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Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung und Isolierung einer neuen Familie von antibiotischen Substanzen, die durch Fermentation eines Stammes der Gattung Actinoplanes erhalten werden. Diese Substanzen werden nachstehend als Metabolit A und Metabolit B bezeichnet ; Metabolit B wird auch Gardimyein genannt.
Die antibiotischen Substanzen werden durch Züchtung eines Fermentationsstammes hergestellt, welcher zur Gattung A etinoplanes gehört. Dieser Stamm wurde aus Bodenproben isoliert, welche aus Temossi (Italien) stammen. In der Sammlung der Patentinhaberin ist die Bezeichnung des Stammes A/6353 ; der Stamm wurde hinterlegt und stellt einen Teil der Kultursammlung der ATCC dar, wo er die Nummer 31048 erhalten hat.
Bei der Herstellung der neuen antibiotischen Substanzen wird der ausgewählte Organismus unter aeroben Bedingungen in einem wässerigen Nährmedium gezüchtet, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält. Üblicherweise wird der Stamm in einer Schüttelflasche vorgezüchtet, bis eine wesentliche antibiotische Aktivität vorliegt, worauf die Kultur zur Beimpfung von Fermentationsbehältern verwendet wird, die ein Fermentationsnährmedium enthalten.
Die Kultivierung wird bei 25 bis 350C unter aeroben Bedingungen während einer ausreichenden Zeit durchgeführt, um einen wesentlichen Antibiotikaspiegel zu bilden. Während dieser Zeit werden mikrobiolo- gische Tests nach der Agardiffusionsmethode durchgeführt, um die Konzentration der gebildeten antibioti- schen Substanz zu überwachen. Als Testorganismus wird Sarcina lutea verwendet.
Die so erhaltene antibiotische Aktivität kann aus der Fermentationsbrühe durch übliche Verfahrensweisen abgetrennt werden, beispielsweise durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, in welchem die antibiotische Aktivität löslich ist und das mit dem wässerigen Medium unmischbar ist. Zu diesem Zweck können organische Lösungsmittel, die aus der Gruppe der niedrigen Alkanole mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und der (Cl-4) niederen halogenierten Kohlenwasserstoffe ausgewählt sind, in vorteilhafter Weise verwendet werden.
Die organische Phase wird vom wässerigen Medium abgetrennt, auf ein kleines Volumen eingeengt und 10 bis 15 h bei niedriger Temperatur stehengelassen, bis sich eine Fällung bildet, die durch Filtration abgetrennt wird. Nach Papierchromatographie auf Whatman-Papier Nr. l und Dünnschichtchromatographie auf Silicagel, durchgeführt mit dem erhaltenen Rohprodukt, und anschliessende mikrobiologische Entwicklung (Nicolaus et al., Il Farmaco, Ed. Part., Bd. 8, S. 350 bis 370 [1961]) auf Staphylococcus aureus am Detektorsystem zeigt sich das Vorliegen von wenigstens zwei aktiven Komponenten, die für Identifizierungszwecke mit Metabolit A und Metabolit B bezeichnet werden, wobei letzterer in höherer Menge als der erstere gebildet wird.
Diese beiden Komponenten haben verschiedene Rf-Werte, die in Abhängigkeit von der Art des Eluierungssystems variieren.
Die Metaboliten A und B können unter Anwendung üblicher Methoden, wie beispielsweise verschiedenen Gegenstromextraktionen in einem vorbestimmten Lösungsmittelsystem, in dem die beiden antibiotischen Substanzen unterschiedliche Verteilungskoeffizienten haben, gereinigt und als Reinverbindungen isoliert werden.
Während dieser Stufe wird Metabolit B als Mononatriumsalz rückgewonnen, das wieder in andere Salze mit Alkali- oder Erdalkalimetallen umgewandelt werden kann oder in die entsprechende freie Säure, wobei in an sich bekannter Weise vorgegangen wird.
Metabolit A und Metabolit B (nachfolgend als Gardimycin bezeichnet) sowie ihre Salze mit Alkali- und Erdalkalimetallen zeigen sowohl in vitro als auch in vivo gute antibakterielle Aktivitäten.
Insbesondere zeigt Gardimycin eine aussergewöhnliche antimikrobielle Wirkung in vitro, besonders gegen grampositive Bakterien bei Konzentrationswerten zwischen 1 und 50 jug/ml, wie aus der folgenden Tabelle ersichtlich ist, in der die Minimalkonzentration der antibiotischen Substanz angegeben ist, die das Wachstum verschiedener pathogener Mikroorganismen hemmt.
Tabelle 1 :
EMI1.1
<tb>
<tb> Minimale <SEP> Hemmkonzentration
<tb> Stamm <SEP> : <SEP> ( <SEP> g/ml) <SEP> : <SEP>
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> A <SEP> TCC <SEP> 538 <SEP> 50
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> A <SEP> TCC <SEP> 10240 <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> ATCC <SEP> 10541 <SEP> 50
<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> C <SEP> 203 <SEP> 2
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> UC <SEP> 41 <SEP> 50
<tb> Clostridium <SEP> perfringens <SEP> ISS <SEP> 30543 <SEP> 2
<tb> Neisseriagonorrheae <SEP> ATCC <SEP> 9826 <SEP> 20
<tb>
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Eine weitere günstige Eigenschaft der antibiotischen Substanz Gardimycin ist ihre Aktivität gegen klinisch isolierte Streptococcusstämme.
Tabelle 2 :
EMI2.1
<tb>
<tb> Minimale <SEP> Hemmkonzentration
<tb> Stamm <SEP> : <SEP> ( g/ml):
<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> 2078 <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> 2087 <SEP> 1
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 2057 <SEP> 5
<tb> Streptococcus <SEP> viridans'2085 <SEP> 2
<tb>
Gardimycin zeigt auch eine sehr interessante in vivo-Aktivität gegen experimentelle Infektionen inMäu- sen, die durch pathogene Diplococcus-und Streptococcus-Bakterien hervorgerufen worden sind. In der folgenden Tabelle sind die ED50 -Werte von Gardimycin gegen experimentelle Infektionen angegeben, die durch Streptococcus haemolyticus C 203 und Diplococcus pneumoniae UC 41 hervorgerufen worden sind.
Tabelle 3 :
EMI2.2
<tb>
<tb> Stamm <SEP> ED, <SEP> mg/kg <SEP> : <SEP>
<tb> Streptococcus <SEP> haemolyticus <SEP> C <SEP> 203 <SEP> 0,75
<tb> Diplococcus <SEP> pneumoniae <SEP> UC <SEP> 41 <SEP> 30
<tb>
Diese günstigen antimikrobiellen Eigenschaften sind verbunden mit einer sehr niedrigen Toxizität, da
EMI2.3
LDträgt.
Beschreibung des Antibiotika bildenden Stammes A/6353.
Der Stamm wächst auf verschiedenen Agarmedien gut. Auf Hafermehlagar zeigen die Kolonien, die einen Durchmesser von etwa 5 mm aufweisen, scharfe Konturen, schwache Radialfurchen und eine Zentraldepression. Luftmycel fehlt stets. Sporangien bilden sich reichlich auf Weizenmehlagar, Glycerinasparaginagar und Czapek-Glukoseagar, wobei sie verschiedene Form und Grösse in Abhängigkeit vom Medium zeigen,
Auf Weizenmehlagar haben sie regelmässige Konturen und eine Form, die von sphärisch bis oval variiert. Die Sporangiengrösse liegt im Bereich von 15 bis 25 fl, Die Sporen sind frei beweglich und sphärisch mit einem Durchmesser von 1,5 bis 2 fl, Ein gelb-bernsteinfarbiges lösliches Pigment wird in verschiedenen Medien gebildet.
Einige morphologische Kernmerkmale des Stammes sind in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4 :
EMI2.4
<tb>
<tb> Stamm <SEP> A/6353 <SEP>
<tb> Sporangien <SEP> bilden <SEP> sich <SEP> reichlich <SEP> auf <SEP> verschiedenen <SEP> A <SEP> garmedien <SEP> ; <SEP> variieren <SEP> jedoch <SEP>
<tb> in <SEP> Grösse <SEP> und <SEP> Gestalt. <SEP> Auf <SEP> Hafermehlagar <SEP> beträgt <SEP> die <SEP> Grösse <SEP> 15 <SEP> bis
<tb> 25 <SEP> ;
<tb> Sporan <SEP> sphärisch <SEP> (1, <SEP> 5 <SEP> bis <SEP> 2 <SEP> my);
<tb> Luftmycel <SEP> fehlt <SEP> stets <SEP> ; <SEP>
<tb> Lösliches <SEP> Pigment <SEP> gelb-bernsteinfarbiges <SEP> Pigment
<tb> liegt <SEP> auf <SEP> einigen <SEP> Agarmedien <SEP> vor.
<tb>
In Tabelle 5 sind die Kulturkennmerkmale des Stammes Actinoplanes A/6353, der auf verschiedenen
EMI2.5
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geschlagen worden sind, und andern, von Waksman (The Actinomycetes, Bd. II, The Williams and Wilkins Co.
[1961]) empfohlenen Medien gezüchtet wurde, angegeben. Die Kulturkennmerkmale wurden nach 6 bis 14 Tagen Bebrütung bei 300C bestimmt.
Tabelle 5 : (Die Nummernangabe bei einigen der Kulturmedien bezieht sich auf jene, die von Shirling und Gottlieb angegeben worden ist.)
EMI3.1
<tb>
<tb> Kulturmedium <SEP> : <SEP> Kulturkennmerkmale <SEP> für <SEP> A/6353 <SEP> : <SEP>
<tb> (a) <SEP> (b)
<tb> Medium <SEP> Nr. <SEP> 2 <SEP> reichliches <SEP> Wachstum, <SEP> schwach <SEP> ge-
<tb> (Hefeextrakt-Malzagar) <SEP> runzelt, <SEP> hellorange <SEP> bis <SEP> hell <SEP> bernsteinfarbig <SEP> ; <SEP>
<tb> Medium <SEP> Nr. <SEP> 3 <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> (Hafermehlagar) <SEP> und <SEP> dünner <SEP> Oberfläche, <SEP> hell <SEP> orange.
<tb>
Einige <SEP> Sporangien <SEP> stark <SEP> gelblosliches <SEP> Pigment <SEP> ; <SEP>
<tb> Medium <SEP> Nr. <SEP> 4 <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> (anorganische <SEP> Salze/OberfLäche, <SEP> orange. <SEP> Einige <SEP> SpoStärke-Agar) <SEP> rangien. <SEP> Kanariengelbes, <SEP> lösliches
<tb> Pigment <SEP> ; <SEP>
<tb> Medium <SEP> Nr. <SEP> 5 <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> (Glycerin-Asparagin-Oberfläche, <SEP> hell <SEP> orange. <SEP> ReichliAgar) <SEP> ehe <SEP> Pigmentproduktion. <SEP> Kanariengelbes, <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> ; <SEP>
<tb> Medium <SEP> Nr. <SEP> 6 <SEP> mässiges <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> (Pepton-Hefeextrakt-Oberfläche, <SEP> orange <SEP> ;
<SEP>
<tb> Eisen-Agar)
<tb> Medium <SEP> Nr. <SEP> 7 <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> (Tyrosinagar) <SEP> Oberfläche, <SEP> rosen-bernsteinfarbig.
<tb>
Gute <SEP> Sporangienproduktion. <SEP> Rosenbernsteinfarbiges, <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> ; <SEP>
<tb> Weizenmehlagar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> (nach <SEP> Waksman) <SEP> Oberfläche, <SEP> hell-orange <SEP> bis <SEP> topasgelb. <SEP> Gute <SEP> Produktion <SEP> von <SEP> schweren
<tb> Sporangien, <SEP> gelbes, <SEP> lösliches
<tb> Pigment <SEP> ; <SEP>
<tb> Hickey <SEP> und <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> Tresner's <SEP> Agar <SEP> Oberfläche, <SEP> rosen-bernsteinfarbig,
<tb> reichliche <SEP> Sporangienproduktion <SEP> ; <SEP>
<tb> Czapek's <SEP> Glukose- <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> Agar <SEP> und <SEP> dünner <SEP> Oberfläche, <SEP> orange.
<tb>
Reichliche <SEP> Sporangienproduktion <SEP> ; <SEP>
<tb> Glukose-Asparagin- <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> Agar <SEP> Oberfläche, <SEP> orange, <SEP> Einige <SEP> Sporangien <SEP> ; <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 4>
Tabelle 5 (Fortsetzung)
EMI4.1
<tb>
<tb> Kulturmedium <SEP> : <SEP> Kulturkennmerkmale <SEP> für <SEP> A/6353 <SEP> : <SEP>
<tb> (a) <SEP> (b)
<tb> Nähragar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> Oberfläche, <SEP> orange <SEP> ; <SEP>
<tb> Kartoffelagar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> Oberfläche, <SEP> bernsteinfarbig <SEP> ; <SEP>
<tb> Bennett's <SEP> Agar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> rustiger
<tb> Oberfläche, <SEP> hell-orange <SEP> ;
<SEP>
<tb> Calcium- <SEP> Malat-Agar <SEP> spärliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> Oberfläche, <SEP> farblos. <SEP> Einige <SEP> Sporangien <SEP> ; <SEP>
<tb> Magermilchagar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> schwach
<tb> krustiger <SEP> Oberfläche, <SEP> tief-orange
<tb> gelbes <SEP> lösliches <SEP> Pigment <SEP> ; <SEP>
<tb> Czapek's <SEP> Agar <SEP> spärliches <SEP> Wachstum, <SEP> hell-orange,
<tb> Mässige <SEP> Sporangienproduktion <SEP> ; <SEP>
<tb> Eier-Agar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> glatter
<tb> Oberfläche, <SEP> hell <SEP> eremefarbig.
<tb>
Mässige <SEP> Sporangienproduktion <SEP> ; <SEP>
<tb> Pepton-Glucose-Agar <SEP> reichliches <SEP> Wachstum <SEP> mit <SEP> gerunzelter <SEP> Oberfläche, <SEP> tief-orange <SEP> ; <SEP>
<tb> Agar <SEP> sehr <SEP> kärgliches <SEP> Wachstum, <SEP> dünn
<tb> und <SEP> glatt <SEP> ; <SEP> farblos <SEP> ; <SEP>
<tb> Löffler's <SEP> Serum <SEP> spärliches <SEP> Wachstum, <SEP> hell-orange <SEP> ; <SEP>
<tb> Kartoffelmedium <SEP> spärliches <SEP> Wachstum, <SEP> gerunzelt,
<tb> hell-orange.
<tb>
Die geeignetste Temperatur zur Entwicklung der Kolonien liegt im Bereich von etwa 18 bis etwa 420C, wobei die Optimaltemperatur etwa 28 bis etwa 370C beträgt,
In Tabelle 6 ist die Verwertung von Kohlenstoffquellen angeführt, die nach der Methode von Pridham und Gottlieb geprüft wurden.
Tabelle 6 :
Kohlenstoffverwertung
EMI4.2
<tb>
<tb> Kohlenstoffquelle <SEP> : <SEP> Wachstum, <SEP> A/6353 <SEP> : <SEP>
<tb> Inosit <SEP> +
<tb> Fructose <SEP> + <SEP>
<tb> Rhamnose <SEP> +
<tb> Mannit
<tb> Xylose <SEP> + <SEP>
<tb> Raffinose
<tb> Arabinose <SEP> + <SEP>
<tb> Cellulose
<tb> SalieinSaccharose
<tb> Mannose <SEP> +
<tb> Lactose
<tb> Glucose <SEP> (Positivkontrolle) <SEP> + <SEP>
<tb>
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In Tabelle 7 sind die physiologischen Kennmerkmale des Stammes angegeben.
Tabelle 7 :
Physiologische Kennmerkmale
EMI5.1
<tb>
<tb> Test <SEP> A/6353 <SEP> :
<tb> Stärkehydrolyse <SEP> posotiv
<tb> H <SEP> S-Bildung <SEP> negativ
<tb> Melaninbildung <SEP> negativ
<tb> Tyrosinhydrolyse <SEP> negativ
<tb> Caseinhydrolyse <SEP> positiv
<tb> Caicium-malathydrolyse <SEP> negativ
<tb> Lackmusmilchkoagulation <SEP> negativ
<tb> Lackmusmilchpeptonisierung <SEP> negativ
<tb> Nitratreduktion <SEP> negativ
<tb> Gelatineverflüssigung <SEP> negativ
<tb>
Der Stamm A/6353 ist wegen seiner kugelförmigen Sporangien, beweglichen Sporenundseiner Kolonie- morphologie der Gattung Actinoplanes zugeordnet worden.
A/6353 zeigt eine sehr beschränkte Fähigkeit zur Hydrolyse glycosidischer Bindungen, einschliesslich Saccharose, die von an allen bisher beschriebenen Spezies der Actinoplanes verwertet wird,
Der Stamm ist von allen bekannten Actinoplanesspezies leicht zu unterscheiden. Der Stamm A/6353 ist eine neue Spezies von Actinoplanes und hat den Namen Aetinoplanes liguriae ATCC 31048.
Bei s pie 1 : Herstellung des Antibiotikums, Isolierung und Trennung der verschiedenen Metaboliten,
Zur Gewinnung der antibiotischen Aktivitäten wird der Stamm Actinoplanes liguriae ATCC 31048 einer aeroben Vorkultur in einem Nährmedium unterworfen, bis eine wesentliche antibiotische Aktivität vorliegt, Beispielsweise kann eine Schüttelkolbenkultur folgende Zusammensetzung in g/l aufweisen :
EMI5.2
<tb>
<tb> Fleischextrakt <SEP> 3, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Hefeextrakt <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Stärke <SEP> 25, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Leitungswasser, <SEP> Rest <SEP> auf <SEP> 1000 <SEP> ml.
<tb>
Die Kolben werden etwa 24 h bei etwa 28 bis 30 C geschüttelt und dann werden die Vorkulturen (l l) verwendet, um Fermentationsbehälter zu beimpfen, von denen jeder 101 des folgenden Nährmediums enthält :
EMI5.3
<tb>
<tb> Fleichextrakt <SEP> 40 <SEP> g
<tb> Pepton <SEP> 40 <SEP> g
<tb> Hefeextrakt <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 100 <SEP> g <SEP>
<tb> Glukoxe <SEP> 500 <SEP> g <SEP>
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Leitungswasser, <SEP> Rest <SEP> auf <SEP> 10 <SEP> 1.
<tb>
Die Fermentationsansätze werden aerob unter Rühren bei 28 bis 300C bebrütet. In Intervallen wird die antibiotische Aktivität mikrobiologisch nach der Agar-Diffusionsmethode geprüft, wobei Sarcina lutea als Testorganismus verwendet wird. Die maximale Aktivität wird nach 130 bis 170 h Fermentation erreicht.
Die Fermentationsbrühe wird auf PH 8, 0 eingestellt und dann unter Verwendung von Hyf1o-Super-Cell als Filterhilfsmittel filtriert. Das Mycel wird verworfen und das Filtrat wird mit einer Butanolmenge, die etwa der Hälfte seines Volumens entspricht, extrahiert. Die organische Phase wird von der wässerigen abgetrennt und nach Waschen mit angesäuertem Wasser (pH 4, 0) wird sie auf etwa 1/10 ihres ursprünglichen Volumens eingeengt und 10 bis 12 h bei einer Temperatur von 3 bis 60C stehengelassen.
Es bildet sich eine rohe Fällung, die abfiltriert, mit Butanol gewaschen und im Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet wird. Ausbeute l, 4 g. Bei chromatographischen Tests auf Whatman Papier Nr. l oder auf Silicagel unter Verwendung dieser rohen Fällung und anschliessende mikrobiologische Entwicklung der Flecken unter Verwendung von Staphylococcus aureus als Detektorsystem wird das Vorliegen von zwei Kom-
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EMI6.1
:Rf-Werte, die von der Art des angewendeten Eluierungssystems abhängen.
Die rohe Mischung wird weiter durch Auflösen in etwa 15 ml Wasser gereinigt. Die entstehende Lösung wird etwa 16 h gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt. Es werden 0, 8 g der rohen antibiotischen Substanz erhalten, die noch immer ein Gemisch des Metaboliten A und Gardimycin ist.
Die beiden antibiotischen Substanzen werden abgetrennt und durch verschiedene Gegenstromextraktionen, die auf den verschiedenen Verteilungskoeffizienten der Komponente A und Gardimycin indem vorbestimmten Lösungsmittelsystem beruhen, gereinigt. Das angewendete Lösungsmittelsystem besteht aus Butanol : Natrium-Kallumphosphatpuffer M/15, PH 7, 2 : Hexan im Verhältnis 1 : 1 : 0, 1 ; die Verteilungskoeffizienten des Metaboliten A und Gardimycin betragen in diesem Medium 0, 3 bzw. 0, 8. Nach 100 Extraktionen werden 0, 2 g Gardimycin als Mononatriumsalz erhalten.
Die verschiedenen chromatographischen Verhaltensweisen der zwei Metaboliten der verschiedenen Eluierungssysteme sind in der folgenden Tabelle angegeben :
Chromatographisches Verhälten von Metabolit A und Metabolit B (Gardimycin)
EMI6.2
<tb>
<tb> Chromatographie <SEP> auf <SEP> Whatman <SEP> Papier <SEP> Nr. <SEP> l <SEP> ; <SEP> R <SEP> -Werte <SEP> : <SEP>
<tb> Sichtbarmachung <SEP> der <SEP> Flecken <SEP> durch <SEP> mikro- <SEP> Metabolit <SEP> A <SEP> : <SEP> Metabolit <SEP> B <SEP> : <SEP>
<tb> biologische <SEP> Entwicklung <SEP> auf <SEP> Styphylococcus
<tb> aureus
<tb> Eluierungssystem <SEP> :
<SEP> (Gardimycin) <SEP> * <SEP>
<tb> (a) <SEP> (b) <SEP> (c) <SEP>
<tb> 1) <SEP> Butanol, <SEP> das <SEP> mit <SEP> M/15 <SEP> Phosphatpuffer
<tb> vom <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 0 <SEP> gesättigt <SEP> ist <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP>
<tb> 2) <SEP> Butanol, <SEP> das <SEP> mit <SEP> 2% <SEP> p-Toluolsulfonsäure <SEP> enthaltendem <SEP> Wasser <SEP> gesättigt <SEP> ist <SEP> 0, <SEP> 75 <SEP> 0, <SEP> 80 <SEP>
<tb> 3) <SEP> Butanol, <SEP> das <SEP> mit <SEP> 2% <SEP> Ammoniumhydroxyd <SEP>
<tb> enthaltendem <SEP> Wasser <SEP> gesättigt <SEP> ist <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb> 4) <SEP> Phosphatpuffer <SEP> M/15 <SEP> mit <SEP> PH <SEP> 6, <SEP> 0, <SEP> der
<tb> mit <SEP> Butanol <SEP> gesättigt <SEP> ist <SEP> 0, <SEP> 65 <SEP> 0, <SEP> 80 <SEP>
<tb> 5) <SEP> 20%ige <SEP> wässerige <SEP> Lösung <SEP> von <SEP> Natriumchlorid <SEP> 0,
<SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 80 <SEP>
<tb> 6) <SEP> Butanol <SEP> : <SEP> Methanol <SEP> : <SEP> Wasser <SEP> = <SEP> 40 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 20
<tb> mit <SEP> 0, <SEP> 75% <SEP> Methylorange <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP> 0, <SEP> 65 <SEP>
<tb> 7) <SEP> Butanol <SEP> : <SEP> Methanol <SEP> : <SEP> Wasser <SEP> = <SEP> 40 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 20 <SEP> 0, <SEP> 85 <SEP> 0, <SEP> 60 <SEP>
<tb> 8) <SEP> Aceton <SEP> : <SEP> Wasser <SEP> = <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 80 <SEP> 0, <SEP> 80 <SEP>
<tb> 9) <SEP> mit <SEP> Wasser <SEP> gesättigtes <SEP> Äthylacetat <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP> 0, <SEP> 00 <SEP>
<tb> Dünnschichtchromatographie <SEP> auf <SEP> Silicagel <SEP> ;
<SEP>
<tb> Sichtbarmachung <SEP> der <SEP> Flecken <SEP> mittels
<tb> Schwefelsäure <SEP> und <SEP> Vanillin <SEP> und <SEP> mikrobiologische <SEP> Entwicklung <SEP> auf <SEP> Staphylococcus
<tb> aureus.
<tb>
Eluierungssystem <SEP> : <SEP>
<tb> Ammoniumhydroxyd <SEP> : <SEP> Äthanol <SEP> : <SEP> Wasser <SEP> = <SEP>
<tb> 1 <SEP> : <SEP> 8 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 30 <SEP> 0, <SEP> 70 <SEP>
<tb>
* Metabolit B wird als Mononatriumsalz getestet.
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Chemisch-physikalische Eigenschaften des Gardimycins als Mononatriumsalz.
Gardimycin (als Mononetriumsalz) stellt ein amorphes weisses Pulver mit amphoterem Charakter dar.
Es hat einen isoelektrischen Punkt von 4, 2, der durch Elektrofokalisierung bestimmt wurde. Nach starker Hydrolyse in en-Chlorwasserstoffsäure bei 1200C in einem geschlossenen Trichter während 16 h und chromatographischer Analyse des Hydrolyseproduktes war es möglich, folgende Aminosäuren zu ermitteln : Valin, Serin, Glycin, Glutaminsäure, Isoleucin, Leucin und Alanin. Nach alkalischer Hydrolyse mit Ba- riumhydroxyd bei 110 C in einem geschlossenen Trichter während 15 h und ehromatographischer Analyse der Hydrolyseprodukte war es möglich, das Vorliegen von Tryptophan festzustellen.
Die oben erwähnten Aminosäuren liegen in folgenden Anteilen vor :
EMI7.1
<tb>
<tb> Aminosäuren <SEP> : <SEP> angenäherter <SEP> Anteil <SEP> : <SEP>
<tb> Valin <SEP> 2
<tb> Serin <SEP> 1
<tb> Glycin <SEP> 2
<tb> Glutaminsäure <SEP> 1
<tb> Isoleucin <SEP> 2
<tb> Leucin <SEP> 1
<tb> Alanin <SEP> l <SEP>
<tb> Tryptophan <SEP> 1 <SEP>
<tb>
Im übrigen zeigt die Analyse der Produkte, die bei der sauren Hydrolyse entstehen, das Vorliegen weiterer Aminosäuren unbestimmter Struktur, von denen einige Schwefel enthalten.
Ausserdem ist Gardimyein
EMI7.2
EMI7.3
<tb>
<tb> C <SEP> = <SEP> 48, <SEP> 7 <SEP> bis <SEP> 48, <SEP> 6% <SEP> ; <SEP> H <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> bis <SEP> 6, <SEP> 6% <SEP> ; <SEP> N <SEP> = <SEP> 11, <SEP> 8 <SEP> bis <SEP> 12, <SEP> 2% <SEP> ; <SEP>
<tb> S <SEP> = <SEP> 5,3 <SEP> bis <SEP> 5,5%; <SEP> Na= <SEP> 1,1% <SEP> H2O <SEP> = <SEP> 3, <SEP> 6 <SEP> bis <SEP> 3, <SEP> 3% <SEP> ; <SEP>
<tb>
EMI7.4
EMI7.5
<tb>
<tb> :Lösungsmittel <SEP> : <SEP> max <SEP> (MM) <SEP> :
<SEP> Ex%
<tb> max <SEP> lern <SEP>
<tb> Methanol <SEP> 273 <SEP> (Schulter)
<tb> (in <SEP> Fig. <SEP> 1, <SEP> Kurve <SEP> A) <SEP> 280 <SEP> 26 <SEP>
<tb> 299 <SEP> 24
<tb> Natriumhydroxyd, <SEP> 0, <SEP> ln <SEP> 273 <SEP> (Schulter)
<tb> (in <SEP> Fig. <SEP> 1, <SEP> Kurve <SEP> D) <SEP> 279 <SEP> 26
<tb> 288 <SEP> 22
<tb> Salzsäure, <SEP> 0, <SEP> In <SEP> 273 <SEP> (Schulter)
<tb> (in <SEP> Fig. <SEP> l, <SEP> Kurve <SEP> C) <SEP> 279 <SEP> 26
<tb> 288 <SEP> 22
<tb> Phosphatpuffer, <SEP> 273 <SEP> (Schulter)
<tb> PH <SEP> 7, <SEP> 38 <SEP> 279 <SEP> 24
<tb> (in <SEP> Fig. <SEP> l, <SEP> Kurve <SEP> B) <SEP> 288 <SEP> 20
<tb>
Das vollständige Spektrum ist in Fig. l dargestellt.
5) Infrarotspektrum : Charakteristische Absorptionsbanden in Nujol wurden bei den folgenden Wellen- zahlen festgestellt :
EMI7.6
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EMI8.1
7) Löslichkeit :
Löslich in Wasser, wässerigem Natriumbicarbonat, verdünnten wässerigen Lösungen der Alkalihy- droxyde, heissem Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd, Eisessig.
Unlöslich in verdünnten Mineralsäuren, Benzol, Aceton, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, (Cg-g)' allphatischen Alkanolen, Tetrahydrofuran ; 8) charakteristische Reaktionen :
EMI8.2
<tb>
<tb> Fehling <SEP> positiv
<tb> Tollens <SEP> positiv
<tb> Kin04 <SEP> positiv
<tb> H <SEP> SO, <SEP> konz. <SEP> positiv
<tb> 2 <SEP> 4
<tb> Ninhydrin <SEP> negativ
<tb> Fecal <SEP> negativ
<tb> Millon <SEP> negativ
<tb> Schiff <SEP> negativ
<tb> Maltol <SEP> negativ <SEP> ; <SEP>
<tb>
9) Ionisierbare Funktionen :
Eine ionisierbare Funktion ist potentiometrisch feststellbar mit pKα=7,1 (Wasser) und pK, = 8, 5 (Methylcellosolve :
Wasser = 16 : 4) ; 10) Ferner ist es möglich, ausgehend vom Mononatriumsalz des Gardimycins, die folgenden Derivate herzustellen : a) Freie Gardimycinsäure: 1,0g Gardimycin-mononatriumsalz wird in 150 ml Wasser gelöst.
Die entstehende Lösung bringt man unter Zugabe von 10%iger Chlorwasserstoffsäure aufpH 2,5 und extrahiert dann zweimal mit 75 ml wassergesättigtem Butanol. Die Butanolextrakte werden gesammelt und im Vakuum bei 450C auf ein Volumen eingeengt, das 1/20 des Ausgangsvolumens entspricht. Nach Stehenlassen bei 40C während 12 h bildet sich eine Fällung, die gesammelt, mit
Leichtbenzin gewaschen und im Vakuum bei 40 bis 450C getrocknet wird. Man erhält 0,950 g Pro- dukt, das sich zwischen etwa 250 und etwa 3000C zersetzt. b) Gardimycin-dinatriumsalz: 1, 0 g Gardimycinmononatriumsalz wird in 150 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der entstehenden Lösung wird unter Zugabe von N/10-Natronlauge auf 9,6 gebracht.
Die Lösung wird dann lyophilisiert. Man erhält 0,900 g Produkt mit dem Fp. = 250 C. c) Gardimycin-Calciumsalz : 0,3 gGardimycln-mononatriumsalz werden in 20 ml Wasser gelöst und die entstehende Lösung versetzt man langsam unter Rühren mit mehreren Anteilen einer gesättig- ten Lösung von Calciumchlorid, bis eine vollständige Fällung erzielt ist. Der entstehende Fest- stoff wird abfiltriert, im Vakuum getrocknet und in 10 ml Aceton gelöst. Nach Eingiessen in 200 ml
Diäthyläther bildet sich eine Fällung, die abfiltriert und im Vakuum bei 40 bis 450C getrocknet wird. Man erhält 0,2 g des Produktes, das sich bei 330 bis 3400C zersetzt.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung antibiotisch wirksamer Substanzen, die aus zwei trennbaren Fraktionen
EMI8.3
man den Stamm Actinoplanes liguriae ATCC 31048 unter aeroben Bedingungen in einem wässerigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und anorganische Salze enthält, züchtet, bis eine wesentliche antibiotische Aktivität im Medium vorliegt, worauf man die antibiotisch aktiven Anteile davon abtrennt und die zwei Fraktionen auftrennt.