DE2035655A1

DE2035655A1 - Janiemycin und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE2035655A1
Application number: DE19702035655
Authority: DE
Inventors: Edward. Oak Tree; Parker William L. No Brunswick; Weisenborn Frank L. Somerset; Pansy Felix E Jamesburg; Principe Pacifico A.. So.River; N.J. Meyers (V.StA.)
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1969-07-24
Filing date: 1970-07-17
Publication date: 1971-01-28
Also published as: FR2059552B1; GB1322797A; CA932283A; CH509406A; US3577530A; FR2059552A1

Description

"Janiemycin und Verfahren zu seiner Herstellung" ä

Priorität: 24. Juli 1969, V.St.A., Nr. 844 342

Die Erfindung betrifft ein neues und wertvolles Antibiotikum, das nachstehend mit Janiemycin bezeichnet wird, und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Zur Herstellung von Janiemycin wird Streptomyces macrosporeus A.T.C.C. 21388 verwendet. Eine Kultur dieses Mikroorganismus wurde bei der'A.T.C.C. unter der Nummer 21 388 hinterlegt.

Zur Isolierung und Charakterisierung des Mikroorganismus wurde ein Teil der Bodenprobe in sterilisiertem, destilliertem Wasser geschüttelt und dann auf ein Agar.Nährmedium der folgenden Zusammensetzung aufgestrichen: 15 g Agar, 10 g Saccharose,

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10 g Galactose, 1,2 g Citronensäure, Ö„4 g (NH₄O₂HFO₄, 0,08 g KCl, 0,418 g MgCl₂.6H₂O, 0,036 g'MnCl₂.4H₂0, 0,023 g 0,021 g ZnCl₂.6H₃O, 0,004 g CoCl₂₉6H₂0 und destilliertes ".Yasser ad 1000 ml.

Das Nährmedium wurde auf den pH-V/ert 7₉O eingestellt und 30 Minuten bei 121⁰C in einem Autoklaven sterilisiert. Nach 7- bis 10-tägiger Inkubation bei 25⁰C wurden Kolonien von Streptomyces macrosporeus A.T.C.C.21388 vom Nährmedium isoliert. Diese isolierten Kolonien v/erden dann in einem Nährmedium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet: 1,5 g Rindfleischextrakt, 3,0 g Hefeextrakt, 6,0 g Pepton, 1,0 g Dextrose und destilliertes (Yasser ad 1000 ml. Das Nährmedium wird 15 Minuten bei 121 C sterilisiert.

Der Organismus gehört nach Pridham zur Reihe der grausporigen Mikroorganismen (Pridham, T.G., C.W. Hesseltine und R.G. Benedict, A guide for the classification of streptomycetes according to selected groups: placement of strains in morphological sections, Appl. Microbiol. £, (1958) Seite 52 bis 79). Die Sporen werden in Ketten auf Sporophoren gebildet, die,-.,einfache bis ausgedehnte Spiralen bilden. Die Sporen sind dornig und kugelförmig bis flach gewölbt, wie durch elektronenmikroskopische Betrachtung festgestellt wird,

Streptomyces macrosporeus A.T.C.C. 21388 weist folgende Wachstumsmerkmale auf:

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Auf repton-'.ii:en-Agar oder anderen organischen Nnhrmedien wird kein melanoides Pigment gebildet.

In Tabelle I pin-3 einige '.Vachstumemerkmale von Streptomyces mscrosporeus, gezüchtet auf Staniordmedium, ancereben.

Tabelle I

Einirre "."achPtur.sTr.erkrr.ale von otreOtomycep mecrosporeus A.T.C.C,21388 ·

Nährmediumv' 7 Tage 14 Tage

Hefeextrakt-Malzex- Luftmyzel: v/eiss bis Sporenbildung:gut,

(2) trakt-Agar grau. Rückseite:färb- grau '.Rückseite:

los. Kein lösliches gelb-braun. Kein Pigment. . lösliches Pigment.

Hafermehl-Agar Wachstum: diinn,f-arb- Wachstum: spärlich.

los, mit weissem Rand, Sporenbildung:mäßig, Mitte leicht grau. leicht gr&u. mit Kein lösliches Pigment.leuchtendem Rand.

Rückseite: hell gelblich—grün^.

Stärke-Agar mi-t an- Luftmyzel: grau mit Sporenbildung: organischen Salzen Rand. Rückseiterhell grau' ', Rückseite:

olivefarben. gelb-braun bis grünlich-schwarz (olivefarben).Kein lösliches Pigment.

Grlycerin-Asparagin- Keine Sporenbildung. Sporenbildung:leicht

RUckseite:farblos. grau^ ^.Rückseite: Kein lösliches Pig- farblos bis hell ment. gelblich-braun.Kein

lösliches Pigment.

009885/2273. ^_{0 onlGjNAL}

(1) Diese Medien v/erden bei der Züchtung von Mikroorganismen der Gattung Streptomyces als Standardmedien vom "International, Streptomyces Project" zur Standardisierung von ZUchtungsbesehreibungen empfohlen. Ihre Zusammensetzung ist in "Methods for Characterization of Streptomyces Species" von E.B. Shirling und D. Gottlieb, International J.Syst. Bacteriol. 16 (3)

«■MW* _%

313 -.340 (1966) angegeben.

(2) Die genaue Farbbezeichnung ist hell bräunlich-grau (63) ISCC-NBS (Kelly, K.L. und D.B. Judd, The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names, National Bureau of Standards Circular 553» U.S. Department of Commerce (1955)) oder Farbprobe 3 fe im "Color Harmony Manual" (Fourth Color Harmony Manual, Container Corporation of America, Chicago, Illinois, Herausgeber: Taylor, H»D*, Knoche, L, und Granville, W.C. (1950)),

Streptomyces macrosporeus A.TiC.C. 21388 kann nach dem Standard» untersuchungaverfahren von Pridham und Gottlieb folgende Kohlenstoffquellen verwerten; Glucose, Mannit,, Inosit, Xylose, Arabinose, Bhamnose, Fructose, Galactose und Trehalose. Durch Sorbit, Raffinose, Melobiose, Saccharose und Lactose wird das Wachstum nicht gefördert (Pridham« T.G» und Gottlieb, D₀₉ Utilization of Carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination, J₀ Bacteriology j>6, 107-114 (1948)),

ORIQWAL INSPECTED

Der Mikroorganismus hydrolysiert Stärke schwach, Protein mäßig und Calciummalat gut. Der Organismus reduziert Nitrat und wird durch 9^-ige Salzlösung nicht beeinträchtigt.

Janiemycin reagiert basisch und bildet mit Anionen Salze. Beispiele für solche Anionen sind; Halogenanionen, das Acetat und Sulfatanion.

Zur Erzeugung des Antibiotikums Janiemycin wird Streptomyces maerosporeus A.T.C.C. 21388 bei Temperaturen von 15 - 3O⁰C, vorzugsweise bei 25⁰C ,unter aeroben Submersbedingungen in einem wässrigen Nährmedium, das verwertbare Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen enthält, gezüchtet. Die Züchtung wird etwa 90 bia 150 Stunden lang durchgeführt. Nach dieser Zeit hat sich das Antibiotikum in ausreichender Menge gebildet.

Nach dem Ende der Züchtung wird die Gärmaische mit Filtrierhilfe versetzt und dann filtriert. Das Antibiotikum wird mit Methanol aus dem Myzelkuchen extrahiert. Das Antibiotikum befindet sich nicht nur im Myzelkuchen, sondern auch im Filtrat. Deshalb wird das Filtrat mit wassergesättigtem n-Butanol extrahiert. Die Butanol- und Methanol-Extrakte werden unter vermindertem Druck eingedampft, bis man aus beiden jeweils wässrige Suspensionen erhält. Die vereinigten Suspensionen werden mit wassergesättigtem n-Butanol extrahiert. Die Butanolschicht wird unter vermindertem Druck auf ein Minimalvolumen eingedampft

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und das Konzentrat wird mindestens mit dem 10-fachen Volumen an Aceton verdünnt. Der ausgefallene, in Aceton unlösliche Niederschlag wird entweder durch Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen und im Exsikkator getrocknet. Man erhält ein amorphes gelbbraunes Pulver·

Das in Aceton unlösliche Pulver kann durch Vierfach-Gegenstromverteilung in n-Butanol/HgO weiter gereinigt werden. Der Hauptteil der Aktivität wird in den n-Butanolphasen der ersten zwei Rohre gefunden· Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man einen amorphen Peststoff· Dieses Material kann durch Chromatographie an Kieselgel v/eiter gereinigt werden, wobei zuerst mit Propanol/Butanol und dann mit Propanol/Butanol/1 η ΝΗ,ΟΗ eluiert wird. Das letztere Löaungamittelayatem eliaiert schließlich das aktive Material, das nach dem Entfernen des Lösungsmittels ale amorpher Peststoff erhalten wird.

Eine weitere Reinigung erreicht man durch Chromatographie an SephadexG-50 mit Dimethylsulfoxyd.

Die Beispiele erläutern die Erfindung,

Beispiel 1

Schräg gestellte Tomatenmark-Hafermehl-Agarmedien wurden mit Streptomyces macrosporeus !„T.C.C. 21388 angeimpft_e Man inkubierte 10 bia 14 Tage and verwendet© die erhaltenen Kulturen zum Animpfen von jeweils 25 ml tines wässrigen Sojabohnenmehl-

Nährmediums, das sich in 125 ml-Erlenmeyerkolten befand. Die Zu sammensetzung des Nährmediums war folgende: 15#0 g Sojabohnenmehl (Stalye's 4S), 15,0 g KartoffelpUrreepulver, 50,0 g Glucose, 0,005 g CoCl₂«2H₂0, 10,0 g CaCO*, 2,5 g Agar und destilliertes Y.asser ad 1000 ml.

Das Nährmedium wurde 30 Minuten bei 121⁰C dampfsterilisiert. .. Man inkubierte 72 - 96 Stunden bei 25⁰C unter Verwendung einer Rotationssch'ittelmasc-hlne mit 280 U.p.M. und ca. 5 cm Hub.

2tlchtun^sbed indungen

100 ml eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie das

• -

Anzuchtnährmedium, das jedoch kein Agar enthielt, wurden in 500 ml fassenden Erlenraeyericolben mit 5 VoIfIi der vorstehend angegebenen Anzuchtgärmaische versetzt. Man inkubierte und schüttelte ebenso wie beim Anzuchten. Nach 4 und 6 Tagen wurden Proben entnommen. Zur untersuchung wurde das Myeel dieser Proben abzentrifugiert und mit einem dem überstand entsprechenden Volumen an Methanol extrahiert, überstand und Methanolextrakt wurden durch Papierchromatographie und biologische Bestimmung untersucht. Zur Chromatographie wurden geeignete Mengen als Flecken auf Whatman Kr. 1 -Papier aufgesetzt unä mit einem Lö-Bungsmitte!system der Zusammensetzung n-Butanol:Wasser:Essigsäure = 4:5:1 (Vol/Vol/Vol) chromatographiert. Die obere Phase dieses Lösungsmittelsysteics wurde als Laufnittel verwendet. In diesem System hatte Janiercycin einen R,-Wert von 0,15. Daa Antibiotikum wurde durch Bioautogr.aphie gegen Staphylococcus

aureus 2O9P nachgewiesen,

Beispiel 2

In einem 38 Liter fassenden Behälter aus korrosionsbeständigem Stahl wurde Streptomyces macrosporeus A.T.C.C. 21388 auf 30
Liter Nährmedium gezüchtet. Im folgenden werden das Nährmedium und die ZUchtungsbedingungen näher beschrieben.

Stufe 1

Inoculum: Kultur von Streptomyces macrosporeus A.T.C.C. 21388
aus Milch lyophilisiert und auf einem schräggestellten Tomaten mark-Weizenmehl-Agarnährrnedium gezüchtet. Das Oberflächenwachs tum einer schräggestellten Kultur wurde in einer 0,01$ Antischaummittel enthaltenden L5*sung (Dupanol-Lösung) suspendiert. 3 ml dieser Suspension wurden als Inoculum verwendet.

Nährmedium: 15,0 g Sojabohnenmehl (Staley's 4S), 15,0 g Kartof felpUrreepulver, 50,0 g Glucose, 0,005 g CoCl₂.2H₂O, 10,0 g
CaCO,, 2_f5 g Agar und destilliertes Wasser ad 1000 ml.

50 ml dieses Nährmediums wurden in einen 250 ml fassenden Erlenmeyerkolben gegeben und 96 Stunden bei 25⁰C auf einer Rotationsachüttelmaschine (280 ü.p.M., 5 cm Hüb) inkubiert.

Stufe 2

Inoculum: 5 ml aus Stufe 1·

Kährmediumi wie in Stufe 1. 1000 ml Mährmedium wuräea in einem

4 Liter fassenden Kolben 96 Stunden bei 25⁰C auf einer Rotationsschüttelmaschine (120 U.p.M., 5 cm Hub) inkubiert.

Stufe 3

Inoculum: 2000 ml aus Stufe 2. .

Nährmedium: 30,0 g Sojabohnenmehl (Staley's 4S)_f 20,0 g Cereloae, 10,0 g CaGO,, 0,5 g Antischaummittel (Ucon LB 625) und

destilliertes V/asser ad 1000 ml. · |

30 Liter des mit Inoculum versetzten Nährmediums wurden 144 Stunden inkubiert. Während der Inkubation-wurde die Gärmaische gerührt und während der ersten 12 Stunden mit einer Oberflächen-Luftgeschwindigkeit von 30 cm/Minute und ansehliessend von 120 cm/Minute belüftet.

113 Liter der auf diese Weise erhaltenen vereinigten Gärmaische wurden mit 5»6 kg Piltrierhilfe (Hyflo) versetzt. Das unlösli- ^ ehe Material wurde abfiltriert. Man erhielt 26,6 kg Myzelkuchen.

Der Myzelkuchen wurde je dreimal mit 53 LitemMethanol extrahiert. Der Kuchen wurde zwischen zwei Extraktionsschritten abfiltriert. Die vereinigten Methanolextrakte wurden unter vermindertem Druck auf 5 Liter eingedampft. Die entstandene wässrige Suspension ⁱ-vurde einmal mit 6 Liternwassergesättigtem n-Butanol und zweimal mit je 2 Litern wassergesättigtem n-Butanol extrahiert. .

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Die 92 Liter Gärmaische wurden mit konzentrierter Salzsäure auf den pH-Wert 7,0 eingestellt und dreimal mit je 30 Litern wassergesättigtem n-Butanol extrahiert. Die Butanolschichten ergaben zusammen 75 Liter und wurden mit den 6 Litern der aus der Extraktion des Myzelkuchens erhaltenen Butanolschicht vereinigt*

Die vereinigten.Butanolfraktionen wurden zur Entfernung des Butanols unter vermindertem Druck eingedampft, Es entstanden 6 Liter einer wässrigen Suspension, die wiederum mit 6 Litern wassergesättigtem n-Butanol und zweimal mit je 2 Liternwassergesättigtem n-Butanol extrahiert wurden. Die Butanolschichten wurden zu 10 LitemButanolextrakt vereinigt. Dieser Extrakt wurde unter vermindertem Drück auf annähernd 2 Liter eingedampft. Ungefähr 40 Liter Aceton wurden dem Butanolkonzentrat zugesetzt. Es entstand ein amorpher Niederschlag. Der Niederschlag wurde entweder abfiltriert oder zentrifugiert und im Exsikkator auf Gewichtskonstanz getrocknet. Man erhielt 9,7 g Produkt.

5,55 g des so erhaltenen, in Aceton unlöslichen Pulvers (1900 Verdiinnungseinheiten pro mg (du/mg), bestimmt durch zweifache RöhrchenverdUnnung mit Staphylococcus aureus 2O9P) wurden in einem äquilibrierten Gemisch aus je 100 ml Wasser und n-Butanol gelöst und durch eine Vierfach-Rohr-Gegenstromverteilung gereinigt, wobei die untere Phase als mobile Phase diente.

- Ii -■■■■■■■■■

Es ergaben sich folgende Mensen und Aktivitäten des Materials in jeder Phase:

phase Gewicht Aktivität (S.cureus 209P)

n-Butanol, Rohr 1 0,488 g 5100du/mg

n-Butanol, Rohr 2 0,500 g 4200

n-Butanol, Rohr 3 0,245 g HOO ·

n-Butanol, Rohr 4 0,231 g 220

Wasser, Rohr 1 · 0,390 g 8

Wasser, Rohr 2 0,738 g 8

Wasser, Rohr 3 1,200 g 11

Wasser, Rohr 4 1,190 g 4_

Gesamt 4,982 g 5xlO⁶ du

Das interessierende Material befand sich hauptsächlich in den n-Butanolphasen des ereten und »weiten Rohres.

Beispiel 3

Teilweise gereinigtes Joniemycin wurde durch Chromatographie an Kieselgel erhalten. 779 mg des nach Beispiel 2 durch Lösungsmittelverteilung vorgereinigten Materials wurden in n-Propanol/ n-Butanol (2:3) gelöst und auf eine mit diesem Lösungsmittel äquilibrierte, 200 g Kieselgel enthaltende Säule aufgesetzt. Bei Elution mit diesem Lösungsmittelsystem erhielt man 183 mg Material von geringer Aktivität. Bei weiterer Elution mit n-Propanol/n-Butanol/1,0 η NHLOH (2:3:4) erhielt man weitere

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80 mg einer schwach aktiven Substanz und anschlieesend 97 mg stark janiemycinhaltiges Material, Der Verlauf der Chromate·« ' graphie konnte zweckmässigerweise durch die UV-Absorption des Eluats bei 254 nm verfolgt werden,

Beispiel 4

76 mg des nach Beispiel 3 erhaltenen janiemycinreichen Materials wurden mit Dimethylsulfoxyd an einer Sephadex G-50 fine Säule (2,5 x 80 cm) chromatographierto Die Extinktion des Eluats bei 254 nm wurde kontrolliert, Fraktionen von 1,7 ml wurden aufgefangen und auf ihre Aktivität untersucht. Die Hauptaktivität fand sich in,den Fraktionen 100 bis 132_S was dem Maximum der Extinktion bei 254 nm bei Fraktion 114 entsprach* Die Fraktionen 100 bis 132 wurden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhielt 35 mg eines amorphen Feststoffes mit einer Aktivität von 5500 du/mg*

Beispiel 5

175 mg des nach Beispiel 4 erhaltenen₀ janiemycinreichen Materials wurden durch preparative DUnnschichtchromatographie auf Kieselgel weiter gereinigt, wobei mit n°Propanol/n-Butanol/l η Ammoniak (2:3:4) eluiert wuröe« Ein Streifen mit einem R_f»Wert von 0,04 - 0,15 wurde gewonnen und das Antibiotikum aus dem Kieselgel mit dem gleichen Lösungsmittelsystem ausgewaschen^ Das Lösungemittel v/urde entfernt und der Rückstand in Dimethyl·=» aulfoxyd gelöst. Durch Methanolzusatz wurde das Antibiotikum

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ausgefällt. Durch entsprechende Umfällung erhielt man nach dein Trocknen im-Exsikkator 40 ^mg amorphen Feststoff. Das auf diese Weise gewonnene Material hatte eine Aktivität von 5000 bis 6000 du/mg.
Analyse: C 47,49$; H 5,305b; N 13,07$.

UV-Spektrum:) _mav. in 99$-igem wässrigem Dimethylsulfoxyd ■Λ. max

239 und 272 nm; in 0,15 η Ammoniaklösung vom pH-Wert ca. 8 λ

R_ (Whatman Nr.1 Filterpapier, n-Butanol/Essigsäure/Wasser = 4:1:5): 0,13.

R_f (Whatman Nr,1 Filterpapier, n-Butanol/Pyridin/Wasser =

4;3:7): 0,85. ·

Das IR-Spektrum von Janiemyein ist in der Abbildung gezeigt.

Durch Elektrophorese beim pH-Wert 3,3 in Gegenwart von 30$ Formamid konnte man in 3 Komponenten mit antibiotischer Wirksamkeit auftrennen. Die elektrophoretische Beweglichkeit betrug % bei Verwendung von Safranin 0 als Kathodenindikator und Apaion als elektroosmotischem Indikator +85, +44 bzw. +12 für diese Komponenten. · - ' . '

Beispiel 6

Zweifach-Rohr-VerdUnnungabestimmungen wurden mit verschiedenen Mikroorganismen durchgeführt. Das bei dieser Untersuchung verwendete Antibiotikum entsprach in der Reinheit dem in Beispiel 4

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erhaltenen Material (Fraktionen 100 bis 132).

Organismen Mindesthesnmkonzentration,

/ ml

Staphylococcus aureus 2O9P Streptococcus pyogenes C2O3 Bacillus subtilis A.T,C.C. 6633 Sarcina lutea A.T.C.C. 9341 Diplococcus pneumoniae Typ 3 A.¹ Escherichia coli A..T.C.C. 10536 Candida albicans CBS 35 H Mycobacterium tuberculosis BCG SC*5516

Trichomonas vaginalis SC 8560 *Squibb-Kultur

Mäusen wurde intraperitoneal die 1000-fache IAjq ^on Streptococcus pyogenes C2O3 injiziert. Eine Stunde und fünf Stunden nach der Infektion erhielten sie subeutan das Antibiotikum der Erfindung. Das zu dieser Untersuchung verwendete Antibiotikum entsprach in seinem Reinheitsgrad dem in Beispiel 4 (Fraktionen 100 bis 132) erhaltenen Material. Ungefähr 0,5 mg/kg des Antibiotikum-Präparats reichten aus, um 50$ der Mäuse vor dem Tode zu bewahren.

0,	12	I
0,	01
0,	2
O₉	16
C₀ 6303 0,	12
>100
>10Q -
516 > 25₉O

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Janiemycin und seiner Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von Streptomyces macroeporeua A.T.C,C. 21388 bei Temperaturen von 15 bis 3O⁰C in einem wässrigen Nähnnedium, das verwertbare Kohlenhydrat- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Sub-

mersbedinrungen züchtet und das sich in der Gärmaische anreichernde Antibiotikum, in an sich bekannter Weise isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung etwa 90 bis 150 Stunden durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch^ 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei etwa 25°C durchführt.

Mit Janiemycin. bezeichnete Substanz, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Wachstum von Bakterien wirksam hemmt, wobei sie bei der Elementaranalyse 47,49^C, 5,30^H und 13,O7£N ergibt und das'in Pig. I gezeigte IR-Absorptionsspektrum aufweist, sowie ihre Salze,

5. Substanz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ihr R-p-Wert im Lösungsmittelsystem n-Butanol/Eisessig/Wasser (4:1:5) etwa 0,13 ist.

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6. Substanz n'jch Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ihr R_f-".'ert im Lösungsmittelsystem n-Butanol/Pyridin/Wacser (4:3:7) etwa 0,85 ist.

7. Substanz n^ch Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ihre drei antibiotisch wirksamen Komponenten bei der Verwendung von* Sofranin 0 als Knthodenindikator und Apaion als elektroosraotischem Indikator elektrophoretisehe Beweglichkeiten von +85, +44 bzw. +12 aufweisen.

8, Substanz noch Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet, dass sie in neutraler Lösung Absorptionsmaxima bei etwa 239 und 272 mn und in alkalischer Lösung ein Absorptionsraaximum von etwa 253 nm aufweist.

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