Eigenschaften von Streptomyces griseoruber Yamaguchi & Saburi mit denen des erfindungsgemäß verwendeten Stammes übereinzustimmen. Der erfindungsgemäß verwendete Stamm wurde somit von den Erfindern als Stamm von Streptomyces griseoruber eingestuft und als Streptomyces griseoruber

IQ Nr. 71070 bezeichnet.

Eine Probe von Streptomyces griseoruber Nr. 71070 wurde bei der American Type Culture Collection, Maryland, USA, unter der Nr. ATCC 17919 hinterlegt.

Das nach der Strichmethode ermittelte antibakterielle' Spektrum von Streptomyces griseoruber Nr. 7IO7O auf Bouillon-Agar und Glycerin-Bouillon-Agar 1st in Tabelle 1 genannt. Streptomyces griseoruber Nr. 7IO7O wurde strichförmig auf Agarplatten geimpft und 4 Tage bei 28°C bebrütet. Die Platten wurden dann senkrecht zum Strich ebenfalls strichförmig mit Testorganismen beimpft, die in Tabelle 1 genannt sind, worauf die Bebrütung bei 37°C 20 Stunden für grampositive und gramnegative Bakterien und 40 Stunden für säurefeste Bakterien fortgesetzt wurde. Abschließend wurde die Länge der Hemmzone für jeden Testorganismus gemessen.

Tabelle 1

Antlbiotisebea Spektrum von Streptomyces griseoruber Nr. 7107Q nacii der Strichmethode.

Hammzone (mm)

Bouillon-Agar Glyoeriü-Bouillon-Aggr *

30 Escheriehia coil 332 2

_ Proteus vulg&TTi.s 0 0 7 6

k Staphylococcus aureus 15 13 6 7

0 qh a ^i /1 η

a ^i /1 η 9 8

BAD ORIGINAL

Bacillus subtilis	14	15	8	8
Bacillus cereus	11	11	O	O
Bacillus brevis	13	13	O	O
Sarcina lutea	17	18	7	6
Micrococous flavus	14	15	7	7
Aerobacter aerogenes	0	0	O	0
Pseudomonas aeruginosa	0	Q	3	3
Myeobacterium avium			O	O
Mycobacterium smegmatis			O	0
Myeobacterium phlei			O	O

Aus Tabelle 1 ist ersichtlich« daß Streptomyces griseoruber Nr. 7IO7O eine antibiotische Substanz bildet, die hauptsächlich gegen grampositive Bakterien wirksam ist.

Die mikrobischen Eigenschaften von Aetinomoetes, insbesondere der Gattung Streptomyces, liegen nicht allgemein fest, und dies gilt auch für die Eigenschaften von Streptomyoes griseoruber Nr. 71070, Es gibt somit viele natürliche oder induzierte Mutanten und Varianten von Streptomyces griseoruber Nr. 71070. Von den Mutanten und Varianten von Streptomyces griseoruber Nr. 7IO7O können ohne Rücksicht darauf, ob die Variation oder Mutation natürlich oder künstlich beispielsweise durch Behandlung mit Röntgenstrahlen, Ultraviolettlicht oder durch Einwirkung chemischer Reagentien hervorgebracht wurde, alle diejenigen, die Lateriomycin P bilden, für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird ein Stamm, der Lateriomycin P bildet und zur Gattung Streptomyces griseoruber gehört, Jaa einem Kulturmedium gezüchtet, das assimilierbare Kohlenstoffquellen, verwertbare Stickstoff quellen und andere notwendige Nährstoffe enthält. Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Stärke, Glucose, Lactose, Maltose, Galactose, Saccharose, Dextrin, Glycerin ader Hirsebrei»

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- ίο -

Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise Pepton, Sojabohnenmehl, Haisquellwasser, Fleischextrakt, Ammoniumsalze, Nitrate oder andere organische oder anorganische stickstoffhaltige Materialien. Ferner kann eine geringe Menge anorganischer Salze, wie Natriumchlorid, Phosphate, Salze von Metallen, wie Calcium, Zink, Mangan und Eisen, dem Medium zugesetzt werden. Falls erforderlich, können Übliche Nährelemente oder ein Antischaummittel, z. B. tierisches Ul oder Wachs, pflanzliches öl oder Mineralöl,

10 zugesetzt werden.

Es ist besonders zweckmäßig, wenn das Kulturmedium ein Eisensalz einer anorganischen Säure, z. B. ein Elsen-(H)-SaIz (z. B. Eisen(II)-sulfat, Eisen(II)-chlorid) oder ein Eisen(III)-salz (z. B. Eisen(III)-sulfat,

15 Eisen(III)-Chlorid), in einer verhältnismäßig hohen

Konzentration enthält, da im Vergleich zu einem üblichen Kulturmedium, d. h. einem Medium, das dieses Eisensalz nicht oder in einer Menge von weniger als 0,001 # (Gew./ Vol.) enthält, eine erheblich gesteigerte Menge Lateriomycin F in der Kulturbrühe angereichert wird, wenn ein Lateriomycin F bildender, zu Streptomyces griseoruber gehörender Stamm in einem solchen Medium gezüchtet wird, wie sich deutlich aus den nachstehend beschriebenen Versuchen und Beispielen ergibt. Die optimale Kponzentration des Eisensalzes im Kulturmedium vom Standpunkt der im Kulturmedium anzureichernden Menge des gewünschten Lateriomycins F beträgt etwa 0,03 »is etwa 0,1 % (Gew./ Vol.). Am zweckmäßigsten enthält, das Kulturmedium etwa 0,001 bis etwa 0,05 % (Gew./Vol.) Calciumchlorid, Zink-Chlorid oder Kupfer(II)-sulfat sowie das genannte anorganische Eisensalz, weil im Vergleich zu einem Kulturmedium, das nur das genannte Eisensalz enthält, eine größere Menge Lateriomycin F im Kulturmedium gebildet wird, wenn ein zu Streptomyces griseoruber gehörender Stamm, der dieses Antibiotikum bildet, in einem solchen Medium gezüchtet wird.

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Für die Züchtung von Stämmen« die Lateriomycin F bilden, ist die Submerskultur unter Verwendung eines flüssigen Mediums vorzuziehen. Gegebenenfalls kann jedoch die Züchtung auch in der Schüttelkultur erfolgen. Die Züchtungsbedingungen, ζ. B. Temperatur, Fermentationsdauer und pH-Wert des Mediums, sind so zu wählen« daß Lateriomycin F in möglichst guter Ausbeute gebildet wird. In der Submerskultur ist die Bildung von Lateriomycin F im allgemeinen bei etwa 25 - 35°C* einem ungefähr neutralen pH-Wert und bei einer Dauer von etwa 2 bis 6 Tagen maximal»

!Das hierbei gebildete Lateriomycin F ist zum größten Tel-1 im Kycel, jedoch auch im flüssigen Teil der KuI-turlösung enthalten. Das in der Kulturlösung angereieherte Lateriomycin F wird isoliert und auf die gewünschte Reinheit nach Methoden gebracht, bei denen die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Lateriomycin F, z. B· unterschiede zwischen Lateriomycin F '«id Verunreinigungen hinsichtlich der Löslichkeit, im ¥erteilungsverhältnis zwischen zwei Flüssigphasen, in der Adsorptionsfähigkeit oder in der Xonenkohärenz,.ausgenutzt werden. Am zweckmäßigsten kann das in der Kulturlösung angereicherte Lateriomycin F durch Ausnutzung des Unterschiedes in der Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln zwischen Lateriomyein F und den Verunreinigungen gewonnen werden. Beispielsweise können die besten Ergebnisse bei der Isolierung von Lateriomycin F nach der folgenden Methode erzielt werden: Das Uyoel, das aus der Kulturbrühe des Lateriomycins F bildenden Stammes abgetrennt wird, wird mit Methasaol, Aceton oder einem Gemisch von Aceton und Äthylaeetat extrahiert. Der Extrakt wird unter vermin-■ - dertem Drusk eingeengt^ wobei die ©rganisefoen Lösungsmittel abge<ä»j3sft werden,-. BIe Konzentrate und/oder die .geklärte Kulturlusüng wiM vorzugssjsiga mit Chloroform,

©der Mefefeylätfeylketon @s.t?rsthi.ex»t, Der

erhaltene Extrakt wird unter vermindertem Druck auf ein bestimmtes Volumen eingeengt und dann mit Petroläther versetzt, wobei sich eine Fällung bildet. Die Fällung wird durch Dekantieren abgetrennt und mit Diäthyläther gewaschen, wobei ein Lateriomycingemisch erhalten wird. Dieses Gemisch wird in Aceton oder Äthylacetat gelöst und dann mit Diäthyläther erneut ausgefällt, wobei gereinigtes Lateriomycln F erhalten wird. Die beim vorstehend beschriebenen Reinigungsprozeß verwendeten Lösungsmittel werden so gewählt, daß das gereinigte Lateriomycin F in möglichst hoher Ausbeute erhalten wird.

Das auf diese Weise 'gereinigte Lateriomycln F hat die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

1. Elementaranalyse: % C	£_H	1,98
63,04	6,35	2,15
61,85	6,30	1,83
62,98	6,18	2,12
63,59	6,44
61,96	6,45

62,86*1,2 6,30+0,6 2,04+0,6

2. Spezifische Drehung:

jp = +110 + 20° (C = 0,1, I % Dimethylformamid in 99 % Äthanol)

3» Absorptionsspektrum:

Das mtraviolett-Absorptionßspektrum und das Absorptionsspektrum im sichtbaren Bereich von Lateriomycin F im Äthanol, das 0,5 % Essigsäure enthält, ist in Fig. 1 dargestellt. Das Spektrum enthält die folgenden wesentlichen Afosorptiorismaximaj

■ _BAD

0 09S12/189S

λ 0,5 % Essigsäure in Äthanol , *

max. 234 mu (ET * = 465 + 45)

/ χ ein —!

252 D^u(Ej J_n- 415 + 40)

' 285 ψ (EJ J_n = 190 + 20)

480

498 jpu (E* J_n ^= 125 + 25)

.Schulter

Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Lateriomycin F, gemessen nach der Kaliumbromid-Hethode, ist in Fig. 2 dargestellt· Das Spektrum enthält die folgenden wesentlichen Banden in/ut

2,90 (mittel) 8,10 (eehr stark)

3,38 (mittel) 8,28 (sehr stark)

3*41 (mittel) 8,92 (etark)

>v50 (mittel) 9,23 (mittel)

5,82 (mittel) 9*38 (mittel)

6,18 (sehr stark) 9,65 (stark)

6,30 (sehr stark) 9*9P (stark)

6,60 (mittel) 10,05 (stark)

6,90 (stark) 11*27 (schwach)

7,08 (stark) 11,88 (mifctel)

7,28 (stark) 12,20 (mittel)

7*40 (stark) 12,65 (mittel)

7*79 (sehr stark) 13,10 (sehwach)

25⁼ 4« Farbreaktion:

Lateriomycin F ist positiv in der Molisch-Reaktlon und gegenüber Eisen(III)-Chloridreagenz und zeigt eine purpurrote Farbe in konzentrierter Schwefelsaure.

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5. Löslichkeit:

Lateriosmycin F ist löslich in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Aceton, Chloroform, Dichlormethan, Äthylacetat, Benzol, Toluol, Essigsäure, Dimethylformamid, Methylcellosolve, schwerlöslich in Biäthyläther und unlöslich in Wasser, Petroläther, η-Hexan und Cyclohexan.

6. Rf-Wert,bei der Papierverteilungschromatographie:

Bei der Papierverteilungs-Chromatographie wurden nach der aufsteigenden Methode die folgenden Werte gemessen:

10 Lösungsmittelsystem Papier Rf-Wert

mit Wasser gesättigtes Whatman-Filterpapier n-Butanol Nr. I⁺ (W. and R. 0,8 - 0,9

Baiston ltd·, Großbritannien)

15 dto. Arches-Filterpapier

Nr. 302⁺ 0,8 - 0,9

dto. Toyo-Filterpapier 0,8 - 0,9

Nr. 51 (Toyo Roshl Kaisha Ltd., Japan)

mit Phosphatpuffer ge- Whatman-Filter-• · sättigtes n-Butanol papier Nr, 1 0,65 - 0,95 (pH 5,6)

n-Butanol, Essigsäure,

Wasser (4:1:5) dto. 0,75 - 0,95

25 Aceton, Benzol, Wasser

(12:5:2) dto. 0,75 - 0,99

⁺ Imprägniert mit Mollvain-Phosphatpuffer (pH 4,8).

7» Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie:

Bei der Dünnschicht Chromatographie wurde nach der aufsteigenden Methode unter Verwendung von Äthylacetat-Methanol (10:1) an Silicagel G (Merck GmbH, Deutschland) ein Rf-Wert von 0,2 - 0,45 gemessen.

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8. Aglykone:

Das durch Hydrolyse (40 - 45 Min., etwa 80°C) mit 1,On-HoSOi, aus Lateriomycin F erhaltene Aglykone hat die folgenden Kennzahlen:

a) Elementaranalyse:

Test Nr. % C .__ % H % 0

I
II

63,27	3	4,41	31,93	0,3
6?,QJ	4*57	?2,?6
63,31 + 0,	4,55 + 0,2	32,13 +

_ao fe) SehiaeXzpusiIcfcs 212 - 217°€

@) Absorptionsspektrum:

Das illtraviolett-Absorptionsspektrum und sichtbare Absorptionsspektrum für Aglykone in Äthanol ist in Fig. dargestellt. Es zeigt die folgenden wesentlichen Abjksorptionsmaxima:

EtOH 234 (E* J_n = 925)

Λ, ■■-'■'■-.'■■■■ - - ■- ■-.::■-

max. 252 '(sf ?_ = 664)

²⁹⁰ <^Εί 4i =

Das Infrarot-Absorptionsspektrum von Aglykone, gemessen

nach der Kaliumbroinid-Methode, ist in Fig. 4 dargestellt, . Das Sektrum enthält die folgenden wesentlichen Banden in /u:

§88 8^10 (sehr stark) 10,85 (mittel)

3*42 (Büttel) 8_s2b (sehr stark) 11,26 (schwach)

5,00 (stark) : ö_#42 (sehr stark) 11,57 (schwach)

.6,18 (sehr staiic) 8,70 {raLtte^JL " 11,93 (mittel)

6_a32 (sehr sterk) 8,88 (stark) , 12,^0 {eehr stark)

6,92 (sehr stark). 9₃19 (stark) 12^65 (mittel) '

ö ö S 8 1 2 / 1 8 9 6 ■- -,.. , BAD

7,0ό (sehr stark) 9,35 (stark) 13,08 (stark)

7,25 (stark) 9,65 (stark) 13,52 (schwach)

7,40 (sehr stark) 10,10 (sehr stark) 13,90 (schwach)

7,78 (sehr stark) 10,60 (mittel) 14,30 (schwach)

7*97 (sehr stark) 10,77 (mittel) 14,50 (schwach)

d) Spezifische Drehung;

d 3

Lateriomycin F hat die folgenden biologischen Eigenschaften:

1. Antibiotisches Spektrum

Die antibiotische Wirkung von Lateriomycin F gegen die 10 verschiedenen Mikroorganismen sind in Tabelle II angegeben. Die als Testorganismen verwendeten grampositiven oder gramnegativen Bakterien wurden auf Bouillon-Agar 24 Std. bei 37°C gezüchtet. Bei säurefesten Bakterien wurde Glycerin-Bouillon-Agar verwendet und 48 Std. bei 15 37°C bebrütet. Bei Verwendung von Pilzen oder Hefe wurde Glukose-Bouillon-Agar als Versuchsmedium verwendet und 48 Std. bei 28°C bebrütet.

Tabelle II Antlbiotlsches Spektrum von Lateriomycin F

Test-Mikroorganismus Hemmende Mindestkon-

zentration (Mikro-

gramm/ml)

Escherichia coli 20

Proteus vulgaris 50 - 100

Staphylococcus aureus 0,5

' Bacillus subtilis 0,1

Bacillus cereus 0,5

Bacillus brevis 0,2

Sarcina lutea 0,2 - 0,5

Micrococcus flavus 0,1

Pseudomonas aeruginosa >100

. Mycobacterium avium ,-

(ein gegen Streptomycin resistenter Stamm ^

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Mycobacterium smegmatis 2

Mycobacterium 607 5

Mycobacterium phlei 5

Mycobacterium avium
(ein gegen Neomycin resistenter Stamm) 5

Penicillium ehrysogenum . >1OO

Piricularia oryzae >1OO

Aspergillus niger ^100

Saceharomyees cerevisiae ¹^lOO

Wie die Werte in Tabelle II deutlich zeigen, hat Lateriomycin F eine starke Wirkung gegen grampositive Bakterien,

2. Akute Toxizität

Die folgenden LDp.₀-Werte wurden für Lateriomycin P an Mäusen ermittelt :

etwa 600 Mikrogramm/kg (intravenös, Beobachtungsdauer

1 Woche)

etwa 245 Mlkrogramm/kg (intravenös, Beobachtungsdauer

2 Wochen)

etwa 310 Mikrogramm/kg (intraperitoneal, Beobachtungsdauer 1 Woche)

etwa 162 Mikrogramm/kg (intraperitoneal, Beobachtungsdauer 2 Wochen)

3, Antitumorwirkung

Lateriomycin P ist auffallend wirksam gegen verschiedene Arten von experimentellen Tumoren. Durch wiederholte intraperitoneale oder intravenöse Behandlung mit dem Antibiotikum bei einer Dosis von 2 - 10 Mikrogramm/kg/ Tag wurde die Lebensdauer von Ratten, die von Yoshida-Sarkom oder einigen Aszites hepatomasr AHlJ, AHlJO, J>0 AH6o1 usw. befallen waren, wesentlich verlängert. Das Wachstum des festen Sarkoms l80 bei .Mäusen und des Walker-Carcinosarkoms 256 bei Ratten wird bei intravenöser Behandlung ebenfalls gehemmt.

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Ein Vergleich der vorstehend genannten physikalischchemischen und biologischen Eigenschaften von Lateriomycin P mit den entsprechenden Eigenschaften der bisher bekannten Antibiotika ergibt, daß Lateriomycin P ein neues Antibiotikum ist. Aus dem in Pig. I dargestellten Ultraviolett-Absorptionsspektrum und sichtbaren Spektrum wird gefolgert, daß Lateriomycin P zur Rhodomycin-Gruppe gehört. Die folgenden Antibiotika der Rhodomycin-Gruppe sind bisher bekannt?

1) "Rhodomycin A und B¹¹, beschrieben in "Chemische Berichte, ^88^ Seite 1792 (1955)

2) "Rutilantin", beschrieben in "Biochemical Journal", 81, Seite 101 (1961), in "Tetrahedron Letters" TT959), Nr. 16, Seite 17 und in "Tetrahedron Letters"

15 (I960) Nr. 8, Seite 25

3) "Cinerubin A und B", beschrieben in "Chemische Berichte" 92^ Seite I867 (1959)

•4) "Pyrromycin", beschrieben in "chemische Berichte" 92, Seite 1880 und 1904 (1959)

5) "Aklavin", beschrieben in "Journal of Bacteriology", 72, Seite 90 (1956) und in "Tetrahedron Letters" TI^60), Nr. 8, Seite 28

7) "Daunomycin" beschrieben in "Nature" 201, Seite

(1964), und in "Journal of the American Chemical So-25 ciety", 86j_ Seite 5334 (1964)

8) "Rubidomycin", beschrieben in der am 7. 5. 196if unter der Nr. Sho. 40-8800 (88OO/I965) ausgelegten japanischen Patentanmeldung und in "Comptes rendus Hebdomadaries des Seances de l'Acedemie des Sciences"

30 257* Seite 1813 (I963)

Lateriomycin P unterscheidet sich jedoch deutlich von den vorstehenden bekannten Antibiotika beispielsweise in bezug auf Elementaranalyse, Ultraviolettspektrum, InfrarotSpektrum, antibiotisches Spektrum, Toxizität, Rf-Werte bei der DUnnschichtchromatographie und bei der Papierverteilungs-Chromatographie und/oder Eigenschaften der Aglykone. Hieraus ist zu folgern, daß Lateriomycin P ein neues Antibiotikum ist.

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•Wie aus Tabelle II deutlich ersichtlich ist, hemmt Lateriomycin F stark das Wachstum, von grampositiven Bakterien. Lateriomycin F ist somit wertvoll als Mittel für die Therapie von Krankheiten, die durch Staphylokokkus hervorgerufen werden,, ohne wesentliche Nebenwirkungen zu zeigen. Beispielsweise.ist Lateriomycin F wertvoll für örtlich anzuwendende ,Präparate zur Behandlung von Wunden, die durch Staphylokokken infiziert sind.

Die folgenden Versuche und Beispiele veranschaulichen zur Zeit bevorzugte AusfUhrungsformen der Erfindung.

Bei den nachstehenden Versuchen und Beispielen beziehen sich die Prozentangaben auf Gew.-/Vol., falls nicht anders angegeben. Die antimikrobische Wirksamkeit- einer filtrierten Kulturlösung wurde nach der Schalenmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis als Testorganismus und die antimikrobische Wirksamkeit des Antibiotikums im Mycel nach der Papierscheibenmethode unter Verwendung der extrahierten Lösung aus dem Mycel als Probe gemessen. Hierbei wurde die Lösung hergestellt, indem die Kulturbrühe zentrifugiert und das erhaltene nasse Mycel mit Aceton in der Gleichen Menge wie der durch Zentrifugierung abgetrennte Flüssiganteil extrahiert' wurde.

Versuch 1

50 ml Kulturmedium A, das 5*0 % lösliche Stärke, 2,0Ji Sojabohnenmehl, 0,5 % Reiskleie, 0,5 % Kaseinhydroly-■ sat und 0,5 % Natriumchlorid enthält, und 50 ml Kulturmedium B, das hergestellt wird durch Ergänzung von Kulturmedium A durch 0,05 $ Eisen(II)-sulfat (FeSO^), werden jeweils mit Streptomyces griseoruber Nr, 71070 (ATCC I7919) beimpft, worauf 120 Stunden bei 2e°C unter

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Schütteln bebrütet wird. Die filtrierte Brühe und die extrahierte Lösung aus dem Mycel, das mit dem Kulturmedium A erhalten wurde, zeigen eine antimikroblsche Wirksamkeit von 70 Mikrogramm/ml bzw. 105 Mikrogramm/ml. Im Gegensatz hierzu beträgt die antibiotische Wirksamkeit der filtrierten Brühe und der extrahierten Lösung aus dem im Kulturmedium B erhaltenen Mycel 150 Mikrogramm/ml bzw· 700 Mikrogramm/ml·

Versuch 2

Streptomyces griseoruber Nr. 71070 (ATCC 17919) wird bei 28°C unter Schütteln in einem Kulturmedium gezüchtet, das hergestellt worden ist durch Ergänzung des Kulturmediums A gemäß Versuch 1 durch 0,05 % Eisen(IH)-sulfat (FCg(SOn)-,) und verschiedene Mengen Calciumchlorid (CaCIg.2HgO), Zinksulfat (ZnSO^.7HgO) und/oder Kupfer(II)-sulfat (CuSO₄.5HgO). Die antibiotische Wirksamkeit der filtrierten Brühe und der extrahierten Lösung aus dem Mycel jeder Kultur nach J5, 5 und 7 Tagen nach Beginn der Bebrütung ist nachstehend in Tabelle III angegeben.

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Tabelle ΧΕΙ

Zugesetzte Menge, %

Bebrütungsdauer in Tagen

CUoOi

Filtrierte
Brühe ⁺

Mycei Filtrierte Myeel Filtrierte Mycel Brühe + ++ Brühe + ++

O O	0,05 0,05	0,05
(O	0,05	0,05
12/	0,05 0,05	0,05
00	0,05
co 00	0,05	0,05
	0,05

0,01

0,01 0,01

0,01

Kontrolle (Kulturmedium A)

0,001

0,001 0,001 0,001

37
62

75
57
52
40
52

57
21

165 125 230 140 175 115 140 150 65

650	200
930	170
1150	I70
650	170
380	155
750	115
1300	185
930	I85
45	52

= Antibiotische Wirksamkeit der filtrierten Brühe (Mikrogramm/ml)

Antibiotische Wirksamkeit der extrahierten Lösung des Mycels (Mikrogramm/ml)

225 225 340 310 195 265 290 245 28,5

Beispiel 1

Streptorayces griseoruber Nr. 7IO7O (ATCC I7919) wird auf 30 1 eines wässrigen Kulturmediums (pH 7*0) geimpft« das 5,0 % lösliche Stärke, 3,0 % Sojabohnenmehl, 1,0 % Fleischextrakt, 0,5 % Natriumchlorid und 0,05 % Eisen(III)' chlorid enthält und in einem Fermenter aus nicht rostendem Stahl enthalten ist, worauf Il4 Stunden unter Belüftung und Bewegung bei 28°C bebrütet wird. Die aus dem Mycel extrahierte Lösung und die filtrierte Brühe, die auf diese Weise erhalten werden, zeigen eine antibioti-

10 sehe Wirksamkeit von 450/ml bzw· 110 Mikrogramm/ml ·

Durch Filtration der Kulturlösung werden 6 kg nasses Mycel erhalten. Das Mjiycel wird mit 12 1 Aceton unter Rühren extrahiert und abfiltriert· Der Extrakt wird unter vermindertem Druck auf etwa 3,3 1 eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird mit einer 10£igen wässrigen Natriumhydroxydlösung auf pH 8,0 eingestellt und mit 2,4 1 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt und mit Wasser gewaschen, getrocknet und dann unter Stickstoff bei vermindertem Druck eingeengt. Zur erhaltenen Lösung werden 130 g Petroläther gegeben. Das Gemisch wird dann 3 Stunden bei 4°C stehen gelassen, wobei sich eine Fällung abscheidet. Zur Fällung, die vom flüssigen Anteil durch Dekantieren abgetrennt wird, werden 75 ml Diäthyläther gegeben. Das Gemisch wird 4 Stunden bei 4°C stehen gelassen. Die Fällung wird dann abfiltriert, wobei 1,2 g eines Lateriomyc Ingemis ches erhalten werden. Dieses Gemisch (1 g) wird in 250 ml Aceton gelöst. Nach der Filtration wird das Filtrat bei 40°C uiiter vermindertem Druck auf etwa 25 ml eingeengt. Nach Zugabe von 100 ml

-30 Dläthyläther zur Lösung wird das Gemisch 4 Stunden bei 0⁰C stehen gelassen, wobei sich eine Fällung abscheidet. Die.Fällung wird abfiltriert und getrocknet, wobei 0,49 g Lateriomyein F als orangenrotes Pulver erhalten werden» ·

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Beispiel 2

Streptomyces griseoruber Nr. 71070 (AOXJC 17919) wird in 30 1 eines wässrigen Kulturmediums bebrütet, das die in Beispiel 1 genannte Zusammensetzung hat, wobei 90 Stunden unter Belüftung und Bewegung bei 28°C bebrütet wird.

10,3 kg des aus dem Kulturmedium abgetrennten nassen Mycels werden unter Rühren mit 20 1 Aceton extrahiert und abfiltriert· Der Extrakt wird unter vermindertem Druck auf 5 g eingeengt· Die konzentrierte Lösung wird mit einer 10 £igen wässrigen Natriumhydroxyiösung auf pH 8,0 eingestellt und dansi 2-mal mit je 2,5 1 Äthyläcetat extrahiert. Naeli einer Wäsche mit Wasser und Trocknung wird die Äthylacetat schicht unter vermindertem Druck eingeengt. Zum erhaltenen Rückstand werden l8o ml Diäthyläther gegeben, worauf das Gemisch 4 Stunden bei 4°G stehen gelassen wird, wobei sich eine orangerote Fällung bildet. Die Fällung wird abfiltriert, wobei 65Ο mg eines Lateriomyclngemisches erhalten werden. Dieses Gemisch (400 mg) wird In 60 ml Äthylacetat gelöst, und die Lösung wird filtriert. Das FiItrat wird unter Stickstoff und unter vermindertem Druck bei 4o°C eingeengt. Zum Konzentrat werden 4o ml Diäthyläther gegeben· Das Gemisch wird 4 Stunden bei 0°C stehen gelassen, worauf sich eine Fällung abscheidet. Die Fällung wird abfiltriert und getrocknet, wobei 230 mg Lateriomycin F erhalten werden.

Beispiel 3

Mit Streptomyces griseoruber Nr. 71070 (ATCC 17919) werden 500 ml eines wässrigen Kulturmediums geimpft, das 3,0 % lösliche Stärke, 2,0 % Sojabohnenmehl, 1,0 % Fleischextrakt und 0,5 % Natriumchlorid enthält, worauf 48 Stunden . _£ bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet wird. Die erhaltene _r Kulturbrühe wird in 30 1 eines wässrigen Kulturmediums der vorstehend genannten Zusammensetzung unter Belüftung und

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Rührung vorinkublert· Die Vorkultur wird in 500 ml eines ' wässrigen Kulturmediums der vorstehend genannten Zusammensetzung bebrütet und 96 Stunden unter Belüftung und Rührung bei 28°C in einem Fermenter aus nicht rostendem Stahl gehalten· Die hierbei erhaltene Kulturbrühe wird auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 257 mg Lateriomycin F erhalten werden·

Wenn Streptomyces grlseoruber Nr. 71070 (ATCC 17919) auf die vorstehend beschriebene Welse in einem wässrigen KuI- · turmedium bebrütet wird« das hergestellt worden ist durch Ergänzung des vorstehend beschriebenen Mediums durch 0,05 % Eisen(III)-chlorid, und die erhaltene Kulturbrühe auf die In Beispiel 1 beschriebene Weise behandelt wird« werden 2,5 g Lateriomycin F erhalten.

Beispiel 4

Dieses Beispiel veranschaulicht den Wert des erfindungsgemäß hergestellten neuen Produkts .für die Bekämpfung von pathogenen grampositiven Bakterien in vitro.

Staphylokokken sind pyogene oder eiterbildende Bakterien. In typischer Weise pflegen sie begrenzte Läsionen z. B.

die in Form von Abszessen u. dgl. zu bilden,/häufig auf der Haut auftreten. Staphylokokken sind die Ursache von Furunkeln und Karbunkeln und anderen üblichen Wundinfektionen. Das erfindungsgemäß hergesteile neue Produkt ist wertvoll für örtlich anzuwendende Präparate zur Behand- * lung dieser Art von Infektionen. Beispielsweise, wird ein wertvolles Präparat für die örtliche Anwendung zur Bekämpfung einer auf Staphylococcus aureus zurückzuführenden Infektionen wie folgt hergestellt:

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In 1 g Wollfett werden 8 mg Lateriomycin F gleichmäßig eingearbeitet. Das Gemisch wird dann gleichmäßig mit einer genügenden Menge weißem Petrolatum gemischt, um ,10 g Salbe zu bilden.

Aufgrund der vorstehend beschriebenen bakterieiden und bakteriostatischen Eigenschaften der erfindungsgemäß hergestellten neuen Produkte eigenen sieh diese außerdem . in vitro. als_Antiseptika und Desinfektionsmittel beispielsweise zu Desinfektion von Krankenhausgeräten usw., die im allgemeinen pathogenen grampositiven Bakterien des Typs ausgesetzt sind, die gegenüber den vorstehend beschriebenen Produkten empfindlich sind·

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Claims (7)

- 26 Patentansprüche

1) Neues Antibiotikum, erhältlich als Stoffwechselprodukt von Streptomyces griseoruber, mit den folgenden Eigenschaften s '''.'"_
ä) Elementaranalyse:

62,86 + 1,2 % 6,30+ 0,6 % 2,04+ 0,6 #,

(C = 0,1, 1 Si Diiriethylformamid in 99 Ji Äthanol),

c) maximale Absorption im UV-Bereich und im sichtbaren Bereich bei folgenden Wellenlängen:

S\. max. (gelöst in einem Gemisch von 0,5 % (Vol/Vol) Essigsäure in Äthanol) . ;

234 mu C^E1 cm — if65 + 45) 252 ψ χ cm = 415 + 4o) 285 mu == 190 + 20) 480, mu - 125 + 25)

498ψ (eJ J_n = 125 + 25) " 533 mu Schulter,

d) positive Holisch-Reaktion, positive Elsen(III)-chlorid-Reaktion sowie Purpurrotfärbung in konzentrierter Schwefelsäure,

e) löslich in Methanol, Äthanol, n-Butanol, Acetonchloroform, Dichlormethan, Äthylacetat, Benzol, Toluol, Essigsäure, Dimethylformamid, Methylcellosolve, schwerlöslich in Diäthyläther und unlöslich in Wasser, Petroläther, η-Hexan und Cyclohexan,

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f) Aglykon mit folgenden Eigenschaften: eui) Eletaentaränalyse C H 0

63,31 ± 0,3* 4.55 + 0.2% 32,12 + 0

bb) Schmelzpunkt 212 bis 217°C cc) spezifische Drehung £~olJ/ « +90° (C «0,05, CHCl₃)

g) selektive Aktivität gegenüber grampositiven Bakterien.

2) Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Lateriomycln F auf mikrobiologischem Wege, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Lateriomycln P bildenden und zur Gattung Streptomyces griseoruber gehörenden Stamm in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff quellen, verwertbare Stickstoffquellen und andere für das Wachstum der Mikroorganismen notwendige Nährstoffe enthält, bei Temperaturen von etwa 25 bis 35°C unter aeroben Bedingungen züchtet und das dabei gebildete Lateriomycln F aus der Kulturbrühe gewinnt.

3)Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stamm Streptomyces griseoruber 71070 (ATCC 17919) verwendet.

4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet« daß man ein Kulturmedium verwendet, das etwa 0,03 bis etwa 0,1 % (Gew./VOl.) eines Eisensalzes einer anorganischen Säure enthält.

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5) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, das Ferrosulfat, Ferrisulfat, Perrochlorid und/oder Perrichlorid enthält.

6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium verwendet, das etwa 0,001 # bis etwa 0,05 % (Gew./Vol.) Calciumchlorid, Zinkchlorid, Zinksulfat und/oder Kupfersulfat enthält.

7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das Lateriomycin F isoliert unter Ausnutzung der Löslichkeitsunterschiede zwischen Antibiotikum und Verunreinigungen.

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ZR L e e r seit e