SU1296009A3

SU1296009A3 - Штамм @ @ 15118-продуцент антибиотического комплекса и способ получени антибиотического комплекса

Info

Publication number: SU1296009A3
Application number: SU833637906A
Authority: SU
Inventors: Пирали Джорджо; Пагани Хермес; Гранди Мария; Патерностер Мануэлла; Тамони Джорджо
Original assignee: Группо Лепетит С.П.А.
Priority date: 1982-08-26
Filing date: 1983-08-25
Publication date: 1987-03-07
Also published as: FI832985A0; JPS5978695A; GR77567B; NO156418B; PT77250A; NO832901L; US4692333A; AU562921B2; ES8502729A1; PH18898A; HUT37166A; CA1216532A; HU191108B; FI832985A; DK385483A; IL69472A; ZA835833B; EP0105148A3; NO156418C; ES525157A0

Abstract

Изобретение относитс к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Цель изобретени - изыскание штамма, способного продуцировать новый антибиотический комплекс, который обладает помимо антимикробной активности противоопухолевой активностью. Штамм Micromonospora sp, NRRL 15118 вл етс продуцентом антибиотического комплекса М 9026. Штамм выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в услови х аэрации при 26-30&deg;С и рН 6,0-8,5. Затем культу- рапьную жидкость или мицелий экстрагируют органическим растворителем, таким как этилацетат, метилэтил- кетон, э танол и др., при рН 3,5- 8,5. Очистку провод т методом хроматографии и при необходимости антибиотический комплекс раздел ют на составл ющие его факторы 1-3. Дл выделени факторов 2 и 3 провод т разделение комплекса на колонке с си- ликагелем и элюируют смесью хлористого метилена и метанола при соотношении последних 9:1. Экстракци при рН 7,0 дает выход комплекса 390 мг, ПО мг фактора 1, 90 мг фактора 2, 91 мг. фактора 3. 2 с. и 1 з.п.ф-лы. СО см

Description

Изобретение относитс к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков.

Цель изобретени - изыскание штамма, способного продуцировать новый антибиотический комплекс, который обладает помимо антимикробной активности противоопухолевой активностью .

Штамм Мicromonospora sp. выделен в штате Нангал (Инди ) и депонирован в коллекции сельскохоз йственных культур NRRL США под номером NRRL 15П8.

Культурально-морфологические признаки .

Хорошо растет на различных питательных агарах. На овс ном агаре колонии с диаметром 2 - 3 мм имеют правильные контуры и складчатые поверхности . Воздушный мицелий всегда отсутствует.

При исследовании под микроскопом установлено, что мицелий имеет удлиненную , разветвленную форму и диамет 0,6 мкм, а также происходит обильное образование овальных или сферических спор с диаметром 0,7-1,0 мкм. Бесчеренковые споры развиваютс непосредственно из мицели и зарождаютс главным образом на симподиально разветвленных спорофорак.

Рост на питательных средах определ ют через 7-14 дн инкубировани при . Цвет определ ют по методу Мэрца и Паула.

Овс ный агар: рост умеренный, шероховата , светло-оранжева , коричневата поверхность (12Е8),

Крахмальный агар с неорганически- ми сол ми: обильный рост, шероховата оранжева поверхность (I1F1I).

Глицерин-аспарагиновый агар: пло- кой рост, гладка поверхность с цветом от прозрачного до светло-оранжевого .

Жепезный агар с пептонно-дрожжевы экстрактом: умеренный рост, морщиниста поверхность, нтарного цвета (12D9).

Тирозиновый агар: плохой рост, гладка поверхность, прозрачна .

Овс ный агар (по Ваксману): обильный рост, гладка поверхность, цвет оранжевый, темноватый, влажна . Агар Хики и Треснера: обильный рост, морщиниста , коричнева поверхность. Глюкоза-аспарагиновый агар: плохой

fO

f5

0

25

30

35

5

0

5

рост, гладка поверхность, цвет от прозрачного до светло-оранжевого. Питательный агар: умеренный рост, гладка поверхность, цвет оранжевый (10Т9). Картофельный агар: обильный рост, морщиниста , черновато-оранжева поверхность, влажна . Агар Бен- нета: обильный рост, гладка , оранжево-коричнева поверхность. Агар с блочно-кислым кальцием: плохой рост, гладка , прозрачна поверхность . Агар со сн тым молоком: умеренный рост, гладка , оранжева поверхность (iicio).

Физиолого-биохимические признаки.

Усваивает арабинозу, ксилозу, глюкозу, маннозу, сахарозу, лактозу, раффинозу, мелибиозу, галактозу, целлобиозу, прегапозу и растворимый крахмал. Плохо усваивает фруктозу; не усваивает маннит, инозит, рамно- зу, целлюлозу, салицин, рибозу, дуль- цит и глицерин.

Гидролизует крахмал и казеин, образует Н 5, не образует меланин, реакци на тирозиназу отрицательна , гидролизует блочно-кисльй кальций, восстанавливает нитраты в нитриты, коагулирует молоко Литмуса. Разжижает желатину.

Дл получени антибиотика с использованием штамма 15118 в качестве источника у глерода можно использовать глюкозу, крахмал, мальтозу, сахарозу , галактозу, целлобиозу, раффинозу, фруктозу, декстрин, мелассу, а также масло земл ного ореха, кукурузное масло, рыбий жир, соевое масло и т.п.

В качестве источника азота можно использовать дрожжевые экстракты, . аминокислоты, казеиновый гидролизат, м сной экстракт, соевую муку, пептоны , овс ную муку, соевую муку, соевую мелочь, муку из хлопкового семени и т.д.

в качестве неорганических солей, которые можно вводить в питательную среду, примен ют растворимые соли, дающие ионы натри , кали , железа, цинка, коОальта, магни , кальци , аммони , хлорида, карбоната, сульфата , нитрата, фосфата и т.д. Штамм растет при 25-37°С, предпочтительно при 26-30 С, рН ферментационной среды 6,0 - 875.

Пример 1. Культуру MIcromonospora sp, NRRL 15118 внос т в среду следующего состава,г/л водопро

водной воды:дрожжевой экстракт ,5,м сной экстракт 3 .триптон 4,декстроза 1 , крахмал 24, СаСО 4. Колбы инкубируют в течение 48 ч нри при встр хивании,

Полученный инокул т внос т в ферментационную среду следующего состава , г/л водопроводной воды: дрожжевой экстракт 2, казеиновый гидро- лизат 4, м сной экстракт 2, декстроза 10, крахмал 20, СаСО 3.

Ферментацию ведут в аэробных глубинных услови х при перемешивании при 26-30°С и рН 6,0 - 8,5. Максимальна антибиотическа активность достигаетс через 72 ч ферментации .

КультуралЬную жидкость в объеме 100 л фильтруют, устанавливают в фильтрате рН 7 и экстрагируют дважды равными объемами этилацетата. Органические экстракты сливают и концентрируют в вакууме до 1/100 первоначального объема. Осадок выдел ют фильтрацией. Дополнительное количество целевого продукта получают в результате обработки маточного раствора этиловым эфиром. После фильтрации твердую фазу регенерируют и сушат в вакууме при комнатной температуре . Получают антибиотический комплекс - сырец.

Пример 2. Выделение фактора 1 антибиотика М9026.

Отфильтрованную мицелиальную масс промывают водой, устанавливают рН К 7,0 и смесь суспендируют в метаноле при перемешивании в течение 20 мин. Затем смесь фильтруют и метанол упаривают из фильтрата. В полученном водном слое устанавливают рН 7,0 и Экстрагируют этилацетатом аналогично примеру 1.

Полученный фактор 1 антибиотика . можно очистить (согласно примеру З). Из мицели , регенерированного из 200 л ферментационного бульона, получают 110 мг фактора I, При экстракции мицели при рН 3,5 выход фактор 1 составл ет 65 мг, а при рН 8,5 - 70 мг.

Фактор I характеризуетс следующими физико-химическими характеристиками ,

Кристаллическое твердое вещество с т.пл, около . Растворим в хлороформе, метаноле, менее раство

fO

f5

0

5

0

5

0

гидрокарбидах, нераст- С 68,83;

рим в а 1;етоне, ворим в воде.

Элементный состав, %: Н 8,70; N 5,56; О 16,91 ,

ИК-спектр, см- : 3670; 3550; 3460; 3320; 3100; 3080; 3040; 2740; 1720; 1660; 1630; 1545; 1500; 1260; 1245; 1220; 1190; 1140; 1090; 1040; 985; 950; 895; 750; 725; 700,

УФ-спектр: концева адсорбци при 215 нм в метаноле.

ЯМР-спектр: S 0,70 - 0,73 (2 дублет , 6Н, I 6,5); 0,83 (дублет, 6Н, I- 7); 1,0-2,0 (мультиплет, 4Н); 1,06 (мультиплет, 1Н); 1,24 (дублет, ЗН, I 6,5); 1,5 - 2,0 (мультиплет, 2Н); 1,66 (мультиплет, 2Н); 1,66 (триплет-септет, 1Н,1 7,5); 1,98 (тройной дублет, 2Н, I 7,5 - 7,5 - 1); 2,49 (тройной дублет, 1Н, 1Н, I 7-10; 2,5); 3,00 (дублет, 2Н, I 7,5); 3,91 (четверной дублет, 1Н, I 9: 2,5-9,5); 4,08 (двойной дублет, 1Н); 4,32 (двойной дублет-квартет, 1Н, I 2,510); 4,57 (дублет-триплет, 1Н, I 8); 5,69 (дублет-триплет, 1Н, I 15); 6,15 (дублет 1Н); 6,22 (дублет 1н); 6,73 (дублет-триплет, 1Н); 7,18 (мультиплет, 5Н),

Масс-спектр, m/z (% от,инт,): :486 (35) ; 91 (18) ; 1 1 1 (81) ; 120

(37) ; 216 (18) ; 217 (19) ; 230 (70) , 23 (34); 258 (100); 344 (48); 372 (8,3j; 395 (3,5); 486 (2,6); 471

(1.1)

Пример 3. Очистка антибиотического комплекса,

1,5 г сырого комплекса (пример ) раствор ют в 10 мл элюирующей смеси (хлороформ:метанол:гидроокись аммони в соотношении 60:30:4) и очищают с помощью хроматографической колонки с силикагелем. Колонку про вл ют ука- смесью и отбирают фракции объемом 15 мл под посто нным контролем антибиотической активности, например с помощью S,aureLis в качестве тест-микроба. Фракции объедин ют по активности, К концентрированным объединенным фракци м добавл ют этиловый эфир дл осаждени очищенного комплекса (можно использовать изо- пропиловый или петролейный эфир). Выход антибиотического комплекса составл ет 390 мг. При экстракции при рН 3,5 выход составл ет 260 мг, при рН 8,5 280 мг.

Пример 4, Вьщеление факторов 2 н 3 антибиотического комплекса М9026.,

340 мг комплекса очищенного по примеру 3 раствор ют в 5 мл смеси хлористого метилена и метанола, вз тых в соотношении 9:1, Раствор пропускают через хроматографическую колонку с 30 г силикагел . Эту же смесь растворителей используют дл про влени колонки, отбира фракции по 15 мл. Фракции объедин ют по ак- тивности и содержанию целевого продукта .

Объединенные фракции концентрируют в вакууме. Каждый концентрат до бавл ют в этиловый эфир дл осаждени целевого продукта. Выдел ют 90 мг фактора 2 и 91 мг фактора 3. При проведении процесса экстракции при рН 3,5 выход фактора 2 составл ет 50 мг, фактора 3 - 55 мг, а при рН 8,5 выход фактора 2-55 мг, фактора 3 - 60 мг.

Фактор 2 представл ет собой светло-серый порошок с т.пл.вьше 280 С. Он растворим в метаноле, этаноле, ацетоне, этилацетате, хпороформе;

. 358 (42); 386 (18); 395 (34); 482 (6); 485 (3).

Rf 0,54 (при использовании в качестве элюирующей смеси системы хло- 5 ристый метилен:метанол в соотношении 95:1) и Rf 0,76 (смесь хлористый метилей:метанол 9:1).

Фактор 3 представл ет собой белое кристаллическое вещество с 10 т.пл. около 1 .

Элементный состав, %: С 67,01; Н 9,24; N 5,52; О 18,33.

ИК-спектр, %: 3700; 3610; 3420; 3300; 3040; 2960; 2935; 2880; 1730; 15 1665; 1635; 1600; 1500; 1455; 1435; 1370; 1275; 1235; 1200; 1170.

УФ-спектр: терминальна абсорбци при 215 ни в среде метанола.

ЯМР-спектр: S 0,88 (дублет, 6Н, 20 f 7); 0,91- - 0,94 (2 дублет, 6Н, ); 1,4 - 2,0 (мультиплет, 8Н); 1,16 (дублет, ЗН; I 6,5); 1 ,31 (дублет, ЗН, I 7); 1,99 (тройной дублет, 2Н, f 7-7-1); 2,49 (трой- 25 ной дублет, 1Н, I 2,5; 7-11); 3,07 (широка , 1Н); 3,34 (дублет- квартет, Ш, 8); 3,68 (S, ЗН); 3,70 (мультиплет, 1Н); 3,75 (двойной

ограниченно растворим в ацетонитриле, ,, (широка ,

,30 1Н); 4,01 ( четвертной дублет, I

9, I 2-11); 4,54 (двойной дублет, 1Н, ); 5,62 (дублет-триплет 1Н, t 15); 6,16 (дублет, 1Н); 6,52 (дублет, 1Н); 6,65 (дублет-триплет,

35 Ч); 7,27 (мультиплет, 5Н).

Масс-спектр, %: 532 (0,б); 105 (28); in (76); 134 (40); 230 (12); 231 (20); 244 (82); 245 (34); 272 (100); 358 (40); 386 (6); 395 (5);

40 427 (7); 482 (2); 500 (1,2). Rf 0,41 (при использовании смеси хлористый метилен:метанол в соотношении 95:1 в качестве элюирующей смеси) и Rf 0,63 (смесь хлористый мети45 лен:метанол 9:1).

Комплекс антибиотика М9026 и его

факторы I - 3 обладают антибактеои- альной активностью in vitro, особенно против грамположительных бактерий,

50

нерастворим в воде, петролейном эфире , этиловом эфире.

Элементный состав, %: С 68,82; Н 9,04; N 5,70; О 17,09.

ИК-спектр, см : 3340; 3295; 3070; 2730; 1720;.1670; 1655; 1630;. 1540; 1500; 1270; 1240; 1215; 1190;, 1140; 1090; 1040; 980; 945; 760; 720; 700.

УФ-спектр: абсорбци при s215 нм.

ЯМР-спектр: S 0,78 (дублет, 6Н, I 7); 0,87 - 0,90 (2 дублет, 6Н, 1 6,5); 1,4 - 2,0 (мультиплет, 8Н); 1,24 (дублет, ЗН; I 6,5); 1,27 (дублет, ЗН; I 7); 1,92 (тройной дублет,2Н, I 7,5-7,5 - l); 2,60 (тройной дублет, 1Н, I 2,5-7-11); 3,27 (дублет-квартет, 1Н; I 9); 4,08 (четвертной дублет, 1Н, I 9, 9-9-2); 4,14 (двойной дублет, 1Н); 4,38 (двойной дублет-квартет, 1Н, 1 2-11); 4,54 (двойнойдублет,, 1Н,1 8); 5,62 (дублет-триплет, 1Н, I 15); 6,13 (дублет, 1Н); 6,60 (дублет-триплет, 1Н); 7,23 (мульти- гшет, 5Н); 7,27 (дублет, 1Н).

Масс-спектр, %: 500 (9); 105 (28); 111 (78); 134 (40); 230 (12); 231 (20); 244 (82); 245 (34)} 272 (ШО);

а также цитотоксической активностью in vitro и противоопухолевой активностью in ViVO,

Форму л а изобретени

1 . Штамм Mf cromonospora sp. MRRL 15118 (Agricultural Res.each Culture Collection) - продуцент антибиотического комплекса.

358 (42); 386 (18); 395 (34); 482 (6); 485 (3).

Rf 0,54 (при использовании в качестве элюирующей смеси системы хло- ристый метилен:метанол в соотношении 95:1) и Rf 0,76 (смесь хлористый метилей:метанол 9:1).

Фактор 3 представл ет собой белое кристаллическое вещество с т.пл. около 1 .

Элементный состав, %: С 67,01; Н 9,24; N 5,52; О 18,33.

ИК-спектр, %: 3700; 3610; 3420; 3300; 3040; 2960; 2935; 2880; 1730; 1665; 1635; 1600; 1500; 1455; 1435; 1370; 1275; 1235; 1200; 1170.

ЯМР-спектр: S 0,88 (дублет, 6Н, f 7); 0,91- - 0,94 (2 дублет, 6Н, ); 1,4 - 2,0 (мультиплет, 8Н); 1,16 (дублет, ЗН; I 6,5); 1 ,31 (дублет, ЗН, I 7); 1,99 (тройной дублет, 2Н, f 7-7-1); 2,49 (трой- ной дублет, 1Н, I 2,5; 7-11); 3,07 (широка , 1Н); 3,34 (дублет- квартет, Ш, 8); 3,68 (S, ЗН); 3,70 (мультиплет, 1Н); 3,75 (двойной

Форму л а изобретени

Claims

7 12960098

2. Способ получени антибйотичес-экстракцией устанавливают рН 3,5 кого комплекса, заключающийс в том,8,5, целевой продукт подвергают хро- что штамм Micromonospora sp. NRRLматографической очистке и при необ- 15118 выращивают при 26 - и рН. ходимости антибиотический комплекс 6,0 - 8,5 в глубинных аэробных5 раздел ют на факторы 1-3. услови х в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и3, Способ поп.2, отличаю- минеральные соли, с последующим вы-щ и и с тем, что, с целью выделе- делением целевого продукта путемни фактора 2 и/или фактора 3, антиэкстракции культуральной жидкости или биотический комплекс раздел ют хро- мицели ,этил-,бутил- или пропилаце-матографически на колонке с силикаге- татом, бутилпропионатом, метилэтил-лем и элюируют целевой продукт смесью кетоном, хлороформом, хлористьм ме-хлористого метилена и метанола в тиленом или этанолом, при этом передсоотношении 9:1.